ES2219700T3

ES2219700T3 - Expresion regulada de proteinas en celulas de mamiferos transfectadas de manera estable.

Info

Publication number: ES2219700T3
Application number: ES96940158T
Authority: ES
Inventors: Markus Peter Wilhelmus Einerhand; Domenico Valerio
Original assignee: Crucell Holand BV
Current assignee: Janssen Vaccines and Prevention BV
Priority date: 1995-12-01
Filing date: 1996-11-29
Publication date: 2004-12-01
Anticipated expiration: 2016-11-29
Also published as: AU7710996A; DK0870044T3; JP2000501934A; ATE264398T1; DE69632201T2; DE69632201D1; EP0870044B1; WO1997020943A1; EP0870044A1; JP3881382B2; US6140103A

Abstract

LA INVENCION SE ENCUENTRA EN EL CAMPO DE LOS MATERIALES GENETICOS RECOMBINANTES, EN ESPECIAL PARA EL USO EN TERAPIA GENICA. LOS VECTORES QUE SE UTILIZAN PARA TRANFERIR INFORMACION GENETICA ADICIONAL A CELULAS EN EL CAMPO DE LA TERAPIA GENICA A MENUDO SE BASAN EN VIRUS. UN GRUPO DE VIRUS QUE SE HA PROPUESTO PARA SU UTILIZACION PARA LA TRANSFECCION ES EL GRUPO DE LOS PARVOVIRUS, Y EN PARTICULAR SE HA PROPUESTO EL USO DE VIRUS ADENO ASOCIADOS. LA INVENCION DESCRIBE PROCEDIMIENTOS Y MEDIOS MEJORADOS PARA LA TERAPIA GENICA Y PARA PREPARAR PRODUCTOS PARA SER UTILIZADOS EN LA TERAPIA GENICA, QUE UTILIZAN MATERIALES BASADOS EN PARVOVIRUS. LA INVENCION DESCRIBE DE FORMA PARTICULAR LA EXPRESION REGULADA DE GENES BAJO EL CONTROL DE LA COMBINACION DE UN RADICAL REPRESOR Y UN RADICAL ACTIVADOR, EN PARTICULAR PARA LA EXPRESION DE PRODUCTOS QUE SON TOXICOS PARA LA CELULA HUESPED EN LA CUAL SON EXPRESADOS. DE ESTA FORMA ES POSIBLE LOGRAR UNA TRANSFECCION ESTABLE PARA LA EXPRESION DE PROTEINAS TOXICAS DE PARVOVIRUS, DE FORMA QUE, ENTRE OTRAS, SE DESCRIBE UNA LINEA CELULAR DE ENCAPSULACION PARA PRODUCIR LOS PARVOVIRUS RECOMBINANTES, EN PARTICULAR VIRUS ADENO ASOCIADOS, ASI COMO LOS VIRUS PRODUCIDOS EN SU INTERIOR.

Description

Expresión regulada de proteínas en células de mamíferos transfectadas de manera estable.

La presente invención se refiere a moléculas de ADN recombinante que codifican productos de interés, así como a métodos que emplean dichas moléculas. En particular, se refiere a moléculas de ADN recombinante capaces de expresión regulada de uno o más genes en una célula huésped. En particular, la invención se refiere a la expresión de productos que son en cierta manera tóxicos cuando se expresan en una célula huésped. Un buen ejemplo de tal producto o productos son los productos de los genes no estructurales de los parvovirus (PV). Debido a que estos productos son tóxicos para sus células huésped, no es viable planear la expresión constitutiva de dichos productos en células huésped.

Un nivel de expresión elevado de proteínas de PV en células de mamífero transfectadas de manera estable es muy a menudo un objetivo difícil de conseguir cuando se intenta producir células huésped que expresen genes de proteínas de PV introducidos en ellas mediante la tecnología del ADN recombinante. Por ejemplo, niveles elevados de síntesis de proteínas de PV en células humanas son importantes para la producción de células de empaquetamiento para vectores PV recombinantes. En tales células de empaquetamiento el ADN del vector PV recombinante se replica y empaqueta en cápsidas de PV cuando las proteínas del PV son proporcionadas in trans por la célula de empaquetamiento.

El parvovirus Virus Adeno-Asociado (VAA) es un parvovirus humano no patógeno (revisado en ^{1, \ 2}). El virus se replica para dar un ADN de hebra sencilla de 4,6 kb aproximadamente. La hebra más y la hebra menos están empaquetadas y son infecciosas. La replicación eficaz del VAA requiere la coinfección de la célula por un virus cooperador tal como un Adenovirus o el Virus del Herpes Simple. En ausencia de un virus cooperador no se observa una replicación sustancial del VAA. El VAA es por tanto clasificado también como "Dependovirus". Cuando no está presente un virus cooperador, el genoma del VAA se integra en el genoma de la célula huésped.

El virus de tipo salvaje tiene una fuerte preferencia (70%) por un sitio de integración en el brazo largo del cromosoma 19 (19 q13.3)^{3-5}.

Después de la integración, la expresión de los genes del virus no es detectable. El provirus integrado se replica como una parte normal del genoma de la célula huésped después de la división de la célula transducida y acaba en ambas células hijas. Esta etapa del ciclo vital del virus es conocida como etapa latente. Esta etapa latente es muy estable pero puede ser interrumpida después de la infección de la célula transducida por un virus cooperador. Después de la infección por el virus cooperador, el VAA se escinde del genoma de la célula huésped, expresa sus genes y comienza a replicarse. Durante la fase temprana de este ciclo lítico se expresan los genes REP. Después de 16 horas aproximadamente, se expresan las proteínas de la cápsida VP1, VP2 y VP3 y el virus replicado es empaquetado en viriones (la estructura del genoma del VAA y sus genes están representados en la Figura 1). Los viriones se acumulan en el núcleo de la célula y son liberados cuando la célula es lisada como resultado de la acumulación de VAA y del virus cooperador.

El genoma del VAA consta de dos genes rep y cap (Fig. 1). Tres promotores (P5, P19 y P40) conducen la síntesis de ARNms que codifican 4 proteínas Rep (Rep78, Rep68, Rep52 y Rep40) y tres proteínas de la cápsida (VP1, VP2 y VP3). Las proteínas Rep y las proteínas VP están codificadas ambas en marcos de lectura solapantes. Por tanto, las proteínas Rep y también las proteínas VP comparten un extremo carboxiterminal común pero difieren en sus extremos N. El genoma del VAA está flanqueado en ambos lados por una secuencia de 145 pb, denominada Repetición Terminal Invertida (RTI). La RTI contiene toda la información requerida in cis para la replicación, el empaquetamiento y la integración del genoma del VAA. Durante una infección productiva, el promotor P5 es activado primeramente y dirige la producción de Rep78 y Rep68. Estas proteínas son esenciales para la replicación del VAA y la regulación trans de los genes víricos. Las proteínas Rep grandes activan el promotor P19 y el P40. En una infección latente, sin embargo, Rep78 y Rep68 regulan por disminución la expresión del promotor P5 y ayudan a mantener la latencia del VAA (para una revisión ver ^{1}). Las proteínas Rep más pequeñas, Rep52 y Rep40 son codificadas por transcritos procedentes del promotor P19 y son importantes para la formación del virus infeccioso ^{6}. El promotor P40 es el último promotor que resulta activado y la expresión sigue a la expresión de los genes tardíos del adenovirus cooperador. Mediante un ayuste alternativo se producen diferentes ARNms que codifican las proteínas estructurales VP1, VP2 y VP3. VP2 y VP3 son traducidas desde el mismo mensajero, por lo que VP2 comienza en un ACG corriente arriba. Un virión de VAA maduro consta de un 5% de VP1, un 5% de VP2 y un 90% de VP3 ^{7}.

Los primeros vectores VAA recombinantes fueron producidos sustituyendo secuencias de los genes rep o cap por las secuencias de interés ^{8-10}. El genoma del vector fue empaquetado por cotransfección en células infectadas con adenovirus de un plásmido que contenía el vector con un plásmido que contenía el gen del VAA que faltaba o un genoma del VAA recombinante que era demasiado grande para ser empaquetado por la inserción de ADN del fago lambda ^{8-10}. El virus recombinante que era producido de esta forma estaba siempre contaminado con VAA de tipo salvaje (variando del 10-50% en comparación con el título recombinante). Esto era debido presumiblemente a la recombinación entre los dos plásmidos cotransfectados que contenían una región de solapamiento sustancial, o por la pérdida de la secuencia de ADN de lambda. El VAA de tipo salvaje contaminante tenía como resultado una amplificación adicional del rVAA después de la infección de un nuevo lote de células infectadas con adenovirus. Esto daba lugar a títulos de rVAA más elevados, pero producía también la amplificación del VAA de tipo salvaje contaminante ^{8-10}.

Para evitar la producción de VAA de tipo salvaje, se construyó un plásmido de empaquetamiento que no contenía el solapamiento con el plásmido vector ^{11}. Con este plásmido de empaquetamiento es posible generar una solución madre de virus rVAA que esté libre de cantidades detectables de VAA de tipo salvaje y que permita al mismo tiempo la producción de 0,1 a 1 partículas de rVAA por célula ^{11}. Este sistema de empaquetamiento, o sistemas análogos derivados del mismo, son actualmente utilizados de manera estándar por la mayoría de los laboratorios. Aunque éste es el método de elección actualmente, el método está lejos de ser óptimo y no puede ser incrementado a escala fácilmente para permitir la producción "industrial" de vectores rVAA. Las transfecciones plasmídicas son inherentemente ineficaces y difíciles de estandarizar o de ampliar a escala. Esto es incluso más cierto para las cotransfecciones. Además, aunque el virus de tipo salvaje se replica a 10^{3}-10^{4} partículas por célula, la producción de rVAA en una producción típica de rVAA (0,1-1 partículas por célula) es muy baja con los métodos actuales ^{11-12}. Este bajo rendimiento hace que la purificación del rVAA sea una tarea difícil de llevar a cabo. Los problemas de producción representan un obstáculo tecnológico real para el desarrollo posterior de la tecnología de vectores VAA con fines de terapia génica. Existe claramente una gran necesidad de un método eficaz, pero sencillo, para la producción de rVAA. El sistema de empaquetamiento más conveniente sería el empaquetamiento in vitro de rVAA por proteínas del VAA producidas recombinantemente purificadas. Una alternativa práctica es la producción de una línea celular de empaquetamiento para el rVAA, donde la línea celular de empaquetamiento proporciona in trans las proteínas del VAA y del virus cooperador requeridas para la producción de rVAA. Las líneas celulares productoras de VAA recombinante específico pueden ser generadas mediante la transfección de manera estable de un plásmido que contenga el VAA recombinante en las células de empaquetamiento. La presente invención es útil para la estrategia de empaquetamiento in vitro y para la estrategia de la línea celular de empaquetamiento.

Las líneas celulares de empaquetamiento son actualmente la vía más eficaz a través de la cual se producen vectores retrovíricos y adenovíricos para fines terapéuticos tales como la terapia génica ^{13-14}. La producción de proteínas del virus para el empaquetamiento in vitro a escala industrial se emplea actualmente para los fagos lambda. Las líneas celulares de empaquetamiento actualmente disponibles para vectores retrovíricos y adenovíricos producen constitutivamente las proteínas del virus requeridas in trans ^{15-21}. No existen células de mamífero disponibles útiles para el empaquetamiento eficaz de rVAA o para la producción de proteínas de VAA. Las líneas celulares para el empaquetamiento de VAA recombinante requieren que esté presente en las células la producción de las proteínas requeridas del VAA in trans solamente durante la fase de producción del vector rVAA. No se desea la expresión constitutiva por dos razones: 1) el rescate y la replicación del ADN del vector antes de la producción interferirían con el crecimiento y la estabilidad de la línea celular y 2) específicamente las proteínas Rep son tóxicas para las células incluso en ausencia de un vector VAA recombinante. Esto último es en gran parte debido al efecto antiproliferativo bien documentado, aunque no caracterizado todavía, de las proteínas Rep grandes ^{22, \ 23}. Rep78 y Rep68 reprimen ambas los promotores celulares y víricos en ensayos transitorios ^{24, \ 25}. Después de la transfección estable, las proteínas Rep grandes inhiben la proliferación celular ^{22, \ 23}. El mecanismo no es bien conocido. Es posible que la inhibición observada de la transcripción y traducción del ARNm reprima genes celulares cruciales ^{26-28}. Por otra parte, es posible que las proteínas Rep grandes inhiban directamente la replicación del ADN ^{24, \ 29, \ 30A}. Considerando el efecto pleiotrópico de la expresión de las proteínas Rep en las células, es posible que ambos efectos tengan un papel en el efecto antiproliferativo de las proteínas Rep grandes.

No es posible producir líneas celulares estables que expresen constitutivamente las proteínas Rep grandes (nuestros propios resultados no publicados). Después de la sustitución del promotor P5 por un promotor inducible tal como el promotor de la metalotionina ^{22} o el promotor de la repetición terminal larga (LTR) del Virus del Tumor Mamario del Ratón (MMTV) inducible por esteroides ^{23}, fue posible aislar de entre un gran número de clones uno y dos clones que expresaban de manera inducible Rep78 respectivamente. Rep52 se expresaba constitutivamente en dos de los tres clones mientras que Rep68 y Rep40, que son traducidas a partir de los ARNms ayustados, no eran detectables ^{22, \ 23}. Aunque los clones eran capaces de producir funcionalmente Rep78 y Rep52, el nivel era demasiado bajo para la replicación y el empaquetamiento de VAA recombinante ^{22, \ 23}. Además, el porcentaje de clones que expresaban Rep78 era muy bajo. Por tanto, había una potente selección contra un nivel elevado de expresión de rep.

Recientemente, Clark y col. ^{30b} describieron la producción de líneas celulares dedicadas capaces de producir vectores rVAA específicos después de la infección con adenovirus.

Esto se consiguió transfectando una única construcción plasmídica, cerrada covalentemente, que llevaba un genoma de rVAA, un gen marcador para selección y un genoma de empaquetamiento de VAA. Por otra parte, la transfección estable de solamente la construcción de empaquetamiento y el gen marcador seleccionable tuvo como resultado líneas celulares que, después de la transfección de una construcción de rVAA, eran capaces de replicar rVAA pero no de empaquetar rVAA. Por tanto, este método no puede ser utilizado para generar líneas celulares de empaquetamiento universales para la producción de diferentes vectores rVAA.

Al intentar solucionar el problema anteriormente mencionado, hemos conseguido ahora proporcionar la expresión regulada de moléculas de ADN recombinante en células huésped por un método en el que la expresión puede ser suprimida esencialmente de manera completa. Aunque hemos encontrado este medio inesperado en un sistema de vectores víricos de virus adenoasociados recombinantes, estará claro para un persona experta en la técnica que este fenómeno será aplicable en un campo mucho más amplio, al menos a otros sistemas de vectores parvovíricos, si es que no es aplicable de manera general a células de mamífero o incluso a células eucarióticas.

La invención proporciona por tanto una molécula de ADN recombinante que contiene un gen, gen que está bajo el control de una combinación de un represor inducible y de un transactivador inducible. Hemos encontrado que poniendo el gen a expresar bajo este régimen de control, por el que al menos están presentes una función represora inducible y una función activadora inducible separada corriente arriba del (y funcionalmente ligadas al) gen de interés, la expresión puede ser suprimida esencialmente de manera completa mediante la inducción de la represión y la no inducción del activador. Si el activador es un modulador, en cuanto a que reprime en una situación y activa en otra, está claro que el modulador debe estar en la situación de represión. Lo mismo es cierto, por supuesto, si el represor es también un modulador. Es importante solamente el que esté presente una funcionalidad de represión al mismo tiempo que un activador no funcional en el estado "desconectado" y una funcionalidad represora no funcional y una funcionalidad activadora funcional en el estado "conectado". A esto puede llegarse, por tanto, mediante cualquier combinación de los dos, represor-activador, modulador-modulador, modulador-represor o modulador-activador. La expresión está no sólo desconectada esencialmente de manera completa en el estado "desconectado", sino que también los niveles de expresión en el estado "conectado" son inesperadamente elevados.

La invención es particularmente útil para la expresión de genes cuyo producto sea tóxico para las células que expresan dicho producto. Existen por supuesto muchos represores y/o activadores inducibles conocidos, algunos de los cuales pueden ser promotores y otros son parte de una molécula de ADN corriente arriba de un promotor, todos los cuales pueden ser utilizados de acuerdo con la presente invención. El término inducible tiene la intención de incluir todos estos promotores, activadores o represores que respondan a la presencia o ausencia de una señal, tal como la presencia de una sustancia química o un cambio de temperatura, mejorando la transcripción o reduciendo la transcripción. La elección que debe hacerse es que ambas funcionalidades (represora y activadora) tengan como resultado juntas un estado de "desconexión" esencialmente completa y un estado de "conexión" intensificado. A continuación se dan en la presente varias combinaciones preferidas. Una de tales combinaciones comprende al menos una secuencia transactivadora que es un sitio de unión para un represor de la tetraciclina, preferiblemente una en la que el sitio de unión deriva de tn10 descrito en la presente más adelante.

Otra de tales realizaciones preferidas comprende una molécula de ADN recombinante en la que al menos una secuencia represora inducible es un sitio de unión para un represor YY1, o en la que al menos un represor inducible es un sitio de unión para un factor de transcripción tardío principal (MTLF), o en la que al menos un represor inducible deriva de un promotor P5 de un virus adenoasociado, descritas todas más adelante.

Las moléculas inventadas son utilizadas preferiblemente para expresar productos génicos de parvovirus. Una realización preferida comprende, por tanto, una molécula de ADN recombinante en la que el gen codifica al menos una parte específica de una proteína de Parvovirus y/o una molécula de ADN recombinante en la que el gen es un gen no estructural de Parvovirus, preferiblemente un gen rep de un virus adenoasociado.

Utilizando las moléculas de ADN recombinante de acuerdo con la invención, pueden transfectarse células con las mismas de manera estable. Tales células son también parte de la presente invención, especialmente células que han sido inmortalizadas y que son de origen mamífero.

Uno de los objetivos de la presente invención es proporcionar medios y métodos de terapia génica mejores, en los cuales las células más adecuadas para ser utilizadas en la producción de medios para terapia génica son células de mamífero. Son también el huésped natural de los virus que son preferidos de acuerdo con la presente invención. Las células de acuerdo con la invención, que van a ser utilizadas como centro de producción de proteínas, partículas o viriones de virus recombinantes, o que son líneas celulares de empaquetamiento, necesitan ser capaces de tener una expresión inducible y una represión inducible del gen contenido en la molécula de ADN recombinante.

Cuando las células son utilizadas para el empaquetamiento o la producción de partículas víricas de virus adenoasociado recombinante, deben ser capaces preferiblemente de al menos la expresión y la represión inducibles de Rep78/Rep68 o de derivados de los mismos, de un virus adenoasociado.

Las líneas celulares para ser utilizadas como centro de producción para la producción de parvovirus recombinante, preferiblemente rVAA, deben comprender células de empaquetamiento de acuerdo con la invención que hayan sido proporcionadas con al menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional para ser empaquetada en un parvovirus, preferiblemente rVAA, ácido nucleico adicional que debe contener al menos un gen de interés, flanqueado por repeticiones terminales invertidas de parvovirus que lleven in cis la información de secuencias requerida para el rescate, la replicación, el empaquetamiento y la integración del vector rVAA.

Se prefiere una línea celular en la que estén presentes los materiales necesarios para la producción de partículas víricas en el material genético de la célula de empaquetamiento o en el ácido nucleico recombinante adicional, pero no en ambos. La presente invención proporciona también métodos para producir parvovirus recombinante que comprenden el cultivo de una línea celular de acuerdo con la invención en un medio de cultivo adecuado y la recogida de los parvovirus recombinantes a partir de dicho cultivo, además de que contenga parvovirus recombinantes obtenibles por tal método.

La presente invención proporciona además una línea celular que expresa de manera regulada Rep78 y Rep68 útiles para la producción y purificación de proteínas de VAA y para la producción de una línea celular de empaquetamiento de rVAA. Describe además la identificación de secuencias en el promotor P5 del VAA que combinadas con elementos promotores regulados o solas facilitan la expresión regulada de Rep78 y Rep68 en células de mamífero transfectadas de manera estable. La presente invención describe además métodos para la generación de tales líneas celulares que expresan las regiones codificadoras de VAA en células de mamífero útiles para la producción de células de empaquetamiento de rVAA.

En una realización de la invención, se proporciona una línea celular que expresa niveles elevados de Rep78 y Rep68 de manera regulada.

En una realización adicional, se proporcionan métodos para obtener la síntesis de proteínas de VAA regulada en células de mamífero útiles para la generación de líneas celulares de empaquetamiento de rVAA.

Una realización más de la invención comprende métodos para mejorar la calidad de las preparaciones de rVAA mediante la reducción de la cantidad de VAA de tipo salvaje producida y métodos para mejorar el rendimiento global de rVAA por célula mediante la separación de las unidades de transcripción del VAA y la colocación de las mismas en construcciones diferentes.

Se comprenderá que por el término "célula de empaquetamiento de VAA recombinante" se indica una línea celular que proporciona las proteínas del VAA requeridas in trans necesarias para la replicación y/o el empaquetamiento de genomas del VAA de tipo salvaje modificados o recombinantes. Las proteínas requeridas in trans se proporcionan de manera constitutiva o de manera regulada.

Según se utiliza en la presente, el término "niveles funcionales de expresión de proteínas de parvovirus" se refiere a niveles de expresión suficientes para la replicación y/o el empaquetamiento de genomas de parvovirus recombinantes o de tipo salvaje modificados.

Se comprende que el término "expresión regulada" tiene la intención de indicar niveles de expresión que pueden ser alterados mediante la manipulación del entorno de las células o mediante infección de las células con un virus tal como un adenovirus o el virus del herpes simple.

Se comprenderá además, según se indicó más o menos anteriormente, que el término "promotor regulado" significa una secuencia de ADN, preferiblemente un promotor, que permite que un gen ligado sea expresado a niveles que pueden ser modificados cambiando el entorno de las células, por ejemplo mediante la adición o la eliminación de compuestos en el medio en el que las células son cultivadas.

El sistema de represión combinado con activación puede ser utilizado también en montajes in vivo, por lo que la conexión y desconexión del gen se consigue mediante la administración de un agente inductor.

Descripción de las figuras

La Fig. 1 representa la estructura y la organización del genoma del wtVAA.

La Fig. 2 representa la construcción de tet(O)+P5-rep y tet(O) \DeltaP5-rep.

La Fig. 3 representa la expresión regulada de Rep78 y Rep68 a partir de tet(O)+P5-rep y tet(O) \DeltaP5-rep en células HtTA transfectadas de manera transitoria.

La Fig. 4 representa la utilización de tet(O)+P5-rep y tet(O) \DeltaP5-rep como construcciones de empaquetamiento para la producción del VAA recombinante IG-CFT. El plásmido de empaquetamiento pAAV/Ad sirvió como control positivo para el ensayo y células HtTA infectadas con adenovirus sirvieron como control negativo para el ensayo.

La Fig. 5 representa la expresión regulada de Rep78 y Rep68 a partir de tet(O)+P5-rep y tet(O) \DeltaP5-rep en células HtTA transfectadas de manera estable.

La Fig. 6 representa dos experimentos en los que se observa la expresión silenciosa eficaz de CAT en el estado no inducido a partir de una unidad de transcripción gobernada por un transactivador y un represor regulables. La Fig. 6A muestra un autorradiograma de un análisis de la actividad CAT, las calles 1 a 4 y las calles 9 a 12 representan la actividad CAT en células transfectadas con ADN de ptet(o)OPCAT; pCMVLacI, pBluescript SK^{+}, pCMVLacZ. Las calles 5 a 8 y 13 a 16 representan células con actividad CAT procedentes de cultivos control no transfectados. La Fig. 6B muestra la conversión de cloranfenicol medida. La Fig. 6C muestra la inducción de actividad CAT en las calles 1 a 4 y en las calles 9 a 12, con relación a la actividad CAT en las calles 2 y 10 respectivamente.

Descripción detallada de la invención

La presente invención está basada en un aspecto en el descubrimiento de secuencias que permiten la producción eficaz de líneas celulares estables que expresan de manera regulada niveles elevados de Rep78 y Rep68. Según se indicó anteriormente, se ha mostrado que es posible obtener clones estables que expresen la proteína Rep78 de manera regulada. Sin embargo, la frecuencia con la que se encuentran tales clones, y lo que es más importante, el nivel de expresión regulada de Rep78, son muy bajos. Esto ha limitado seriamente la aplicación y el desarrollo de líneas celulares de empaquetamiento para rVAA. La presente invención describe por primera vez la generación de líneas celulares de empaquetamiento eficaces para la producción de VAA recombinantes.

Los promotores eucarióticos inducibles clásicos, como por ejemplo el promotor de la metalotionina del ratón o el promotor de la repetición terminal larga del virus del tumor mamario del ratón, responden a metales pesados, al choque térmico o a hormonas ^{31-38}. Además, el promotor de la repetición terminal larga del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) puede ser inducido por la proteína transactivadora TAT del VIH o por la proteína E1A de adenovirus. Un sistema de expresión inducible basado en la inducción del promotor del VIH por TAT ha sido descrito en la Solicitud de Patente EP 0 455 424, y la expresión de proteínas rep de VAA conducida por el promotor del VIH fue sugerida en la Solicitud de Patente WO 95/13365. Sin embargo, todos estos promotores inducibles no son en principio idealmente adecuados para expresar genes (tóxicos) de manera inducible, ya que los promotores no son completamente silentes en el estado no inducido ^{32} y/o porque el principio de inducción induce efectos pleiotrópicos en las células diana ^{39}. Una nueva generación de promotores regulados ha adaptado partes de unidades de transcripción bacterianas para ser utilizadas en células eucarióticas ^{40-47}. Estas unidades de transcripción artificiales son adaptadas a partir del sistema represor-operador-inductor lac o a partir del operón de resistencia a tetraciclina específico Tn10 de E. coli. Se han descrito tres sistemas diferentes: i) la prevención del inicio de la transcripción por complejos represor-operador bien situados en el promotor ^{40-42, \ 46}; o ii) el bloqueo de la ARN-polimerasa II durante la elongación por un complejo represor-operador ^{43, \ 46}; o iii) la activación de una secuencia TATA mínima rellena de secuencias operadoras que pueden ser reconocidas por un transactivador (tA) artificial, donde el tA consta del componente de unión al operador derivado del represor lac o del represor de tetraciclina y del dominio activador de la transcripción procedente de VP16, un activador de la transcripción codificado por el Virus del Herpes Simple ^{44, \ 45, \ 47}. La unión del tA a las secuencias del operador puede ser inhibida eficazmente con compuestos específicos, esto es IPTG para un tA basado en el dominio de unión al operador del represor lac, y tetraciclina o compuestos relacionados con tetraciclina para un tA basado en el dominio de unión al operador del represor de tetraciclina.

Específicamente, este último sistema en el que un promotor mínimo es combinado con secuencias del operador del represor tet es adecuado para la expresión regulada de genes foráneos. Como en células eucarióticas proteínas transactivadoras no funcionales se unen a secuencias del operador tet, estos promotores son prácticamente inactivos en presencia de bajas concentraciones de tetraciclina o de compuestos relacionados tales como doxiciclina ^{47, \ 48}. De manera similar, pueden obtenerse patrones de expresión adecuados con el sistema que utiliza un tA que contiene el componente de unión al operador del represor lac. Sin embargo, la utilidad de los sistemas basados en el represor/operador lac en células de mamífero es limitada, debido a que el compuesto inductor \beta-D-tiogalactopiranósido (IPTG), a pesar de su rápida captación y de su estabilidad intracelular, actúa bastante lentamente y de manera ineficaz. Por consiguiente, tales sistemas producen una inducción de la expresión solamente moderada (47). Existen líneas celulares estables que expresan constitutivamente el gen de fusión (tA) VP16 represor de tetraciclina. Por tanto, en una realización de la invención, el gen rep del VAA es colocado corriente abajo del operón tet y esta construcción es introducida en células que expresan tA. Tetraciclina o compuestos relacionados con tetraciclina están presentes en el medio durante la expansión celular. La expresión de rep del VAA puede ser inducida por la eliminación de dichos compuestos del cultivo.

Aunque la tetraciclina y muchos derivados de la tetraciclina no son tóxicos para las células eucarióticas a la baja concentración requerida para suprimir la expresión génica, su presencia continua es subóptima en una variedad de montajes experimentales e industriales; por ejemplo, en la cría de animales transgénicos, en terapia génica o en biorreactores de volumen grande, en los que para la activación completa de la expresión génica la tetraciclina o su derivado necesitan ser eliminados por lavado rigurosamente. Para estos fines, se preferiría una sustancia efectora inductora sobre un compuesto inhibidor y por tanto se desarrolló tal tA modificado (Gossen y col., Science 268 (1995):1766-1769). Varias mutaciones en el represor de Tet tuvieron como resultado la inversión de las características de unión de la proteína represora (se unía en presencia de tetraciclina y no había unión en su ausencia). Esta nueva proteína es referida como represor de Tet inverso (rTetR). Se desarrolló un activador controlado por tetraciclina inverso (rtTA) en el que rTetR estaba fusionado a VP16. Se generaron líneas celulares que expresaban rtTA y pudieron ser utilizadas para expresar unidades de transcripción controladas por el operón tet después de la inducción con tetraciclina o con derivados de tetraciclina (Gossen y col., Science 268 (1995):1766-1769). Por tanto, en otra realización de la presente invención, el gen rep del VAA clonado corriente abajo del operón tet es introducido en células que expresan rtTA, y la expresión de rep del VAA puede ser inducida por la adición al medio de tetraciclina o compuestos relacionados.

La invención está ilustrada por los ejemplos no limitantes siguientes, en los que se emplearon los materiales y métodos siguientes.

Ejemplo 1 Unión del genoma del VAA carente de RTI flanqueantes a un promotor regulado

Hemos utilizado la línea de células HeLa HtTA que expresa constitutivamente el tA ^{47} para analizar la expresión regulada de rep a partir de construcciones tet(O)-gen rep. Con este fin clonamos un fragmento de XbaI de 4,3 kb derivado de pAAV/Ad ^{11} (una amable donación del Dr. R.J. Samulski) que contenía el dominio codificador completo de rep y cap en el sitio de XbaI inmediatamente corriente abajo del tet(O) (Fig. 2). En esta construcción, denominada tet(O)+P5-rep, el tet(O) está situado corriente arriba de un promotor P5 de -68 pb (medido desde la primera base de la secuencia TATA). Con el fin de sustituir completamente el tet(O) por el promotor P5 tuvimos que realizar una reacción de PCR debido a la ausencia de sitios de restricción adecuados. El cebador corriente arriba fue 5'-ATTAATCTAGAC
TAGTCGCGCAGCCGCCATGCCGGGG-3' y el cebador corriente abajo fue 5'-TGTGGAAGTAGCTCTCTCCC-3'. La reacción de PCR fue realizada en pAAV/Ad con pfu™ (Stratagene) utilizando el tampón y las condiciones de reacción recomendadas por el fabricante. La construcción final, tet(O) \DeltaP5-rep, fue generada sometiendo a digestión el producto de PCR de 299 pb con SfiI y XbaI y ligando el fragmento de 248 pb resultante en una ligadura de tres partes con un fragmento SfiI-XbaI de 3,95 kb de pAAV/Ad en el sitio de XbaI inmediatamente corriente abajo de la construcción tet(O). La parte amplificada de la construcción fue comprobada mediante secuenciación y se encontró que era según se esperaba.

Ejemplo 2 Expresión de rep y cap a partir de estos plásmidos

Con el fin de analizar la capacidad de expresión de las construcciones para el empaquetamiento de VAA recombinante era necesario determinar las actividades de los diferentes promotores. Con este fin, tet(O) \DeltaP5-rep y tet(O)+P5-rep fueron transfectados a células HtTA en presencia o ausencia de doxiciclina (1 \mug/ml) y en ausencia o presencia de adenovirus ts149 (moi=20). La proteína fue extraída después de dos días y sometida a transferencia Western. Los filtros fueron incubados con el anticuerpo monoclonal 7B7 específico para Rep78, Rep68 (una amable donación del Dr. R.J. Samulski) (Fig. 3). Las construcciones tet(O) \DeltaP5-rep y tet(O)+P5-rep expresan ambas Rep78 y Rep68 en células HtTA de manera regulada por doxiciclina. El promotor tet(O) \DeltaP5-rep y el promotor tet(O)+P5-rep son ambos regulados por incremento después de la infección con adenovirus. La expresión de Rep78 y Rep68 en el estado no inducido (esto es, con doxiciclina y sin adenovirus) está notablemente reducida con el tet(O)+P5-rep en comparación con la expresión de Rep78 y Rep68 a partir de la construcción tet(O) \DeltaP5-rep bajo las mismas condiciones. Estos resultados demuestran i) que es posible obtener la expresión regulada de Rep78/Rep68 utilizando el operón tet artificial. ii) Que la infección por adenovirus regula por incremento la expresión del gen rep en ambas construcciones. Esto es posible debido a un efecto directo sobre el tet(O) y la secuencia TATA mínima, o debido a un elemento sensible al adenovirus (un intensificador) en el genoma del VAA. Otro mecanismo posible es una traducción incrementada inducida por el adenovirus de ARNm específico de Rep78/Rep68 en las células infectadas por adenovirus. iii) En la construcción tet(O)+P5-rep es probable que el sitio del factor de transcripción tardío principal (MTLF) y los dos sitios de YY1 en el promotor P5 medien al menos parte de la regulación por disminución de la expresión de Rep78 y Rep68 observada a partir de tet(O)+P5-rep en el estado no inducido y la regulación por incremento de la expresión de Rep78 y Rep68 a partir de tet(O)+P5-rep en células HtTa infectadas con adenovirus.

Con el fin de determinar si la expresión del gen rep era funcional, las construcciones fueron utilizadas para producir VAA recombinante. Para este fin las construcciones fueron cotransfectadas con un plásmido pIG-CFT, que llevaba un vector VAA recombinante ^{49}, en células HtTA infectadas con el adenovirus ts149 (moi=20). Después de la incubación a 39ºC y con un 10% de CO_{2} durante tres días, se recogieron las células y el sobrenadante del cultivo y se sometieron a tres ciclos de congelación-descongelación según está descrito en ^{49}. Los desechos celulares fueron eliminados por centrifugación (1200 rpm, temperatura ambiente) y el adenovirus ts149 residual fue inactivado por calor (1 hora, 56ºC). El VAA recombinante fue valorado en un ensayo de centros de replicación (RCA) mediante dilución seriada de la solución madre de VAA recombinante en células 293 infectadas con el adenovirus ts149 y con el wtVAA ^{20} según está descrito en ^{49}. Este ensayo aprovecha el hecho de que el ADN del VAA recombinante se replica en cantidades muy grandes en las células 293 infectadas con wtVAA y adenovirus. Después de un día, la acumulación de ADN del vector en el núcleo de las células transducidas es suficientemente grande para permitir la detección de células infectadas individuales después de la hibridación con una sonda específica del vector. Para este fin las células fueron recogidas en PBS-EDTA (5 mM) después de un día y suspensiones de un sólo tipo de célula fueron transferidas a una membrana de nailon Hybond N^{+}. Después del procesamiento del filtro y de hibridación con una neo-sonda (fragmento de SmaI de 1002 pb), las manchas individuales señalaban células transducidas por el vector VAA recombinante. Utilizando el RCA, la construcción de empaquetamiento tet(O) \DeltaP5-rep producía alrededor de 20 manchas que, ajustadas por la dilución, correspondían a un título de 6 x 10^{4} Partículas Infecciosas (PI) por ml, mientras que la construcción de empaquetamiento tet(O)+P5-rep producía alrededor de 34 manchas correspondientes a un título de 1,0 x 10^{5} PI por ml (Fig. 4). Por tanto, el dominio que codifica la proteína del VAA es funcional en ambas construcciones.

Ejemplo 3 Líneas celulares estables que expresan niveles elevados regulados de Rep78 y Rep68

Se ha demostrado previamente que el promotor P5 del virus adenoasociado contiene un motivo centrado en -60 y +1 con relación a su sitio de inicio, que media la transactivación por la proteína E1A 13S. Se identificó un factor celular, YY1, que se une al motivo y se clonó su ADNc. El YY1 es una proteína con dedo de zinc de 414 aminoácidos que reprime la transcripción cuando se une corriente arriba de promotores basales heterólogos; las proteínas E1A liberan la represión y activan la transcripción a través de YY1 ^{50}.

Con el fin de determinar si podían producirse líneas celulares estables que expresaran niveles elevados de Rep78 y Rep68 de manera regulada, realizamos cotransfecciones en células HtTA de tet(O) \DeltaP5-rep o de tet(O)+P5-rep con el plásmido pX343 que contenía un gen de resistencia a higromicina B bajo el control transcripcional del promotor de SV40 en una proporción de 10:1 respectivamente. Las transfecciones fueron realizadas en presencia o ausencia de 2 \mug/ml de tetraciclina. Dos días después de la transfección, el medio fue sustituido por medio que contenía 400 \mug/ml de higromicina B con o sin 2 \mug/ml de tetraciclina. Este medio de selección fue renovado cada 3 ó 4 días. Después de dos semanas las colonias de las placas fueron tripsinizadas, sembradas en medio sin tetraciclina e infectadas con adenovirus ts149 (moi=20). Después de dos días, se recogieron las células y las proteínas totales fueron sometidas a transferencia Western. La expresión de las proteínas Rep fue analizada utilizando el anticuerpo monoclonal 7B7 específico para Rep78/Rep68. En las células no tratadas (calle HtTA) y en las células HtTA transfectadas con pBluescript (pBlue), no se detectaron bandas específicas de Rep. En la calle del control positivo, HtTA infectadas con wtVAA-2, Rep 78 y Rep68 son detectadas fácilmente. Rep68 corre como una doble banda en SDS-PAGE (M.E., resultados no publicados). Las proteínas Rep78 y Rep68 purificadas (proporcionadas amablemente por el Dr. Nick Muzyczka) en las calles marcadas como Rep78; Rep68 servía como marcador de tamaño para las proteínas respectivas. Cuando el

\hbox{pAAV/Ad  ^{11} }

fue transfectado o cuando la construcción tet(O) \DeltaP5-rep fue transfectada, no pudieron detectarse Rep78 ni Rep68 en los grupos infectados con adenovirus (Fig. 5).

Por tanto, las construcciones que llevaban solamente el promotor P5 (pAAV/Ad) como elemento funcional dirigiendo la expresión de Rep78 y Rep68, son mucho menos eficaces para generar líneas celulares estables que expresen Rep78/Rep68 de manera regulable que las combinaciones de un activador regulable con el promotor P5 (tet(O)+P5-rep).

Esto está de acuerdo con la idea de que incluso bajos niveles de Rep78 y Rep68 inhiben el crecimiento celular. La construcción tet(O)+P5-rep, en contraste, expresa cantidades significativas de Rep78 y Rep 68 de manera regulada (Fig. 5). Los grupos generados en presencia de tetraciclina, cuando el tet(O) está inactivo, expresan Rep78 y Rep68 después de la eliminación de la tetraciclina del medio. Sin embargo, cuando los grupos son generados en ausencia de tetraciclina, cuando el tet(O) es activo, no puede detectarse la expresión de Rep78 y Rep68. Estos resultados indican la presencia de secuencias en el promotor P5 que regulan por disminución la expresión de Rep78 y Rep68, coincidiendo probablemente con el factor de transcripción tardío principal (MTLF) de adenovirus y los dos sitios de YY1 ^{50} en el promotor P5 del VAA.

Ejemplo 4 Nivel basal disminuido de la expresión de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) de un promotor regulado por un transactivador regulable y por un transrepresor regulable Construcciones

Las construcciones pOPI3CAT y pCMVLacI fueron obtenidas de Stratagene (La Jolla, California, EE.UU.). El pCMVLacI contiene el represor lac de E. coli bajo el control transcripcional del promotor de CMV. En ptet(o)OPCAT el promotor constitutivo del Virus del Sarcoma de Rous (VSR) de pOPI3CAT fue cambiado por el promotor del operón tet ligando el fragmento SnaBI-BglII de 5,7 kb procedente de pOPI3CAT a un fragmento PvuII-BamHI de 0,66 kb que contenía el operón tet + la secuencia TATA mínima del promotor de CMV. Este último fragmento fue obtenido de un pBluescript SK^{+} (Stratagene, la Jolla, California, EE.UU.) que contenía el fragmento ClaI-BamHI de pUHD10-3 (obtenido del Prof. Bujard) en los sitios de ClaI-BamHI de pBluescript SK^{+}. La construcción pCMVLacZ fue utilizada como control de eficacia de la transfección. Lleva el gen de la \beta-galactosidasa de E. coli como gen informador bajo el control transcripcional de un promotor de CMV.

Se utilizó un gen informador (CAT) para analizar la actividad de un promotor con un transactivador regulable (tet-VP16) y un represor regulable (LacI). El sistema tet-VP16 ha sido descrito en el Ejemplo 1 de esta solicitud. Se ha demostrado que el sistema represor/operador/inductor lac de E. coli funciona en células de mamífero (Dueschle, U., Hibskind, R.A. y Bujard, H. (1990) Science 248, 480-483). La represión con este sistema puede ser obtenida a través de varios métodos de interferencia con la transcripción. Nosotros utilizamos un sistema, comercializado por Stratagene (La Jolla, California, EE.UU), en el que la ARN-polimerasa II que transcribe es bloqueada durante la elongación por un complejo represor/operador lac. El complejo represor/operador lac puede ser liberado de la unidad de transcripción, permitiendo así la elongación por la adición de isopropil \beta-D-tiogalactopiranósido (ITPG) al medio de cultivo. En ptet(o)OPCAT, la expresión de CAT puede ser regulada mediante la adición al medio de IPTG y/o tetraciclina o sus análogos tales como doxiciclina. Nuestra suposición era que un promotor conteniendo un transrepresor regulable y una función transactivadora regulable mostraría menos expresión en el estado desconectado. En el plásmido tet(o)OPCAT esta situación se crea cuando se impide la unión de la proteína de fusión tet-VP16 y el represor lac está unido a la unidad de transcripción.

Con el fin de analizar esta suposición, células HtTA fueron transfectadas de manera transitoria con las construcciones siguientes: pCMVLacI, ptet(o)OPCAT, pBluescript SK^{+} y pCMVLacZ. Las transfecciones y el cultivo posterior se llevaron a cabo en DMEM+10% FCS y gentamicina (50 \mug/ml). Las transfecciones se realizaron utilizando el sistema de transfección con fosfato de calcio de Life Technologies (Breda, Países Bajos) de acuerdo con la descripción del fabricante. Células HtTA (3-6 x 10^{5} células por placa) fueron sembradas en 8 placas de 60 mm (Greiner, Alphen y de Rijn, Países Bajos) un día antes de la transfección. Al día siguiente el medio fue sustituido por medio y cuando estaba indicado se añadió doxiciclina (1 \mug/ml, Sigma). Tres horas más tarde, 4 placas recibieron el precipitado de fosfato de calcio que contenía 3 \mug de pCMVLacI, 1 \mug de pCMVLacZ, 0,3 \mug de ptet(o)OPCAT y 2,7 \mug de pBluescript SK^{+}. Las otras cuatro placas sirvieron como controles negativos y no fueron transfectadas. Cuarenta horas después de la transfección, se añadió IPTG (3 mM) a las placas relevantes y aproximadamente 8 horas más tarde las células fueron lavadas con PBS y recogidas en 1 ml de PBS fresco mediante rascado con una varilla de caucho. La suspensión fue transferida a un tubo Eppendorf y las células fueron centrifugadas 5 minutos a 6000 rpm. El aglutinado celular fue resuspendido en 100 \mul de Tris-HCl 250 mM (pH 7,8). Las células fueron lisadas mediante tres ciclos de congelación-descongelación y los desechos celulares fueron eliminados por centrifugación (14 krpm, 5 minutos, temperatura ambiente). La actividad \beta-galactosidasa en el extracto fue medida según está descrito en Sambrook y col. (Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T.: Molecular Cloning: A laboratory manual. 1989). Las muestras fueron diluidas en Tris-HCl 250 mM (pH 7,8) de tal manera que contuvieran la misma actividad \beta-galactosidasa. Se utilizaron 80 \mul de las diluciones para determinar la actividad CAT. Los ensayos de CAT fueron realizados según está descrito en Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T.: Molecular Cloning: A laboratory manual. 1989). Las placas de cromatografía en capa fina fueron expuestas a placas de almacenamiento de fósforo fotoestimulables y escaneadas con un PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA) y se cuantificó la conversión de cloranfenicol.

Se realizaron dos experimentos independientes. Los resultados de los experimentos están representados en la Figura 6. La Figura 6A muestra el autorradiograma del ensayo de CAT. Las calles 1 a 4 del Experimento 1 y 9 a 12 del Experimento 2 muestran los ensayos de CAT de la transfección y las calles 5 a 8 del Experimento 1 y 13 a 16 del Experimento 2 muestran el resultado de los cultivos control no transfectados. Debajo del autorradiograma se representa si IPTG o doxiciclina (Dox.) estaban presentes (+) o ausentes (-) durante el experimento. La Figura 6B muestra el porcentaje de conversión de cloranfenicol en las formas acetiladas de cada calle. La Fig. 6C muestra la inducción de la actividad CAT en las muestras con relación a la actividad CAT en el estado más reprimido (-IPTG, +Dox.) en el mismo experimento. En presencia de doxiciclina y en ausencia de IPTG, cuando el promotor está en su estado más reprimido, puede detectarse la expresión de CAT, aunque a un nivel muy bajo (Fig. 6A, calle 2 y calle 10). En ausencia de doxiciclina o en presencia de IPTG, cuando solamente uno de los dos elementos regulables está en el estado desconectado, la actividad CAT se incrementa en 19 y 2,3 veces respectivamente. Por tanto, la combinación de un sistema de activador y represor regulables en una unidad de transcripción permite una silenciación de la transcripción más eficaz que cuando está presente solamente un elemento regulable.

Literatura citada

1. Berns, K.I. Microbiol. Rev. 54, 316-329 (1990).

2. Berns, K.I. en Virology (eds. Chanock, R.M., Hirsch, M.S., Melnick, J.L., Monath, T.P. y Roizman, B.) 1743-1763 (Raven Press, New York, 1990).

3. Samulski, R.J. y col. EMBO J. 10, 3941-3950 (1991).

4. Kotin, R.M. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2211-2215 (1990).

5. Samulski, R.J. Curr. Opi. Gen. Dev. 3, 74-80 (1993).

6. Chejanovsky, N. y Carter, B.J. Virology 173, 120-128 (1989).

7. Trempe, J.P. y Carter, B.J. J. of Virol. 62, 3356-3363 (1988).

8. Hermonat, P.L. y Muzyczka, N. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6466-6470 (1984).

9. Tratschin, J.D., Miller, I.L., Smith, M.G. y Carter, B.J. Mol. Cell. Biol. 5, 3251-3260 (1985).

10. McLaughlin, S.K., Collis, P., Hermonat, P.L. y Muzyczka, N. J. Virol. 62, 1963-1973 (1988).

11. Samulski, R.J., Chang, L. y Shenk, T. J. Virol. 63, 3822-3828 (1989).

12. Muzyczka, N. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 158, 97-129 (1992).

13. Valerio, D. en Transgenic animals (eds. Grosveld, F. y Kollias, G.) 211-246 (Academic Press, London, 1992).

14. Morgan, R. y Anderson, W. Ann. Rev. Biochem. 63, 191-217 (1993).

15. Miller, A.D., Law, M.F. y Verma, I.M. Mol. Cell. Biol. 5, 431-437 (1985).

16. Markowitz, D., Goff, S. y Bank, A. Virology 167, 400-406 (1988).

17. Markowitz, D., Goff, S. y Bank, A. J. Virol. 62, 1120-1124 (1988).

18. Miller, A.D. y Buttimore, C. Mol. Cell. Biol. 6, 2895-2902 (1986).

19. Miller, A.D., Trauber, D.R. y Buttimore, C. Somatic Cell. Mol. Genet. 12, 175-183 (1986).

20. Graham, F.L., Smiley, J., Russell, W.C. y Naiva, R. J. Gen. Virol. 36, 59-72 (1977).

21. Miller, A.D. y col. J. of Virol. 65, 2220-2224 (1991).

22. Yang, Q., Chen, F. y Trempe, J.P. J. of Virol. 68, 4847-4856 (1994).

23. Holscher, C. y col. J. of Virol. 68, 7169-7177 (1994).

24. Heilbronn, R., Burkle, A., Stephan, S. y zur Hausen, H. J. Virol. 64, 3012-3018 (1990).

25. Tratschin, J.D., Tal, J. y Carter, B.J. Mol. Cell. Biol. 6, 2884-2894 (1986).

26. Trempe, J. y Carter, B. J. Virol. 62, 68-74 (1988).

27. Beaton, A., Palumbo, P. y Berns, K. J. Virol. 63, 4450-4454 (1989).

28. Hermonat, P. Cancer Lett. 81, 129-136 (1994).

29. Bantel-Schaal, U. y zur Hausen, H. Virology 164, 64-74 (1988).

30a. Hermonat, P. Virology 189, 329-333 (1992).

30b. Clark, K.R., Voulgaropoulou, F., Fraley, D.M., Johnson, P.R. Hum. Gen. Ther. 6, 1329-1341 (1995).

31. Brinster, R.L., Chen, H.Y., Warren, R., Sarthy, A. y Palmiter, R.D. 296 (1985).

32. Mayo, E.K., Warren, R. y Palmiter, R.D. Cell 29, 99-108 (1982).

33. Searle, P.F., Stuart, G.W. y Palmiter, R.D. Mol. Cell. Biol. 5, 1480-1489 (1985).

34. Nouer, L. en Heat Shock Response (ed. Nouer, L.) (CRC, Boca Raton, FL, 1991).

35. Hynes, N.E., Kennedy, N., Rahmsdorf, U. y Groner, B. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2038-2042 (1981).

36. Lee, F., Mulligan, R., Berg, P. y Ringold, G. Nature 294, 228-232 (1981).

37. Klock, G., Strahle, U. y Schutz, G. Nature 329, 734-736 (1987).

38. Israel, D.I. y Kaufman, R.J. Nucleic Acids Res. 17, 2589-2604 (1989).

39. Lee, S.W. y col. Proc. Natl. Acad. Sci. 85, 1204-1208 (1988).

40. Brown, M. y col. Cell 49, 603-612 (1987).

41. Hu, M.C.-T., y Davidson, N. Cell 48, 555-566 (1987).

42. Figge, J., Wright, C., Collins, C.J., Roberts, T.M. y Livingston, D.M. Cell 52, 713-722 (1988).

43. Deuschle, U., Hipskind, R.A. y Bujard, H. Science 248, 480-483 (1990).

44. Labow, M.A., Baim, S.B., Shenk, T. y Levine, A.J. Mol. Cell. Biol. 10, 3343-3356 (1990).

45. Baim, S.B., Labow, M.A., Levine, A.J. y Schenk, T. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 5072-5076 (1991).

46. Gatz, C., Kaiser, A. y Wendenburg, R. Mol. Gen. Genet. 227, 229-237 (1991).

47. Gossen, M. y Bujard, H. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 5547-5551 (1992).

48. Gossen, M. y col. Science 268, 1766-1769 (1995).

49. Einerhand, M. y col. Gene. Ther. 2, 336-343 (1995).

50. Chang, L.-S., Shi, Y. y Shenk, T. J. Virol. 63, 3479- 3488 (1989).

Claims

1. Una molécula de ADN recombinante que contiene un gen de interés, que está bajo el control de una combinación de un represor inducible y un transactivador inducible, en la que la secuencia del transactivador es un sitio de unión para un represor de tetraciclina.

2. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en la que el sitio de unión deriva de Tn10.

3. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que al menos una secuencia del represor inducible es un sitio de unión para un represor YY1.

4. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que al menos un represor inducible es un sitio de unión para un factor transcripcional tardío principal (MTLF).

5. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con las reivindicaciones 1 ó 2, en la que al menos un represor inducible deriva de un promotor P5 de un virus adenoasociado.

6. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el gen de interés codifica al menos una parte específica de una proteína de Parvovirus.

7. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el gen de interés es un gen no estructural de Parvovirus.

8. Una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la reivindicación 7, en la que el gen de interés es un gen rep de un virus adenoasociado.

9. Una célula de mamífero que contiene una molécula de ADN recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones precedentes.

10. Una célula de acuerdo con la reivindicación 9, que ha sido inmortalizada.

11. Una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 y 10, que es capaz de expresión inducida y represión inducible del gen de interés contenido en la molécula de ADN recombinante.

12. Una célula de acuerdo con la reivindicación 11, que es capaz de expresión y represión inducibles de Rep78/
Rep68, Rep52/Rep40 y/o VP1/VP2/VP3 de un virus adenoasociado.

13. Una línea celular de empaquetamiento para producir partículas de Parvovirus recombinantes que comprende una célula de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 y/o una molécula de ADN recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

14. Una línea celular para producir partículas de Parvovirus recombinantes que comprende una línea celular de empaquetamiento de acuerdo con la reivindicación 13, en la que las células de empaquetamiento han sido provistas de al menos una molécula de ácido nucleico recombinante adicional para ser empaquetada que contiene un gen de interés flanqueada por repeticiones terminales invertidas de Parvovirus que contienen in cis la información de secuencias requeridas para el rescate, la replicación, el empaquetamiento y la integración del vector rVAA.

15. Una línea celular de acuerdo con la reivindicación 14, en la que los materiales necesarios para la producción de partículas víricas están presentes en el material genético de la célula de empaquetamiento o en el ácido nucleico recombinante adicional, pero no en ambos.

16. Una célula de mamífero que contiene una molécula de ADN conteniendo un gen de interés, que está bajo el control de una combinación de un represor inducible y un transactivador inducible.

17. Una célula de mamífero de acuerdo con la reivindicación 16, donde la célula de mamífero es una célula de empaquetamiento.

18. Un método para producir Parvovirus recombinantes que comprende el cultivo de una línea celular de acuerdo con la reivindicación 14 ó 15, o de una célula de mamífero de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17, en un medio de cultivo adecuado y la recogida de los Parvovirus recombinantes a partir de dicho cultivo.

19. Un Parvovirus recombinante que contiene una molécula de ADN recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

20. Un Parvovirus recombinante que contiene una molécula de ADN recombinante conteniendo un gen de interés, que está bajo el control de una combinación de un represor inducible y un transactivador inducible.

21. Un método para la expresión inducible de un gen de interés en una célula huésped de mamífero, por el cual la expresión de dicho gen puede ser esencialmente desconectada completamente, en el que el gen está bajo el control de una combinación de un transactivador inducible y un represor inducible.