ES2218717T3 - Peptido portenciador de la vasopermeabilidad de la interleuquina-2 humana e inmunoconjugados del mismo. - Google Patents
Peptido portenciador de la vasopermeabilidad de la interleuquina-2 humana e inmunoconjugados del mismo.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN NUEVO PEPTIDO QUE MEJORA LA PERMEABILIDAD (PEP), EL CUAL ES UN FRAGMENTO DE LA INTERLEUQUINA-2. CUANDO DICHO PEPTIDO (PEP) SE UNE A UN VEHICULO DE SUMINISTRO QUE SE PUEDE DIRECCIONAR SOBRE UNA ZONA TUMORAL, PUEDE AUMENTAR LA CAPTACION POSTERIOR DE AGENTES ANTINEOPLASICOS O AGENTES DE FORMACION DE IMAGEN TUMORAL. DICHO PEPTIDO (PEP) PUEDE UNIRSE QUIMICAMENTE A UN ANTICUERPO MONOCLONAL PARA FORMAR UN INMUNOCONJUGADO. ALTERNATIVAMENTE, UN VECTOR DE EXPRESION ES DISEÑADO GENETICAMENTE PARA EXPRESAR UNA PROTEINA DE FUSION. DICHA PROTEINA DE FUSION TIENE UNA PORCION DE ENLACE CON ANTIGENO UNIDA A DICHO PEPTIDO PEP. DICHO PEPTIDO PEP ES MAS EFECTIVO CUANDO ESTA EN FORMA DE UN DIMERO ENLAZADO MEDIANTE UN PUENTE DISULFURO. EL PEPTIDO PEP DESCRITO ESTA PRACTICAMENTE LIBRE DE ACTIVIDAD CITOQUINA Y PRODUCE EFECTOS SECUNDARIOS TOXICOS MINIMOS SOBRE TEJIDOS NORMALES.
Description
Péptido potenciador de la vasopermeabilidad de la
interleuquina-2 humana e inmunoconjugados del
mismo.
La capacidad de los anticuerpos monoclonales
(MAb) de dirigirse y acumularse en los tumores se ha demostrado
ampliamente tanto en modelos animales como en el ser humano. Aunque
la especificidad de esta dirección varía con los diferentes MAb, la
cantidad de anticuerpo que se une al tumor, con respecto a la
cantidad que se une al tejido normal, ha sido suficientemente
grande como para permitir la obtención de imágenes claras de los
tumores usando marcadores radiactivos apropiados.
Sin embargo, para la terapia, la cantidad de
anticuerpo que se acumula en el sitio del tumor determina la carga
útil del radionúclido terapéutico, toxina o fármaco liberado en el
tumor. Ciertos estudios tempranos que miden el porcentaje de dosis
inyectada encontrada en tumores en pacientes después de la
inyección de MAb radiomarcados han demostrado valores extremadamente
bajos, del orden del 0,01-0,1%. (Véase, por
ejemplo, Goldenberg, D.M., Arch. Pathol. Lab. Med.
112: 580-587 (1988); Epenetos et al.,
Cancer Res. 46: 3183-3191 (1986)).
Considerando la resistencia relativa de la mayoría de los tumores
sólidos malignos a los fármacos y a la radioterapia, es
imprescindible mejorar sustancialmente la acumulación de MAb en el
sitio del tumor para obtener un índice terapéutico adecuado
requerido para la destrucción máxima del tumor y una terapia
sostenida.
Para mejorar la eficacia de la terapia con
anticuerpos monoclonales (MAb), varios investigadores han producido
inmunoconjugados compuestos de MAb y modificadores de la respuesta
biológica, tales como el factor de veneno de cobra (Vogel, C. y
Muller-Eberhard, H., Proc. Natl. Acad. Sci,
USA, 78(12): 7707-7711 (1981), Vogel, C.
et al., "Hematology and Blood Transfusion", en Modern
Trends in Human Leukemia VI, 29: 514-517 (1985),
Rolf Neth, Ed.),
formil-metionil-leucil-fenilalanina
(Obrist, R. Sandberg, A., Cellular Immunology 81:
169-174 (1983); Obrist, et al., Bent
53: 251 (1986)); e interferón-\gamma
(Flannery, G. et al., Eur. J. Cancer Clin. Oncol.,
20(6): 791-798 (1984)). Estos
estudios demuestran que los inmunoconjugados podrían dirigir
respuestas específicas, tales como efectos tumoricidas o
quimiotaxis, específicamente en el sitio de un tumor, sin toxicidad
demostrable en órganos y tejidos normales. Sin embargo, esta
estrategia para mejorar la eficacia de la terapia con anticuerpos
monoclonales no solucionó el problema de que sólo se acumulaban en
el sitio del tumor niveles extremadamente bajos de anticuerpos
monoclonales.
Otra estrategia para solucionar este problema es
alterar la fisiología de los vasos tumorales para mejorar la
captación de macromoléculas por parte del tumor. Esta estrategia
usaba MAb como vehículos para la liberación de péptidos y compuestos
vasoactivos en el tumor. Se unieron químicamente siete compuestos
vasoactivos diferentes, particularmente el factor de necrosis
tumoral á, la interleuquina-1\beta, la
interleuquina-2 (IL-2), fisalamina,
histamina, bradiquinina o leucotrieno, a un anticuerpo monoclonal
que se dirige a células que se están degenerando en regiones
necróticas de tumores. Aunque los siete inmunoconjugados mostraron
un aumento específico de captación del anticuerpo monoclonal en los
tumores, el conjugado IL-2/MAb proporcionó el mayor
porcentaje de dosis inyectada por gramo de tumor. (Khawll, et
al., Cancer 73: 824-831
(1994)).
La interleuquina-2 es un
candidato prometedor para los esfuerzos para mejorar el índice
terapéutico de la terapia con MAb. Es una proteína de 15.000 Daltons
producida por linfocitos T adyuvantes. Como un potente modulador
biológico del sistema inmune de los animales y del ser humano, ocupa
un papel central en el aumento de las respuestas inmunes mediadas
por células. Sus funciones principales incluyen la proliferación de
los linfocitos T (Morgan, D.A., et al., Science
193: 1007-1008, (1976)) y la generación de
destrucción tumoral no específica por macrófagos activados, células
asesinas activadas por linfoquinas (células LAK) (Grimm, E.A.,
et al., J. Exp. Md.
155:1823-1841 (1982)), y linfocitos
infiltrantes de tumor (células TIL) (Rosenberg, S.A., et
al., Science 233: 1318-1321
(1986)). Además de su actividad de citoquina, se ha demostrado que
la IL-2 produce permeabilidad vascular cuando se
administra sistémicamente causando la salida de fluidos
intravasculares a los espacios extravasculares (síndrome de fuga
capilar) (Rosenstein., M., et al., Immunology 137:
1735-1742 /1986); Ohkubo, C., et al.,
Cancer Res. 51: 1561-1563 (1991);
Edwards, M.J., et al., Cancer Res. 52:
3425-3431 (1992); Damie, N.K., et al., J.
Immunol. 142: 2660-2669 (1989)).
La IL-2 humana es una proteína
globular que consta de 133 aminoácidos y es similar en estructura a
la interleuquina-4 y al Factor Estimulador de
Colonias de Granulocitos/Macrófagos (GM-CSF) (Bazan,
J.F.; Science 257: 410-412 (1992)).
Los estudios estructurales de la IL-2 demuestran que
se compone de cuatro alfa hélices anfipáticas principales
dispuestas de forma antiparalela, constituyendo las caras hidrófobas
un núcleo hidrófobo muy estable (Bazan, J.F., (1992); McKay, D.B.,
Science 257: 412-413 (1992)). Además,
un enlace disulfuro es importante para la estabilidad de la
estructura terciaria y es esencial para la actividad biológica de
la IL-2 (Landgraft, B.E., Proteins 9:
207 (1991)). La pérdida de este enlace disulfuro, así como incluso
cambios minoritarios en la estructura primaria o secundaria anulan
la actividad de la citoquina IL-2, como se
demuestra por estudios de mutagénesis de localización dirigida
(Cohen et al., Science 234:
349-352 (1986)). Ciertos estudios previos han
demostrado que la estructura de la IL-2 nativa
intacta es un prerrequisito para la actividad biológica debido a la
estructura única del receptor de IL-2, que puede
ser de baja afinidad (cadena \alpha), de afinidad intermedia
(cadenas \beta y \gamma), o de alta afinidad (cadenas \alpha,
\beta y \gamma) (Smith, K.A., Blood 81:
1414-1423 1993)).
Se han usado fragmentos peptídicos de
IL-2 para generar anticuerpos monoclonales, que
pueden usarse en ensayos de diagnóstico y para identificar la unión
de IL-2 (documento EP 0 157 643). Además, se ha
identificado un pequeño fragmento de IL-2 que se une
pero que no activa el receptor de IL-2 (documento JP
2-209892). Por lo tanto, el fragmento bloquea la
actividad de citoquina de la IL-2, que requiere la
unión al receptor de IL-2.
Cuando la IL-2 se usa como agente
terapéutico sola o en combinación con otros agentes, tales como el
interferón-\alpha, LAK, TIL, o anticuerpos
monoclonales, se obtienen respuestas completas y parciales del
20-50% en ciertos neoplasmas humanos; incluyendo
linfoma, cáncer de células renales y melanoma (Lotze, M.T.,
"Interleukin-2", en Human Cytokines, Ed.
de Aggarwall y Guttermann, páginas 81-96 (1992);
Marincola, F.M., Biologic Therapy of Cancer Updates
4(3): 1-16 (1994); Thompson, J.A.,
et al., Hematologic Growth Factors
2(5): 351-355 (1994)). La actividad de
la IL-2 contra el cáncer se ha atribuido a su
capacidad de mediar una mayor resistencia inmune del hospedador,
principalmente por medio de la expansión de células T y la dirección
del tráfico de tales células T-activadas a los
tejidos. Sin embargo, la administración de IL-2
produce varios efectos sistémicos asociados con el síndrome de fuga
capilar, incluyendo la formación de edemas, hipotensión y disfunción
renal. Estos efectos secundarios limitan la administración de
mayores dosificaciones de IL-2 y pueden conducir a
la interrupción de la terapia.
Una estrategia para reducir los efectos tóxicos
de la administración sistémica de IL-2 sería dirigir
la IL-2 a un sitio tumoral usando un sistema de
liberación de anticuerpos. Por consiguiente, la IL-2
se ha incorporado satisfactoriamente en varios inmunoconjugados y
proteínas de fusión. Varios investigadores han demostrado que la
actividad de la citoquina IL-2 puede conservarse en
tales construcciones. Por ejemplo, Gilles et al (Proc.
Natl. Acad. Sci., USA 89, 1428-1432
(1992)) montaron una proteína de fusión obtenida por ingeniería
genética que constaba de un anticuerpo quimérico
anti-gangliósido GD2 e IL-2, que
podía aumentar la destrucción de células diana de melanoma que
expresaban GD2 por una línea de células TIL. De forma similar,
Savage et al. (Br. J. Cancer 67:
304-310 (1993)) construyeron una proteína de fusión
de anticuerpo monocatenario e IL-2 que retenía la
capacidad de unirse al antígeno así como a receptores de
IL-2 de baja afinidad y de estimular la
proliferación de linfocitos de sangre periférica humana. Además,
Naramura et al (Immunol. Lett. 39:
91-99 (1994)) demostraron que una proteína de
fusión obtenida por ingeniería genética, compuesta por
IL-2 y un anticuerpo monoclonal quimérico de
ratón/humano dirigido contra el factor de crecimiento epidérmico
humano, activaba células efectoras inmunes in vitro y
mejoraba la citotoxicidad celular contra células de melanoma
humanas.
En lugar de trabajar aprovechando las actividades
de citoquina de la IL-2, otra estrategia se centró
en utilizar su toxicidad. Por ejemplo, la IL-2 se ha
unido covalentemente a un anticuerpo monoclonal específico de tumor
(MAb/IL-2) para inducir una vasopermeabilidad
localizada en el sitio del tumor (Khawll, et al., (1994);
LeBerthon et al., Cancer Res. 51:
2694-2698 (1991)). La generación de un endotelio
tumoral propenso a las fugas por medio del pretratamiento con
MAb/IL-2 produjo un aumento de 3-4
veces en la captación del anticuerpo monoclonal, que no se observó
en los tejidos normales. A diferencia de los estudios previos
citados anteriormente (Gilles et al., Savage et al.,
y Naramura et al.), la química usada para asociar la
IL-2 a anticuerpos monoclonales destruyó la
actividad de citoquina de la IL-2 sin afectar a sus
efectos de vasopermeabilidad.
Considerados conjuntamente, estos estudios
resaltan el hallazgo de que la actividad de vasopermeabilidad de la
IL-2 parece ser una propiedad estable de la molécula
en comparación con la actividad de citoquina, que parece ser más
sensible a perturbaciones en la estructura terciaria de la
IL-2. Por consiguiente, sería ventajoso desarrollar
un péptido sintético de IL-2 que retuviera la
actividad biológica de la vasopermeabilidad, pero sin necesidad de
retener la actividad de citoquina de la molécula. Tal péptido podría
usarse para generar potentes inmunoconjugados vasoactivos, que
tengan menos toxicidad para los tejidos normales, y que puedan
usarse para mejorar la liberación de agentes terapéuticos y de
diagnóstico en tumores y otros tejidos.
La presente invención se refiere a péptidos que
aumentan la permeabilidad que satisfacen la necesidad de potentes
agentes vasoactivos, que mejoran la captación de agentes
terapéuticos y de diagnóstico en el sitio de un tumor. Un péptido
vasoactivo que tiene las características de la presente invención
comprende un fragmento de la interleuquina-2 que
carece sustancialmente de actividad de citoquina. El péptido
vasoactivo puede mejorar la permeabilidad vascular cuando se une a
una macromolécula de soporte, mientras que el péptido solo es
sustancialmente menos potente in vivo.
Una macromolécula de soporte particularmente
ventajosa funciona como un vehículo de liberación, que puede
localizarse en el sitio del tejido neoplásico. El péptido
vasoactivo y el vehículo de liberación se pueden unir por una
reacción química para formar un conjugado. Como alternativa, puede
modificarse por ingeniería genética un vector de expresión para
producir una proteína de fusión, que exprese un vehículo de
liberación unido a un péptido potenciador de la permeabilidad (PEP)
dentro de una línea celular adecuada.
Una realización preferida de la presente
invención comprende un PEP que tiene al menos un resto de cisteína,
que puede formar un enlace disulfuro con otro PEP. Una realización
más preferida comprende un dímero de PEP unido por tal puente
disulfuro.
Otra realización de la presente invención incluye
un péptido sintético, que tiene al menos 22 aminoácidos
correspondientes a los restos 37 a 58 de la IL-2.
Una realización más preferida incluye una secuencia de aminoácidos
con una longitud de al menos 37 aminoácidos, correspondiente a la
SEC ID Nº: 1.
Otras versiones de la invención comprenden un
conjugado o una proteína de fusión, donde el vehículo de liberación
es un anticuerpo monoclonal específico de tumor. Las versiones
preferidas de la invención incluyen conjugados y proteínas de
fusión, donde el vehículo de liberación se selecciona entre el
grupo compuesto por un anticuerpo murino, un anticuerpo humano y una
quimera de anticuerpos humanos y murinos. Las realizaciones más
preferidas incluyen un anticuerpo monoclonal seleccionado entre el
grupo compuesto por Lym-1, Lym-2,
TNT-1, TNT-2 y
TV-1.
Los conjugados y las proteínas de fusión de la
presente invención pueden usarse en un método para la terapia de
tejidos neoplásicos. El método terapéutico comprende administrar
una cantidad eficaz de un conjugado o proteína de fusión a un
hospedador portador de un tumor. La terapia también comprende
administrar un agente terapéutico antineoplásico, después o al mismo
tiempo que la administración del conjugado o la proteína de fusión.
Tal método terapéutico puede mejorar la captación de un agente
antineoplásico en el sitio del tumor. Un kit para uso durante el
método terapéutico contiene una proteína de fusión o conjugado
vasoactivo, y un agente antineoplásico.
De una manera similar, las proteínas de fusión y
los conjugados vasoactivos de la presente invención pueden usarse en
un método de diagnóstico para formar imágenes de tumores. El método
comprende administrar una cantidad eficaz de una proteína de fusión
o conjugado vasoactivo a un hospedador portador de un tumor. El
método también comprende administrar un agente para formar imágenes
de tumores, después o al mismo tiempo que la administración de la
proteína de fusión o conjugado. El método de diagnóstico puede
aumentar la cantidad de agente de formación de imágenes de tumores
que se acumula en el sitio de un tumor. Un kit de diagnóstico para
uso en el procedimiento de formación de imágenes de tumores contiene
una proteína de fusión o conjugado vasoactivo y un agente de
formación de imágenes de tumores apropiado.
Estas y otras características, aspectos y
ventajas de la presente invención se entenderán mejor con respecto
a la siguiente descripción, reivindicaciones adjuntas y dibujos
adjuntos, en los que:
la Fig. 1(A) muestra la secuencia de
aminoácidos (SEC ID Nº: 1) y la secuencia de ADN (SEC ID Nº: 2) de
PEP (aa22-58 de la IL-2 de longitud
completa), la Fig. 1(B) muestra un dibujo esquemático de la
IL-2, donde las hélices se muestran como cilindros
(McKay, D.B., (1992)), la Fig. 1(C) muestra un estereograma
de un trazo de esqueleto de átomos Ca de una molécula de
IL-2 (McKay, D.B., (1992)), la Fig. 1(D)
muestra un diagrama de cintas de un miembro de la familia de
cilindros dextrógiros de la estructura de IL-2
prevista (Cohen et al., (1986)), estando destacada la
secuencia de PEP y mostrándose el puente disulfuro en las Figs.
1(CB), 1(C) y 1(D);
la Fig. 2 muestra un diagrama esquemático de la
producción química de un (A) dímero y (B) monómero de péptido
potenciador de la permeabilidad (PEP);
la Fig. 3 muestra los resultados de estudios de
biodistribución con la IL-2 humana recombinante
(rhIL-2) e inmunoconjugados de PEP en ratones
desnudos portadores de tumores; donde los resultados se expresan
como (A) % de dosis inyectada/gramo o (B) relaciones de
tumor/órgano, (n=4); y
la Fig. 4 muestra los resultados de los estudios
de biodistribución con inmunoconjugados de rhIL-2,
PEP, monómero de PEP y dímero de PEP en ratones desnudos portadores
de tumores, donde los resultados se expresan como (A) % de dosis
inyectada/gramo y (B) relaciones de tumor/órgano.
Esta invención proporciona un péptido de
IL-2 activo, preferiblemente sintético, y su dímero,
que tiene actividad de vasopermeabilidad pero que carece de
actividad de citoquina. La invención también proporciona potentes
inmunoconjugados vasoactivos de estos péptidos con anticuerpos
específicos de tumores. Tales conjugados facilitan el suministro de
agentes terapéuticos y de diagnóstico en tumores y otros
tejidos.
La invención proporciona péptidos de
IL-2 vasoactivos, preferiblemente sin actividad de
citoquina. Estos nuevos péptidos incluyen porciones de la secuencia
de aminoácidos de la IL-2, secuencias que también
pueden deducirse a partir de la secuencia de nucleótidos descrita
por Taniguchi et al. (Nature 302:
305-310 (1983)), incorporada en este documento como
referencia. Los péptidos son preferiblemente sintéticos. Los
péptidos monoméricos también pueden aislarse a partir de la
IL-2 natural por técnicas conocidas.
Se han sintetizado varios péptidos potenciadores
de la permeabilidad (PEP) distintos que, cuando se unen a un
vehículo de liberación apropiado, son responsables de un aumento de
la permeabilidad vascular in vivo. Además, los péptidos
sintéticos desprotegidos por sí mismos tienen una corta duración
después de la administración intravenosa y tienen efectos
insignificantes sobre la permeabilidad vascular en relación con la
IL-2 inalterada. Por consiguiente, el péptido
vasoactivo debe unirse a un vehículo de liberación apropiado para
maximizar los efectos de vasopermeabilidad de los péptidos.
Preferiblemente, los péptidos, solos o unidos a un vehículo de
liberación, presentan una actividad de citoquina despreciable en
bioensayos de IL-2, tales como ensayos de
proliferación de células T y ensayos de citotoxicidad. Consideradas
conjuntamente, estas características del PEP proporcionan un agente
vasoactivo poderoso cuando se asocia a un vehículo de liberación
apropiado, pero minimizan cualquier efecto tóxico potencial en
tejidos normales.
La longitud del PEP preferiblemente es de al
menos 22 aminoácidos y más preferiblemente de aproximadamente 37
aminoácidos. Las realizaciones preferidas del péptido incluyen los
restos aminoacídicos números 37 a 58, 33 a 58, o 37 a 72 de la
secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 3. Estas realizaciones
preferidas presentan aproximadamente un 50% de los efectos de
vasopermeabilidad de un inmunoconjugado de IL-2
cuando se une a un vehículo de liberación apropiado. La realización
más preferida del PEP comprende los restos números 22 a 58 de la SEC
ID Nº: 3, es decir, la secuencia de aminoácidos entera de la SEC ID
Nº: 1. Esta realización de PEP presenta un óptimo de aproximadamente
un 100% de la vasopermeabilidad de un inmunoconjugado de
IL-2 cuando se une a un vehículo de liberación
apropiado.
En la Figura 1A se muestra la secuencia de
aminoácidos completa del fragmento peptídico de IL-2
que es el PEP más preferido (SEC ID Nº: 1), así como la
correspondiente secuencia de ADN (SEC ID Nº: 2). La localización de
este fragmento en la molécula de IL-2 intacta se
muestra esquemáticamente en tres diagramas, que se han usado por los
investigadores para representar la molécula de IL-2
(véanse las Figuras 1B, 1C y 1D).
Los efectos de permeabilidad de los péptidos de
la presente invención se optimizan adicionalmente cuando el PEP
comprende un dímero, preferiblemente unido por un enlace disulfuro.
Por consiguiente, una realización preferida del PEP incluye un
resto de cisteína y es capaz de formar un enlace disulfuro con otra
molécula de PEP. Una realización más preferida comprende un dímero
de PEP, que tiene un enlace disulfuro que conecta dos restos de
cisteína.
Las moléculas de PEP adquieren su capacidad para
producir un aumento localizado en la permeabilidad vascular cuando
se unen a vehículos de liberación, que pueden dirigir los péptidos
vasoactivos a dianas tumorales apropiadas. La unión de PEP con
vehículos de liberación apropiados, tales como anticuerpos
monoclonales específicos de tumores (MAb), puede realizarse
fácilmente por medios de conjugación química, como se describe más
adelante. Como alternativa, el PEP puede unirse al MAb específico
de tumor usando métodos de ingeniería genética para dar una
proteína de fusión PEP/MAb, también descrita más adelante. Además
del PEP, los conjugados o proteínas de fusión pueden incluir
moléculas de engarce apropiadas, por ejemplo, péptidos o reactivos
bifuncionales, que pueden solucionar perturbaciones de la estructura
terciaria del PEP o MAb.
Las propiedades potenciadoras de la permeabilidad
de los conjugados pueden determinarse por medio de experimentos
in vivo, tales como los descritos en el Ejemplo 7. En el
Ejemplo 8 pueden encontrarse ensayos in vitro ilustrativos
de la actividad de citoquina.
Un aspecto importante de la invención comprende
la potencia de un péptido vasoactivo cuando se une a un vehículo de
liberación específico de tumor. Los MAb son vehículos de liberación
ideales porque son homogéneos, reconocen determinantes específicos
y son relativamente biocompatibles. Los vehículos de liberación
preferidos incluyen MAb de ratón, conejo u otras especies de
mamífero. Más preferiblemente, la inmunogenicidad de los MAb no
humanos se evita por medio de la selección de MAb humanos o
quiméricos de humano-ratón como vehículos de
liberación.
Los anticuerpos monoclonales (MAb) adecuados para
uso en la invención comprenden no sólo los que tienen una
especificidad por los antígenos única para las células tumorales,
sino también los que tienen una especificidad compartida por
antígenos de tejidos normales. La propiedad esencial de estos
anticuerpos monoclonales es su eficacia como vehículos, que
preferentemente concentran agentes vasoactivos en el sitio del
tumor. Son anticuerpos monoclonales adecuados los que tienen una
especificidad por los antígenos que son más abundantes en el tejido
tumoral o se unen más fácilmente al tejido tumoral que al tejido
normal.
Algunos MAb contra antígenos tumores o antígenos
celulares normales, adecuados para uso en los inmunoconjugados,
están disponibles en el mercado (por ejemplo, Centocor, Malvern,
PA). Otros pueden prepararse por el procedimiento de hibridoma bien
establecido de Kohler y Milstein (Nature 256: 495 (1975)), y
ciertos kits comerciales facilitan este proceso, por ejemplo, HyBRL
Prep Kit (Bethesda Research Labs, Bethesda Research Lab, Bethesda,
MD).
La selección de líneas de células de hibridoma
que producen MAb adecuados se realiza dejando crecer en primer lugar
las células de hibridoma durante varios días, por ejemplo, en los
pocillos de placas de microtitulación. Después se ensayan los
sobrenadantes celulares con respecto a la presencia de un MAb contra
antígenos tumorales o celulares por medio de cualquier inmunoensayo
conveniente, por ejemplo, un ELISA. Las células que dan un resultado
positivo en el ensayo después se expanden en cultivos a mayor escala
para producir mayores cantidades de MAb. Después puede purificarse
una cantidad adecuada de MAb a partir de los sobrenadantes, por
ejemplo, usando cromatografía de afinidad de Proteína A.
En una realización preferida de la invención, se
usan MAb disponibles en el mercado específicos para células de
linfoma, por ejemplo, Lym-1 y Lym-2
(Techniclone, Corp., Tustin, CA).
En otra realización preferida, se usan MAb
específicos para antígenos intracelulares accesibles en células en
degeneración, por ejemplo, TNT-1 y
TNT-2 (Techniclone, Corp., Tustin, CA).
En otra realización preferida, se usan MAb
específicos para vasos tumorales, por ejemplo TV-1
(Epstein, A.L., Cancer Res. 55:
2673-2680 (1995), incorporado este documento como
referencia).
El MAb del inmunoconjugado puede ser un
anticuerpo entero intacto, la isoforma HL monovalente, la porción
F(ab)'2 de un anticuerpo o fragmentos Fab de anticuerpos. La
eliminación de todo o parte de la porción Fc de la molécula del
anticuerpo puede facilitar su uso eliminando sitios o dominios que
interaccionan con componentes no tumorales tales como receptores de
Fc o el complemento, dejando intactos los sitios de unión a los
antígenos. Los fragmentos de anticuerpo tales como Fab, HL y
F(ab')2, que tienen 1/3, 1/2 y 2/3 del peso del anticuerpo
entero, respectivamente, tienen una mayor capacidad de difundir a
través del tejido intersticial y al interior del tumor. Sin embargo,
los fragmentos Fab, HL y F(ab')2 se eliminan de la
circulación más rápidamente. Los fragmentos Fab pueden prepararse
por digestión del anticuerpo entero con papaína, o por digestión
del anticuerpo entero con pepsina para dar fragmentos
F(ab')2, seguido de digestión de los enlaces disulfuro
intercatenarios para producir fragmentos univalentes.
Además, los vehículos de liberación adecuados
deben retener su capacidad de unirse a un antígeno después de la
conjugación química con los péptidos vasoactivos. La
inmunorreactividad de los MAb, antes y después de la conjugación con
los péptidos, puede determinarse por cualquier inmunoensayo
adecuado, tal como el radioinmunoensayo descrito en el Ejemplo 6.
Preferiblemente, se usan in vivo inmunoconjugados que tienen
una inmunorreactividad mayor del 75%, en comparación con el
anticuerpo no conjugado.
La asociación estructural entre el MAb y el
péptido vasoactivo, así como el método químico por el cual se unen,
debe elegirse de forma que la capacidad de unión del MAb y la
actividad biológica del péptido, cuando se unen en el conjugado, se
vean comprometidas mínimamente. Como apreciarán los especialistas en
la técnica, hay varios métodos de conjugación química adecuados,
incluyendo los siguientes procedimientos.
Las carbodiimidas (CDI), que son anhídridos de
urea, pueden producir enlaces cruzados entre el anticuerpo y el
péptido, independientemente de la orientación de cada molécula. Los
conjugados se obtienen por condensación del anticuerpo y el péptido
en condiciones ácidas con CDI. Este método proporciona un medio
rápido y sencillo de conjugación.
El
3-(2-piridiltio)propionato de
N-succinimidilo (SPDP) es un reactivo
heterobifuncional que introduce grupos tiol en el extremo amino de
proteínas, y se ha usado en varios inmunoconjugados.
Los péptidos también pueden acoplarse a
anticuerpos usando el reactivo bifuncional,
1-carboxilato de
succinimidil-4-(N-maleimido
metil)ciclohexano (SMCC).
La N-hidroxisuccinimida (NHS)
activa un grupo COOH terminal, por ejemplo, de un péptido, para
formar un derivado de éster activo que puede acoplarse
covalentemente a la proteína del anticuerpo monoclonal.
Un método alternativo para la conjugación de
péptidos a proteínas usa glutaraldehído como reactivo para el
acoplamiento. Al aldehído se le unen covalentemente grupos
nucleófilos tales como grupos sulfhidrilo y amino formando una base
de Schiff. Posteriormente, los grupos glutaraldehído activos en
exceso pueden bloquearse por medio de la adición de glicina, y el
exceso de moléculas de péptido y de glicina se retiran por
diálisis.
Las proteínas de fusión modificadas por
ingeniería genética, construidas por la clonación de las secuencias
génicas de cadenas ligeras de anticuerpos y cadenas pesadas
fusionadas a secuencias que codifican péptidos vasoactivos,
presentan una alternativa atractiva a la unión química de péptidos
vasoactivos a MAb. Estas construcciones pueden adaptarse para que
sean menos inmunogénicas que los MAb de origen no humano. Además,
las proteínas de fusión permiten que cantidades molares definidas de
monómero de PEP o, como alternativa, al menos dos secuencias de PEP
unidas en tándem, se unan a sitios específicos del MAb.
Como ejemplo, se aísla ARNm de células de
hibridoma que expresan un anticuerpo monoclonal. A partir de este
ARNm, se transcribe de forma inversa el ADNc y se amplifica por
medio de la reacción en cadena de la polimerasa. Las regiones
específicas que codifican las cadenas pesadas y ligeras de una
inmunoglobulina, por ejemplo, regiones variables y/o constantes,
pueden amplificarse por medio de la selección de cebadores
oligonucleotídicos apropiados que se dirijan a la región o regiones
deseadas. El ADNc se secuencia, se mapea por medio de endonucleasas
de restricción y se clona en un vector de transferencia apropiado.
Como mínimo, las secuencias de inmunoglobulina que codifican un
dominio de unión a antígenos, es decir, las regiones variables de
cadena ligera y las regiones variables de cadena pesada, están
contenidas en el vector de transferencia. Además, una porción
truncada o de longitud completa de la región constante que codifica
la inmunoglobulina original u otra inmunoglobulina pueden unirse en
fase con la región variable para permitir la expresión de las
regiones unidas. Por ejemplo, una realización preferida de la
invención codifica un MAb quimérico, compuesto por regiones
variables murinas unidas a sus correspondientes regiones constantes
humanas de las cadenas pesadas y ligeras.
Una secuencia de ADN apropiada, que codifica al
menos un péptido vasoactivo, después se une próxima a una región de
un gen de inmunoglobulina que codifica el extremo carboxi,
preferiblemente una región constante, más preferiblemente la región
constante de una cadena pesada. El mejor sitio para unir cada
péptido vasoactivo puede ser diferente y puede determinarse
fácilmente por métodos experimentales. Por ejemplo, entre el PEP y
el extremo carboxi del gen de inmunoglobulina puede no insertarse
ningún engarce o pueden insertarse diversas longitudes de engarcen
que codifican aminoácidos. Además, pueden unirse dos o más
secuencias de PEP unidas en tándem a la región o regiones apropiadas
de un gen de inmunoglobulina. Los productos de expresión resultantes
después pueden ensayarse con respecto a la actividad biológica.
El gen modificado por ingeniería genética
completado para la proteína de fusión se inserta en un vector de
expresión, que puede introducirse en células eucariotas o
procariotas por métodos de transfección de genes, por ejemplo,
electroporación o el método de fosfato cálcico. El producto de
proteína de fusión después puede expresarse en cultivos celulares a
gran escala y purificarse.
Una proteína de fusión o inmunoconjugado
vasoactivo satisfactorio maximizará la eficacia clínica de la
diagnosis y terapia basadas en anticuerpos monoclonales.
Clínicamente, la proteína de fusión o inmunoconjugado vasoactivo se
administra antes o junto con un agente de inmunodiagnóstico,
quimioterapéutico o inmunoterapéutico inyectado por vía intravenosa.
La inducción de un cambio de permeabilidad localizada dentro de la
vasculatura del tumor hará que el tumor sea más susceptible a la
penetración y mejorará la liberación de fármacos, toxinas,
radioisótopos, anticuerpos monoclonales o conjugados de anticuerpos
monoclonales con fármacos, toxinas o radioisótopos en el sitio del
tumor.
La conveniencia de anticuerpos específicos de
tumores, inmunoconjugados y proteínas de fusión obtenidas por
ingeniería genética para uso in vivo se determina por su
biodistribución, localización celular, unión selectiva y velocidad
de eliminación del hospedador del tumor, o un modelo animal del
hospedador del tumor. Los estudios para evaluar esta idoneidad se
realizan convenientemente por medio de MAb marcados. Por ejemplo,
puede realizarse una radioyodación de restos de anticuerpo por el
método de cloramina T modificado del Ejemplo 6. Un hospedador de un
tumor se trata con un inmunoconjugado, una proteína de fusión o se
deja sin tratar. Después de inyectar el MAb marcado en el
hospedador del tumor, la eficacia de la proteína de fusión o
conjugado vasoactivo puede evaluarse por medio de métodos
apropiados de formación de radioimágenes, biodistribución, estudios
histológicos y métodos autorradiográficos.
El tiempo requerido para producir el efecto
vasoactivo máximo depende del conjugado específico o proteína de
fusión elegida. Sin embargo, puede determinarse experimentalmente un
intervalo óptimo entre el momento de administración del agente
vasoactivo y el agente terapéutico o de diagnóstico. Por ejemplo,
la capacidad de un MAb radiomarcado de concentrarse selectivamente
en el sitio de un tumor puede determinarse por medio de formación de
radioimágenes. Se obtienen imágenes de centelleo gamma (100.000 cpm)
posteriores a partir de un hospedador anestesiado en días alternos
después de la inyección del MAb radiomarcado, usando una cámara de
centelleo gamma con un colimador de agujero de alfiler. La cámara
preferiblemente se conecta a un sistema informático. Para
cuantificar los datos, se realiza un recuento de un patrón de
^{131}I apropiado con la misma actividad.
También pueden realizarse estudios de
biodistribución usando modelos animales, donde el hospedador animal
se sacrifica a un tiempo óptimo, como se determina por los estudios
de formación de imágenes descritos anteriormente. Después se recogen
la sangre, los órganos principales y los tejidos tumorales, se
pesan y se cuentan para determinar la biodistribución del MAb.
Además, el tejido tumoral puede fijarse e incluirse en bloques, y
las secciones de tejido pueden examinarse por autorradiografía para
determinar la localización del MAb radiomarcado unido en el
tumor.
Se prevé que el tiempo mínimo entre la
administración de la proteína de fusión o conjugado vasoactivo y la
administración de un agente de diagnóstico o terapéutico es de al
menos aproximadamente 20 minutos, y el tiempo máximo es de
aproximadamente 72 horas.
La dosis de la proteína de fusión o
inmunoconjugado vasoactivo a administrar se basa en criterios de
juicio médico y experiencia, tanto objetivos como subjetivos. Sin
embargo, una medida adecuada de una dosis eficaz es la cantidad que
mejora la eficacia clínica de la terapia, o exactitud de la
diagnosis, en un grado estadísticamente significativo. Pueden
realizarse comparaciones entre los hospedadores de los tumores
tratados o no tratados a los que se administran dosis equivalentes
de los agentes de diagnóstico o terapéuticos. Cuando un agente de
diagnóstico o terapéutico es tóxico para el tejido normal, una
dosis eficaz de proteína de fusión o conjugado vasoactivo es una
que minimice tales efectos tóxicos.
Un agente terapéutico preferido es un MAb
clínicamente útil. Además, un agente terapéutico antineoplásico
puede ser un agente tumoricida, tal como un radioisótopo, un fármaco
quimioterapéutico o una toxina. Además, el MAb puede unirse a un
agente tumoricida, por ejemplo, un radioisótopo, fármaco
quimioterapéutico o toxina.
Un agente de diagnóstico puede usarse para formar
imágenes del tumor y se compone de un MAb que tiene especificidad
por un tumor, que tiene un marcador detectable in vivo.
Preferiblemente, este marcador comprende un isótopo radioactivo.
Además del marcador detectable, el agente de formación de imágenes
del tumor también puede unirse a un agente citotóxico, tal como un
radioisótopo, fármaco o toxina.
En otra versión de la invención, la proteína de
fusión o inmunoconjugado vasoactivo se asocia a un agente
tumoricida. Por consiguiente, el método terapéutico es un
procedimiento simplificado que comprende administrar a un hospedador
portador de un tumor una cantidad eficaz de una proteína de fusión o
conjugado vasoactivo, que está asociada a un agente
quimioterapéutico, toxina o radioisótopo.
De manera similar, la proteína de fusión o
inmunoconjugado vasoactivo puede unirse directamente a un marcador
detectable, tal como un radioisótopo. Por consiguiente, el método de
diagnóstico puede comprender administrar simplemente a un hospedador
portador de un tumor el inmunoconjugado vasoactivo marcado en una
cantidad suficiente para dar una imagen clara del tumor.
Las versiones previas de la presente invención
tienen muchas ventajas incluyendo la capacidad de aumentar la
permeabilidad vascular en el sitio del tejido neoplásico o de otro
tejido enfermo. Además, las versiones previas de la invención
proporcionan potentes agentes vasoactivos que mejoran la captación
de agentes terapéuticos y de diagnóstico en el sitio de un tumor con
un mínimo de efectos secundarios tóxicos en los tejidos
normales.
Todos los agentes químicos, tales como
N-hidroxisuccinimida (sulfo-NHS),
meto-p-toluenosulfonato de
1-ciclohexil-3-(morfolinoetil)carbodiimida
(CDI) y cloramina T se adquirieron en Sigma Chemical Co. (St. Louis,
MO). Las yodo-perlas se adquirieron en Pierce
(Rockford, IL). Todos los disolventes fueron de calidad analítica y
se usaron como se adquirieron. El yodo-125 se obtuvo
como yoduro sódico en una solución de hidróxido sódico 0,05 N (ICN
Biomedicals, Irvine; CA). Las muestras radiactivas se midieron
usando un contador 1282 Compugamma (LKB Instruments, Pleasant Hill,
CA) o un calibrador de dosis CRC-7 (Capintec Inc.,
Pittsburgh, PA).
Los anticuerpos monoclonales murinos
Lym-1 (IgG_{2a}) y TNT-1
(IgG_{2a}) se obtuvieron en Techniclone, Corp.
(Tustin, CA). Lym-1 se dirige contra una variante del antígeno HLA-Dr expresado en la superficie celular de linfocitos B humanos y linfomas malignos (Epstein, A.L., et al., Cancer Res. 47: 830-840 (1987)), mientras que TNT-1 reconoce un epítopo de nucleohistonas expresado en el núcleo de células de mamífero (Epstein, A.L., et al., Cancer Res. 48: 5842-5848 (1988)). Las concentraciones de proteína de las preparaciones de anticuerpos se estimaron por espectroscopía óptica a 280 nm. La IL-2 humana recombinante (rhIL-2) se obtuvo de Hoffman La-Roche (Nutley, NJ) o Chiron (Emeryville, CA). La albúmina de suero bovina (HSA) se obtuvo a partir de la Sigma Chemical Company.
(Tustin, CA). Lym-1 se dirige contra una variante del antígeno HLA-Dr expresado en la superficie celular de linfocitos B humanos y linfomas malignos (Epstein, A.L., et al., Cancer Res. 47: 830-840 (1987)), mientras que TNT-1 reconoce un epítopo de nucleohistonas expresado en el núcleo de células de mamífero (Epstein, A.L., et al., Cancer Res. 48: 5842-5848 (1988)). Las concentraciones de proteína de las preparaciones de anticuerpos se estimaron por espectroscopía óptica a 280 nm. La IL-2 humana recombinante (rhIL-2) se obtuvo de Hoffman La-Roche (Nutley, NJ) o Chiron (Emeryville, CA). La albúmina de suero bovina (HSA) se obtuvo a partir de la Sigma Chemical Company.
Para los experimentos in vivo, se usaron
la línea de células de linfoma de Burkitt de Raji y la línea de
células de carcinoma cervical humano ME-180 como se
ha descrito previamente (Chen, F, -M., et al., J. Nucl.
Med. 31: 1059-1066 (1990)). Las dos
líneas celulares se cultivaron en medio RPMI-1640
que contenía suero de ternero fetal al 10% (Hyclone Laboratories,
Logan, UT), penicilina G (100 U/ml), y sulfato de estreptomicina
(100 \mug/ml). Para los estudios de citotoxicidad in vitro
se usaron la línea celular de eritroleucemia humana K562, la línea
celular de linfoma de Burkitt de Daudi, y la línea celular de
mastocitoma P815 de ratón. Todas las líneas celulares se cultivaron
en un incubador con un 5% de CO_{2} bien humidificado a 37ºC y se
pasaron rutinariamente dos veces por semana.
Los péptidos se sintetizaron por el método de
Merrifield (Merrifield, B., Science 232:
341-347 (1986)) usando un sintetizador de péptidos
de una columna (Modelo 430A, Applied Biosystems, Foster City, CA).
Los péptidos protegidos se montaron por una síntesis en fase sólida
y se escindieron por ácido trifluoroacético (Fields, C.G.; et
al., Peptide Res. 4: 95-101 (1991);
King, D.S.; et al., Int. J. Peptide Prot. Res.
36: 255-266 (1990)). Los péptidos después se
purificaron por exclusión molecular en Sephadex
G-10 en ácido acético al 30% y se liofilizaron. En
la tabla 1 se proporciona una lista de los diferentes fragmentos
peptídicos de la IL-2 generados por estos
procedimientos (véase más adelante).
Se radioyodó IL-2 recombinante y
se usó en pequeñas cantidades durante reacciones de acoplamiento
posteriores para determinar la unión de IL-2 a
anticuerpo o a HSA. La IL-2 liofilizada se disolvió
en suficiente agua para dar una concentración final de 2 mg/ml. Se
añadieron 50 \mul de solución de IL-2 (100
\mug), 100 \muCi de yodo-125 sin vehículo y 5
\mul de cloramina T (10 mg/ml) en agua a 100 \mul en tampón
fosfato 0,1 M; pH 7,4, y la reacción se dejó avanzar durante 1
minuto a temperatura ambiente. La reacción se inactivó con 100
\mul de resina de intercambio aniónico (AG1=X8;
Bio-Rad Laboratories; Richmond, CA) en PBS. Después
de 1 minuto, la suspensión se extrajo y se filtró en una unidad de
centrífuga Spin-X (Costar, Cambridge, MA) para
retirar la resina.
La reacción de acoplamiento se inició por la
adición de 500 \mul de IL-2 (2 mg/ml) a 500
\mul de anticuerpo (10 mg/ml), CDI (14 mg) y
sulfo-NHS (8 mg) para dar un volumen total de 1,2
ml en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4. La reacción se incubó durante
una noche a 4ºC. Después de la centrifugación, el anticuerpo
acoplado soluble se cromatografió en una columna se Sephadex
G-100 calibrada con azul dextrano. La radiactividad
y los picos de anticuerpo coeluyeron, lo cual indica que la
IL-2 se había unido al anticuerpo. A partir de la
concentración de anticuerpo y la radiactividad, se calculó que a
cada anticuerpo se unía aproximadamente una molécula de
IL-2. Estos inmunoconjugados retenían un mínimo del
75% de la reactividad de unión al anticuerpo determinada por un
ensayo de unión en células vivas (Epstein et al., (1987);
Gaffar, S.A., et al., J. Immunoassay 12:
1-4 (1991)).
También se radioyodaron porciones de los
fragmentos peptídicos de IL-2, preparados de acuerdo
con el Ejemplo 1, antes de la conjugación con el anticuerpo o HSA
usando un procedimiento ligeramente diferente. Los fragmentos
peptídicos liofilizados se disolvieron en etanol acuoso al 10% hasta
una concentración final de 1 mg/ml. A una solución de 100 \muCi de
Na^{125}I en NaOH 0,1 N neutralizado con un volumen equivalente
de ácido acético 0,1 M se le añadieron cien \mul de esta solución.
La mezcla se agitó vigorosamente y se añadieron dos
yodo-perlas. La reacción se dejó avanzar durante 1
hora. después de la incubación, la mezcla se extrajo en una jeringa
y las yodo-perlas se lavaron dos veces con etanol
acuoso al 100%. Los líquidos de lavado reunidos se purificaron en
una columna corta de Sephadex G-10 (eluida con PBS,
pH 7,4).
La pureza de los fragmentos radiomarcados se
determinó por cromatografía de capa fina instantánea (ITLC)
analítica. Las tiras de la ITLC (2 x 20 cm) que tenían fibras
impregnadas con gel de sílice (Nº 61886, Gelman Sciences, Ann Arbor,
MI) se activaron por calentamiento a 110ºC durante 15 minutos antes
del uso, se salpicaron con 1 \mul de muestra, se secaron al aire,
se cortaron por la mitad y se contaron para determinar la
radiactividad unida y no unida al fragmento. En este sistema, el
yodo libre migra con el disolvente, mientras que los fragmentos
peptídicos marcados permanecen cerca del origen. En todos los
casos, más del 90% de la radiactividad estaba asociada con los
fragmentos peptídicos de IL-2. Los diferentes
fragmentos de IL-2 radiomarcados se usaron en
pequeñas cantidades en la mezcla de reacción para averiguar la
unión de los fragmentos peptídicos al anticuerpo como se indica a
continuación.
Las reacciones de acoplamiento se iniciaron
añadiendo diferentes fragmentos peptídicos al anticuerpo o HSA, CDI
y sulfo-NHS en una relación de 1:2:50:50 en peso
para dar un volumen total de 0,6 ml en tampón fosfato 0,1 M, pH 7,4.
Las reacciones se incubaron durante una noche a 4ºC. Después de la
centrifugación, el anticuerpo acoplado soluble se cromatografió en
una columna G-100 calibrada con azul dextrano. A
partir de la concentración de anticuerpo y la radiactividad, se
calculó que a cada anticuerpo o molécula de HSA se unía
aproximadamente una mitad de la molécula del fragmento peptídico de
IL-2.
Un método alternativo usado para la conjugación
de péptidos a proteínas usaba glutaraldehído como reactivo para el
acoplamiento. Al aldehído se le unen covalentemente grupos
nucleófilos tales como grupos sulfhidrilo y amino formando una base
de Schiff. Se mezclaron dos mg de proteína (10 mg/ml en PBS, pH 8,0)
con 2-3 mg de péptido (5 mg/ml en H_{2}O) a
temperatura ambiente. El pH se mantuvo a 8,0 con la adición de NaOH
diluido. A la mezcla de reacción se le añadieron 100 \mul de una
solución al 0,02% de glutaraldehído reciente con mezcla durante
9-10 minutos y la mezcla se almacenó durante una
noche a 4ºC. Los grupos glutaraldehído activos restantes se
bloquearon por medio de la adición de glicina 0,2 M (0,2 ml) durante
2 horas. El exceso de péptido y de moléculas de glicina se retiró
por diálisis.
Los fragmentos peptídicos conjugados se
analizaron por cromatografía líquida de proteínas rápidas (FPLC)
realizada a temperatura ambiente usando un sistema de Pharmacia
(Pharmacia, Piscataway, NJ) equipado con dos bombas de disolvente
P-50, un inyector de válvula de motor
MV-8, un monitor UV de una sola trayectoria, un
controlador automático LLG-500 y un registrador de
diagramas de doble estilete REC-482. Los conjugados
se eluyeron a partir de una columna pre-rellenada
de superose 12 HR (Pharmacia) usando PBS 0,1 M, pH 7,2 como sistema
disolvente, a un caudal de 1,0 ml/min. La absorbancia UV del eluato
de FPLC se detectó a 280 nm. Los anticuerpos conjugados aparecieron
a 650 segundos y los fragmentos no unidos a 1170 segundos. Los
inmunoconjugados retenían un mínimo del 75% de reactividad de unión
al anticuerpo, determinado por un ensayo de unión celular indirecto
(Epstein et al., (1987); Gaffar et al. (1991)).
El dímero de PEP se preparó uniendo el péptido
monovalente a través de la cisteína intrínseca (aminoácido nº 58)
para formar un enlace disulfuro como se muestra diagramáticamente en
la Fig. 2A. La forma tiol de PEP se regeneró por tratamiento con
2-mercaptoetilamina 10 mM durante 30 minutos,
seguido de exclusión molecular en una columna de Sephadex
G-10 equilibrada con fosfato sódico 0,1 M, pH 6,8.
El péptido después se incubó durante 16 horas a temperatura ambiente
a pH 9 por medio de la adición de NaOH 5 M (Figura 2). El dímero de
péptido deseado se purificó de la mezcla de reacción por exclusión
molecular en una columna de Sephadex G-25
equilibrada con tampón fosfato, pH 7,4. Se encontraron rendimientos
de dímero de PEP del 90% en estas condiciones sin la formación de
especies de alto peso molecular. El dímero de PEP se acopló al
anticuerpo usando las condiciones descritas anteriormente y se
descubrió que tenía aproximadamente el mismo rendimiento de
conjugación que los otros péptidos.
La estrategia para sintetizar
N-fenilmaleimida se muestra esquemáticamente en la
Figura 2B. Se disolvió anhídrido maleico (1,33 g, 13,6 mmol) en
tolueno (15 ml) y se añadió anilina (1,3 g, 13,9 mmol) en tolueno
(20 ml) gota a gota durante un periodo de 20 minutos. La mezcla de
reacción se agitó durante 45 minutos a temperatura ambiente y
después se enfrió en un baño de agua enfriada con hielo. El producto
precipitado, ácido N-fenilmaleámico, se recogió por
filtración, se lavó con hexano y se secó durante una noche
(rendimiento de 2,1 g).
El análisis de resonancia magnética nuclear de
protón (^{1}H) (RMN) del producto se registró en un instrumento
Perkin-Elmer R-24 de 60 MHz Hitachi.
Las concentraciones de la muestra de RMN fueron aproximadamente un
10% (p/v) en el disolvente indicado. Los desplazamientos químicos
(ppm) se presentan campo abajo (\delta) con respecto al patrón
interno tetrametilsilano (TMS). Los siguientes resultados
verificaron que el producto era ácido
N-fenilmaleámico: ^{1}H RMN
(Me_{2}-SO-d_{6}; \delta);
10,3 (1H, singlete, OH), 7-7,8 (5H,
multiplete, 5 arilo CH), 6,4 (2H, doblete de dobletes,
COCH=CHCO).
Se añadió ácido N-fenilmaleámico
(2,0 g, 10 mmol) y la solución se agitó a 120ºC. El precipitado de
color pardo se filtró y se evaporó a sequedad a presión reducida y
el residuo se disolvió en éter dietílico. La mezcla de éter se
filtró y el filtrado se evaporó de nuevo a sequedad. El residuo
obtenido se aplicó a una columna de cromatografía ultrarrápida (30
x 200 mm) de Kieselgel 60, malla 230-400 (Nº 9385,
E. Merck, Darmstadst, Alemania). La elución con 500 ml de acetato
de etilo/hexano (1:3) produjo cincuenta fracciones. Las fracciones
25-40 se combinaron para proporcionar
N-fenilmaleimida pura (rendimiento de 1,5 g); TLC
(EtOAc/hexano, 1:3) R_{f} 0,45. ^{1}RMN (CDCl_{3}, \delta):
7-7,8 (5H, multiplete, 5 aril CH); 6,8 (2H,
singlete, COCH=CHCO).
El aislamiento y la identificación del producto
se realizaron por cromatografía líquida de alta resolución (HPLC)
usando un Beckman System Gold Instrument (Beckman Instruments,
Fullerton, CA) equipado con dos bombas de disolvente 110 B, una
válvula de inyector 210A, un detector de absorbancia programable 166
y un módulo de interfaz analógico 406. Se eluyó una columna de fase
inversa Zorbax GF-250 (DuPont, Wilmington, DE) a un
caudal de 1 ml/min con acetonitrilo al 100%. La detección de los
picos se determinó por absorbancia UV a 254 nm. El material de
partida, ácido N-fenilmaleámico apareció a 220
segundos seguido del producto deseado a 340 segundos.
La conjugación de
N-fenilmaleimida al PEP se realizó por la adición de
un exceso molar de 2,5 veces de N-fenilmaleimida (en
15 \mul de metanol) a PEP disuelto en tampón citrato 0,1 M, pH
6,0. La reacción se dejó avanzar durante 30 minutos a 37ºC. La
mezcla de reacción que contenía el conjugado de PEP- fenilmaleimida
se expuso a mercaptoetilamina 15 mM para reducir cualquier enlace
disulfuro que pudiera haberse formado durante la reacción y se dejó
reaccionar durante una noche. El conjugado de reacción final se
purificó por exclusión molecular en una columna de Sephadex
G-10 que se eluyó con PBS 0,01 M, pH 7,2. Al igual
que con el dímero, el acoplamiento del monómero de
PEP-fenilmaleimida al anticuerpo se realizó como se
ha descrito anteriormente y produjo aproximadamente el mismo
rendimiento de conjugación.
Se radiomarcaron fragmentos F(ab')_{2}
de anticuerpos monoclonales Lym-1 y
TNT-1 con yodo-125 usando un método
de cloramina T modificado. En resumen, la reacción de yodación se
inició añadiendo cloramina T en una relación de pesos de 10:1
(anticuerpo:cloramina T). La reacción se inactivó por medio de la
adición de metabisulfito sódico y la mezcla se cromatografió en una
columna de gel Sephadex G-25 que previamente se
había equilibrado con PBS que contenía un 1% de albúmina de suero
bovino (Sigma). Se recogieron fracciones de anticuerpos monoclonales
marcados con ^{125}I y se diluyeron con el mismo tampón hasta un
volumen apropiado para inyección.
Los anticuerpos radiomarcados se analizaron
usando un sistema ITLC analítico como se describe en el Ejemplo 3.
Todas las preparaciones revelaron la misma pureza radioquímica
(\geq98%).
La inmunorreactividad de preparaciones de
Lym-1 radiomarcadas se controló por un
radioinmunoensayo de células vivas. Se lavaron células Raji dos
veces en PBS frío que contenía 1 mg/ml de albúmina de suero bovino y
azida sódica al 0,02%. Las células (5 x 10^{5}) resuspendidas en
100 \mul de tampón de lavado se introdujeron en pocillos de
microtitulación (Immulon Removawell Strips; Dynatech Labs, Inc.,
Alexandria, VA) por medio de una pipeta. Las placas de
microtitulación se pre-trataron la noche previa con
BSA (10 mg/ml) en PBS con azida para impedir que las soluciones de
anticuerpo se unieran a los pocillos. Después se añadieron
Lym-1 radiomarcado o inmunoconjugados de
Lym-1 (100.000 cpm/pocillo) en un volumen de 100
\mul/pocillo y las placas se incubaron durante 30 minutos a
temperatura ambiente con agitación constante. Las placas después se
lavaron 4 veces por centrifugación a 1.000 rpm durante 5 minutos y
aspirando los sobrenadantes con un colector micromatic de 12 puntas,
y después resuspendiendo las células en 200 \mul de tampón de
lavado usando una pipeta Titertek Multichannel (Flow Labs, Mc Lean,
VA). Los pocillos después se separaron mecánicamente y se contaron
en un contador gamma para cuantificar la cantidad de marcador unido
a las células.
Se descubrió que aproximadamente un 80% de las
preparaciones de Lym-1 F(ab')2 radiomarcadas
se unía a las células Raji por medio de un radioinmunoensayo de
células vivas. El TNT-1 F(ab')2 radiomarcado
tenía una inmunorreactividad de \geq 80% en un ensayo de células
tratadas con paraformaldehído-acetona desarrollado
en nuestro laboratorio (Gaffar et al., (1991)).
Se ensayaron inmunoconjugados de
TNT-1 en el sistema de carcinoma cervical humano
ME-180 para demostrar la dirección de
inmunoconjugados de TNT-1 a antígenos intracelulares
accesibles en células tumorales (muertas) permeables. La línea
celular de carcinoma cervical humano ME-180 se
heterotrasplantó en el muslo izquierdo de ratones desnudos atímicos
hembra de 6 semanas de edad (Harlan Sprague Dawley, San Diego, CA)
por inyección subcutánea de un inóculo de 0,2 ml que constaba de
10^{7} células. Los tumores se dejaron crecer durante
3-4 semanas hasta que alcanzaron un diámetro de
aproximadamente 1 cm.
Los inmunoconjugados de Lym-1 se
ensayaron en el modelo de linfoma de Raji para demostrar la
dirección a los antígenos de la superficie celular. La línea de
células de linfoma de Raji se usó para producir heterotrasplantes en
ratones desnudos hembra de 6 semanas de edad por medio de la
inyección subcutánea de un inóculo de 0,2 ml que constaba de 4 x
10^{7} células Raji y 4 x 10^{6} células de alimentación de
fibroblastos fetales humanos en el muslo izquierdo. Tres días antes
de la inyección, los ratones se irradiaron con 400 rads usando un
irradiador de cesio para asegurar un alta proporción de captación
de las células implantadas. Los tumores se cultivaron durante
14-18 días hasta que alcanzaron aproximadamente 1
cm de diámetro.
Para ensayar los efectos relativos de los
inmunoconjugados sobre la biodistribución y la captación de
Lym-1 o TNT-1 por parte de los
tumores en ratones portadores de tumores, a grupos separados de
4-5 ratones se les administraron inyecciones
intravenosas de 30 \mug de anticuerpo solo o conjugado de
anticuerpo. Dos horas y media después de la inyección, cada grupo
recibió 50 \muCi de Lym-1 marcado con ^{125}I o
TNT-1 fragmento F(ab')_{2} como
indicador.
Todos los animales se sacrificaron 72 horas
después por sobredosis de pentobarbital sódico, para los análisis de
biodistribución. Se extrajeron diversos órganos, la sangre y los
tumores, se pesaron y se sometieron a recuento las muestras en un
contador gamma. Para cada ratón, los datos se expresaron como
relación de tumor:órgano (cpm por gramo de tumor/cpm por gramo de
órgano) y porcentaje de dosis inyectada/gramo (%ID/g). A partir de
estos datos, se calcularon la media y la desviación típica para cada
grupo.
Basándose en las estructuras primaria, secundaria
y terciaria de la IL-2, se sintetizó una serie de
péptidos distintos para identificar las secuencias responsables del
aumento de la permeabilidad vascular. Los péptidos y sus secuencias
se indican en la Tabla 1. Cada péptido y rhIL-2, así
como sus inmunoconjugados respectivos con el MAb
Lym-1, se ensayaron con respecto a su capacidad de
inducir la permeabilidad vascular de tumores y aumentar la captación
de anticuerpos en ratones desnudos portadores de tumores Raji.
| Actividad de vasopermeabilidad de fragmentos del péptido sintético de interleuquina-2 e inmunoconjugados | ||
| Fragmento/inmunoconjugado^{1} | Secuencia de aminoácidos | Vasopermeabilidad (%Lym-1/IL-2) |
| 3A Lym-1/3A | 44-58 | n.t.^{2} 0 |
| B1 Lym-1/B1 | 37-58 | n.t. 50 |
| 3B Lym-1/3B | 33-58 | n.t. 50 |
| 3C Lym-1/3C | 22-58 | 0 100 |
| E6 Lym-1/E6 | 22-38 | n.t. 0 |
| A3 Lym-1/A3 | 37-72 | n.t. 50 |
| 4A Lym-1/4A | 105-133 | n.t. 0 |
| 4B Lym-1/4B | 87-133 | n.t. 0 |
| L-2 Lym-1/IL-2 | 1-133 | 75 100 |
| ^{1} se añadió una concentración de 30-40 pM de péptido por ensayo. |
Los estudios de control usaron
IL-2 intacta y el inmunoconjugado
Lym-1/IL-2 para establecer niveles
marcadamente mejorados de captación de Lym-1 en
ratones desnudos portadores de tumores Raji con fines comparativos.
Como se ha indicado previamente (LeBerthon et al. (1991)),
puede obtenerse una mayor permeabilidad a pesar del hecho de que el
MAb/IL-2 conjugado químicamente no demuestra
actividad de citoquina. Como se muestra en la Tabla 1, un
vasoconjugado derivado de un péptido sintético, denominado 3C,
produjo aproximadamente un 100% de los efectos de vasopermeabilidad
del conjugado químico Lym-1/IL-2.
Otros tres vasoconjugados, compuestos de los péptidos sintéticos 3B,
B1 y A3, que contenían fragmentos más pequeños de 3C, produjeron
aproximadamente la mitad de los efectos de vasopermeabilidad de
Lym-1/IL-2 en estos ensayos.
Como era de esperar, la administración
intravenosa de los fragmentos sintéticos no conjugados de corta
duración y no protegidos, por sí mismos, no tenía ningún efecto
sobre la captación de Lym-1 en ratones desnudos
portadores de tumores. Por lo tanto, se requiere la conjugación de
los péptidos con otra macromolécula, tal como un anticuerpo, para
demostrar la actividad biológica de los péptidos sintéticos. Para
comparación, la IL-2 nativa tenía una
vasopermeabilidad del 75% en el modelo in vivo.
A partir de los datos presentados en la Tabla 1,
parece ser que la secuencia entera de los aminoácidos
22-58 de la SEC ID Nº: 3 produce una
vasopermeabilidad óptima. Sin embargo, los conjugados compuestos por
los aminoácidos 37-58, 33-58 y
37-72 de la SEC ID Nº: 3 retienen un 50% de la
actividad, mientras que el fragmento E6, que consta de los
aminoácidos 22-38 de la SEC ID Nº: 3 no tiene
ninguna actividad.
Se usaron MAb solo, inmunoconjugados
MAb/IL-2 o MAb/PEP para pretratar ratones desnudos
portadores de tumores en dos modelos de tumor para demostrar el
aumento de la captación del MAb radiomarcado por parte del tumor 2,5
horas después del pretratamiento. Se usaron inmunoconjugados de
TNT-1 en el sistema de carcinoma cervical humano
ME-180 para demostrar la dirección a antígenos
intracelulares accesibles en células tumorales permeables (muertas).
En estudios complementarios, se usaron inmunoconjugados
Lym-1 en el modelo de linfoma de Raji para demostrar
la dirección a antígenos de la superficie celular.
Como se muestra en la Figura 3A; el
pretratamiento con TNT-1 dio un 1,28% de la dosis
inyectada en el tumor y los pretratamientos con
TNT-1/IL-2 y
TNT-1/PEP condujeron a un 4,5 y 4,4 por ciento de
dosis inyectada/gramo, respectivamente. Igualmente impresionante, el
pretratamiento con Lym-1 solo hizo que sólo un 1,4%
de la dosis inyectada de Lym-1 radiomarcado se
acumulara en el tumor, mientras que
Lym-1/IL-2 y
Lym-1/PEP dieron un 5,7 y 5,6 por ciento de dosis
inyectada/gramo, respectivamente (Figura 4A). En los dos sistemas,
hubo un aumento de aproximadamente cuatro veces en el anticuerpo
radiomarcado dentro del tumor.
Además de estos hallazgos, el uso de
inmunoconjugados de IL-2 o PEP aumentó la dirección
específica de los anticuerpos radiomarcados como se demuestra por
las mayores relaciones de tumor/órgano (Figuras 4A y 4B).
Estos resultados indican que PEP es equivalente a
rhIL-2 después de la conjugación con dos anticuerpos
monoclonales diferentes en la potenciación de la captación de
anticuerpo en el tumor. Sin embargo, a diferencia de
IL-2, el PEP no conjugado, que tiene un peso
molecular de 3.700 Daltons, no mostró actividad de
vasopermeabilidad después de la administración intravenosa en el
ratón (Tabla 1), presumiblemente debido a su rápida degradación y
eliminación de la circulación.
La presencia de la cisteína terminal (aminoácido
nº 58) sugiere que la dimerización del péptido sintético podría
realizarse durante los procedimientos de conjugación. Para evaluar
si la dimerización afectaba a los efectos de vasopermeabilidad del
PEP, se produjeron formas monoméricas y diméricas de PEP antes de la
conjugación como se describe en el Ejemplo 5 y se resume en la
Figura 2. Por lo tanto, los vasoconjugados construidos con estos
fragmentos generados químicamente estaban compuestos sólo de formas
monoméricas o diméricas de PEP con fines comparativos.
Cuando se usaron como pretratamiento en ratones
desnudos portadores de tumores, los análisis de biodistribución
demostraron que el vasoconjugado que constaba del dímero mostraba un
aumento de aproximadamente dos veces de la captación de anticuerpo
en el tumor en comparación con el vasoconjugado construido con el
monómero de PEP (Figura 4). Además, el vasoconjugado construido con
el dímero de PEP proporcionó aproximadamente el mismo aumento de la
captación de anticuerpo que el conjugado MAb/IL-2,
lo que indica que la dimerización era importante en la generación de
una vasopermeabilidad óptima en el sitio del tumor en este sistema
modelo.
Se usó el crecimiento de una línea de células
indicadoras dependiente de IL-2,
CTLL-2 para comparar la actividad biológica de PEP,
conjugados de PEP y la IL-2 recombinante humana de
control positivo. Se diluyeron en serie muestras de PEP, conjugados
de PEP o patrones de IL-2 (100 \mul/pocillo) 3
veces desde una concentración inicial de 8,1 pM
(IL-2 recombinante) en placas de microtitulación de
fondo plano estériles de 96 pocillos. A cada pocillo se le añadieron
células CTLL (4 x 10^{5}) en un volumen de 50 \mul. Las placas
se incubaron durante 18 horas en CO_{2} al 5% a 37ºC, después se
sometieron a pulsos de 0,5 \muCi de
^{3}H-timidina durante 6 horas (25 \mul de una
dilución 1:50 de 1,0 mCi en medio; Amersham, Arlington Hts. IL)
antes de recoger los pocillos en papel de filtro de fibra de vidrio
y de realizar el recuento de centelleo líquido en miniviales de
vidrio. Aunque la IL-2 recombinante era muy activa
como control positivo, no se descubrió que ninguna de las
preparaciones que contenían PEP soportara la proliferación de la
línea de células T.
La capacidad de PEP y de conjugados de PEP de
inducir la destrucción por células LAK se ensayó por medio de
ensayos de microtoxicidad de liberación de ^{51}Cr en placas de
microtitulación de 96 pocillos como se ha descrito previamente
(Katsanis, E., et al., Blood 78:
1286-1291 (1991). Se usaron dos poblaciones de
células efectoras, células mononucleares de sangre periférica
humana (PBMC) o esplenocitos murinos. Las células efectoras se
aislaron por centrifugación en gradiente de densidad de Ficoll y se
activaron durante 4 días in vitro en medio que contenía una
concentración 13,7 pM u 80 pM de PEP, o 13,7 pM de conjugados de
anticuerpo/PEP o HSA/PEP a una densidad de 0,5 x 10^{6}
células/ml. Como controles se usaron efectores recién aislados en
medio sin IL-2 recombinante humana. Las células
humanas se cultivaron en RPMI-1640 con
L-glutamina 2 mM, 100 U/ml de penicilina, 100
\mug/ml de estreptomicina y suero de ternero fetal al 10%. Las
células murinas se cultivaron en el mismo medio de cultivo que se
ha indicado anteriormente, pero se suplementaron con aminoácidos no
esenciales a una concentración 10 mM, piruvato sódico 100 mM y
2-mercaptoetanol 25 mM (Sigma).
Se ensayaron tres líneas celulares diana de tumor
diferentes. Las PBMC efectoras se ensayaron contra dos líneas de
células diana de tumores malignos, K562 (sensibles a NK) y Daudi
(resistentes a NK). Para evaluar el potencial de destrucción de las
células T, se ensayaron esplenocitos murinos activados contra la
línea de células de mastocitoma P815 en un ensayo de citotoxicidad
celular dependiente de anticuerpo dirigido al tumor (ADCC inversa)
(Anderson, P.M., et al., J. Immunol. 142:
1383-1394 (1989)). La adición de 10 ng/ml de
anticuerpo 145-2C11 anti-CD3 murino
(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a las placas que contenían
las líneas de células P815 positivas para el receptor Fc produce
una destrucción notablemente mayor por las células T activadas.
Los ensayos de citotoxicidad usaron 500 dianas
tumorales marcadas con ^{51}Cr por pocillo en placas de
microtitulación de fondo en V y relaciones entre efector y diana de
30:1, 10:1 y 3,3:1 conseguidas por dilución 3 veces en serie de la
primera fila antes de la adición de dianas radiomarcadas. Las placas
se centrifugaron durante 5 minutos a 500 rpm para asegurar el
contacto celular, se incubaron durante 4 h a 37ºC y después se
centrifugaron de nuevo a 1.000 rpm. Se recogieron cien microlitros
de sobrenadante en viales de centelleo de vidrio antes del recuento
de centelleo líquido.
Debe tenerse en cuenta que las preparaciones de
PEP o de conjugado de PEP inducían la destrucción por células LAK de
las líneas celulares diana en cualquiera de los ensayos de
citotoxicidad descritos anteriormente. Por comparación, la
IL-2 recombinante humana, que servía como control
positivo, era muy activa.
La construcción de un vector de expresión de
proteína de fusión PEP/MAb puede realizarse usando técnicas de
clonación molecular convencionales. Puede construirse un vector de
transferencia para un anticuerpo monoclonal quimérico de
humano-ratón y usarse como vector parental. El
vector de transferencia llevará secuencias de ADNc para una cadena
pesada quimérica de humano-ratón bajo el control de
un primer promotor y una cadena ligera quimérica de
ratón-humano bajo el control de un segundo promotor.
Un ejemplo de tal vector de transferencia es el vector de
baculovirus, pBVchLYM-1, de Hu et al.
(Hum. Antibod. Hybridomas 6(1):
57-67, incorporado en el presente documento como
referencia.
Se insertarán secuencias de nucleótidos que
codifiquen el PEP, es decir, un ADNc sustancialmente homólogo a la
SEC ID Nº: 2, en un sitio de enzima de restricción apropiado cerca
del extremo 3' del gen de la cadena pesada. El vector de expresión
resultante codificará una cadena ligera quimérica así como una
proteína de fusión que consta de la cadena pesada quimérica con PEP
unido en el extremo carboxi. El vector de expresión se utilizará
para transfectar una línea celular adecuada y las proteínas de
fusión de cadena ligera y cadena pesada se coexpresarán en cultivos
celulares. Las cadenas pesada y ligera de la proteína de fusión
quimérica PEP/MAb se autoensamblarán dentro de las células
transfectadas y posteriormente pueden purificarse a partir del
cultivo celular por cromatografía de afinidad de proteína A.
Pueden usarse inmunoconjugados o proteínas de
fusión de PEP para mejorar la liberación de agentes terapéuticos o
de formación de imágenes de tumores. El mecanismo de acción de las
moléculas que contienen PEP es aumentar la permeabilidad vascular en
el sitio del tumor. En el modelo animal descrito en el Ejemplo 7, la
administración de inmunoconjugados de PEP 2,5 horas antes de la
administración de MAb radioyodados produjo una captación
notablemente aumentada del indicador radiactivo en tumores. Por
consiguiente, el inmunoconjugado o la proteína de fusión de PEP
generalmente se administrarán al hospedador tumoral
1-3 horas antes de la dosis posterior del agente de
formación de imágenes de tumores o terapéutico.
Aunque la presente invención se ha descrito con
un detalle considerable haciendo referencia a ciertas versiones
preferidas de la misma, son posibles otra versiones. Por ejemplo,
el PEP puede unirse a un vehículo de liberación que incluye una
toxina. Por lo tanto, el espíritu y alcance de las reivindicaciones
adjuntas no debe limitarse a la descripción de las versiones
preferidas contenidas en este documento.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Epstein, Alan L.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PÉPTIDO POTENCIADOR DE LA VASOPERMEABILIDAD DE LA INTERLEUQUINA-2 HUMANA E INMUNOCONJUGADOS DEL MISMO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 3
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Fullbright Jaworski, L.L.P.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 885 South Figueroa Street, 29th Floor
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Los Angeles
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: California
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- CÓDIGO POSTAL: 90017-2576
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible, 3,5 pulgadas, 1,44 Mb de capacidad
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: Windows NT-WordPerfect 8.0
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: ASCII (DOS) TEXT
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/808.121
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 23 de diciembre de 1996
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN DEL MANDATARIO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Churchill, Margaret A. (Ph. D.)
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 39.944
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 1920-325XX
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (213) 892-9200
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (213) 680-4518
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TELEX: 25-3856
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
Asn Pro Lys Leu Thr}
\sac{Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys
Lys Ala Thr Glu Leu}
\sac{Lys His Leu Gin Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 111 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 127 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (29)
1. Un péptido vasoactivo aislado y purificado,
comprendiendo dicho péptido un fragmento de
interleuquina-2 que contiene los aminoácidos 37 a 58
de la SEC ID Nº: 3, donde dicho fragmento y dicho péptido carecen
sustancialmente de actividad de citoquina y aumentan la
permeabilidad vascular cuando se localiza en un sitio diana.
2. Un dímero del péptido vasoactivo de la
reivindicación 1.
3. El péptido vasoactivo de la reivindicación 1,
donde dicho péptido consta de una porción de la SEC ID Nº: 3 de los
restos aminoacídicos 22 a 72 que contiene los restos aminoacídicos
37 a 58 de la SEC ID Nº: 3, teniendo dicha porción una longitud de
22 a 51 aminoácidos.
4. El péptido de la reivindicación 3, donde la
porción de la SEC ID Nº: 3 se selecciona entre el grupo compuesto
por:
a) los restos aminoacídicos 37 a 58;
b) los restos aminoacídicos 33 a 58;
c) los restos aminoacídicos 22 a 58; y
d) los restos aminoacídicos
37-72.
5. El péptido de la reivindicación 1, que consta
de los restos 37 a 58 de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº:
3.
6. El péptido de la reivindicación 1, que consta
de la secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 1.
7. El dímero de la reivindicación 2, donde cada
péptido incluye al menos un resto de cisteína, formando los restos
de cisteína el dímero por medio de un enlace disulfuro.
8. Un conjugado que comprende:
- a)
- un vehículo de liberación que se localiza en el sitio del tejido neoplásico; y
- b)
- el péptido vasoactivo de la reivindicación 1, estando conectado dicho péptido a dicho vehículo de liberación.
9. El conjugado de la reivindicación 8, donde el
vehículo de liberación es un anticuerpo monoclonal específico de
tumor.
10. El conjugado de la reivindicación 9, donde el
anticuerpo monoclonal se selecciona entre el grupo compuesto por un
anticuerpo murino, un anticuerpo humano y una quimera de anticuerpos
murinos y humanos.
11. El conjugado de la reivindicación 9, donde el
anticuerpo monoclonal se selecciona entre el grupo compuesto por
Lym-1, Lym-2, TNT-1,
TNT-2 o TV-1.
12. El conjugado de la reivindicación 9, que
comprende además un agente antineoplásico unido al vehículo de
liberación.
13. El conjugado de la reivindicación 12, donde
dicho agente antineoplásico se selecciona entre el grupo compuesto
por fármacos, toxinas y radioisótopos.
14. Una proteína de fusión que comprende:
- a)
- un vehículo de liberación que se localiza en el sitio del tejido neoplásico, teniendo el vehículo al menos un aminoácido terminal; y
- b)
- al menos un péptido vasoactivo de acuerdo con la reivindicación 1, estando unido el péptido a al menos un aminoácido terminal del vehículo de liberación.
15. La proteína de fusión de la reivindicación
14, que comprende además un engarce de aminoácidos que une el
vehículo de liberación y el péptido vasoactivo.
16. La proteína de fusión de la reivindicación
14, donde el al menos un péptido vasoactivo comprende dos péptidos
vasoactivos unidos en tándem.
17. La proteína de fusión de la reivindicación
16, que comprende además un espaciador de aminoácidos entre los dos
péptidos vasoactivos unidos en tándem.
18. La proteína de fusión de la reivindicación
14, donde el vehículo de liberación comprende al menos un dominio de
unión a antígenos de una inmunoglobulina.
19. La proteína de fusión de la reivindicación
14, donde el vehículo de liberación comprende un anticuerpo
monoclonal quimérico de humano-ratón.
20. Un vector para la expresión de una proteína
de fusión, que comprende:
- a)
- una secuencia de una proteína de fusión que comprende:
- 1)
- una secuencia que codifica un vehículo de liberación, teniendo dicho vehículo de liberación la capacidad de localizarse en el sitio de un tejido neoplásico, y
- 2)
- una secuencia codificante de un péptido vasoactivo, que comprende ADN codificante del péptido vasoactivo de la reivindicación 1, teniendo dicha secuencia codificante del péptido una fase de lectura alineada con la fase de lectura de dicha secuencia codificante del vehículo de liberación; y
- b)
- un vector de expresión que tiene al menos una secuencia que dirige la expresión de la proteína de fusión en las células.
21. Una línea celular para expresar la proteína
de fusión, que comprende:
- a)
- el vector de expresión de la reivindicación 20; y
- b)
- células eucariotas que llevan el vector de expresión y expresan la proteína de fusión.
22. Uso de un péptido vasoactivo para la
fabricación de un medicamento para uso en un método de tratamiento
del tejido neoplásico en un hospedador portador de un tumor,
comprendiendo dicho método:
- a)
- administrar a un hospedador que tiene dicho tejido una cantidad eficaz de un conjugado, comprendiendo dicho conjugado:
- 1)
- un vehículo de liberación que se localiza en el sitio del tejido neoplásico; y
- 2)
- el péptido vasoactivo de la reivindicación 1, estando conectado dicho péptido a dicho vehículo de liberación; y
- b)
- administrar de forma contemporánea o posteriormente a dicho hospedador un agente terapéutico antineoplásico.
23. El método de la reivindicación 22, donde
dicho agente antineoplásico es un agente inmunológico.
24. El método de la reivindicación 22, donde
dicho agente antineoplásico se selecciona entre el grupo compuesto
por fármacos quimioterapéuticos, toxinas y radionúclidos.
25. Uso de un péptido vasoactivo para la
fabricación de un medicamento para uso en un método de tratamiento
de un tejido neoplásico en un hospedador portador de un tumor,
comprendiendo dicho método administrar a un hospedador que tiene
dicho tejido una cantidad eficaz de un conjugado, comprendiendo
dicho conjugado:
- a)
- un vehículo de liberación que se localiza en el sitio del tejido neoplásico;
- b)
- el péptido vasoactivo de la reivindicación 1, estando conectado dicho péptido a dicho vehículo de liberación; y
- c)
- un agente tumoricida.
26. Uso de un péptido vasoactivo para la
fabricación de un agente de diagnóstico para uso en un método para
la diagnosis de un tejido neoplásico, comprendiendo dicho
método:
- a)
- administrar a un hospedador que tiene dicho tejido una cantidad eficaz de un conjugado, comprendiendo dicho conjugado:
- 1)
- un vehículo de liberación que se localiza en el sitio del tejido neoplásico; y
- 2)
- el péptido vasoactivo de la reivindicación 1, estando conectado dicho péptido a dicho vehículo de liberación; y
- b)
- administrar de forma contemporánea o posteriormente a dicho hospedador un agente de formación de imágenes de tumores.
27. Uso de un péptido vasoactivo para la
fabricación de un agente de diagnóstico para uso en un método para
la diagnosis de un tejido neoplásico, comprendiendo dicho método
administrar a un hospedador que tiene dicho tejido una cantidad
eficaz de un conjugado, comprendiendo dicho conjugado:
- a)
- un vehículo de liberación que se localiza en el sitio del tejido neoplásico;
- b)
- el péptido vasoactivo de la reivindicación 1, estando conectado dicho péptido a dicho vehículo de liberación; y
- c)
- un marcador detectable.
28. Un kit terapéutico, que comprende:
- a)
- un conjugado, comprendiendo dicho conjugado:
- 1)
- un vehículo de liberación que se localiza en el sitio del tejido neoplásico, y
- 2)
- el péptido vasoactivo de la reivindicación 1, estando conectado dicho péptido a dicho vehículo de liberación; y
- b)
- un agente terapéutico antineoplásico.
29. Un kit de diagnóstico, que comprende:
- a)
- un conjugado, comprendiendo dicho conjugado:
- 1)
- un vehículo de liberación que se localiza en el sitio del tejido neoplásico, y
- 2)
- el péptido vasoactivo de la reivindicación 1, estando conectado dicho péptido a dicho vehículo de liberación; y
- b)
- un agente de formación de imágenes de tumores.
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