ES2208178T3 - Procedimiento para la preparacion fermentativa de l-aminoacidos y secuencias de nucleotidos que codifican el gen accda. - Google Patents
Procedimiento para la preparacion fermentativa de l-aminoacidos y secuencias de nucleotidos que codifican el gen accda.Info
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Abstract
Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos mediante fermentación de bacterias corineformes, caracterizado porque se utilizan bacterias en las que se ha sobre-expresado el gen accDA, o la secuencia de nucleótidos que lo codifica, procedente de Corynebacterium.
Description
Procedimiento para la preparación fermentativa de
L-aminoácidos y secuencias de nucleótidos que
codifican el gen accDA.
Objeto de la invención son procedimientos para la
preparación fermentativa de L-aminoácidos, en
particular L-lisina, utilizando bacterias
corineformes en las que se ha sobre-expresado el gen
accDA o secuencias de nucleótidos que lo codifican procedente de
Corynebacterium.
Los L-aminoácidos, en particular
la L-lisina, encuentran aplicación en la
alimentación animal, la medicina humana y en la industria
farmacéutica.
Es conocido que estos aminoácidos se preparan por
fermentación de cepas de bacterias corineformes, en particular
Corynebacterium glutamicum. Debido a su gran importancia, se
trabaja constantemente en la mejora de los procedimientos de
preparación. Las mejoras de los procedimientos pueden referirse a
medidas técnicas de fermentación tales como, p. ej., agitación y
suministro de oxígeno, o a la composición de los medios nutricios
tales como, por ej., la concentración de azúcar durante la
fermentación, o el tratamiento para dar forma al producto mediante,
por ej., cromatografía de intercambio iónico o las propiedades
intrínsecas de rendimiento del propio microorganismo.
Para la mejora de las propiedades de rendimiento
de estos microorganismos se utilizan métodos de mutagénesis,
selección y elección de mutantes. De esta manera se obtienen cepas
que son resistentes a antimetabolitos tales como, por. ej., el
análogo de lisina
S-(2-aminoetil)-cisteína, o son
auxótrofos con respecto a aminoácidos importantes en la regulación y
producen L-aminoácidos.
Desde hace algunos años se utilizan asimismo
métodos de la técnica del ADN recombinante para la mejora de cepas a
partir de cepas productoras de L-aminoácidos de
Corynebacterium, amplificando diferentes genes de biosíntesis
de aminoácidos e investigando el efecto sobre la producción de
L-lisina. Se encuentran artículos recopilatorios,
entre otros, en Kinoshita ("Glutamic Acid Bacteria", en:
Biology of Industrial Microorganisms, Demain y Solomon (Comp.),
Benjamin Cummings, Londres, GB, 1985, 115-142),
Hilliger (BioTec 2, 40-44 (1991)), Eggeling (Amino
Acids 6:261-272 (1994)), Jetten y Sinskey (Critical
Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995)) y Sahm
et al. (Annuals of the New York Academy of Science 782,
25-39 (1996)).
La enzima acetil-CoA caboxilasa
cataliza la carboxilación de acetil-CoA a
malonil-CoA. La enzima de Escherichia coli se
compone de cuatro subunidades. El gen accB codifica la proteína
portadora biotina-carboxilo, el gen accC la
biotina-carboxilasa y los genes accA y accD la
transcarboxilasa (Cronan y Rock, Biosynthesis of Membrane lipids.
En: Escherichia coli and Salmonella typhimurium (Comp. F. C.
Neidhardt), 1996, págs. 612-636, American Society
for Microbiology). Debido a la propiedad de la enzima de carboxilar
grupos acilo en forma de acil-CoA, también es
llamada acil-CoA carboxilasa.
La secuencia de nucleótidos del gen accBC de
Corynebacterium glutamicum fue determinada por Jäger et al.
(Archives of Microbiology 166, 76-82 (1996)) y se
encuentra a libre disposición en el Banco de Datos de European
Molecular Biologies Laboratories (EMBL, Heidelberg, Alemania) con el
número de acceso U35023. El gen accBC codifica una subunidad de la
acetil-CoA carboxilasa que porta un dominio de
proteína portadora biotina-carboxilo y un dominio de
biotina-carboxilasa.
Los autores de la invención se han puesto como
misión proporcionar nuevas medidas para una preparación fermentativa
mejorada de L-aminoácidos, en particular
L-lisina.
Los L-aminoácidos encuentran
aplicación en la alimentación animal, en la medicina humana y en la
industria farmacéutica. Por tanto, existe un interés general en
proporcionar nuevos procedimientos mejorados para la preparación de
L-aminoácidos.
Cuando se cite en lo sucesivo la
L-lisina o lisina, se entiende con ello no solamente
la base, sino también las sales tales como, por ej.,
monohidrocloruro de lisina o sulfato de lisina.
Se describe un ADN, preferentemente recombinante,
que es replicable en microorganismos corineformes, procedente de
Corynebacterium, que contiene al menos la secuencia de
nucleótidos que codifica el gen accDA, representado en la
SEQ-ID-No 1.
La invención se refiere a un procedimiento para
la preparación fermentativa de L-aminoácidos
utilizando bacterias corineformes, que en particular ya producen los
L-aminoácidos, y en las cuales se
sobre-expresan las secuencias de nucleótidos que
codifican el gen accDA.
Finalmente, también es objeto de la invención un
procedimiento para la sobre-expresión de la
acil-CoA carboxilasa en bacterias corineformes, por
sobre-expresión conjunta del gen accDA empleado
según la invención y del gen accBC conocido.
Los microorganismos, que se utilizan en el
procedimiento según la invención, pueden producir
L-aminoácidos a partir de glucosa, sacarosa,
lactosa, fructosa, maltosa, melaza, almidón, celulosa o a partir de
glicerina y etanol. Puede tratarse de representantes de bacterias
corineformes, en particular del género Corynebacterium. En el
caso del género Corynebacterium cabe citar en particular la
especie Corynebacterium glutamicum, que se conoce en el mundo
especializado por su capacidad para producir
L-aminoácidos.
Cepas apropiadas del género
Corynebacterium, en particular de la especie
Corynebacterium glutamicum, son las conocidas cepas del tipo
silvestre
Corynebacterium glutamicum ATCC13032
Corynebacterium acetoglutamicum
ATCC15806
Corynebacterium acetoacidophilum
ATCC13870
Corynebacterium thermoaminogenes FERM
BP-1539
Brevibacterium flavum ATCC14067
Brevibacterium lactofermentum ATCC13869
y
Brevibacterium divaricatum ATCC14020
y mutantes o cepas derivados de ellas que
producen L-aminoácidos como, por
ejemplo
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 1709
Brevibacterium flavum
FERM-P 1708
Brevibacterium lactofermentum
FERM-P 1712
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 6463 y
Corynebacterium glutamicum
FERM-P 6464
Los autores de la invención aislaron el gen accDA
de C. glutamicum. Para aislar el gen accDA o también otros
genes de C. glutamicum se construye, en primer lugar, un
banco de genes de este microorganismo en E. coli. La
construcción de bancos de genes se encuentra registrada en libros de
texto y manuales ampliamente conocidos. Como ejemplo se pueden
mencionar el libro de texto de Winnacker: Gene und Klone, Eine
Einführung in die Gentechnologie (Verlag Chemie, Weinheim, Alemania,
1990) o el manual de Sambrook et al.: Molecular Cloning, A
Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). Un
banco de genes muy conocido es el de la cepa W3110 de E. coli
K-12, que fue construido por Kohara et al. (Cell 50,
495-508 (1987)) en vectores \lambda. Bathe et al.
(Molecular and General Genetics, 252:255-265, 1996)
describen un banco de genes de C. glutamicum ATCC13032, que
se construyó con ayuda del vector cósmido SuperCos I (Wahl et al.,
1987, Proceedings of the National Academy of Sciences USA,
84:2160-2164) en la cepa NM554 de E. coli
K-12 (Raleigh et al., 1988, Nucleic Acids Research
16:1563-1575). Börmann et al., (Molecular
Microbiology 6(3), 317-326)) describen a su
vez un banco de genes de C. glutamicum ATCC13032 utilizando
el cósmido pHC79 (Hohn y Collins, Gene 11, 291-298)
(1980)). Para la preparación de un banco de genes de C.
glutamicum en E. coli se pueden utilizar también
plásmidos como pBR322 (Bolivar, Life Sciences, 25,
807-818 (1979)) o pUC9 (Viera et al., 1982, Gene,
19:259-268). Como huéspedes, son especialmente
apropiadas aquellas cepas de E. coli con defectos de
restricción y recombinación. Un ejemplo de esto es la cepa
DH5\alphamcr que fue descrita por Grant et al. (Proceedings of the
National Academy of Sciences USA, 87 (1990)
4645-4649). Los largos fragmentos de ADN clonados
con la ayuda de los cósmidos pueden, a continuación, ser subclonados
a su vez en vectores corrientes adecuados para la secuenciación y, a
continuación, ser secuenciados, tal como lo describe, p. ej., Sanger
et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America USA, 74:5463-5467,
1977).
De esta forma se obtuvo la secuencia de ADN que
codifica el gen accDA de C. glutamicum, que forma parte de la
presente descripción como SEQ ID NO 1. En la SEQ ID NO 2 se
reproduce la región codificante (cds) del gen accDA. Además se
dedujo, a partir de la secuencia de ADN presente, la secuencia de
aminoácidos de la proteína correspondiente, mediante los métodos
arriba descritos. En la SEQ ID NO 3 está representada la secuencia
de aminoácidos resultante del gen accDA.
Los autores de la invención descubrieron que las
bacterias corineformes, tras la sobre-expresión de
los genes accDA procedentes de Corynebacterium, producen
L-lisina de forma mejorada.
Para conseguir una
sobre-expresión se puede aumentar el número de
copias de los genes correspondientes, o se puede mutar la región del
promotor y de regulación o el sitio de unión a los ribosomas, que se
encuentra en dirección 5' respecto al gen estructural. De igual
manera actúan los casetes de expresión, que se insertan en dirección
5' respecto al gen estructural. Mediante promotores inducibles, es
adicionalmente posible aumentar la expresión en el transcurso de la
producción fermentativa de L-lisina. Mediante
medidas para alargar la duración de vida del ARNm se mejora asimismo
la expresión. Además, mediante la inhibición de la degradación de la
proteína enzimática, se refuerza asimismo la actividad enzimática.
Los genes o constructos génicos pueden o bien estar presentes en
plásmidos con diferentes números de copias o bien estar integrados y
ser amplificados en el cromosoma. De forma alternativa, también se
puede conseguir una sobre-expresión de los genes en
cuestión mediante modificaciones en la composición del medio y la
forma de realizar el cultivo.
El especialista encuentra instrucciones a este
respecto, entre otros, en Martin et al. (Bio/Technology 5,
137-146 (1987)), Guerrero et al. (Gene 138,
35-41 (1994)), Tsuchiya y Morinaga (Bio/Technology
6, 428-430 (1988)), en Eikmanns et al. (Gene 102,
93-98 (1991)), en la memoria de patente europea EPS
0 472 869, en la patente de EE.UU. 4 601 893, en Schwarzer y Pühler
(Bio/Technology 9, 84-87 (1991)), en Reinscheid et
al. (Applied and Environmental Microbiology 60,
126-132 (1994)), en LaBarre et al. (Journal of
Bacteriology 175, 1001-1007 (1993)), en la solicitud
de patente WO 96/15246, en Malumbres et al. (Gene 134,
15-24 (1993)), en la memoria de publicación de
solicitud de patente japonesa
JP-A-10-229891, en
Jensen y Hammer (Biotechnology and Bioengineering 58,
191-195 (1998)), en Makrides (Microbiological
Reviews 60:512-538 (1996)) y en conocidos libros de
texto de genética y biología molecular.
Un ejemplo de un plásmido, con cuya ayuda se
puede sobre-expresar el gen accDA, es pZ1accDA
(figura 1), que está contenido en la cepa
MH20-22B/pZ1accDA. El plásmido pZ1accDA es un vector
transportador de E. coli-C. glutamicum basado en el
plásmido pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology
55(3), 684-688 (1989)), que porta el gen
accDA. Otros vectores plásmidos replicables en C. glutamicum
como, p.ej., pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene 102:93-98
(1991)) o pZ8-1 (memoria de patente europea 0 375
889) pueden emplearse de igual manera.
Además, los autores de la invención descubrieron
que por sobre-expresión adicional del conocido gen
accBC además del gen accDA, las bacterias corineformes producen de
forma mejorada acil-CoA carboxilasa. Un ejemplo de
plásmido con cuya ayuda se pueden sobre-expresar
conjuntamente el gen accDA y el gen accBC, es pEK0accBCaccDA (figura
2). El plásmido pEK0accBCaccDA es un vector transportador de E.
coli-C. glutamicum basado en el plásmido pEK0 (Eikmanns
et al., Gene 102, 93-98 (1991)), que porta el gen
accBC y el gen accDA. Otros vectores plásmidos replicables en C.
glutamicum como, p.ej., pEKEx1 (Eikmanns et al., Gene
102:93-98 (1991)) o pZ8-1 (memoria
de patente europea 0 375 889) pueden emplearse de igual manera.
Además, puede ser ventajoso para la producción de
L-aminoácidos sobre-expresar,
además del gen accDA, una o varias enzimas de la ruta biosintética.
De esta manera se puede, por ejemplo, para la preparación de
L-lisina
\bullet sobre-expresar
simultáneamente el gen dapA que codifica la dihidrodipicolinato
sintasa (documento EP-B 0 197 335), o
\bullet amplificar simultáneamente un fragmento
de ADN que induzca resistencia a la
S-(2-aminoetil)-cisteína (documento
EP-A 0 088 166).
También puede ser ventajoso para la producción de
L-aminoácidos, en particular de
L-lisina, adicionalmente a la
sobre-expresión del gen accDA, eliminar reacciones
secundarias indeseadas (Nakayama: "Breeding of Amino Acid
Producing Micro-organisms", en: Overproduction of
Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (comps.), Academic
Press, Londres, GB, 1982).
Los microorganismos empleados en el procedimiento
según la invención se pueden cultivar de manera continua o
discontinua, en procedimientos batch (cultivo en lotes) o de
fed-batch (procedimiento semicontinuo) o en
procedimientos repeated fed-batch (procedimiento
semicontinuo repetitivo), con el fin de producir
L-lisina. Se describe un resumen sobre métodos
conocidos de cultivo en el libro de texto de Chmiel
(Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav
Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) o en el libro de texto de Storhas
(Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag,
Braunschweig/Wiesbaden, 1994)).
El medio de cultivo a emplear debe satisfacer de
forma apropiada las necesidades de las respectivas cepas. Se
encuentran descripciones de los medios de cultivo para diferentes
microorganismos en el manual "Manual of Methods for General
Bacteriology" de la American Society for Bacteriology (Washington
D.C., EE.UU., 1981). Como fuente de carbono se pueden emplear azúcar
y carbohidratos tales como, p. ej., glucosa, sacarosa, lactosa,
fructosa, maltosa, melaza, almidón y celulosa, aceites y grasas
tales como, p. ej., aceite de soja, aceite de girasol, aceite de
cacahuete y aceite de coco, ácidos grasos tales como, p. ej., ácido
palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico, alcoholes tales como,
p. ej., glicerol y etanol, y ácidos orgánicos tales como, p. ej.,
ácido acético. Estas sustancias pueden emplearse solas o como
mezcla. Como fuente de nitrógeno se pueden emplear compuestos que
contienen nitrógeno orgánico tales como peptonas, extracto de
levadura, extracto de carne, extracto de malta, agua de fermentación
de maíz, harina de habas de soja y urea, o compuestos inorgánicos
tales como sulfato amónico, cloruro amónico, fosfato amónico,
carbonato amónico y nitrato amónico. Las fuentes de nitrógeno pueden
emplearse solas o en mezcla. Como fuente de fósforo se pueden
emplear ácido fosfórico, dihidrógeno-fosfato
potásico, o hidrógeno-fosfato dipotásico o las
correspondientes sales que contengan sodio. El medio de cultivo
también debe contener sales de metales tales como, p. ej., sulfato
magnésico o sulfato férrico, que son necesarias para el crecimiento.
Finalmente, se pueden utilizar sustancias de crecimiento esenciales
tales como aminoácidos y vitaminas, además de las sustancias antes
mencionadas. Al medio de cultivo se le pueden añadir, además,
precursores apropiados. Las mencionadas sustancias a emplear se
pueden añadir al cultivo en forma de mezcla única o de forma
apropiada durante el crecimiento del cultivo.
Para el control del pH del cultivo se emplean
compuestos básicos tales como hidróxido sódico, hidróxido potásico,
amoníaco, o bien agua amoniacal, o compuestos ácidos tales como
ácido fosfórico o ácido sulfúrico de manera apropiada. Para el
control del desarrollo de la espuma se pueden emplear agentes
antiespumantes tales como, p. ej., ésteres poliglicólicos de ácidos
grasos. Para el mantenimiento de la estabilidad de los plásmidos, se
pueden añadir al medio sustancias apropiadas de acción selectiva, p.
ej. antibióticos. Para mantener las condiciones aerobias, se
incorporan oxígeno o mezclas gaseosas con contenido en oxígeno como,
p. ej., aire en el cultivo. La temperatura del cultivo se encuentra
normalmente de 20ºC a 45ºC, y preferentemente de 25ºC a 40ºC. El
cultivo se prolonga el tiempo necesario hasta que se haya formado un
máximo del L-aminoácido deseado. Este objetivo se
alcanza normalmente en el plazo de 10 horas a 160 horas.
El análisis de la L-lisina se
puede realizar por cromatografía de intercambio aniónico con
subsiguiente derivatización de ninhidrina tal como se describe en
Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190).
Los siguientes microorganismos se depositaron en
la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares (DSMZ,
Braunschweig, Alemania) de acuerdo con el Tratado de Budapest:
\bullet La cepa de Corynebacterium
glutamicum DSM5715/pZ1accDA como DSM 12785
\bullet La cepa de Corynebacterium
glutamicum DSM5715/pEK0accBCaccDA como DSM 12787
El procedimiento según la invención sirve para la
preparación fermentativa de L-aminoácidos, en
particular ácido L-aspártico,
L-aspartina, L-homoserina,
L-treonina, L-isoleucina y
L-metionina, con bacterias corineformes, en
particular para la preparación de L-lisina.
A continuación, la presente invención se
ilustrará más detalladamente con la ayuda de ejemplos de
realización.
Se preparó un banco de genes de C.
glutamicum ATCC13032 con la ayuda del cósmido pHC79 (Hohn y
Collins, Gene 11, 291-298 (1980)), tal como se
describe en Börmann et al. (Molecular Microbiology 6(3),
317-326).
Se digerió un cósmido seleccionado con las
enzimas de restricción EcoRI y XhoI según las instrucciones del
fabricante de estas enzimas de restricción (Boehringer Mannheim).
Los fragmentos de ADN originados se mezclaron con el vector pUC18
(Norrander et al. (1983) Gene 26: 101-106), que
también había sido tratado con las enzimas de restricción EcoRI y
XhoI y, tras tratamiento con ADN-ligasa de T4, se
clonó en la cepa DH5\alphamcr de E. coli (Grant et al.
(1990) Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 87:
4645-4645), tal como se describe en Sambrook et al.
(Molecular Cloning a Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour
Laboratories). La selección de transformantes se llevó a cabo
mediante selección en agar LB con contenido de 50\mug/ml de
ampicilina, como se describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning a
Laboratory Manual (1989) Cold Spring Harbour Laboratories). Se aisló
el ADN plásmido a partir de un transformante y se designó como
pUCaccDA. A continuación, se prepararon subclones mediante digestión
con exonucleasa III, con el kit
(Erase-a-Base) de la firma Promega
(Heidelberg, Alemania) previsto para este fin. Estos subclones se
secuenciaron según el método didesoxi enzimático de terminación de
cadena de Sanger et al. (Proceedings of the National Academy of
Sciences USA (1977) 74: 5463-5467). Para ello se usó
el kit Auto-Read Sequencing (Amersham Pharmacia
Biotech, Uppsala, Suecia). El análisis por electroforesis en gel se
llevó a cabo con el secuenciador automático por fluorescencia láser
(A.L.F.) de Amersham Pharmacia Biotech (Uppsala, Suecia). La
secuencia de nucleótidos obtenida se analizó con el paquete de
programas HUSAR (Release 4.0, EMBL, Heidelberg, Alemania). La
secuencia de nucleótidos está representada en la SEQ ID NO 1. El
análisis de la secuencia de nucleótidos dio como resultado un marco
de lectura abierto de 1.473 pares de bases, que se designó gen
accDA. El gen accDA de C. glutamicum codifica un polipéptido
de 484 aminoácidos.
El gen accDA se subclonó en el vector pZ1 (Menkel
et al. (1989) Applied and Environmental Microbiology 55:
684-688) para su expresión en C. glutamicum.
Para ello, se cortó el plásmido pUCaccDA (véase el Ejemplo 1) con la
enzima de restricción ClaI. El fragmento resultante de 1,6 kb de
tamaño se aisló como se describe en el Ejemplo 1, se trató con
polimerasa de Klenow y fosfatasa alcalina y se empleó para la
ligación con pZ1. Previamente se había linearizado este vector con
ScaI. Con la mezcla de ligación se transformó E. coli
DH5\alphamcr (Grant et al. (1990) Proceedings of the National
Academy of Sciences, USA, 87: 4645-4645) y se
seleccionaron los transformantes en agar LB con contenido en
kanamicina (50 \mug/ml). De este modo se obtuvo el vector
transportador pZ1accDA (figura 1) con un tamaño de 7,7 kb. Éste se
introdujo en la cepa DSM5715 mediante electroporación, como se
describe en Haynes (FEMS Microbiol. Letters (1989) 61:
329-334), donde se seleccionaron los transformantes
en agar LBHIS (Liebl et al., FEMS Microbiology Letters 1989, 65:
299-304). De esta forma se obtiene la cepa de C.
glutamicum DSM5715/pZ1accDA.
La cepa DSM5715/pZ1accDA, tras cultivo previo en
medio CgIII (Keilhauer et al. 1993, Journal of Bacteriology
175:5595-5603), se cultivó en el medio de producción
CgXII (Keilhauer et al. 1993, Journal of Bacteriology
175:5595-5603). Se añadieron glucosa al 4% y 50
mg/l de sulfato de kanamicina.
Tras 48 horas de incubación se determinaron la
densidad óptica a 660 nm y la concentración de
L-lisina formada. En la Tabla 1 se representa el
resultado del ensayo.
| Cepa | DO | L-lisina g/l |
| DSM5715 | 31,4 | 7,2 |
| DSM5715/pZ1accDA | 43,1 | 8,0 |
El plásmido pWJ71 que contiene accBC (Jäger et
al., Archives of Microbiology (1996) 166:76-82) se
digerió con las enzimas de restricción AgeI y SmaI y, a
continuación, se trató con polimerasa de Klenow y fosfatasa
alcalina. Paralelamente a esto, se digerió el plásmido pUCaccDA con
EcoRI/XhoI y, a continuación, se llevó a cabo un tratamiento con
polimerasa de Klenow y fosfatasa alcalina. Mediante aislamiento
preparativo en un gel de agarosa, que se llevó a cabo tal como se
describe en Sambrook et al. (Molecular Cloning a Laboratory Manual
(1989) Cold Spring Harbour Laboratories), se aisló el fragmento de
2,1 kb de tamaño, portador de accDA. Éste se ligó con el vector
pWJ71, tratado tal como se ha descrito anteriormente. En el plásmido
resultante se cortó el fragmento de 4,6 kb de tamaño portador de
accBCaccDA por digestión con KpnI/SalI y se aisló nuevamente de
forma preparativa por electroforesis en gel de agarosa. Para la
ligación de este fragmento con el vector lanzadera C.
glutamicum/E. coli pEK0 (Eikmanns et al. (1991) Gene
102:93-98), pEK0 se digerió con las enzimas de
restricción KpnI y SalI y, a continuación, se realizó un tratamiento
con polimerasa de Klenow y fosfatasa alcalina. El vector, así
preparado, fue ligado al fragmento de 4,6 kb de tamaño portador de
accBCaccDA. El vector resultante pEK0accBCaccDA se representa en la
figura 2. Este vector se introdujo, mediante electroporación (Haynes
1989, FEMS Microbiol. Letters 61: 329-334) tal como
se describe en el Ejemplo 2, en la cepa ATCC13032. De esta forma se
obtuvo la cepa de C. glutamicum ATCC13032/pEK0accBCaccDA.
La cepa de C.glutamicum
ATCC13032/pEK0accBCaccDA, tras cultivo previo en medio CgIII
(Keilhauer et al. 1993, Journal of Bacteriology
175:5595-5603), se cultivó en el medio CGXII tal
como se describe en Keilhauer et al. (Journal of Bacteriology (1993)
175:5595-5603). Las células se recolectaron mediante
centrifugación, y el sedimento celular se lavó una vez con
Tris-HCl 60 mM (pH 7,2) y se resuspendió en el mismo
tampón. Se llevó a cabo la disrupción celular mediante tratamiento
con ultrasonidos (Branson-Sonifier
W-250, Branson Sonic Power Co, Danbury, EE.UU.)
durante 10 minutos. A continuación, los restos celulares se
separaron por centrifugación a 4ºC durante 30 minutos y se utilizó
el sobrenadante como extracto bruto en el test enzimático. La mezcla
de reacción del test enzimático contenía, en 1 ml de volumen de
reacción, Tris-HCl 60 mM (pH 7,2), KHCO_{3} 65 mM,
ATP 1 mM, MgCl_{2} 1,5 mM, acil-CoA 4 mM
(opcionalmente acetil-CoA o
propionil-CoA) y 4 mg de extracto bruto. Las tandas
del test se incubaron a 30ºC y se tomaron muestras de 100 \mul a
los 15, 30, 45 y 60 segundos y se determinó en ellas la
concentración de malonil- o bien metilmalonil-CoA,
mediante HPLC analítica (Kimura et al. (1997) Journal of
Bacteriology 179: 7098-7102). Como se muestra en la
Tabla 2, la cepa de C. glutamicum ATCC13032/pEK0accBCaccDA
muestra una alta actividad acil-CoA carboxilasa
tanto con acetil-CoA como con
propionil-CoA, mientras que la cepa de control tan
solo presenta una actividad acil-CoA carboxilasa
baja tanto con acetil-CoA como con
propionil-CoA.
| Actividad acil-CoA carboxilasa con el sustrato | ||
| Cepa | Acetil-CoA | Propionil-CoA |
| ATCC13032/pEK0accBCaccDA | 0,048 | 0,124 |
| ATCC13032/pEK0 | 0,011 | 0,018 |
Se adjuntan las siguientes figuras:
\bullet Figura 1: Mapa del plásmido
pZ1accDA.
\bullet Figura 2: Mapa del plásmido
pEK0accBCaccDA.
Claims (9)
1. Procedimiento para la preparación de
L-aminoácidos mediante fermentación de bacterias
corineformes, caracterizado porque se utilizan bacterias en
las que se ha sobre-expresado el gen accDA, o la
secuencia de nucleótidos que lo codifica, procedente de
Corynebacterium.
2. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque se utiliza una cepa transformada con un
vector plásmido, y el vector plásmido porta la secuencia de
nucleótidos procedente de Corynebacterium que codifica el gen
accDA.
3. Procedimiento según la reivindicación 2,
caracterizado porque se utilizan bacterias transformadas con
el vector plásmido pZ1accDA, depositado en Corynebacterium
glutamicum con el número DSM 12785.
4. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se utilizan
bacterias corineformes que producen ácido
L-aspártico, L-aspartina,
L-homoserina, L-treonina,
L-isoleucina y L-metionina.
5. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se utilizan
bacterias corineformes que producen L-lisina.
6. Procedimiento según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el gen accBC
procedente de Corynebacterium glutamicum se
sobre-expresa conjuntamente con el gen accDA
procedente de Corynebacterium.
7. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque se sobre-expresa
simultáneamente el gen dapA que codifica la dihidrodipicolinato
sintasa, procedente de Corynebacterium glutamicum.
8. Procedimiento según la reivindicación 1,
caracterizado porque simultáneamente se amplifica un
fragmento de ADN que induce resistencia a la
S-(2-aminoetil)-cisteína, procedente
de Corynebacterium glutamicum.
9. Procedimiento para la preparación fermentativa
de L-aminoácidos según una o varias de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque se llevan a cabo
las siguientes etapas:
- a)
- fermentación de las bacterias corineformes productoras del L-aminoácido deseado, en las cuales al menos está sobre-expresado el gen accDA procedente de Corynebacterium glutamicum;
- b)
- enriquecimiento del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de las bacterias y
- c)
- aislamiento del L-aminoácido deseado.
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