ES2218806T3 - Sialilacion practica in vitro de glicoproteinas recombinantes. - Google Patents

Sialilacion practica in vitro de glicoproteinas recombinantes.

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ES2218806T3 ES98904583T ES98904583T ES2218806T3 ES 2218806 T3 ES2218806 T3 ES 2218806T3 ES 98904583 T ES98904583 T ES 98904583T ES 98904583 T ES98904583 T ES 98904583T ES 2218806 T3 ES2218806 T3 ES 2218806T3
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Abstract

Utilización de un enzima sialiltransferasa para obtener por lo menos una sialilación de aproximadamente el 80% de los grupos sacáridos de una glicoproteína diana en un procedimiento de sialilación in vitro a gran escala, utilizándose dicho enzima sialiltransferasa con una concentración de 50 mU/mg de glicoproteína o menos, juntamente con una fracción donante de ácido siálico.

Description

Sialilación práctica in vitro de glicopoteínas recombinantes.
La presente solicitud reivindica la prioridad de solicitud provisional US 60/035.710, presentada el 16 de enero de 1997, que se incorpora en su integridad a la presente memoria como referencia a todos los efectos.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la sialilación de glicoproteínas in vitro, incluyendo las glicoproteínas recombinantes.
Antecedentes
El período temporal circulatorio de las glicoproteínas en la sangre depende en gran manera de la composición y estructura de los grupos de hidratos de carbono suyos unidos al N. Este hecho tiene una relevancia directa para las glicoproteínas terapéuticas que están previstas para su administración parenteral. En general, la vida media circulatoria máxima de una glicoproteína necesita que sus grupos de hidratos de carbono unidos al N finalicen en la secuencia NeuAc-Gal-GlcNAc. Sin el ácido siálico terminal (NeuAc), la glicoproteína es eliminada rápidamente de la sangre mediante un mecanismo que implica el reconocimiento de los residuos subyacentes de N-acetilgalactosamina (GalNAc) o de galactosa (Gal) (Goochee et al. (1991) Bio/Technology 9:1347-1355). Por esta razón, asegurar la presencia del ácido siálico terminal en los grupos de hidratos de carbono unidos al N de la glicoproteínas terapéuticas, constituye una consideración importante para su desarrollo comercial.
En principio, los sistemas de cultivo de células de mamíferos que se utilizan para la producción de la mayoría de las glicoproteínas terapéuticas, tienen la capacidad de producir glicoproteínas con grupos de hidratos de carbono unidos al N completamente sialilados. En la práctica, sin embargo, la glucosilación óptima es a menudo difícil de alcanzar. Bajo las condiciones de producción a gran escala, la sobreproducción de la glicoproteína por las células puede impedir la capacidad de éstas para mantener la glucosilación, pudiendo esta capacidad ser positiva y negativamente influenciada por muchas sutiles variables en las condiciones del cultivo (Goochee et al., supra).
La producción de glicoproteínas en los animales transgénicos presenta alguno de los mismos problemas que en los cultivos celulares de mamíferos. Aunque la "producción" de una glicoproteína está inherentemente mejor controlada, también es menos susceptible a la manipulación. Si la glucosilación no es completa, hay poco que pueda hacerse con los animales para alterar el resultado. Con los animales transgénicos, se presenta a menudo otro problema. Aunque el ácido siálico predominante en el hombre es el ácido N-acetil-neuramínico (NeuAc), la totalidad de las cabras, ovejas y vacas producen una gran parte de su ácido siálico total como ácido N-glicolil-neuramínico (NeuGc). Aunque el impacto de esta modificación todavía no se ha explorado todavía desde una perspectiva reguladora o funcional, se sabe que la sustitución NeuGc es antigénica en el hombre (Varki (1992) Glycobiology 2:25-40).
Ya que los problemas más importantes asociados con la glucosilación de las glicoproteínas transgénicas y recombinantes comercialmente importantes, involucran al ácido siálico terminal, se requiere un procedimiento in vitro para "tapar" las cadenas de hidratos de carbono en las que falte un ácido siálico terminal. Con dicho procedimiento, el problema al que se enfrentan las glicoproteínas transgénicas podría también resolverse mediante resialilación con NeuAc, una vez que el ácido siálico NeuGc "no humano" se eliminara. El procedimiento ideal utilizará una sialiltransferasa que es capaz de llevar a cabo la sialilación eficiente, a escala práctica, de oligosacáridos unidos al O ó al N de glicoproteínas recombinantes. La presente invención cumple estos y otros requerimientos.
Sumario de la invención
La presente invención proporciona la utilización de un enzima sialiltransferasa (o de sialiltransferasa) para obtener por lo menos una sialilación de aproximadamente el 80% de los grupos sacáridos de una glicoproteína diana en un procedimiento de sialilación in vitro a gran escala, utilizándose dicho enzima sialiltransferasa con una concentración de 50 mU/mg de glicoproteína o menos, juntamente con una fracción donante de ácido siálico. Los procedimientos de sialilación in vitro de los grupos sacáridos que se encuentran sobre una glicoproteína producida de modo recombinante comprenden el contacto de los grupos sacáridos con una sialiltransferasa, una fracción donante de ácido siálico, y otros reactantes necesarios para la actividad sialiltransferásica durante un tiempo suficiente y bajo condiciones apropiadas para transferir el ácido siálico desde la fracción donante de ácido siálico a dicho grupo sacárido.
La sialiltransferasa se utiliza a una concentración de aproximadamente 50 mU aproximadamente por mg de glicoproteína o menos, preferentemente entre 5 y 25 mU aproximadamente por mg de glicoproteína, junto con una fracción donante de ácido siálico. Típicamente, la concentración de sialiltransferasa en la mezcla reactiva estará aproximadamente entre 10 y 50 mU/ml, siendo la concentración de glicoproteína por lo menos de alrededor de 2 mg/ml de la mezcla reactiva. La utilización de un enzima sialiltransferasa según la presente invención da lugar a la sialilación del 80% aproximadamente por lo menos de los residuos terminales de galactosa que se encuentran en dichos grupos sacáridos. Generalmente, el tiempo necesario para obtener más del 80% de la sialilación aproximadamente, es menor o igual a alrededor de 48 horas.
Las sialiltransferasas que son útiles en los procedimientos de la invención presentan típicamente un motivo sialilo que comprende alrededor de 48 a 50 aminoácidos, en el interior del cual el 40% aproximadamente de los aminoácidos son idénticos a la secuencia de consenso RCAVVSSAG- - -DVGSKT (donde - - - indica un número variable de residuos aminoácidos, de forma que el motivo tiene alrededor de 48 y 50 residuos de largo). Ejemplos de metiltransferasas que son apropiadas para su uso en la presente invención incluyen ST3Gal III (preferentemente una ST3Gal III de rata), ST3Gal IV, ST3Gal I, ST6Gal I, ST3Gal V, ST6Gal II, ST6GalNAc I, ST6GalNAc II, y ST6GalNAc III (la nomenclatura sialiltransferásica que se describe en la presente memoria es como la que se da a conocer en Tsuji et al (1996) Glycobiology 6:v-xiv). La utilización de la invención puede implicar la sialilación de glicoproteínas recombinantes con más de una sialiltransferasa, por ejemplo, con una ST3Gal III y una ST3Gal I, o una ST3 Gal III y una ST6 GAII, u otras combinaciones enzimáticas. La fracción donante de ácido siálico que se utiliza en los procedimientos que se reivindican, es generalmente CMP-ácido siálico, que puede añadirse directamente a la reacción o puede generarse enzimáticamente in situ. Los ácidos siálicos utilizados en una forma de realización preferida se seleccionan de entre el grupo formado por NeuAc y NeuGc.
La invención utiliza asimismo la sialilación in vitro de grupos sacáridos que se encuentran en una glicoproteína, comprendiendo el procedimiento el contacto de los grupos sacáridos con una ST3Gal III sialiltransferasa, una fracción donante de ácido siálico, y otros reactantes necesarios para la actividad sialiltransferásica durante un tiempo suficiente y bajo condiciones apropiadas para transferir el ácido siálico desde dicha fracción donante de ácido siálico a dicho grupo sacárido, en el que dicha ST3Gal III sialiltransferasa se encuentra a una concentración menor que 50 mU por mg de glicoproteína aproximadamente, incluyendo además el procedimiento el contacto de los grupos sacáridos con una ST6Gal I sialiltransferasa.
Las glicoproteínas sialiladas según la presente invención pueden exhibir un patrón de sialilación alterado, en el que son sialilados residuos terminales de galactosa de dicha glicoproteína.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra la sialilación mediada por ST3Gal III a lo largo del tiempo de la glicoproteína ácida-_{\alpha}1 que había sido tratada con neuraminidasa. El porcentaje de residuos terminales de galactosa que son sialilados se gráfica respecto al tiempo de reacción.
La Figura 2 muestra una comparación de la sialilación de la glicoproteína ácida-_{\alpha}1 utilizando dos sialiltransferasas diferentes, ST3Gal III y ST6Gal I.
Descripción detallada Definiciones
En la presente memoria, se utilizan las siguientes abreviaturas:
Ara= arabinosilo;
Fru= fructosilo;
Fuc= fucosilo;
Gal= galactosilo;
GalNAc =N-acetilgalacto;
Glc= glucosilo;
GlcNAc= N-acetilgluco;
Man= manosilo; y
NeuAc= sialilo (típicamente N-acetilneuraminilo).
Se considera que los oligosacáridos poseen un extremo reductor y un extremo no reductor, pero sea el extremo reductor o no, el sacárido en el extremo reductor es, de hecho, un azúcar reductor. Según la nomenclatura que se acepta, en la presente memoria los oligosacáridos se muestran con el extremo no reductor a la izquierda y con el extremo reductor a la derecha. Todos los oligosacáridos que se describen en la presente memoria se refieren con el nombre o abreviatura para el sacárido no reductor (por ejemplo, Gal), seguido por la configuración del enlace glucosídico (\alpha ó \beta), el enlace del anillo, la posición del anillo del sacárido reductor implicado en el enlace, y entonces, el nombre o abreviatura del sacárido reductor (por ejemplo, GlcNAc). La unión entre dos azúcares puede
expresarse, por ejemplo, como 2,3, 2 \rightarrow 3, ó (2,3). Cada sacárido es una piranosa.
El término "ácido siálico" se refiere a cualquier miembro de una familia de azúcares de nueve carbonos carboxilados. El miembro más habitual de la familia del ácido siálico es el ácido N-acetil-neuramínico (ácido 2-ceto-5-acetamido-3,5-didesoxi-D-glicero-D-galactononulopiranos-1-ónico) (que se abrevia a menudo como Neu5Ac, NeuAc, ó NANA). Un segundo miembro de la familia es el ácido N-glicolil-neuramínico (Neu5Gc ó NeuGc), en el que el grupo N-acetilo del NeuAc está hidroxilado. Un tercer miembro de la familia del ácido siálico es el ácido 2-ceto-3-desoxi-nonulosónico (KDN) (Nadano et al) (1986) J. Biol. Chem. 261: 11550-11557; Kanamori et al (1990) J. Biol. Chem. 265: 21811-21819. También se incluyen ácidos siálicos sustituidos en la posición 9, tal como un 9-O-C_{1}-C_{6} acil-Neu5Ac, como 9-O-lactil-Neu5Ac, o como 9-O-acetil-Neu5Ac, 9-desoxi-9-fluoro-Neu5Ac y 9-azido-9-desoxi-Neu5Ac. Para una revisión de la familia del ácido siálico, véase, por ejemplo, Varki (1992) Glycobiology 2:25-40; Sialic acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed. (Springer-Verlag, New York (1992)). La síntesis y utilización de los compuestos de ácido siálico en un procedimiento de sialilación se da a conocer en la solicitud de patente internacional WO 92/16640, publicada el 1 de octubre de 1992.
El término "recombinante", cuando se utiliza con referencia a una célula, indica que ésta da lugar a la replicación de un ácido nucleico heterólogo, o expresa un péptido o proteína codificado por un ácido nucleico heterólogo. Las células recombinantes pueden contener genes que no se encuentran en el interior de la forma nativa (no recombinante) de la célula. Las células recombinantes pueden también contener genes que se encuentran en la forma nativa de la célula, en la que los genes son modificados y vueltos a introducir en ésta mediante medios artificiales. El término abarca asimismo células que contienen un ácido nucleico endógeno a la célula que se ha modificado sin eliminarlo de la célula; dichas modificaciones incluyen las obtenidas mediante reemplazamiento génico, mutación sitio-específica, y técnicas relacionadas. Un "polipéptido recombinante" es uno que se ha producido mediante una célula recombinante.
Una "secuencia heteróloga" o un "ácido nucleico heterólogo", tal como se utiliza en la presente memoria, es uno que se origina a partir de una fuente que es extraña a la célula huésped particular, o, si es a partir de la misma fuente, se modifica a partir de su forma original. Así, un gen de una glicoproteína heteróloga en una célula huésped eucariótica incluye un gen de la glicoproteína que es endógeno respecto a la célula huésped particular que se ha modificado. La modificación de la secuencia heteróloga puede tener lugar, por ejemplo, tratando el ADN con un enzima de restricción para generar un fragmento de ADN que sea capaz de unirse operativamente al promotor. Técnicas tales como la mutagénesis dirigidas a un sitio determinado, son también útiles para modificar una secuencia heteróloga.
Una "subsecuencia" se refiere a una secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos que comprende parte de una secuencia más larga de ácidos nucleicos o aminoácidos (por ejemplo, polipéptido) respectivamente.
Un "cassette de expresión recombinante" o simplemente, "un cassette de expresión", es un constructo de ácido nucleico, generado sintética o recombinantemente, con elementos del ácido nucleico que son capaces de afectar la expresión de un gen estructural en huéspedes compatibles con dichas secuencias. Los casetes de expresión incluyen por lo menos promotores y opcionalmente, señales de finalización de la transcripción. Típicamente, el cassette de expresión recombinante incluye un ácido nucleico que va a transcribirse (por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un polipéptido deseado), y un promotor. Pueden también utilizarse factores adicionales que son necesarios o sirven de ayuda para llevar a cabo la expresión, tal como se describe en la presente memoria. Por ejemplo, un cassette de expresión puede también incluir secuencias nucleótidas que codifican una señal secuencia que dirige la secreción de una proteína que se expresa a partir de la célula huésped. Las señales de finalización de la transcripción, potenciadores, y otras secuencias del ácido nucleico que influencian la expresión génica, pueden incluirse asimismo en un cassette de expresión.
El término "aislado" se refiere a material que está esencial o sustancialmente libre de componentes que acompañan normalmente al enzima tal como se encuentra en su estado original. Típicamente, las moléculas aisladas presentan por lo menos una pureza del 80%, habitualmente por lo menos del 90% aproximadamente, y preferentemente por lo menos del 95%, medida por, por ejemplo, la intensidad de las bandas sobre un gel teñido con (nitrato de) plata o mediante otro procedimiento para determinar la pureza. La pureza proteica o la homogeneidad puede indicarse mediante diversos medios bien conocidos en la técnica, tales como la electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra proteica, seguido por visualización después de la tinción. Para conseguir determinados objetivos, será necesaria una alta resolución, utilizándose para la purificación la HPLC o medios similares.
La práctica de la presente invención puede implicar la construcción de ácidos nucleicos recombinantes y la expresión de genes en las células huésped transfectadas. En la técnica, son conocidas técnicas de clonación molecular para alcanzar estos objetivos. Los expertos en la materia conocen bien una amplia variedad de procedimientos de clonación y de amplificación in vitro que son apropiados para la construcción de ácidos nucleicos recombinantes, tales como vectores de expresión. Ejemplos de estas técnicas e instrucciones que son suficientes para dirigir a los expertos mediante muchos ejercicios de clonación, se encuentran en Berger y Kimmel, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, volumen 152, Academic Press, Inc., San Diego, CA (Berger); y Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al, eds, Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (suplemento 1994) (Ausubel). Los expertos en la técnica conocen células huésped apropiadas para la expresión de los polipéptidos recombinantes, e incluyen, por ejemplo, células eucarióticas que incluyen células de insectos, de mamíferos y fúngicas. En una forma de realización preferida, Aspergillus niger se utiliza como célula huésped.
Ejemplos de protocolos que son suficientes para dirigir a los expertos mediante procedimientos de amplificación in vitro, que incluyen la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), la reacción en cadena de la ligasa (LCR), la amplificación mediante la replicasa Q\beta y otras técnicas mediadas por la ARN polimerasa, se encuentran en Berger, Sambrook, y Ausubel, así como en Mullis et al. (1987) patente U.S. nº 4.683.202; PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis); Arnheim & Levinson (1 de octubre de 1990) C&EN 36-47; The Journal of NIH Research (1991) 3:81-94; (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173; Guatelli et al (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874; Lomell et al. (1989) J. Clin. Chem 35; 1826; Landegren et al (1988) Science 241: 1077-1080; Van Brunt (1990) Biotechnology 8: 291-294; Wu y Wallace (1989) Gene 4:560; y Barringer et al (1990) Gene 89: 117. Procedimientos mejorados para la clonación in vitro ácidos nucleicos amplificados se describen en Wallace et al., patente U.S. nº 5.426.039.
Descripción de las formas de realización preferidas
La presente invención proporciona procedimientos para una sialilación eficiente in vitro de grupos sacáridos unidos a glicoproteínas, en particular a glicoproteínas producidas de forma recombinante. Por ejemplo, los procedimientos de la invención son útiles para la sialilación de glicoproteínas terapéuticas producidas recombinantemente que son sialiladas de modo incompleto durante su producción en células de mamíferos o de animales transgénicos. Los procedimientos implican el contacto de grupos sacáridos con una sialiltransferasa y una fracción donante de ácido siálico durante un tiempo suficiente y bajo condiciones de reacción apropiadas para que el ácido siálico se transfiera desde la fracción donante de ácido siálico a los grupos sacáridos. Las sialiltransferasas comprenden una familia de glucosiltransferasas que transfieren el ácido siálico desde el sustrato donador CMP-ácido siálico a sustratos oligosacáridos aceptores. En formas de realización preferidas, las sialiltransferasas utilizadas en los procedimientos de la invención, son producidas de forma recombinante.
Los procedimientos de la invención son útiles para alterar el patrón de sialilación de las glicoproteínas. El término "alterado" se refiere a la modificación del patrón de sialilación de una glicoproteína utilizando los procedimientos de la invención, siendo distintos de los observados en las glicoproteínas producidas in vivo. Por ejemplo, los procedimientos de la invención pueden llevarse a cabo para producir una glicoproteína con un patrón de sialilación distinto del encontrado en la glicoproteína cuando es producida por células del organismo para las cuales la proteína es nativa. Alternativamente, los procedimientos pueden utilizarse para alterar el patrón de sialilación de glicoproteínas que se producen de forma recombinante mediante la expresión de un gen que codifica la glicoproteína en una célula huésped, que pueden ser de especies de las cuales la glicoproteína es nativa, o de especies distintas.
Las glicoproteínas recombinantes que tienen patrones de sialilación que son modificados mediante los procedimientos de la invención, pueden mostrar importantes ventajas respecto a las proteínas que se encuentran en su estado de glucosilación inalterado nativo, o que se encuentran en un estado de glucosilación que es inferior al óptimo para una aplicación particular. Dichos patrones no óptimos de sialilación pueden surgir cuando una glicoproteína recombinante se produce en una célula que no posee el complemento apropiado del dispositivo de glucosilación para producir este deseado patrón. El patrón óptimo o preferido de glucosilación puede o puede no ser el patrón de glucosilación nativo de la glicoproteína, cuando ésta fue producida en su célula nativa. Las ventajas de los patrones óptimos de sialilación incluyen, por ejemplo, el aumento de la vida media terapéutica de una glicoproteína, debido a la tasa reducida de la depuración. La alteración del patrón de sialilación puede también enmascarar los determinantes antigénicos en las proteínas extrañas, reduciendo o eliminando de esta forma una respuesta inmune contra la proteína. La alteración de la sialilación de un sacárido unido a una glicoproteína puede utilizarse también para dirigir una proteína a un receptor superficial celular que sea específico para el oligosacárido alterado, o para bloquear la dirección a un receptor que sea específico para el sacárido no alterado.
Las proteínas que pueden modificarse mediante los procedimientos de la invención incluyen, por ejemplo, hormonas tales como insulina, hormonas del crecimiento (incluyendo la hormona humana del crecimiento y la hormona bovina del crecimiento), el activador tipo tisular del plasminógeno (t-PA), renina, factores de coagulación tales como el factor VIII y el factor IX, bombesina, trombina, factor de crecimiento hemopoyético, albúmina sérica, receptores para hormonas o factores de crecimiento, interleuquinas, factores estimulantes coloniales, receptores de células T, polipéptidos MHC, antígenos víricos, glicosiltransferasas y similares. Los polipéptidos de interés para la expresión recombinante y la modificación subsiguiente utilizando los procedimientos de la invención, incluyen también la
\alpha1-antitripsina, eritropoyetina, factor estimulante colonial macrófago-granulocítico, anti-trombina III, interleuquina 6, interferón \beta, proteína C, fibrinógeno, entre muchos otros. Esta lista de polipéptidos se proporciona a título de ejemplo, no es exclusiva. Los procedimientos son también útiles para modificar los patrones de sililación de proteínas quiméricas, que incluyen, pero no se limitan a proteínas quiméricas que incluyen una fracción derivada de una inmunoglobulina, tal como IgG.
Los procedimientos de sialilación in vitro que proporciona la invención a diferencia de los anteriormente descritos, son prácticos para la producción a escala comercial de glicoproteínas modificadas. Así, los procedimientos que se reivindican proporcionan medios prácticos para la preparación a gran escala de glicoproteínas que poseen patrones alterados de sialilación. Los procedimientos se adaptan bien a las glicoproteínas terapéuticas que sufren la sialilación de modo incompleto durante su producción en las células de mamíferos o de los animales transgénicos. El procedimiento proporciona un nivel aumentado y consistente de sialilación terminal de una glicoproteína.
Una manera por la que los procedimientos de la invención alcanzan viabilidad comercial es a través de la utilización de sialiltransferasas producidas mediante recombinación. La producción recombinante permite la obtención de sialiltransferasas en las grandes cantidades en que son necesarias para la modificación a gran escala de las glicoproteínas. La deleción del dominio de anclaje de las sialiltransferasas a la membrana, que hace que éstas se solubilicen, facilitando de este modo la producción y purificación de grandes cantidades de ellas, puede llevarse a cabo mediante la expresión recombinante de un gen modificado que codifica la sialiltransferasa. Ejemplos de sialiltransferasas recombinantes, incluyendo las que poseen dominios de anclaje eliminados, así como procedimientos para la producción de ellas, se encuentran, por ejemplo, en la Patente US nº 5.541.083. Se han documentado por lo menos 15 sialiltransferasas distintas de mamíferos, hasta la fecha, se han clonado los cADNs de trece de ellas (para la nomenclatura sistemática que se utiliza en la presente memoria, véase, Tsuji et al (1996) Glycobiology 6: v-xiv). Estos cADNs pueden utilizarse para la producción recombinante de las sialiltransferasas, que pueden entonces utilizarse en los procedimientos de la invención.
La invención puede ponerse comercialmente en práctica también por los procedimientos de la invención mediante la utilización de sialiltransferasas bacterianas, producidas de forma recombinante o en las células bacterianas originales. Recientemente, se ha informado de dos sialiltransferasas bacterianas; una ST6Gal II de Photobacterium damsela (Yamamoto et al (1996) J. Biochem. 120: 104-110) y una ST3Gal V de la Neisseria meningitidis (Gilbert et al (1996) J. Biol. Chem. 271:28271-28276). Los dos enzimas bacterianos recientemente descritos transfieren ácido siálico a la secuencia Gal\beta1,4GlcNAc en los sustratos oligosacáridos. Sin embargo, no se conocen proteínas bacterianas que sean glicosiladas, por lo que no se sabe si o no la fracción Gal\beta1,4GlcNAc unida covalentemente a una proteína, servirá como aceptor sustrato para una sialiltransferasa bacteriana. La Tabla 1 muestra la especificidad del aceptor de estas y otras sialiltransferasas útiles en los procedimientos de la invención.
En las formas de realización preferidas, los procedimientos de la invención pueden ponerse comercialmente en práctica, debido a la utilización de sialiltransferasas que son capaces de llevar a cabo la sialilación de un alto porcentaje de grupos aceptores que se encuentren sobre una glicoproteína, utilizando una baja proporción de unidades enzimáticas respecto a la glicoproteína. En una forma de realización preferida, la cuantía deseada de sialilación se obtendrá utilizando alrededor de 50 mU de sialiltransferasa por mg de glicoproteína o menos. Más preferentemente, se utilizarán menos que 40 mU de sialiltransferasa por mg de glicoproteína aproximadamente, más preferentemente incluso, la proporción de sialiltransferasa a la glicoproteína será menor que o igual a 45 mU/mg aproximadamente, y más preferentemente, alrededor de 25 mU/mg o menos. Más preferentemente, la cuantía de la sialilación deseada se obtendrá utilizando menos que 10 mU/mg aproximadamente de sialiltransferasa por mg de glicoproteína. En las condiciones reactivas típicas, la sialiltransferasa se encontrará en una cantidad del orden de 5 a 25 mU/mg de glicoproteína, o de 10 a 50 mU/ml de la mezcla reactiva la glicoproteína estará presente a una concentración de por lo menos 2 mg/ml aproximadamente.
Típicamente, las cadenas sacáridas que se encuentran sobre una glicoproteína con los patrones de sialilación de ésta alterados por los procedimientos de la invención, tendrán un porcentaje mayor de residuos de galactosa sialilados que la glicoproteína no alterada. Preferentemente, más del 80% aproximadamente de los residuos terminales de galactosa que se encuentran en los grupos sacáridos unidos a la glicoproteína, experimentarán la sialilación después de utilizar los procedimientos. Más preferentemente, los procedimientos de la invención darán lugar a una sialilación superior al 90% aproximadamente, superior incluso, preferentemente al 95%, de los residuos terminales de galactosa. Más preferentemente, el 100% esencialmente de los residuos terminales de galactosa que se encuentran en la glicoproteína, son sometidos a sililación después de la modificación que utiliza los procedimientos de la presente invención. Los procedimientos son capaces típicamente de alcanzar el nivel deseado de sialilación en alrededor de 48 horas o menos, y más preferentemente en 24 horas aproximadamente o menos.
Preferentemente, para la glucosilación de los hidratos de carbono de las glicoproteínas unidos al N, la sialiltransferasa podrá transferir el ácido siálico a la secuencia Gal\beta1,4GlcNAc-, la secuencia penúltima más habitual que subyace al ácido siálico terminal sobre las estructuras de los hidratos de carbono completamente sialilados. Sólo tres de las sialiltransferasas de mamífero clonadas cumplen con este requerimiento de especificidad del aceptor, y se ha demostrado que cada una de éstas transfieren el ácido siálico a los grupos de hidratos de carbono unidos al N de las glicoproteínas. Ejemplos de sialiltransferasas que utilicen Gal\beta1,4GlcNAc- como aceptor, se muestran en la tabla 1.
TABLA 1 Sialiltransferasas que utilizan la secuencia Gal\beta1,4GlcNAc- como un sustrato aceptor
Sialiltransferasa Fuente Secuencia(s) formadas Ref
ST6Gal I mamífero NeuAc\alpha2,6Gal\beta1,4GlcNAc- 1
ST3Gal III mamífero NeuAc\alpha2,3Gal\beta1,4GlcNAc- 1
NeuAc\alpha2,3Gal\beta1,3GlcNAc
ST3Gal IV mamífero NeuAc\alpha2,3Gal\beta1,4GlcNAc- 1
NeuAc\alpha2,3Gal\beta1,3GlcNAc-
ST6Gal II Photobacterium NeuAc\alpha2,6Gal\beta1,4GlcNAc- 2
ST3Gal V N.meningitides NeuAc\alpha2,3Gal\beta1,4GlcNAc- 3
N.gonorrhoeae
1) Goochee et al (1991) Bio/Technology 9:1347-1355
2) Yamamoto et al (1996) J. Biochem. 120: 104-110
3) Gilbert et al (1996) J. Biol. Chem. 271: 28271-28276
La especificidad del sustrato de las sialiltransferasas constituye sólo el primer criterio que un enzima debe satisfacer para establecer un procedimiento para la sialilación de las glicoproteínas transgénicas o recombinantes comercialmente importantes. La sialiltransferasa debe también ser capaz de llevar a cabo eficiente y completamente la sialilación para diversas glicoproteínas, manteniendo la escala hasta 1-10 kg de la glicoproteína recombinante, con unos requerimientos de infraestructura y de coste relativamente bajo. No existen informes publicados que documenten que alguna de estas sialiltransferasas son apropiadas para establecer un procedimiento práctico que cumpla con estos requerimientos.
Un ejemplo de una sialiltransferasa que es útil en los procedimientos que se reivindican es la ST3Gal III, a la que también se alude como \alpha(2,3)sialiltransferasa (EC 2.4.99.6). Este enzima cataliza la transferencia del ácido siálico a la Gal de un glucósido Gal\beta1,3GlcNAc ó Gal\beta1,4GlcNAc (véase, por ejemplo, Wen et al (1992) J. Biol. Chem.,267:21011; Van den Eijnden et al (1991) J. Biol. Chem, 256:3159) y es responsable de la sialilación de los oligosacáridos unidos a la asparagina en las glicoproteínas. El ácido siálico está unido a una Gal con la formación de un enlace \alpha entre los dos sacáridos. La unión, entre los sácaridos tiene lugar entre la posición 2 de NeuAc y la posición 3 de GAl. Este enzima particular puede aislarse del hígado de la rata (Weinstein et al. (1982) J. Biol. Chem., 257:13845; se conocen las secuencias del cADN humano (Sasaki et al (1993), J. Biol. Chem. 268:22782-22787; Kitagawa & Paulson (1994) J. Biol. Chem. 269:1394-1401) y del ADN genómico (Kitagawa et al (1996) J.Biol.Chem. 271:931-938, que facilitan la producción de este enzima mediante la expresión recombinante. En una forma de realización preferida, los procedimientos de sialilación que se reivindican utilizan una ST3Gal III de rata.
Otras sialiltransferasas, que incluyen las que se listan en la Tabla 1, pueden ser útiles asimismo en un proceso a gran escala, eficiente y económico, para la sialilación de glicoproteínas comercialmente importantes. Como una prueba simple para encontrar la utilidad de estos otros enzimas, se hacen reaccionar diversas cantidades de cada enzima (1-100 mU/mg de proteína) con asialo-\alpha_{1} AGP (a 1-10 mg/ml) para comparar la capacidad de la sialiltransferasa de interés para realizar la sialilación de las glicoproteínas respecto a cada una de las sialiltransferasas ST6Gal I o ST3Gal III, o respecto a ambas. Alternativamente, otras glicoproteínas o glucopéptidos, u oligosacáridos unidos al N, liberados enzimáticamente de la estructura peptídica, pueden utilizarse en lugar de asialo-\alpha_{1} AGP para esta evaluación. Las sialiltransferasas que muestran una capacidad para llevar a cabo la sialilación de los oligosacáridos de las glicoproteínas unidos al N de un modo más eficiente que ST6Gal I pueden mostrarse útiles en un procedimiento parcial a gran escala para la sialilación de las glicoproteínas (tal como se ilustra para la ST3Gal III en la presente exposición).
La invención proporciona también procedimientos para alterar el patrón de sialilación de una glicoproteína, añadiendo ácido siálico en un enlace \alpha2,6Gal, así como en uno \alpha2,3Gal, encontrándose ambos en los oligosacáridos unidos al N de las glicoproteínas del plasma humano. En esta forma de realización, las sialiltransferasas ST3Gal III y ST6Gal I se encuentran las dos en la reacción, y proporcionan proteínas que poseen una proporción reproducible de los dos enlaces formados en la reacción de resialilación. De este modo, una mezcla de los dos enzimas puede ser de valor si se desean ambos enlaces en el producto final.
Un aceptor para la sialiltransferasa se encontrará en la glicoproteína que va a modificarse mediante los procedimientos de la presente invención. Los aceptores apropiados incluyen, por ejemplo, aceptores galactosílicos tales como Gal\beta1,4GlcNAc, Gal\beta1,4GalNAc, Gal\beta1,3GalNAc, lacto-N-tetraosa, Gal\beta1,3GlcNAc, Gal\beta1,3Ara, Gal\beta1,6GlcNAc, Gal\beta1,4Glc (lactosa), y otros aceptores conocidos para los expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Paulson et al (1978). J. Biol.Chem. 253:5617-5624). Típicamente, los aceptores se incluyen en las cadenas de oligosacáridos que están unidas a los residuos de asparagina, serina, o treonina que se encuentran en la proteína.
En una forma de realización, un aceptor para la sialiltransferasa se encuentra en la glicoproteína que va a modificarse después de la síntesis in vivo de ésta. Dichas glicoproteínas pueden someterse a sialilación utilizando los procedimientos que se reivindican, sin una modificación previa del patrón de glucosilación de la glicoproteína. Alternativamente, los procedimientos de la invención pueden utilizarse para alterar el patrón de sialilación de una glicoproteína que se ha modificado anteriormente a la sialilación. Por ejemplo, para llevar a cabo la sialilación de una proteína que no incluye un aceptor apropiado, se puede modificar la proteína para incluir un aceptor mediante procedimientos conocidos por los expertos en la materia. El aceptor puede sintetizarse uniendo un residuo de galactosa a, por ejemplo, una GlcNAc u otra fracción sacárida apropiada que está unida a la proteína. Los oligosacáridos unidos a la glicoproteína pueden ser "preparados" en primer lugar, totalmente o en parte, para exponerlos a un aceptor para la sialiltransferasa o a una fracción a la cual pueden añadirse uno o más residuos apropiados para obtener un aceptor apropiado. Enzimas tales como las glucosiltransferasas y las endoglucosidasas son útiles para la unión y las reacciones de "preparación". Los procedimientos que se reivindican son también útiles para la síntesis de una fracción sacárida que finaliza en el ácido siálico sobre una proteína que no está glucosilada en su forma original. Un aceptor apropiado para la sialiltransferasa se une a dichas proteínas mediante procedimientos conocidos por los expertos en la técnica anterior a la sialilación, utilizando los procedimientos de la presente invención. Véase, por ejemplo, la Patente US nº 5.272.066 para los procedimientos de obtención de polipéptidos que tienen aceptores apropiados para la sialilación.
Así, en una forma de realización, la invención proporciona procedimientos para la sialilación in vitro de grupos sacáridos que se encuentran en una glicoproteína, que implican, en primer lugar, la modificación de la glicoproteína para crear un aceptor apropiado. Un procedimiento preferido para la síntesis de un aceptor, implica la utilización de una galactosiltransferasa. Las etapas para estos procedimientos incluyen:
(a) la galactosilación de un compuesto de fórmula GlcNR'\beta(1 \rightarrow 3)Gal\beta-OR con una galactosiltransferasa, en presencia de una UDP-galactosa bajo condiciones suficientes para formar el compuesto: Gal\beta(1 \rightarrow 4)GlcNR'\beta1 \rightarrow 3)Gal\beta-OR; y
(b) la sialilación del compuesto formado en (a) con una sialiltransferasa en presencia de un derivado CMP de un ácido siálico, utilizando una \alpha(2,3) sialiltransferasa bajo condiciones en las que el ácido siálico es transferido al azúcar no reductor para formar el compuesto: NeuAc\alpha(2 \rightarrow 3)Gal\beta(1 \rightarrow 4)GlcNR'\beta(1 \rightarrow 3)Gal\beta-OR. En esta fórmula, R es un aminoácido, un sacárido, un oligosacárido o un grupo aglicon que tienen por lo menos un átomo de carbono. R' puede ser, bien un acetilo o un aliloxicarbonilo (Alloc). R se une a, o forma parte de una glicoproteína.
Las etapas de galactosilación y sialilación se llevan preferentemente a cabo enzimáticamente, realizando la primera preferentemente como parte de un ciclo galactosiltransferásico y la etapa de sialilación, como parte, preferentemente, de un ciclo sialiltransferásico. Se han descrito las condiciones preferidas y las descripciones de otras especies y enzimas en cada uno de estos ciclos. En una forma de realización preferida, las etapas de galactosilación y sialilación se llevan a cabo en una mezcla reactiva única que contiene tanto la sialiltransferasa como la galactosiltransferasa. En esta forma de realización, los enzimas y sustratos pueden combinarse en una mezcla reactiva inicial, o preferentemente, los enzimas y reactivos para un segundo ciclo glucosiltransferásico pueden añadirse al medio de reacción una vez que el primer ciclo glucosiltransferásico haya casi finalizado. Llevando a cabo dos ciclos glucosiltransferásicos secuenciales en un único recipiente, los rendimientos totales experimentan una mejoría respecto a los procedimientos en los que se aísla una especie intermediaria. Además, se reduce la eliminación y disposición de los extra disolventes y los derivados.
En una forma de realización preferida, la sialilación de la glicoproteína se lleva a cabo utilizando un ciclo sialiltransferásico, que incluye un sistema de reciclado de CMP-ácido siálico que utiliza CMP-ácido siálico sintetasa. El CMP-ácido siálico es relativamente caro, por lo que la síntesis in situ de esta fracción donadora de ácido siálico aumenta las ventajas económicas proporcionadas por los procedimientos que se reivindican. Los ciclos sialiltransferásicos se describen, por ejemplo, en la Patente US nº 5.374.541. El sistema que regenera el CMP-ácido siálico que se utiliza en esta forma de realización, comprende el monofosfato de citidina (CMP), un trifosfato nucleósido, un donador de fosfato, una quinasa capaz de transferir el fosfato desde el donador de fosfato a los difosfato nucleósidos y una nucleósido monofosfato quinasa, capaz de transferir el fosfato terminal desde un nucleósido trifosfato al CMP.
El sistema de regeneración utiliza asimismo CMP-ácido siálico y sintetasa, que transfiere el ácido siálico a CTP. La CMP-ácido siálico sintetasa puede aislarse y purificarse a partir de células y tejidos que contiene el enzima sintetasa mediante procedimientos bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Gross et al (1987) Eur. J. Biochem., 168:595; Vijay et al. (1975) J. Biol.Chem. 250:164; Zapata et al (1989) J. Biol. Chem. 264:14769; e Higa et al (1985) J.Biol. Chem., 260:8838. El gen para este enzima también se ha secuenciado. Véase, Vann et al (1987) J. Biol. Chem., 262:17556. Se ha informado de la sobreexpresión del gen para uso en la síntesis a gran escala de CMP-NeuAc. Véase, Shames et al (1991) Glycobiology, 1:187. Este enzima también está disponible comercialmente.
Los nucleósidos trifosfato apropiados para la utilización según el sistema de regeneración CMP-ácido siálico son la adenosina trifosfato (ATP), la citidina trifosfato (CTP), la uridina trifosfato (UTP), la guanosina trifosfato (GTP), la inosina trifosfato (ITP) y la timidina trifosfato (TTP). Un nucleósido trifosfato preferido es el ATP.
Las nucleósido monofosfato quinasas son enzimas que catalizan la fosforilación de los nucleósido monofosfatos. La nucleósido monofosfato quinasa (NMK) o mioquinasa (MK; EC 2.7.4.3) utilizada según el sistema de regeneración CMP-ácido siálico de la presente invención, se utilizan para catalizar la fosforilación de CMP. Los NMK's están comercialmente disponibles (Sigma Chem. Co., St. Louis, MO; Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind.).
Un donador de fosfato y una cantidad catalítica de una quinasa que catalice la transferencia de fosfato desde el donador de éste a un nucleótido activante, forman también parte del sistema de regeneración CMP-ácido siálico. El donador de fosfato del sistema de regeneración es un compuesto fosforilado, cuyo grupo fosfato puede utilizarse para fosforilar el nucleósido fosfato. La única limitación en la selección de un donador de fosfato es que ni las formas fosforiladas ni las defosforiladas del donador del fosfato pueden interferir sustancialmente con ninguna de las reacciones que están implicadas en la formación del galactosil glucósido sialilado. Los donadores de fosfato preferidos son el fosfoenolpiruvato (PEP), el fosfato de creatina y el acetil fosfato. Un donador de fosfato particularmente preferido es PEP.
La selección de una quinasa particular para uso en un ciclo del ácido siálico depende del donador de fosfato utilizado. Cuando el acetil fosfato se utiliza como donador de fosfato, la quinasa es la acetilquinasa; la creatin quinasa se utiliza para un donador de creatin fosfato, y cuando se utiliza PEP como un donador de fosfato, la quinasa es la piruvato quinasa (PK; EC 2.7.1.40.) Pueden utilizarse otras quinasas con otros donadores de fosfato, como es bien conocido por los expertos en la técnica. Las quinasas están disponibles comercialmente (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo; Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind).
A causa del carácter cíclico y auto-contenido de este procedimiento de glucosilación, una vez que todos los reactantes y enzimas están presentes, la reacción continua hasta que el primero de los sustratos estequiométricos (por ejemplo) Neu5Ac libre y PEP, o el aceptor), se consume.
En el ciclo de sialilación, CMP se convierte a CDP mediante la nucleósido nonofosfato quinasa en presencia del ATP añadido. ATP se regenera catalíticamente a partir de su derivado, ADP, mediante la piruvato quinasa (PK) en presencia del fosfoenolpiruvato añadido (PEP). El CDP se convierte ulteriormente a CTP, la cual conversión es catalizada por PK en presencia de PEP. CTP reacciona con el ácido siálico para formar pirofosfato inorgánico (PPi) y CMP-ácido siálico, catalizándose esta última reacción por la CMP-siálico sintetasa. Después de la sialilación del galactosil glucósido, el CMP liberado vuelve a penetrar en el sistema de regeneración, para volver a formar CDP, CTP y CMP-ácido siálico. El PPi formado es barrido tal como se comenta más adelante, y forma el fosfato inorgánico (Pi) como un derivado. El piruvato es también un derivado.
El derivado piruvato puede también utilizar otra reacción en la que reacciona con la N-acetilmanosamina (ManNAc) en presencia de NeuAc aldolasa (EC 4.1.3.3) para formar ácido siálico. De esta forma, el ácido siálico puede reemplazarse por ManNAc y una cantidad catalítica de NeuAc aldolasa. Aunque NeuAc aldolasa cataliza también la reacción inversa (NeuAc a ManNAc y piruvato), el NeuAc producido se incorpora irreversiblemente al ciclo reactivo a través de CMP-NeuAc catalizado por la CMP-ácido siálico sintetasa. Esta síntesis enzimática del ácido siálico y de sus derivados sustituidos en la posición 9 y la utilización de un ácido siálico resultante en un esquema reactivo de sialilación distinto, se da a conocer en la solicitud Internacional de Patente WO 92/16640, publicado el 1 de octubre de 1992.
Tal como se utiliza en la presente memoria, el término "eliminador de pirofosfatos") se refiere a sustancias que sirven para sustraer el pirofosfato inorgánico de una mezcla reactiva de la presente invención. El pirofosfato inorgánico (PPi) constituye un derivado de la preparación de CMP-Neu5Ac. El PPi producido puede retroalimentarse para inhibir otros enzimas, de forma que la glucosilación se reduzca. Sin embargo, el PPi puede degradarse enzimáticamente o mediante medios físicos tales como el secuestro por una sustancia que se una a él. Preferentemente, el PPi es eliminado mediante hidrólisis utilizando pirofosfatasa inorgánica (PPasa; EC 3.6.1.1), un enzima catabólico del PPi disponible comercialmente (Sigma Chem. Co., St. Louis, Mo; Boehringer Mannheim, Indianapolis, Ind), y que o un enzima similar sirve como el eliminador del pirofosfato. Un procedimiento para la eliminación del PPi o del Pi de la mezcla reactiva es mantener una concentración catiónica de metales divalentes en el medio. En particular, los cationes y el fosfato ninorgánico producido, forman un complejo de muy escasa solubilidad. Suplementando los cationes que se han perdido por precipitación con pirofosfato, la velocidad de reacción puede conservarse y finalizarse las reacciones (es decir, llevarse a cabo hasta obtener una conversión del 100%). La suplementación puede llevarse a cabo continuamente (por ejemplo, automáticamente) o discontinuamente. Cuando la concentración catiónica se mantiene de esta forma, el ciclo de reacción transferásica puede conducirse a la finalización.
Para los ciclos glucosiltransferásicos, las concentraciones o cantidades de los diversos reactantes utilizados en los procedimientos, dependen de numerosos factores que incluyen condiciones de reacción tales como la temperatura y el valor del pH, y la selección y la cantidad de los sacáridos aceptores que van a ser glucosilados. A causa de que los procesos de glucosilación permiten la regeneración de los nucleótidos activantes, los azúcares donadores activados y la eliminación del PPi producido en presencia de cantidades catalíticas de los enzimas, el procedimiento está limitado por las concentraciones o cantidades de los sustratos estequiométricos que anteriormente se consideraron. El límite superior para las concentraciones de reactantes que pueden utilizarse según el procedimiento de la presente invención, está determinado por la solubilidad de dichos reactantes. Preferentemente, las concentraciones de los nucleótidos activantes, de los donantes de fosfato, del azúcar donante y de los enzimas, se seleccionan de tal modo que la glucosilación tiene lugar hasta que el aceptor se consume, sialilando completamente de esta forma los grupos sacáridos que se encuentran sobre la glicoproteína.
Las cantidades o concentraciones enzimáticas se expresan en Unidades de actividad, que constituye una medida de la tasa inicial de catálisis. Una unidad de actividad cataliza la formación de 1 \mumol de producto por minuto a una temperatura dada (típicamente 37ºC) y un valor del pH (típicamente 7,5). Así, 10 Unidades de un enzima constituyen una cantidad catalítica del e enzima donde 10 \mumols de sustrato se convierten en 10 \mumol de producto en un minuto a una temperatura de 37ºC y con un valor de pH de 7,5.
Los ingredientes anteriores se combinan mezclándolos en medio acuoso de reacción (solución). Ese medio posee un valor d de pH de alrededor de 6 a alrededor de 8,5. El medio está desprovisto de quelantes que se unan a cofactores enzimáticos t tales como Mg^{+2} o Mn_{2}^{+2} La selección de un medio se basa en la capacidad del medio para conservar el valor del pH en el nivel d deseado. Así, en algunas formas de realización, el medio se tampona hasta un valor pH de alrededor de 7,5, preferentemente con HEPES. Si no se utiliza un tampón, el pH del medio deberá mantenerse entre 6 y 8,5 aproximadamente, preferentemente entre 7,2 y 7,8 aproximadamente, añadiendo la base. Una base apropiada es NaOH, preferentemente 6M NaOH.
El medio reactivo puede también incluir detergentes solubilizantes (por ejemplo, Triton o SDS) y disolventes orgánicos tales como metanol o etanol, si es necesario. Los enzimas pueden utilizarse libres en solución o puede unirse a un soporte tal como un polímero. La mezcla reactiva es, al principio, por tanto, sustancialmente homogénea, aunque puede formarse algo de precipitado durante la reacción.
La temperatura a la cual un procedimiento como el anteriormente mencionado se lleva a cabo puede oscilar desde justamente por encima de la temperatura de congelación a la temperatura a la cual el enzima más sensible se desnaturaliza. Ese intervalo de temperatura es preferentemente de entre cero grados C a alrededor de 45ºC, y más preferentemente entre 20ºC aproximadamente hasta 37ºC.
La mezcla reactiva así formada se mantiene durante un período de tiempo suficiente para que el porcentaje deseado de residuos terminales de galactosa que se encuentran sobre los grupos sacáridos unidos a la glicoproteína, sean sialilados. Para las preparaciones a escala comercial, se dejará que la reacción se prolongue, a menudo, durante 8-240 horas, siendo lo más típico un tiempo de entre 24 y 48 horas aproximadamente.
Los ejemplos siguientes se ofrecen para ilustrar, pero no para limitar, la presente invención.
Ejemplo 1 Sialilación de glicoproteínas recombinantes utilizando ST3Gal III
Se examinaron varias glicoproteínas respecto a su capacidad para ser sialiladas mediante ST3Gal III recombinantes de rata. P Para cada una de estas glicoproteínas, la sialilación o constituirá una etapa valiosa del procedimiento en el desarrollo de las glicoproteínas respectivas como productos comerciales.
Condiciones reactivas
Las condiciones de la reacción fueron las que se resumen en la Tabla 2. Las reacciones sialiltransferásicas se llevaron a cabo durante 24 horas a una temperatura entre la ambiental y los 37ºC. El grado de sialilación se estableció determinando la cantidad de C^{14}-NeuAc que se incorporó a los oligosacáridos unidos a las glicoproteínas.
Resultados y discusión
Los resultados que se presentan en la Tabla 2 demuestran que, en cada caso, se alcanzó un grado notable de sialilación, a pesar de los bajos niveles de enzima utilizados (esencialmente, la sialilación completa se obtuvo basándose en la estimación de la galactosa terminal disponible). La tabla 2 muestra la cantidad de enzima utilizado por mg de proteína (mU/mg), como base de comparación para varios estudios. En varios de los ejemplos que se muestran, sólo se requirieron 7-13 mU de ST3Gal III por mg de proteína, para procurar una sialilación esencialmente completa después de 24 horas.
Estos resultados contrastan con los obtenidos en estudios detallados con ST6Gal I bovina, en los que una cantidad superior a 50 mU/mg de proteína dieron lugar a una sialilación, menor del 50%, y 1070 mU/mg de proteína dieron lugar a una salilación en 24 horas, del 85 a 90% aproximadamente. Paulson et al (1977) J. Biol.Chem. 252:2363-2371; Paulson et al (1978) J. Biol.Chem. 253:5617-5624. Un estudio de las sialiltransferasas \alpha2,3 y \alpha2,6 por otro grupo de investigadores, encontró que la sialilación completa de asialo-\alpha_{1}AGP necesitaba de concentraciones enzimáticas de 150 a 250 mU/mg de proteínas. Weinstein et al. (1982) J. Biol.Chem. 257:13845-13853. Estos estudios más tempranos, en conjunto, sugirieron que la ST6Gal I sialiltransferasa requiere una cantidad superior a 50 mU/mg y hasta 150 mU/mg para alcanzar una sialilación completa.
Este Ejemplo demuestra que la sialilación de las glicoproteínas recombinantes utilizando la ST3Gal III sialiltransferasa requiere mucho menos enzima que el esperado. Para una reacción de escala de un kilogramo, se necesitarían 7.000 unidades de ST3Gal III sialiltransferasa, en vez de las 100.000 a 150.000 unidades que los estudios previos indicaban. La purificación de estos enzimas a partir de las fuentes naturales es prohibitiva, con rendimientos de sólo 1 a 10 unidades para una preparación a gran escala después de 1 a 2 meses de trabajo. Asumiendo que tanto la sialiltransferasa ST6Gal I como la ST3Gal III son producidas como sialiltransferasas recombinantes, alcanzándose niveles iguales de expresión de ambos enzimas, para la ST6Gal I sialiltranferasa se requeriría una escala fermentativa 14-21 veces superior (o más) que para la ST3Gal III sialiltranferasa. Para la ST6Gal I sialiltransferasa, se ha informado de niveles de expresión de 0,3 U/l en las levaduras. Borsig et al. (1995) Biochem. Biophys. Res. Commun. 210:14-20. Niveles de expresión de 1000 U/litro de la ST3Gal III sialiltransferasa se han alcanzado en Aspergillus niger. A los niveles habituales de expresión, se requerirán 300 a 450.000 litros de fermentación de las levaduras para producir suficiente enzima para la sialilación de 1 kg de glicoproteína utilizando la ST6Gal I sialiltransferasa. Por contraste, se requerirían menos de 10 litros de la fermentación de Aspergillus niger para la sialilación de 1 kg de glicoproteínas utilizando la ST3Gal III sialiltransferasa. Así, la capacidad fermentativa requerida para producir la ST3Gal III sialiltransferasa para una reacción de sialilación a gran escala, será 10 a 100 veces menor que la necesaria para producir la ST6Gal I; el coste de la producción de la sialiltransferasa se reducirá proporcionalmente.
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Ejemplo 2 Cinética de la sialilación de las glicoproteínas recombinantes utilizando ST3Gal III Condiciones de la reacción
Las mezclas de ensayos (volumen total de 500 \mul) estaban formadas por: 25 mM MES pH 6,0, Triton CF-54 al 0,5% (vol/vol), 2 mg/ml BSA, Azida de sodio al 0,04%, 1 mg de \alpha1-ácido glicoproteínas tratadas con 1 mg de neuraminidasa, sialiltransferasa (2-100 mUnidad/ml), y 3400 nmoles de CMP-ácido siálico, al que se añadió un trazador CMP-[^{14}C]SA para hacer un seguimiento del grado de sialilación. La ST3Gal III se produjo de modo recombinante, mientras que la ST6Gal I se purificó a partir del calostro bovino. La concentración de \alpha1-ácido glicoproteína tratada con neuraminidasa se determinó mediante absorción, utilizando un coeficiente de extinción predeterminado (\varepsilon278= 0,894 para 1 mg) y mediante la cantidad de galactosa terminal, tal como se determina mediante el ensayo de galactosa deshidrogenasa (Wallenfels y Kurz,G. (1966) Meth. Enzymol. 9:112-116).
Después de los tiempos de incubación indicados a 37ºC, el grado de sialilación de la \alpha1-ácido glicoproteína tratada con n neuraminidasa se determinó eliminando alícuotas de 50 \mul (10%) de la mezcla reactiva, precipitándose el aceptor glucoproteico con 1 ml de ácido fosfotúngstico al 1% en 0,5 M HCl para separarlo del donador CMP-SA. El sedimento se lavó dos veces con ácido fosfotúngstico, seguido por la disolución del sedimento en 400 \mul de cloroformo/metanol 1:1 (vol/vol) de 4ºC durante 20 minutos. Después de que se obtuviera un sedimento final mediante centrifugación, se desechó el sobrenadante y se dejó que el sedimento se secara. El sedimento se disolvió entonces en 400 \mul de 0,2 M NaCl, 0,5 N NaOH a 37ºC durante 1 hora. El sedimento disuelto se transfirió entonces a viales de centelleo para un contaje de centelleo. A partir de cada intervalo de tiempo, se restaron controles negativos representados por la omisión del aceptor.
Resultados y discusión
En la Figura 1 se muestra el curso temporal de la sialilación utilizando ST3Gal III a una concentración de 20 m Unidad/ml (10 mU/mg aceptor). Estos resultados demuestran que ST3Gal III lleva a cabo eficientemente la sialilación de los residuos abiertos de galactosa sobre la \alpha1-ácido glicoproteína tratada con neuraminidasa. De hecho, más del 80% de la sialilación se obtiene en una hora. La consecución de u una sialilación superior al 80% en una hora es significativo, porque las glicoproteínas recombinantes de valor terapéutico pueden perder la bioactividad con tiempos prolongados de incubación a 37ºC.
Debe tenerse en cuenta que la \alpha1-ácido glicoproteína tratada c con neuraminidasa constituye una glicoproteína particularmente difícil de someter completamente a la sialilación, debido a los múltiples oligosacáridos tri y tetra antenarios unidos al N. De hecho, la utilización como un aceptor ST3Gal III de la \alpha1-ácido glicoproteína tratada con neuraminidasa, es superior a otra sialiltransferasa habitual, la ST6Gal I, aislada del calostro bovino. Una comparación de las capacidades de sialilación de estos dos enzimas utilizando la \alpha1-ácido glicoproteína tratada con neuraminidasa como aceptor, se muestra en la Figura 2. Estos resultados demuestran que ST3Ga lIII es superior a ST6Gal I en cada punto temporal examinado, particularmente con tiempos de incubación más cortos. En una hora, ST3Gal III había experimentado una sililación del 80% de los residuos aceptores abiertos de galactosa, mientras que sólo el 30% de los sitios se saturaron con ST6Gal I.
Cuando distintos lotes de \alpha1-ácido glicoproteína tratados con neuraminidasa se utilizaron como aceptores, utilizando condiciones de ensayo similares, la saturación porcentual de los residuos abiertos de galactosa osciló entre 75% y 99% para la ST3Gal III y entre 42% y 60% para la ST6Gal I en 24 horas. Estos resultados representan experimentos en los que ST3Gal III y ST6Gal I se comparan en paralelo utilizando condiciones idénticas tal como se definieron anteriormente. Para estos experimentos, el aceptor de la \alpha1-ácido glicoproteína tratada con neuraminidasa se separa del donador mediante filtración en gel, tal como se describe previamente (Weinstein et al. (1982) J. Biol. Chem. 257: 13845-13853).
En cada caso examinado, ST3Gal III llevó a cabo la sialilación del aceptor a un nivel significativamente superior que el grado de sialilación alcanzado con ST6Gal I hasta las 24 horas.
Además de examinar las sialiltransferasas anteriores citadas de mamíferos, se examinaron dos sialiltransferasas bacterianas respecto a su capacidad para efectuar la sialilación de la \alpha1-ácido glicoproteína. Un hallazgo no anticipado fue que una 2,3 sialiltransferasa recombinante de Neisseria meningitidis no transfirió ácido siálico a la \alpha1-ácido glicoproteína en condiciones en las cuales realiza la sialilación de oligosacáridos que contienen Gal\beta1,4 terminal, tal como LNnT y lactosa. Por el contrario, una 2,6 sialiltransferasa purificada de Photobacterium damsela incorporó eficientemente ácido siálico a la \alpha-ácido glicoproteína tratada con neuraminidasa como aceptor.
Ejemplo 3 Identificación de sialiltransferasas útiles en procedimientos para la modificación comercial práctica de la glicoproteína
En la Tabla 3 que sigue a continuación, miembros de la familia génica sialiltransferásica de los mamíferos se expresan de modo recombinante y se examinan en cuanto a su capacidad para llevar a cabo la sialilación de diversas glicoproteínas de forma comercialmente práctica.
TABLA 3 Sialiltransferasas de mamíferos
Sialiltransferasa Secuencias formadas
ST3Gal I Neu5Ac\alpha2,3Gal\beta1,3GalNAc
ST3Gal II Neu5Ac\alpha2,3Gal\beta1,4GlcNAc
ST3Gal IV Neu5Ac\alpha2,3Gal\beta1,4GlcNAc
Neu5Ac\alpha2,3Gal\beta1,3GlcNAc
ST5GalNAc I Neu5Ac2,6GalNAc
Gal\beta1,3GalNAc(Neu5Ac\alpha2,6)
Gal\beta1,3GalNAc(Neu5Ac\alpha2,6)
Neu5Ac\alpha2,3Gal\beta1,3GalNAc(Neu5Ac\alpha2,6)
ST6GalNAc II Neu5Ac2,6GalNAc
Gal\beta1,3GalNAc(Neu5Ac\alpha2,6)
ST6GaNAc III Neu5Ac\alpha2,3Gal\beta1,3GalNAc(Neu5Ac\alpha2,6)
Las sialiltransferasas capaces de sializar glicoproteínas hasta un nivel de por lo menos el 80%, no utilizando más de 50 mUnidades/mg del aceptor, se consideran "prácticas" para emplearlas en la modificación de las glicoproteínas a escala comercial. El análisis utiliza condiciones del ensayo que son prácticas para uso en una amplia escala, por ejemplo, 1 a 10 mg/ml del aceptor glucoproteico y una concentración sialiltransferásica de (2 a 50 mUnidad/mg del aceptor). La cantidad de residuos de galactosa abiertos se determina mediante el ensayo de galactosa deshidrogenasa (Wallenfels et al., supra). Después de tiempos apropiados de incubación a 37ºC, el grado de glicoproteínas se evalúa eliminando alicuotas de la mezcla reactiva y separando las glicoproteínas del donador CMP-SA mediante precipitación o mediante filtración en gel.
Además, en la Tabla 4 se muestran sialiltransferasas bacterianas recombinantes o purificadas, que pueden examinarse. Una vez más, la concentración sialiltransferásica no excede de 50 mUnidades/mg del aceptor glucoproteico, siendo las concentraciones glucoproteicas del orden de 1 a 10 mg/ml.
TABLA 4 Sialiltransferasas bacterianas
Sialiltransferasa Organismo Estructura formada
Sialiltransferasa N. meningitidis Neu5Ac\alpha2,3Gal\beta1,4GlcNAc
N. gonorrheae
ST3Gal VI Campylobacter jejuni Neu5Ac\alpha2,3Gal\beta1,4GlcNAc (también
ST3Gal VII Haemophilus somnus Neu5Ac\alpha2,3Gal\beta1,3GlcNAc)
H. influenzae
ST3Gal VIII
ST6Gal II Photobacterium damsela Neu5Ac\alpha2,6Gal\beta1,4GlcNAc
Las sialiltransferasas bacterianas y de mamífero que se listan en las Tablas 3 y 4, se ensayan respecto a su capacidad para llevar completamente a cabo la sialilación de las glicoproteínas expresadas recombinante o transgénicamente, tal como las que se dan a conocer a continuación en la Tabla 5. Esta lista no significa que sea exhaustiva, pero en vez de eso proporciona ejemplos de glicoproteínas de conocida utilidad terapéutica, en las que la sialilación completa puede alterar favorablemente la farmacocinética o la actividad biológica de la glicoproteína. Las glicoproteínas utilizadas en estos experimentos pueden ser producidas en un animal transgénico, o en una célula eucariótica o progenie celular.
En este experimento, el grado de sialilación y el tipo de glucano que modifica la glicoproteína de interés se examina utilizando técnicas bioquímicas estándar, tales como electroforesis en gel, HPLC y espectrometría de masas. Esta información estructural se utiliza para seleccionar sialiltransferasas con las características de especificidad correcta para realizar completamente (o tanto como sea posible) la sialilación, juzgado mediante la electroforesis en gel o la HPLC de los glucanos resultantes. En este momento, la farmacocinética de la glicoproteína completamente sialilada puede compararse con la de la glicoproteína no completamente sialilada, mediante examen en pequeños animales.
Se reconoce que ciertas glicoproteínas requerirán una combinación de sialiltransferasas, dada la naturaleza estereoquímica y regioselectiva de este tipo de enzimas. Por tanto, se examinan combinaciones de sialiltransferasas utilizando las condiciones definidas, respecto a su potencial practicabilidad a gran escala en la remodelación de las glicoproteínas. Esto posee una importancia particular cuando se examinan glicoproteínas con ambos N unidos, así como glucanos, tanto unidos al O como modificados mediante oligosacáridos muy ramificados. A este respecto, las sialiltransferasas que exhiben especificidades múltiples tales como ST3Gal IV y la sialiltranferasa de Campylobacter pueden ser particularmente útiles como enzimas de remodelación únicos cuando llevan a cabo la sialilación de glicoproteínas con múltiples glucanos unidos al N y al O.
TABLA 5 Candidatos de sialilación de glicoproteínas
\alpha-1-anti-tripsina
Activador del plasminógeno tisular
Eritropoyetina
Factor estimulante colonial de granulocitos-macrófagos (GMCSF)
Anti-trombina III
Hormona humana del crecimiento
Interleuquina 6 humana
Interferón \beta
Proteína C
Fibrinógeno
Factor IX
Factor VII
Factor de necrosis tumoral
Proteína del receptor del factor de necrosis tumoral
Se entiende que los ejemplos y formas de realización descritos en la presente memoria tienen sólo finalidad ilustrativa y que, a su luz, se sugerirán a los expertos en la materia varias modificaciones o cambios, incluyéndose en el alcance de las reivindicaciones que se adjuntan.

Claims (15)

1. Utilización de un enzima sialiltransferasa para obtener por lo menos una sialilación de aproximadamente el 80% de los grupos sacáridos de una glicoproteína diana en un procedimiento de sialilación in vitro a gran escala, utilizándose dicho enzima sialiltransferasa con una concentración de 50 mU/mg de glicoproteína o menos, juntamente con una fracción donante de ácido siálico.
2. Utilización según la reivindicación 1, en la que la sialiltransferasa se utiliza
(a)
a una concentración de entre 5 y 25 mU aproximadamente por mg de glicoproteína, o
(b)
a una concentración de entre 10 y 50 mU/ml aproximadamente de la mezcla reactiva, encontrándose la glicoproteína en la mezcla reactiva a una concentración de por lo menos 2 mg/ml aproximadamente.
3. Utilización según la reivindicación 1 ó la reivindicación 2, en la que el ácido siálico se selecciona de entre el grupo formado por NeuAc y NeuGc.
4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la sialiltransferasa es una sialiltransferasa bacteriana o recombinante, preferentemente una sialiltransferasa bacteriana recombinante.
5. Utilización según la reivindicación 1, en la que la glicoproteína es una glicoproteína recombinante, comprendiendo el procedimiento de sialilación la puesta en contacto de un grupo sacárido, que comprende una fracción aceptora de N-acetilgalactosamina o de galactosa sobre una glicoproteína recombinante con una fracción donante de ácido siálico y
(a)
una sialiltransferasa recombinante, o
(b)
una sialiltransferasa bacteriana, preferentemente una sialiltransferasa bacteriana recombinante,
en una mezcla reactiva que proporciona los reactantes requeridos para la actividad sialiltransferásica durante un periodo de tiempo suficiente y bajo las condiciones apropiadas para la transferencia de ácido siálico desde dicha fracción donante de ácido siálico a dicho grupo sacárido.
6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la fracción donante de ácido siálico es CMP-ácido siálico, generándose preferentemente el CMP-ácido siálico enzimáticamente in situ.
7. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la sialiltransferasa es una sialiltransferasa recombinante a la que le falta sustancialmente un dominio que atraviesa la membrana, preferentemente una sialiltransferasa eucariótica.
8. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la sialiltransferasa incluye un motivo sialilo que posee una secuencia aminoácida que es por lo menos idéntica en aproximadamente un 40% a un motivo sialilo de una sialiltransferasa seleccionada de entre el grupo formado por ST3Gal I, ST6Gal I y ST3Gal III.
9. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la sialiltransferasa se selecciona de entre una ST3Gal III, una ST3Gal III de rata, una ST3Gal IV, o una ST6Gal I.
10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que la sialiltransferasa es una ST3Gal I, comprendiendo preferentemente la mezcla reactiva una segunda sialiltransferasa, siendo dicha segunda sialiltransferasa una ST3Gal III.
11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la sialiltransferasa bacteriana posee una secuencia aminoácida que es:
(a) idéntica en por lo menos un 50% a una secuencia aminoácida de una 2,3-sialiltransferasa de Neisseria meningitidis, preferentemente en la que la sialiltransferasa bacteriana es una 2,3-sialiltranferasa de Neisseria meningitidis;
(b) idéntica en por lo menos un 50% a una secuencia aminoácida de una 2,6-sialiltransferasa de Photobacterium damsela, preferentemente en la que la sialiltransferasa bacteriana es una 2,6-sialiltranferasa de Photobacterium damsela;
(c) idéntica en por lo menos un 50% a una secuencia aminoácida de una 2,3-sialiltransferasa de Haemophilus, preferentemente en la que la sialiltransferasa es una 2,3-sialiltranferasa de Haemophilus;
(d) idéntica en por lo menos un 50% a una secuencia aminoácida de una 2,3-sialiltransferasa de Campylobacter jejuni, preferentemente en la que la sialiltransferasa es una 2,3-sialiltranferasa de Campylobacter jejuni.
12. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 11, en la que la sialiltransferasa se produce mediante expresión recombinante de una sialiltransferasa en una célula huésped seleccionada de entre el grupo formado por una célula de insecto, una célula de mamífero y una célula fúngica, preferentemente en la que la célula huésped es una célula de Aspergillus niger.
13. Utilización para la sialilación in vitro de grupos sacáridos que se encuentran sobre una glicoproteína, comprendiendo el procedimiento la puesta en contacto de los grupos sacáridos con una sialiltransferasa ST3Gal III, una fracción donante de ácido siálico, y otros reactivos que son necesarios para la actividad sialiltransferásica durante un periodo de tiempo suficiente y bajo condiciones para transferir el ácido siálico desde una fracción donante de ácido siálico a dicho grupo sacárido, en la que dicha sialiltransferasa ST3Gal III se encuentra a una concentración menor que 50 mU aproximadamente por mg de glicoproteína, en la que el procedimiento comprende además la puesta en contacto de los grupos sacáridos con una sialiltransferasa ST6Gal I.
14. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, o un procedimiento según la reivindicación 13, en la que la glicoproteína comprende una fracción derivada de una inmunoglobulina.
15. Utilización según la reivindicación 14, en la que la inmunoglobulina es una IgG.
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