ES2220522T3 - Peptidos oralmente activos que evitan el daño y la muerte celular. - Google Patents

Abstract

Un polipéptido del Factor I Neurotrófico Dependiente de la Actividad (ADNF I), comprendiendo el polipéptido del ADNF I un sitio central activo que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1), en la que el sitio activo comprende al menos un D- aminoácido.

Description

Péptidos oralmente activos que evitan el daño y la muerte celular.

Campo de la invención

Esta invención se refiere a polipéptidos del Factor Neurotrófico Dependiente de la Actividad (ADNF) que comprenden al menos un D-aminoácido en los sitios centrales activos de los polipéptidos del ADNF. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas que contienen polipéptidos del ADNF que comprenden al menos un D-aminoácido en los sitios centrales activos de los polipéptidos del ADNF. La invención se refiere además al uso de los polipéptidos del ADNF de la invención para la fabricación de un medicamento para reducir in vitro e in vivo la muerte celular neuronal, al uso de los polipéptidos del ADNF de la invención para la fabricación de un medicamento para tratar el estrés oxidativo en un paciente, y al uso de los polipéptidos del ADNF de la invención para la fabricación de un medicamento para reducir un estado asociado con la fetopatía alcohólica en una persona.

Antecedentes de la invención

La muerte celular neuronal se ha asociado con diversos estados y enfermedades clínicos. Estos estados y enfermedades incluyen, por ejemplo, enfermedades neurodegenerativas tales como enfermedad de Alzheimer, demencia relacionada con SIDA, enfermedad de Huntington, y enfermedad de Parkinson. La muerte celular neuronal también se ha asociado con el retraso en el desarrollo y las dificultades de aprendizaje. Estas enfermedades y afecciones son gravemente debilitantes y tienen un factor de por vida sobre los individuos diagnosticados con tales enfermedades y afecciones.

Se ha dado a conocer previamente que los polipéptidos del Factor Neurotrófico Dependiente de la Actividad (ADNF) se pueden usar para prevenir o reducir la muerte celular neuronal. El polipéptido del Factor Neurotrófico I Dependiente de la Actividad (ADNF I) es segregado por células astrogliales en presencia de péptido intestinal vasoactivo (VIP). El polipéptido del ADNF I muestra actividad promotora de la supervivencia para neuronas a concentraciones fentomolares sorprendentemente bajas (Brenneman y Gozes, J. Clin. Invest. 97:2299-2307 (1996)). Estudios posteriores identificaron fragmentos peptídicos de ADNF I que imitan las propiedades neurotróficas y neuroprotectoras de ADNF I. El péptido más corto (es decir, el sitio central activo) que capturó la actividad de ADNF I promotora de la supervivencia fue el péptido SALLRSIPA, denominado como ADNF-9 o SAL (Brenneman et al., J. Pharm. Exp. Therp. 285:619-627 (1998)). Los estudios de moléculas relacionadas con el polipéptido del ADNF I dieron como resultado el descubrimiento de la Proteína Neuroprotectora Dependiente de la Actividad (denominada ADNP o ADNF III, intercambiablemente). Esta proteína se clonó (Bassan et al., J. Neurochem. 72:1283-1293 (1999) y se encontró que tenía un péptido activo similar en actividad biológica a SAL. Este péptido (es decir, el sitio central activo) fue NAPVSIPQ, denominado NAP.

Se ha demostrado que los polipéptidos del ADNF evitan la muerte celular neuronal tanto in vitro como in vivo. Por ejemplo, se ha demostrado que los polipéptidos de ADNF evitan la muerte celular neuronal asociada con tetrodotoxina (bloqueo eléctrico), el péptido \beta-amiloide (la neurotoxina de la enfermedad de Alzheimer), N-metil-D-aspartato (excitotoxicidad), y la proteína de la envoltura del virus de la inmunodeficiencia humana. Además, las inyecciones diarias de polipéptidos de ADNF a ratones neonatos deficientes en apolipoproteína E aceleraron la adquisición de reflejos congénitos y evitaron las carencias de memoria a corto plazo. Véase, por ejemplo, Bassan et al., J. Neurochem. 72:1283-1293 (1999). Además, se ha mostrado previamente que el pretratamiento con polipéptidos del ADNF reduce numerosas o diversas afecciones asociadas con la fetopatía alcohólica en un paciente. Véase, el documento U.S.S.N. 09/265.511, presentado el 12 de marzo de 1999.

Aunque los polipéptidos del ADNF tienen un potencial ilimitado como neuroprotectores y/o agentes terapéuticos, sería ventajoso proporcionar polipéptidos del ADNF adicionales que tengan propiedades diferentes de los polipéptidos del ADNF conocidos. Por ejemplo, la disponibilidad de un número de polipéptidos del ADNF con afinidades diferentes por sus receptores permitiría seleccionar receptores específicos en diferentes tipos de células. Además, los polipéptidos del ADNF adicionales ayudarían a diseñar un régimen de tratamiento farmacéutico que se puede adaptar a cada paciente afectado por trastornos neurodegenerativos.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento sorprendente de que los polipéptidos del ADNF que comprenden D-aminoácidos, que no están presentes en la naturaleza, también son eficaces reduciendo la muerte celular neuronal, reduciendo el estrés oxidativo, reduciendo afecciones asociadas con fetopatía alcohólica en un paciente, y para otras afecciones. Los polipéptidos del ADNF incluyen polipéptidos del ADNF I y ADNF III, y subsecuencias de los mismos, que contienen sus sitios centrales activos respectivos y proporcionan funciones neuroprotectores y promotoras del crecimiento. Los polipéptidos del ADNF I tienen un sitio central activo que comprende una siguiente secuencia de aminoácidos: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala ("SALLRSIPA" o "SAL"; SEQ ID NO:1). Los polipéptidos del ADNF III también tienen un sitio central activo que comprende unos pocos restos de aminoácidos, a saber, la siguiente secuencia de aminoácidos: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln ("NAPVSIPQ" o "NAP"; SEQ ID NO:2). Se ha demostrado previamente que los polipéptidos de ADNF I y polipéptidos del ADNF III, que comprenden todos L-aminoácidos, tienen una potencia y actividad notables reduciendo la muerte celular neuronal in vitro e in vivo, así como reduciendo una afección asociada con fetopatía alcohólica en un paciente.

Como tal, en un aspecto, la presente invención proporciona un Factor Neurotrófico I Dependiente de la Actividad (ADNF I) que comprende un sitio central activo que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1), en la que el sitio central activo comprende al menos un D-aminoácido. En una realización, los aminoácidos N-terminal y/o C-terminal del sitio central activo del polipéptido del ADNF I son D-aminoácidos. En otra realización, el sitio central activo del polipéptido del ADNF I comprende todos D-aminoácidos. En otra realización, un polipéptido del ADNF I es Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1), en el que el polipéptido del ADNF I comprende al menos un D-aminoácido. En otra realización, el polipéptido del ANDF I es Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1), en el que el polipéptido del ADNF I comprende todos
D-aminoácidos.

En otro aspecto, la presente invención proporciona un Factor Neurotrófico III Dependiente de la Actividad (ADNF III) que comprende un sitio central activo que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO:2), en la que el sitio central activo comprende al menos un D-aminoácido. En una realización, los aminoácidos N-terminal y/o C-terminal del sitio central activo son D-aminoácidos. En otra realización, el sitio central activo del polipéptido del ADNF III comprende todos D-aminoácidos. En otra realización, el polipéptido del ADNF III es Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln ((SEQ ID NO:2), en el que el polipéptido del ADNF III comprende al menos un D-aminoácido. En otra realización, el polipéptido del ADNF III es Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO:2), en el que el polipéptido del ADNF III comprende todos D-aminoácidos.

En aún otro aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un polipéptido del ADNF, en la que el polipéptido del ADNF es un elemento seleccionado del grupo que consta de: (a) un polipéptido del ADNF I que comprende un sitio central activo que tiene el siguiente aminoácido: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1); (b) un polipéptido del ADNF III que comprende un sitio central activo que tiene el siguiente aminoácido: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO:2); y (c) una mezcla del polipéptido del ADNF I de la parte (a) y del polipéptido del ADNF III de la parte (b); en la que al menos uno del polipéptido del ADNF I y del polipéptido del ADNF III comprende un sitio central activo que comprende al menos un D-aminoácido.

En una realización, la composición farmacéutica comprende un polipéptido del ADNF I, en la que el polipéptido del ADNF I comprende todos D-aminoácidos. En otra realización, la composición farmacéutica comprende un polipéptido del ADNF III, en la que el polipéptido del ADNF III comprende todos D-aminoácidos. En otra realización, la composición farmacéutica comprende un polipéptido del ADNF I y un polipéptido del ADNF III, en la que el polipéptido del ADNF I y el polipéptido del ADNF III comprenden ambos todos D-aminoácidos. En otra realización, la composición farmacéutica comprende un polipéptido del ADNF I y un polipéptido del ADNF III, en la que el polipéptido del ADNF I comprende todos D-aminoácidos, y en la que el polipéptido del ADNF III comprende todos L-aminoácidos. En otra realización, la composición farmacéutica comprende un polipéptido del ADNF I y un polipéptido del ADNF III, en la que el polipéptido del ADN I comprende todos L-aminoácidos, y en la que el polipéptido del ADNF III comprende todos D-aminoácidos.

En aún otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de los polipéptidos del ADNF de la invención para la fabricación de un medicamento para prevenir la muerte celular neuronal, comprendiendo el método poner en contacto células neuronales con al menos uno de los polipéptidos del ADNF anteriormente descritos. En una realización, la muerte celular neuronal se produce en un paciente infectado con el virus de la inmunodeficiencia. En otra realización, la muerte celular neuronal está asociada con la excitotoxicidad inducida por estimulación con N-metil-D-aspartato. En aún otra realización, la muerte celular neuronal está inducida por el péptido beta-amiloide en un paciente que sufre enfermedad de Alzheimer. En aún otra realización, la muerte celular neuronal está inducida por el bloqueo colinérgico en un paciente que sufre enfermedad de Alzheimer, lo que da como resultado un deterioro del aprendizaje.

En aún otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de los polipéptidos del ADNF de la invención para la fabricación de un medicamento para reducir el estrés oxidativo en un paciente, comprendiendo el método administrar al paciente al menos uno de los polipéptidos del ADNF descritos anteriormente, en una cantidad suficiente para tratar el estrés oxidativo.

En aún otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de los polipéptidos del ADNF de la invención para la fabricación de un medicamento para reducir una afección asociada con fetopatía alcohólica en un paciente que está expuesto a alcohol in utero, comprendiendo el método administrar al paciente al menos uno de los polipéptidos del ADNF descritos anteriormente, en una cantidad suficiente para reducir una afección asociada con fetopatía alcohólica.

Breve descripción de los dibujos

La Figura 1 compara la actividad promotora de la supervivencia de las formas D y L de SALLRSIPA en cultivos corticales cerebrales disociados tratados con 1 \muM de tetrodotoxina, un agente que bloquea la actividad eléctrica y produce la muerte celular neuronal apoptótica. La duración del tratamiento fue de 5 días. Cada punto es la media \pm el error estándar de 3-4 determinaciones. Los recuentos de células neuronales se obtuvieron sin el conocimiento del grupo de tratamiento.

La Figura 2A compara la actividad promotora de supervivencia de forma D y L de NAPVSIPQ en cultivos corticales cerebrales disociados tratados con 1 \muM de tetrodotoxina. Las condiciones experimentales fueron como se describen para la Figura 1.

La Figura 2B ilustra el efecto de una mezcla de D- y L-aminoácidos D-NA{L-P}VSIPQ sobre la actividad promotora de la supervivencia en cultivo cortical cerebral cotratado con tetrodotoxina durante 5 días. En el péptido NAPVSIPQ, todos los aminoácidos tenían la forma D, excepto el tercer residuo de prolina que tenía la forma L.

La Figura 3A compara la actividad promotora de la supervivencia de combinaciones de NAPVSIPQ y SALLRSIPA en las formas D y L. Las condiciones experimentales fueron como las descritas para la Figura 1.

La Figura 3B compara la actividad promotora de la supervivencia de combinaciones de L-NAPVSIPQ + D-SALLRSIPA con D-NAPVSIPQ y L-SALLRSIPA. Las condiciones experimentales fueron como las descritas para la Figura 1.

La Figura 4 ilustra que las combinaciones de D-SALLRSIPA + D-NAPVSIPQ pueden proteger frente a la toxicidad de beta amiloide en células PC12.

La Figura 5 ilustra que el pretratamiento con D-NAP, D-SAL, o L-NAP + D-SAL, evita los fallecimientos fetales. A E18, se contó el número de embriones vivos y fallecidos, y se calculó el porcentaje de fallecimiento. Se proporcionó un tratamiento con alcohol en E8, dándose un pretratamiento con péptidos 30 minutos antes. Se realizan comparaciones con el grupo de alcohol, p< 0,001 de ANOVA global. Se realizaron tests de Fishers post hoc, con los grupos * significativamente diferentes que el alcohol (p\leq 0,03 todos post-hoc). Los tamaños de las muestras fueron control (36), alcohol (41), D-NAP (20 \mug) + alcohol (14), D-SAL (20 \mug) + alcohol (19), D-SAL (2 \mug) + alcohol (8), L-NAP (20 \mug) + D-SAL (20 \mug) + alcohol (23).

La Figura 6A ilustra que el pretratamiento con L-NAP + D-SAL evitó la microcefalia fetal. Los pesos de los cerebros fetales para cada hembra preñada se obtuvieron a E18. Se realizaron comparaciones con el grupo del alcohol, valor P de ANOVA global p= 0,01. El tamaño de la muestra fue el número de litros. La media de cada litro se usó para el análisis estadístico y representa una media de 8-10 fetos. Los tamaños de las muestras fueron control (34), alcohol (32), D-NAP (20 \mug) + alcohol 813), D-SAL (20 \mug) + alcohol (19), D-SAL (2 \mug) + alcohol (8), L-NAP (20 \mug) + D-SAL (20 \mug) + alcohol (23).

La Figura 6B ilustra que el pretratamiento con L-NAP + D-SAL evitó o redujo la restricción del crecimiento fetal. Se obtuvieron los pesos fetales para cada hembra preñada a E18. Se realizaron comparaciones con el grupo del alcohol, valor P de ANOVA global p= 0,04. El tamaño de las muestras fue el número de litros. La media de cada litro se usó para análisis estadístico y representa una media de 8-10 fetos. Los tamaños de las muestras fueron control (34), alcohol (32), D-NAP (20 \mug) + alcohol (13), D-SAL (20 \mug) + alcohol (19), D-SAL (2 \mug) + alcohol (8), L-NAP (20 \mug) + D-SAL (20 \mug) + alcohol (23).

La Figura 7 ilustra que el post-tratamiento de una hora con L-NAP y L-SAL evitó la muerte fetal. Se administraron L-NAP (20 \mug) y L-SAL (20 \mug) a una y tres horas tras la administración de alcohol en E8. Se realizaron comparaciones con el grupo del alcohol, p= 0,001 ANOVA global. Se realizaron tests de Fishers post hoc, con los grupos de una hora y del control significativamente diferentes que el alcohol (p< 0,001 y p= 0,04, respectivamente). Los tamaños de muestras fueron control (35), alcohol (41), tratamiento después de una hora (18) y tratamiento después de tres horas (14).

La Figura 8 ilustra que los tratamientos tras una y tres horas con L-NAP y L-SAL evitaron la microcefalia fetal. Se administraron L-NAP y L-SAL una y tres horas tras la administración de alcohol en E8 (N+S+A). Se realizaron comparaciones en el grupo del alcohol, p= 0,001 de ANOVA global. Se realizaron test de Fishers post hoc, con los grupos de una hora, de tres horas, y del control, significativamente diferentes del alcohol (p< 0,001, < 0,03 y p< 0,008, respectivamente). Los tamaños de las muestras fueron control (34), alcohol (32), tratamiento después de una hora (17) y tratamiento después de tres horas (11).

La Figura 9 ilustra el tratamiento oral con D-NAP y D-SAL evitó la muerte fetal asociada con la fetopatía alcohólica. Se administraron D-NAP y D-SAL mediante sonda nasogástrica inmediatamente después del tratamiento con alcohol en E8. Se realizaron comparaciones con el grupo del alcohol p= 0,004 ANOVA global. Se llevaron a cabo tests de Fishers post hoc, con los grupos de tratamiento oral y de control significativamente diferentes del alcohol (p\leq 0,001 y \leq 0,04, respectivamente). Los tamaños de las muestras fueron control (21), alcohol (18), D-NAP + D-SAL oral y alcohol (18).

La Figura 10A ilustra los efectos de la administración oral de polipéptidos del ADNF sobre el peso de cerebro de crías. Se inyectó alcohol a ratas preñadas como un modelo para la fetopatía alcohólica según los métodos de Webster et al., Neurobehav. Tox. 2:227-34 (1980). Se inyectó alcohol al 25% a ratas preñadas, a 0,030 ml/g de peso corporal. El péptido se disolvió en disolución salina tamponada con fosfato, y se administró oralmente mediante sonda nasogástrica 30 minutos antes del tratamiento con alcohol. En la figura se muestra la dosis de péptidos de NAP y SAL administrados a cada ratón. Las barras de errores son \pm 1 errores estándar; * representa diferencias significativas frente a alcohol; y # representa diferencias significativas frente al control.

La Figura 10B ilustra los efectos de la administración oral de polipéptidos del ANDF sobre la muerte fetal. Las ratas preñadas se trataron como se describe anteriormente en la descripción para la Figura 10A. En la figura se muestra la dosis de los péptidos NAP y SAL administrados a cada ratón. Las barras de errores son \pm 1 errores estándar; * representa diferencias significativas frente a alcohol; y # representa diferencias significativas frente al control.

La Figura 11 ilustra el desarrollo del comportamiento de evitación del acantilado en ratones neonatos: comparación de respuesta de fármaco peptídico en ratones de control frente a ratones sin conocimiento por Apo-E. Los animales se trataron mediante aplicación oral o inyección subcutánea de D-SAL + D-NAP. Los péptidos (0,5 mg cada uno) se disolvieron en ácido acético 0,01 M (30 \mul) y 470 \mul de disolución salina. Se realizaron disoluciones posteriores en disolución salina. Para ambas aplicaciones, se administraron 0,5 \mug de cada uno de los fármacos de ensayo; para la aplicación oral (sublingual), en 10 \mul de disolución salina, y para la inyección en 20 \mul. Este protocolo se usó durante los primeros 4 días de vida. A partir del día 5-10, se dobló la cantidad de péptidos y el volumen de disolución. A partir del día 11-14, la cantidad de péptido fue 2 \mug cada uno en 40 \mul (oral) y 80 \mul (inyección). Los ensayos realizados a diario incluyeron la evitación del acantilado, geotaxia negativa, y comportamientos de ubicación y alzamiento. Se comparó la administración tanto subcutánea como oral de D-NAP y D-SAL.

La Figura 12 ilustra el desarrollo de un comportamiento geotáxico negativo en ratones neonatos: comparación de las respuestas al fármaco peptídico en ratones de control frente a ratones Apo-E deficientes. El modelo de tratamiento fue como se describe en la Figura 11.

La Figura 13 ilustra el desarrollo del comportamiento de ubicación en ratones neonatos: comparación de las respuestas al fármaco peptídico en ratones de control frente a ratones Apo-E deficientes. El método de tratamiento fue como se describe en la Figura 11.

Las Figuras 14A y B ilustran el efecto de la administración oral de D-NAPVSIPQ + D-SALLRSIPA sobre el aprendizaje y la memoria en ratas tratadas con la colinotoxina AF-64A. Se examinaron los procesos de memoria a corto plazo mediante el comportamiento en el laberinto de agua de Morris, midiendo el tiempo requerido para encontrar la plataforma escondida en el segundo de dos ensayos diarios. La localización de la plataforma y el tiempo de partida en el que se situó al animal en el agua se mantuvieron constantes en el par de ensayos diarios, pero ambas localizaciones se cambiaron todos los días. Para el primer ensayo, tanto la plataforma como el animal se situaron en una nueva localización con respecto a la piscina (estando la piscina inmóvil). El experimento se realizó según lo siguiente: el animal se situó sobre la plataforma durante 0,5 minutos, y después se colocó en el agua. Como se muestra en la Figura 14A, se midió (primer ensayo) el tiempo requerido para alcanzar la plataforma (lo que indica aprendizaje y memoria de referencia intacta). Después de 0,5 minutos sobre la plataforma, el animal se colocó nuevamente en el agua (en la posición previa) para un segundo ensayo adicional (Figura 14B), y para que buscasen la plataforma escondida (mantenida en la posición previa). Se registró el tiempo requerido para alcanzar la plataforma en el segundo ensayo, lo que indica memoria a corto plazo (de trabajo). Todas las medidas se realizaron usando el sistema de laberinto de agua de HVS (HVS Image Ltd. Hampton, UK) asistido por vídeo computerizado. Los animales se estudiaron durante cuatro días para eliminar animales al azar con memoria defectuosa. El número n designado es el número de animales estudiado. Cada punto es la media + el error estándar.

La Figura 14C ilustra el efecto de la administración oral de D-SALLRSIPA solo sobre el aprendizaje y la memoria en ratas tratadas con la colinotoxina AF-64A.

La Figura 15 ilustra la comparación de la administración sublingual (oral) y subcutánea de D-SAL + D-NAP en ratones de control frente a ratones Apo-E deficientes que se estudiaron para determinar la memoria a corto plazo en el laberinto de agua de Morris. Se observaron mejoras de las funciones cognitivas una semana después de la terminación del tratamiento diario de dos semanas con D-SAL + D-NAP, es decir, en ratones de 21 días expuestos a un protocolo de entrenamiento de 5 días. Se midió el tiempo requerido para encontrar la plataforma escondida en un segundo de dos ensayos diarios. La localización de la plataforma y el punto de partida en el que se situó al animal en el agua se mantuvieron constantes en cada par del ensayo diario, pero ambas localizaciones se cambiaron cada día. En el segundo ensayo del primer día de ensayo, los ratones ApoE deficientes se retrasaron significativamente comparados con los controles (P< 0,04) y mejoraron tras la aplicación oral de D-SAL + D-NAP, encontrando la mayoría del animales tratados la plataforma a una latencia de \leq 20 segundos.

Las Figuras 16A y Figuras 16B ilustran los resultados de la prueba del laberinto de agua de Morris del primer ensayo y del segundo ensayo, respectivamente, en ratones deficientes de apolipoproteína E. Los experimentos se realizaron tras la inyecciones de una mezcla de D-NAP + D-SAL con un protocolo de inyección y un laberinto de agua de Morris según se describe en Gozes et al., J. Pharmacol. Exp. Therap. 293:1091-1098 (2000). Los resultados mostraron mejoras significativas en el día 1 y el día 2 (primer ensayo diario), y en el día tres (segundo ensayo diario) - p< 0,05.

Definiciones

La expresión "polipéptido del ADNF" se refiere a uno o más factores neurotróficos dependiente de la unidad (ADNF) que tienen un sitio central activo que comprende la secuencia de aminoácidos de SALLRSIPA o NAPVSIPQ, o variantes modificadas conservativamente de los mismos que tienen actividad neurotrófica/neuroprotectora según se mide con ensayos de cultivo neuronal cortical in vitro descritos por, por ejemplo, Brenneman et al., J. Pharmacol. Exp. Therp. 285:629-627 (1998); Bassan et al., J. Neurochem. 72:1283-1293 (1999). Un polipéptido del ADNF puede ser un polipéptido del ADNF I o un polipéptido del ADNF III. Un "polipéptido del ADNF" también se puede referir a una mezcla de polipéptido del ADNF I y polipéptido del ADNF III.

La definición "ADNF I" se refiere a un polipéptido del factor neurotrófico dependiente de la actividad, que tiene un peso molecular de alrededor de 14.000 Daltons con un pI de 8,3 \pm 0,25. Como se describe anteriormente, los polipéptidos del ANDF I tienen un sitio central activo que comprende una secuencia de aminoácidos de Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (también denominada como "SALLRSIPA", "SAL", O "ADNF I-9"; SEQ ID NO:1). Véase, Brenneman et al., J. Clin. Invest. 97(2299-2307) (1996), Glazner et al., Anat. Embryol. 200:65-71 (1999). Véase, Brenneman et al., J. Pharm. Exp. Ther. 285:619-27 (1998), Gozes y Brenneman, J. Mol. Neurosci. 7:235-244 (1996), y Gozes et al., Dev. Brain Res. 99:167-175 (1997), todas las cuales se incorporan aquí como referencia. Excepto que se indique de otro modo, "SAL" se refiere a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1), y no a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de Ser-Ala-Leu.

Las expresiones "ADNF III" y "ADNP" se refieren a un polipéptido del factor neurotrófico dependiente de la actividad, que tiene un peso molecular pronosticado de alrededor de 95 kDa (alrededor de 828 restos de aminoácidos) y un pI de alrededor de 5,99. Como se describe anteriormente, los polipéptidos de ADNF III tienen un sitio central activo que comprende una secuencia de aminoácidos de Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (también denominada como "NAPVSIPQ", "NAP", o "ANDF III-8"; SEQ ID NO:2). Véase Bassan et al., J. Neurochem. 72:1283-1293 (1999) incorporada aquí como referencia. Excepto que se indique de otro modo, "NAP" se refiere a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO:2), y no a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de Asn-Ala-Pro.

La expresión "reducir la muerte celular neuronal" ser refiere a la reducción, incluyendo la prevención, de la muerte celular neuronal. La reducción es un cambio de un parámetro en alrededor de 10% hasta alrededor de 100%, preferiblemente al menos alrededor de 50%, y más preferiblemente al menos alrededor de 80%, comparado con el del control (por ejemplo, sin tratamiento con, por ejemplo, polipéptidos del ADNF). La reducción de la muerte celular neuronal se puede medir por cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los polipéptidos de ADNF que reducen la muerte celular neuronal se pueden seleccionar sistemáticamente usando los diversos métodos descritos en U.S.S.N. 60/037.404, presentado el 27 de febrero de 1997 (publicado como documento WO98/35042) y el documento U.S.S.N. 09/187.330, presentado el 6 de noviembre de 1998.

La expresión "estrés oxidativo" en células o tejidos se refiere a la generación potenciada de radicales libres o especies oxigenadas reactivas (ORS) (tal como el radical \alpha-hidroxietilo, el radical superóxido, el radical hidroxi, el radical peroxi, y el peróxido de hidrógeno), y/o para un agotamiento en el sistema de defensa antioxidante lo que provoca un desequilibrio entre los prooxidantes y los antioxidantes. El sistema antioxidante enzimático incluye, por ejemplo, superóxido dismutasa, catalasa, glutationa peroxidasa, y glutationa reductasa, y los antioxidantes no enzimáticos incluyen, por ejemplo, glutationa reducida, vitamina A, C, y E. Véase, Schlorff et al., Alcohol 17:97-105 (1999).

La expresión "reducir el estrés oxidativo" se refiere a la reducción, incluyendo la prevención, del estrés oxidativo en células y tejidos. La reducción es un cambio de un parámetro en alrededor de 10% hasta alrededor de 100%, preferiblemente al menos alrededor de 50%, y más preferiblemente al menos alrededor de 80%, comparado con el del control (por ejemplo, sin tratamiento con, por ejemplo, polipéptidos del ADNF). La reducción en el estrés oxidativo se puede medir mediante cualquiera de los métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los polipéptidos del ADNF que reducen el estrés oxidativo se pueden seleccionar sistemáticamente usando neuronas primarias tratadas con FeSO_{4} in vitro según se describe más abajo. También, los polipéptidos del ADNF que reducen el estrés oxidativo se pueden seleccionar sistemáticamente usando animales que ingieran etanol, lo que se sabe que provoca el estrés oxidativo en células y tejidos. Por ejemplo, se pueden usar los efectos de los polipéptidos del ADNF sobre peroxidación de lípidos en plasma y/o sistema antioxidante de ratas que ingirieron etanol. Véase, por ejemplo, Schlorff et al., Alcohol 17:97-105 (1999).

Las expresiones "fetopatía alcohólica" y "efectos del alcohol sobre el feto" se refieren a diversas afecciones físicas y mentales de un embrión, un feto, o un paciente que está expuesto a alcohol in utero (por ejemplo, cuya madre consume alcohol durante la gestación) en una cantidad suficiente para iniciar el desarrollo de estas afecciones o provocar estas afecciones en ausencia de un tratamiento de prevención, por ejemplo, tratamiento con polipéptidos del ADNF. Algunas de estas afecciones incluyen, pero no se limitan, a las siguientes:

deformidades óseas: costillas y esternón deformados; médula espinal curvada; dislocaciones de la cadera; dedos de la mano o del pie doblados, unidos, interdigitalizados, o perdidos; movimiento limitado de las articulaciones; cabeza pequeña; anormalidades faciales: pequeña apertura de los ojos; formación de membranas de piel entre ojos y base de la nariz; caída de párpados; miopía; fallo de los ojos para moverse en la misma dirección; nariz respingona corta; puente nasal hundido; surco plano o ausencia de surco entre la nariz y el labio superior; labio superior delgado; abertura en el cielo de la boca; mandíbula pequeña; grupo de orejas pequeñas o malamente formadas; deformidades de órganos: defectos cardíacos; soplos cardíacos; malformaciones genitales; defectos renales y urinarios; defectos del sistema nervioso central: cerebro pequeño; mala disposición de células cerebrales y de tejido conectivo; retraso mental -habitualmente leve a moderado, pero ocasionalmente grave; incapacidades para el aprendizaje; poca capacidad de atención; irritabilidad en la infancia; hiperactividad en la niñez; mala coordinación corporal, manual y de los dedos (véase, por ejemplo, www.well.com/user/woa/fsfas.htm); y otras anormalidades: reducción del peso del peso; reducción del peso corporal; tasa más elevada de muerte in utero, y disminución en el nivel de VIP (por ejemplo, ARNm de VIP).

La expresión "reducir una afección asociada con fetopatía alcohólica" se refiere a la reducción, incluyendo la prevención, de parámetros asociados con la fetopatía alcohólica. La reducción es un cambio de un parámetro en alrededor de 10% hasta alrededor de 100%, preferiblemente al menos alrededor de 50%, y más preferiblemente al menos alrededor de 80%, comparado con el del control (por ejemplo, expuesto a alcohol in utero sin tratamiento, por ejemplo, tratamiento con polipéptidos del ADNF). Los parámetros pueden ser cualquiera de las afecciones físicas o mentales enumeradas anteriormente. Por ejemplo, pueden ser: (1) el porcentaje de muerte de feto, (2) pesos fetales y pesos cerebrales fetales, (3) el nivel de VIP (por ejemplo, ARNm de VIP) en embriones, (4) aprendizaje y/o memoria, y (5) el nivel de glutationa.

La expresión "un paciente con fetopatía alcohólica" se refiere a un embrión, un feto, o un paciente, en particular un ser humano, que está expuesto a alcohol in utero, y que tiene fetopatía alcohólica, o que tiene el riesgo o peligro de desarrollar, debido al consumo materno de alcohol, cualquiera de las afecciones relacionadas con fetopatía alcohólica, tales como los efectos descritos anteriormente.

El término "memoria" incluye todas las clasificaciones médicas de memoria, por ejemplo, sensorial, inmediata, reciente y lejana, así como términos usados en psicología, tales como memoria de referencia, que se refiere a información ganada a partir de una experiencia previa, ya sea reciente o lejana (véase, por ejemplo, Harrison's Principles of Internal Medicine, volumen 1, págs. 142-150 (Fauci et al., eds., 1988)).

La expresión "poner en contacto" se usa aquí de forma intercambiable con lo siguiente: combinado con, añadido a, mezclado con, hecho pasar sobre, incubado con, o circulado sobre. Además, los polipéptidos del ADNF de la presente invención se pueden "administrar" mediante cualquier método convencional, tal como, por ejemplo, las vías parenteral, oral, tópica, y mediante inhalación. En realizaciones preferidas, se emplea la administración oral. En el contexto de métodos relacionados con la fetopatía alcohólica, los polipéptidos del ADNF se pueden administrar directamente a un embrión, feto, o paciente in utero, o indirectamente a un paciente in utero, administrando el polipéptido a la madre mediante cualquiera de los otros métodos descritos en este documento.

"Una cantidad suficiente" o "una cantidad eficaz" es aquella cantidad de un polipéptido dado del ADNF que reduce la muerte celular neuronal, o reduce la fetopatía alcohólica o el estrés oxidativo según se describen en este documento. Por ejemplo, en el contexto de la muerte neuronal, "una cantidad suficiente" o "una cantidad eficaz" es aquella cantidad de un polipéptido dado del ADNF que reduce la muerte celular neuronal en los ensayos de, por ejemplo, Hill et al., Brain Res. 603:222-233 (1993); Brenneman et al., Nature 335:639-642 (1988); o Brenneman et al., Dev. Brain Res. 51:63-68 (1990); Forsythe y Westbrook, J. Physiol. Lond. 396:515-533 (1988). En el contexto de la reducción del estrés oxidativo, "una cantidad suficiente" o "una cantidad eficaz" es aquella cantidad de polipéptido del ADNF que reduce o evita, por ejemplo, cambios en la peroxidación de lípidos en el plasma, o cambios en el sistema antioxidante, según los ensayos descritos en Schlorff et al., Alcohol 17:97-105 (1999). En el contexto de la reducción de la fetopatía alcohólica "una cantidad suficiente" o "una cantidad eficaz" es aquella cantidad de un polipéptido dado del ADNF que reduce o evita, por ejemplo, (1) el porcentaje de muerte de fetos, (2) una reducción en los pesos de los fetos y en los pesos de los cerebros de los fetos, o (3) una reducción en el nivel de ARNm de VIP en embriones. El intervalo de dosificación puede variar dependiendo del polipéptido del ADNF usado, la vía de administración y la potencia del polipéptido del ADNF particular, pero se puede determinar fácilmente usando los ensayos anteriores.

Los términos "aislado", "puro", o "biológicamente puro", se refieren a material que está sustancial o esencialmente libre de componentes que normalmente lo acompañan según se encuentra en su estado nativo. La pureza y la homogeneidad se determinan típicamente usando técnicas de química analítica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida o cromatografía de líquidos de altas prestaciones. Se purifica sustancialmente una proteína que es la especie predominante presente en una comparación. En particular, se prepara un ácido nucleico del ADNF aislado a partir de las ventanas de lectura abierta que flanquean el gen del ADNF y que codifica proteínas distintas del ADNF. El término "purificado" significa que un ácido nucleico o proteína da lugar a esencialmente una banda en un gel electroforético. Particularmente, quiere decir que el ácido nucleico o proteína es al menos 85% puro, más preferiblemente al menos 95% puro, y lo más preferible al menos 99% puro.

"Ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma de cadena sencilla o de doble cadena. El término ácido nucleico se usa de forma intercambiable con gen, ADNc, ARNm, oligonucleótido, y polinucleótido.

El término "aminoácido" se refiere a aminoácidos de origen natural en forma L, y sus enantiómeros en forma D. Las formas de imagen especular (enantiómeros) de los aminoácidos se denominan el isómero L y el isómero D, en las que L se refiere a levorrotatorio (giro a la izquierda del plano de polarización de la luz) y D se refiere a dextrorrotatorio (giro a la derecha del plano de polarización).

Los aminoácidos se pueden citar aquí mediante sus símbolos de tres letras habitualmente conocidos, o mediante los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB. Igualmente, los nucleótidos se pueden citar por sus códigos de una sola letra habitualmente aceptados.

Los términos "polipéptido", "péptido", y "proteína" se usan de forma intercambiable en este documento para referirse a un polímero de restos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los que uno o más de los restos de aminoácidos es un aminoácido de origen natural en forma L o sus enantiómeros en forma D o sus combinaciones.

Descripción detallada de la invención y realizaciones preferidas I. Introducción

La quiralidad (diestra o siniestra) de un péptido pertenece a la disposición tetraédrica de cuatro grupos diferentes alrededor del átomo de carbono \alpha de los aminoácidos constituyentes que confieren actividad óptica. Las dos formas de imagen especular (enantiómeros) de los aminoácidos se denominan el isómero L y el isómero D, en las que L se refiere a levorrotatorio (giro a la izquierda del plano de polarización de la luz) y D se refiere a dextrorrotatorio (giro a la derecha del plano de polarización). Sólo los L-aminoácidos son constituyentes de las proteínas de origen natural. La farmacología clásica de receptores enseña que los receptores de membrana discriminan fácilmente entre los L- y D-agonistas y antagonistas. La activación del receptor está mediada a través de una preferencia estereoselectiva por agentes en forma de isómero L de origen natural.

Debido a que los polipéptidos del ADNF I y ADNF III son factores neurotróficos, se predijo que los polipéptidos del ADNF I y ADNF III que comprenden D-aminoácidos no serían capaces de activar sus receptores de membrana estereoselectivos respectivos. Sorprendentemente, se encontró que los péptidos del ADNF I y ADNF III, que comprenden D-aminoácidos, eran bioactivos. De hecho, todas las formas D y todas las formas L de los aminoácidos del péptido de sitio central activo procedente de los péptidos del ADNF I, es decir, SALLRSIPA (SAL), fueron virtualmente idénticas en cuanto a la actividad de supervivencia neuronal in vitro. De forma similar, todas las formas D y todas las formas L de los aminoácidos del péptido del sitio central activo procedente de los polipéptidos del ANDF III, es decir, NAPVSIPQ (NAP), fueron virtualmente idénticas en cuanto a la actividad de supervivencia neuronal in vitro. Es muy poco habitual que todos los péptidos de D-aminoácidos sean activos, e incluso es menos habitual todavía que los isómeros D y L de un péptido dado sean igualmente activos.

Se han dado a conocer unos pocos ejemplos de péptidos con acciones similares en las formas D frente a L. Un ejemplo bien conocido es el beta-amiloide. Se demostró que la bioactividad de los isómeros D de beta-amiloides 1-42 es idéntica a la observada con la forma L del péptido (Cribas et al., J. Biol. Chem. 272:7431-7436 (1997)). Otro ejemplo es el efecto inmunosupresor de los D- y L-péptidos derivados de HLA de clase I de cadena pesada (Woo et al., Transplantation 64:1460-1467 (1997)). Aunque estos ejemplos ilustran que la bioactividad de los péptidos puede ser no estereoselectiva, este fenómeno es muy raro. Esto es debido a que las macromoléculas biológicas están formadas de moléculas monómeras de quiralidad uniforme (Mason, Chirality 3:223 (1990)), y las interacciones bioquímicas de macromoléculas biológicas son inherentemente quirales. De hecho, para los agentes neurotróficos, no hay ningún ejemplo conocido que muestre propiedades no quirales. De este modo, es sorprendente que los polipéptidos del ADNF de la presente invención proporcionen neuroprotección a través de un mecanismo no quiral.

El hecho de que los polipéptidos del ADNF que comprenden D-aminoácidos sean bioactivos permite que estos polipéptidos sean administrados oralmente. Comparados con los isómeros L, los isómeros D de los péptidos tienen una mayor estabilidad en el tubo digestivo, y se pueden absorber sin cambio (He et al., J. Pharmaceutical Sci. 87:626-633 (1998)). Por ejemplo, en He et al., se estimó la biodisponibilidad (según se mide por la aparición de D-péptidos marcados sin cambiar en la orina tras 24-48 horas) era 13% con compuestos de masa molecular de 900 Daltons, el tamaño aproximado de los sitios centrales activos de los polipéptidos del ADNF I y ADNF III. Los polipéptidos del ADNF que comprenden D-aminoácidos proporcionan una mayor biodisponibilidad, y de este modo se pueden formular para la administración oral.

Como tal, la presente invención proporciona por primera vez polipéptidos del ADNF que comprenden al menos un D-aminoácido en sus sitios centrales activos, preferiblemente en el término N y/o el término C de los sitios centrales activos. En una realización actualmente preferida, la invención proporciona polipéptidos del ADNF que comprenden todos D-aminoácidos. La invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un polipéptido del ADNF I, un polipéptido del ADNF III, o una mezcla de los mismos, en la que al menos uno del polipéptido del ADNF I o el polipéptido del ADNF III comprende al menos un D-aminoácido en su sitio central activo. En particular, la invención proporciona una composición farmacéutica oralmente activa que comprende un polipéptido del ADNF que comprende al menos un D-aminoácido en su sitio central activo. Los polipéptidos del ADNF, y las composiciones farmacéuticas de la presente invención, se pueden usar para la fabricación de un medicamento para reducir la muerte celular neuronal, para reducir el estrés oxidativo en un paciente, y para reducir una afección asociada con fetopatía alcohólica.

II. Polipéptidos del ADNF que comprenden D-aminoácidos, y métodos para obtener los polipéptidos

En un aspecto, la presente invención proporciona un polipéptido del ADNF que comprende al menos un D-aminoácido en su sitio central activo, preferiblemente en el N-término y/o el C-término del sitio central activo. Puesto que los enantiómeros D de los polipéptidos son enzimáticamente más estables que sus enantiómeros L, un polipéptido del ADNF que comprende D-aminoácidos proporciona una mayor biodisponibilidad comparado con su contraparte que comprende L-aminoácidos. En particular, los polipéptidos del ADNF que comprenden D-aminoácidos son estables en el tubo digestivo y se pueden absorber sin ruptura en el cuerpo humano. Por lo tanto, los polipéptidos del ADNF de la presente invención son particularmente útiles como un agente oral.

En una realización, el polipéptido del ADNF I comprende un sitio central activo que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1), en el que el sitio central activo comprende al menos un D-aminoácido. En otra realización, ambos aminoácidos N-terminal y/o C-terminal del sitio central activo del polipéptido del ADNF I son D-aminoácidos. En aún otra realización, el sitio central activo del polipéptido del ADNF I comprende D-aminoácidos en localizaciones distintas del N-término y/o el C-término del sitio central activo. Por ejemplo, cualquiera de los aminoácidos en el sitio central activo puede ser un D-aminoácido. En otras palabras, una cualquiera o cualquiera de las combinaciones de serina, alanina, leucina, leucina, arginina, serina, isoleucina, prolina, y alanina, dentro del sitio central activo del polipéptido del ADNF I, puede ser un D-aminoácido. Por ejemplo, cualquier otro aminoácido dentro del sitio central activo del polipéptido del ADNF I puede ser un D-aminoácido. En una realización preferida, el sitio central activo del polipéptido del ADNF I comprende todos D-aminoácidos.

En aún otra realización, el polipéptido del ADNF I puede comprender aminoácidos adicionales en el N-término y/o en el C-término del sitio central activo. Por ejemplo, el polipéptido del ADNF I puede comprender hasta 20 aminoácidos en el N-término y/o el C-término del sitio central activo. En estas realizaciones, el aminoácido N-terminal y/o el aminoácido C-terminal del polipéptido del ADNF I son preferiblemente D-aminoácidos. Uno cualquiera de los aminoácidos adicionales, o todos los aminoácidos adicionales, pueden ser D-aminoácidos. En una realización preferida, el polipéptido del ADNF I no comprende ningún aminoácido adicional, y tiene una secuencia de aminoácidos de Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1), en el que el polipéptido del ADNF I comprende todos D-aminoácidos.

En otra realización, el polipéptido de ADNF III comprende un sitio central activo que tiene la secuencia de aminoácidos siguiente: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO:2), en el que el sitio central activo comprende al menos un D-aminoácido. En otra realización, ambos aminoácidos N-terminal y/o C-terminal del sitio central activo del polipéptido del ADNF III son D-aminoácidos. En aún otra realización, el sitio central activo del polipéptido del ADNF III comprende D-aminoácidos en localizaciones diferentes del término N o C del sitio central activo. Por ejemplo, cualquiera de los aminoácidos dentro del sitio central activo puede ser un D-aminoácido. En otras palabras, una cualquiera o una combinación de aspargina, alanina, prolina, valina, serina, isoleucina, prolina y glutamina, dentro del sitio central activo de los polipéptidos del ADNF III, puede ser un D-aminoácido. Por ejemplo, cualquier otro aminoácido dentro del sitio central activo del polipéptido del ADNF III puede ser un D-aminoácido. En una realización preferida, el sitio central activo del polipéptido del ADNF III comprende todos D-aminoácidos.

En aún otra realización, el polipéptido del ADNF III puede comprender aminoácidos adicionales en el término N y/o en el término C del sitio central activo. Por ejemplo, el polipéptido del ADNF III puede comprender hasta 40 aminoácidos en el término N y/o en el término C del sitio central activo. En otro ejemplo, el polipéptido del ADNF III puede comprender hasta 20 aminoácidos en el término N y/o en el término C del sitio central activo. En aún otro ejemplo, el polipéptido del ADNF III puede comprender hasta 10 aminoácidos en el término N y/o el término C del sitio central activo. En esas realizaciones, preferiblemente el aminoácido N-terminal y/o el aminoácido C-terminal del polipéptido del ADNF III son D-aminoácidos. Uno cualquiera de los aminoácidos adicionales, o todos los aminoácidos adicionales, pueden ser D-aminoácidos. En una realización preferida, el polipéptido del ADNF III no comprende ningún aminoácido adicional, y tiene una secuencia de aminoácido de Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO:2), en el que el polipéptido del ADNF III comprende todos D-aminoácidos.

En una realización preferida, el polipéptido del ADNF I comprende una secuencia de aminoácidos que tiene la siguiente fórmula: (R^{1})_{x}-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala-(R^{2})_{y} (SEQ ID NO:3), en el que el sitio central activo comprende al menos un D-aminoácido. En otra realización preferida, el polipéptido del ADNF III comprende una secuencia de aminoácido que tiene la siguiente fórmula: (R^{3})_{w}-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-(R^{4})_{z} (SEQ ID NO:4), en el que el sitio central activo comprende al menos un D-aminoácido. En estas realizaciones preferidas, es completamente aplicable la discusión previa que se refiere a la localización y al número de D-aminoácidos dentro de los sitios centrales activos de los polipéptidos del ADNF I y del ADNF III, y de este modo no se repetirá con respecto a estas realizaciones particulares de la invención.

En la fórmula anterior, cada uno de R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4}, si están presentes, es una secuencia de aminoácidos que comprende de 1 hasta alrededor de 40 aminoácidos, en la que cada aminoácido en la secuencia de aminoácido se selecciona independientemente. La expresión "se selecciona independientemente" se usa en este documento para indicar que los aminoácidos que constituyen, por ejemplo, la secuencia R^{1} de aminoácido pueden ser idénticos o diferentes (por ejemplo, todos los aminoácidos en la secuencia de aminoácidos pueden ser treonina). Esta discusión con relación a R^{1} es totalmente aplicable a R^{2}, R^{3} y R^{4}. Además, una cualquiera, o cualquiera de las combinaciones, de los aminoácidos que constituyen la secuencia R^{1} de aminoácidos, puede ser un D-aminoácido o un L-aminoácido. En una realización, el aminoácido N-terminal de R^{1} es un D-aminoácido y/o el aminoácido C-terminal de R^{2} es un D-aminoácido. En otra realización, el aminoácido N-terminal de R^{3} es un D-aminoácido, y/o el aminoácido C-terminal de R^{4} es un D-aminoácido. En otra realización, cada uno de R^{1}, R^{2}, R^{3} y R^{4} comprende todos D-aminoácidos.

Dentro de la fórmula anterior para el polipéptido del ADNF I, x e y se seleccionan independientemente y son iguales a cero o uno. La expresión "se seleccionan independientemente" se usa en este documento para indicar que x e y pueden ser idénticos o diferentes. Por ejemplo, x e y pueden ser ambos cero o, como alternativa, x e y pueden ser ambos uno. Además, x puede ser cero e y puede ser uno, o, como alternativa, x puede ser uno e y puede ser cero. Además, si x e y son ambos uno, las secuencias de aminoácidos R^{1} y R^{2} pueden ser iguales o diferentes. Como tal, las secuencias R^{1} y R^{2} de aminoácidos se seleccionan independientemente. Si R^{1} y R^{2} son iguales, son idénticos en términos de longitud de cadena y de composición de aminoácidos. Por ejemplo, tanto R^{1} como R^{2} pueden ser Val-Leu-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:5). Si R^{1} y R^{2} son diferentes, pueden diferir entre sí en términos de longitud de cadena y/o de composición de aminoácidos y/o del orden de los aminoácidos en las secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, R^{1} puede ser Val-Leu-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:5), mientras que R^{2} puede ser Val-Leu-Gly-Gly (SEQ ID NO:9). Como alternativa, R^{1} puede ser Val-Leu-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:5), mientras que R^{2} puede ser Val-Leu-Gly-Gly-Val (SEQ ID NO:13). Como alternativa, R^{1} puede ser Val-Leu-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:5), mientras que R^{2} puede ser Gly-Val-Leu-Gly-Gly (SEQ ID NO:11).

De forma similar, w y z se seleccionan independientemente, y son iguales a cero o uno dentro de la fórmula anterior para el polipéptido del ADNF III. La expresión "se seleccionan independientemente" se usa en este documento para indicar que w y z pueden ser idénticos o diferentes. Por ejemplo, w y z pueden ser ambos cero, o, como alternativa, w y z pueden ser ambos uno. Además, w puede ser cero, y z puede ser uno, o, como alternativa, w puede ser uno, y z puede ser cero. Además, si w y z son ambos uno, las secuencias R^{3} y R^{4} de aminoácidos pueden ser iguales o diferentes. Como tal, las secuencias R^{3} y R^{4} de aminoácidos se seleccionan independientemente. Si R^{3} y R^{4} son iguales, entonces son idénticos en términos tanto de longitud de cadena como de composición de aminoácidos. Por ejemplo, tanto R^{3} como R^{4} pueden ser Leu-Gly-Leu-Gly-Gly (SEQ ID NO:7). Si R^{3} y R^{4} son diferentes, pueden diferir entre sí en términos de longitud de cadena y/o de composición de aminoácidos y/o de orden de aminoácidos de las secuencias de aminoácidos. Por ejemplo, R^{3} puede ser Leu-Gly-Leu-Gly-Gly (SEQ ID NO:7), mientras que R^{4} pueden ser Leu-Gly-Leu-Gly (SEQ ID NO:12). Como alternativa, R^{3} puede ser Leu-Gly-Leu-Gly-Gly (SEQ ID NO:7), mientras que R^{4} pueden ser Leu-Gly-Leu-Gly-Leu (SEQ ID NO:13).

Dentro del alcance, se prefieren ciertos polipéptidos del ANDF I y del ADNF III, principalmente aquellos en los que x, y, w y z son todos cero (es decir, SALLRSIPA (SEQ ID NO:1) y NAPVSIPQ (SEQ ID NO:2), respectivamente). Se prefieren igualmente los polipéptidos del ADNF I en los que x es uno; R^{1} es Val-Leu-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:5); e y es cero. También se prefieren igualmente los polipéptidos del ADNF I en los que x es uno; R^{1} es Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly (SEQ ID NO:6); e y es cero. También se prefieren igualmente los polipéptidos del ADNF III en los que w es uno; R^{3} es Gly-Gly; y z es cero. También se prefieren igualmente los polipéptidos del ADNF III en los que w es uno; R^{3} es Leu-Glu-Gly; z es uno; y R^{4} es Gln-Ser. También se prefieren igualmente los polipéptidos del ADNF III en los que w es uno; R^{3} es Leu-Gly-Leu-Gly-Gly (SEQ ID NO:7); z es uno; y R^{4} es Gln-Ser. También se prefieren igualmente los polipéptidos del ADNF III en los que w es uno; R^{3} es Ser-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Gly (SEQ ID NO:8); z es uno; y R^{4} es Gln-Ser. Los aminoácidos adicionales se pueden añadir tanto al término N como al término C de estos sitios centrales activos (SALLRSIPA o NAPVSIPQ) sin pérdida de actividad biológica, como se evidencia por el hecho de que los factores de crecimiento del ADNF I o del ADNF III intactos muestran actividad biológica extraordinaria. Véase el documento U.S.S.N. 08/324.297, presentado el 17 de octubre de 1994 (también publicado como documento WO96/11948) para la descripción de polipéptidos del ADNF I; y el documento U.S.S.N. 60/037.404, presentado el 27 de febrero de 1997, y el documento U.S.S.N. 60/059.621, presentado el 23 de septiembre de 1997 (también publicado como documento WO98/35042), para la descripción de los polipéptidos del ADNF III.

Los polipéptidos del ADNF que comprenden al menos un D-aminoácido dentro de los sitios centrales activos de los polipéptidos del ADNF se pueden preparar mediante una amplia variedad de técnicas bien conocidas. Los polipéptidos de tamaño relativamente corto se sintetizan típicamente en disolución o sobre un soporte sólido según técnicas convencionales (véase, por ejemplo, Merrifield, Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963)). Hay disponibles comercialmente varios sintetizadores y secuenciadores automáticos, y se pueden usar según protocolos conocidos (véase, por ejemplo, Stewart y Young, Solid Phase Peptide Synthesis (2ª edición, 1984)). La síntesis en fase sólida, en la que el aminoácido C-terminal de la secuencia está unido a un soporte insoluble seguido de la adición secuencial de los aminoácidos restantes en la secuencia, es el método preferido para la síntesis química de los polipéptidos de esta invención. Usando los métodos de síntesis en fase sólida, se pueden insertar uno o más D-aminoácidos, en lugar de L-aminoácidos, en un polipéptido del ADNF en cualquier localización o localizaciones deseadas. Las técnicas para la síntesis en fase sólida se describen por Barany y Merrifield, Solid-Phase Peptide Synthesis; págs. 3-284 en The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology. Vol 2: Special Methods in Peptide Synthesis, Parte A.; Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156 (1963); y Stewart et al., Solid Phase Peptide Synthesis (2ª edición, 1984).

Como alternativa, los polipéptidos del ANDF que comprenden al menos un D-aminoácido dentro de sus sitios centrales activos se pueden sintetizar usando tanto métodos de ADN recombinante como síntesis química. Por ejemplo, se pueden sintetizar químicamente fragmentos de un polipéptido del ADNF que comprende D-aminoácidos usando métodos de síntesis en fase sólida descritos anteriormente, y se pueden producir recombinantemente fragmentos de un polipéptido del ADNF que comprende L-aminoácidos. Esto es, se pueden introducir en células hospedantes vectores de expresión que contienen un ácido nucleico que codifica un fragmento de un polipéptido del ADNF, y después se pueden purificar los fragmentos del polipéptido del ADNF expresado. Estos fragmentos del polipéptido del ADNF que comprenden D-aminoácidos, y los fragmentos de polipéptidos del ADNF que comprenden L-aminoácidos, se pueden enlazar químicamente entre sí.

Tras la síntesis química, la expresión biológica o la purificación, el polipéptido o polipéptidos pueden poseer una conformación sustancialmente diferente que las conformaciones nativas de los polipéptidos constituyentes. En este caso, es útil desnaturalizar y reducir el polipéptido y después hacer que el polipéptido se pliegue en la conformación preferida. Los métodos para reducir y desnaturalizar los polipéptidos, e inducir el plegamiento, son bien conocidos para los expertos en la técnica (véase Debinski et al., J. Biol. Chem. 268:14065-14070 (1993); Kreitman y Pastan, Bioconjug. Chem. 4:581-585 (1993); y Buchner et al., Anal. Biochem. 205:263-270 (1992)). Por ejemplo, Debinski et al. describen la desnaturalización y reducción de polipéptidos de cuerpo de inclusión en guanidina-DTE. El polipéptido se pliega entonces en un tampón redox que contiene glutationa oxidada y L-arginina.

III. Composiciones farmacéuticas

En otro aspecto, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden al menos uno de los polipéptidos del ADNF previamente descritos que comprenden al menos un D-aminoácido dentro del sitio central activo, en una cantidad suficiente APRA exhibir actividad neuroprotectora/neurotrófica, y un diluyente, vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas que comprenden uno de los polipéptidos del ADNF previamente descritos son particularmente útiles como agentes orales, puesto que tienen estabilidad en el tubo digestivo y se pueden absorber sin cambios. Además, al usar mezclas de polipéptidos del ADNF en forma L y en forma D para producir composiciones farmacéuticas, se pueden obtener composiciones farmacéuticas que poseen propiedades variables de respuesta a la dosis. Estas composiciones farmacéuticas son útiles, entre otras cosas, en la selección de diferentes receptores que pueden tener afinidades diferentes por polipéptidos de ADNF, o para proporcionar regímenes de tratamiento farmacéutico adaptados al usuario para personas afectadas por, por ejemplo, trastornos neurodegenerativos.

En una realización, la composición farmacéutica comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un polipéptido del ADNF, en la que el polipéptido del ADNF es un miembro seleccionado del grupo que consta de: (a) un polipéptido del ADNF I que comprende un sitio central activo que tiene los siguientes aminoácidos: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1); (b) un polipéptido del ADNF III que comprende un sitio central activo que tiene los siguientes aminoácidos: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO:2); y (c) una mezcla del polipéptido del ANDF I de la parte (a) y del polipéptido del ADNF III de la parte (b); en la que al menos uno del polipéptido del ADNF I y del polipéptido del ADNF III comprende un sitio central activo que comprende al menos un D-aminoácido, preferiblemente en el término N y/o el término C del sitio central activo.

En otra realización, la composición farmacéutica comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un polipéptido del ADNF I, en la que el sitio central activo del polipéptido del ADNF I comprende al menos un D-aminoácido, preferiblemente en el término N y/o el término C del sitio central activo. La discusión previa relacionada con la localización y el número de D-aminoácidos dentro del sitio central activo del ADNF I, así como la discusión de los D- y/o L-aminoácidos adicionales añadidos al sitio activo del polipéptido del ADNF I es totalmente aplicable aquí, y de este modo, no se repetirá con respecto a esta realización particular de la invención.

En aún otra realización, la composición farmacéutica comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un polipéptido del ADNF III, en el que el sitio central activo del polipéptido del ADNF III comprende al menos un D-aminoácido, preferiblemente en el término N y/o el término C del sitio central activo. Es totalmente aplicable la discusión previa que se refiere a la localización y al número de D-aminoácidos dentro del sitio central activo del ADNF III, así como la discusión de D- y/o L-aminoácidos adicionales añadidos al sitio activo del polipéptido del ADNF III, y de este modo, no se repetirá con respecto a esta realización particular de la invención.

En aún otra realización, la composición farmacéutica comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y una mezcla de un polipéptido del ADNF I y un polipéptido del ADNF III, en la que al menos uno de los polipéptidos del ADNF I y ADNF III comprende un sitio central activo que comprende al menos un D-aminoácido. Es totalmente aplicable la discusión previa que se refiere a la localización y al número de D-aminoácidos dentro del sitio central activo del ADNF I o ANDF III, así como la discusión de D- y/o L-aminoácidos adicionales añadidos al sitio activo del polipéptido del ADNF I o del ADNF III, y de este modo no se repetirá con respecto a esta realización particular de la invención. En aún otra realización, la composición farmacéutica comprende un polipéptido del ADNF I que comprende todos D-aminoácidos y un polipéptido del ADNF III que comprende todos L-aminoácidos. En aún otra realización, la composición farmacéutica comprende un polipéptido del ADNF I que comprende todos L-aminoácidos, y un polipéptido del ADNF III que comprende todos D-aminoácidos. En aún otra realización, la composición farmacéutica comprende un polipéptido del ADNF I que comprende todos D-aminoácidos, y un polipéptido del ADNF III que comprenden todos D-aminoácidos.

En una composición farmacéutica, uno cualquiera o más del polipéptido del ADNF I descrito aquí se puede mezclar con uno cualquiera o más del polipéptido del ADNF III descrito aquí. Una mezcla de un polipéptido del ADNF I y un polipéptido del ADNF III puede ser una mezcla de dos o más de estos polipéptidos. Una mezcla de un polipéptido del ADNF I y de un polipéptido del ADNF III también se puede referir a uno o más de polipéptidos del ADNF I que está acoplado a uno o más de polipéptidos del ADNF III. Por ejemplo, un polipéptido del ADNF I se puede enlazar covalentemente a un polipéptido del ADNF III. Una mezcla de un polipéptido del ADNF I y un polipéptido del ADNF III se puede preparar como una composición única y se puede administrar a un paciente. Como alternativa, un polipéptido del ADNF I y un polipéptido del ADNF III se puede preparar como composiciones separadas, y se puede administrar simultánea o secuencialmente a un paciente. Además, se pueden administrar a un paciente proporciones diferentes de un polipéptido de ADNF I y de un polipéptido del ADNF III. Por ejemplo, en una mezcla, la relación de un polipéptido del ADNF I y un polipéptido del ADNF III puede estar en un intervalo de 1:100 a 100:1, 1:10 a 10:1, ó 1:2 a 2:1.

Las composiciones farmacéuticas de la presente invención son adecuadas para uso en una variedad de sistemas de suministro de fármacos. Las formulaciones adecuadas para uso en la presente invención se encuentran en Remington's Pharmaceutical Sciences (17ª edición, 1985), que se incorpora aquí como referencia. En, por ejemplo, Langer, Science 249:1527-1533 (1990), que se incorpora aquí como referencia, se describe un breve repaso de los métodos para el suministro de fármacos. Además, en, por ejemplo, Therapeutic Peptides and Proteins Formulations, Processing, and Delivery Systems, de Ajay K. Banga, Technomic Publishing Company, Inc., Lancaster, PA (1995), se describen las composiciones farmacéuticas que contienen péptidos y proteínas.

En una realización preferida, la composición farmacéutica de la presente invención se formula para administración oral. En esta realización, se prefiere usar polipéptidos del ADNF que comprenden todos D-aminoácidos. Una composición no tóxica farmacéuticamente aceptable se forma incorporando cualquiera de los excipientes normalmente empleados, y generalmente 10-95% de ingrediente activo, y más preferiblemente a una concentración de 25%-75%. Además, para mejorar la absorción oral de los polipéptidos del ADNF, se pueden usar diversos sistemas de vehículos, tales como nanopartículas, micropartículas, liposomas, fosfolípidos, emulsiones, eritrocitos, etc. Los agentes orales que comprenden polipéptidos del ADNF de la invención pueden estar en cualquier forma adecuada para administración oral, tal como líquido, comprimidos, cápsulas, o similares. Las formulaciones orales se pueden revestir además o se pueden tratar para evitar o reducir la disolución en el estómago. Véase, por ejemplo, Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing, and Delivery Systems, de A.K. Banga, Technomic Publishing Company, Inc., 1995.

Adicionalmente, los polipéptidos del ADNF que comprenden al menos un D-aminoácido entro de los sitios centrales activos fueron útiles en composiciones farmacéuticas destinadas para la administración parenteral, tópica, oral, sublingual, por sonda nasogástrica, o local. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas se administran parenteralmente, por ejemplo, intravenosamente, subcutáneamente, intradérmicamente, o intramuscularmente, o intranasalmente. De este modo, la invención proporciona composiciones para la administración parenteral que comprenden una disolución de una mezcla de polipéptidos del ADNF, disuelta o suspendida en un vehículo aceptable, preferiblemente un vehículo acuoso. Se puede usar una variedad de vehículos acuosas, incluyendo, por ejemplo, agua, agua tamponada, disolución salina al 0,4%, glicina al 0,3%, ácido hialurónico y similares. Estas composiciones se pueden esterilizar mediante técnicas convencionales de esterilización bien conocidas, o se pueden filtrar de forma estéril. Las disoluciones acuosas resultantes se pueden envasar para uso como tales, o se pueden liofilizar, combinándose la preparación liofilizada con una disolución estéril antes de la administración. Las composiciones pueden contener sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables, según se requiera, para aproximarse a las condiciones fisiológicas, incluyendo agentes tamponantes y de ajuste del pH, agentes de ajuste de la tonicidad, agentes humectantes y similares, tales como, por ejemplo, acetato de sodio, lactato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, monolaurato de sorbitán, oleato de trietanolamina, etc.

Para la administración mediante aerosol, los polipéptidos del ADNF, que comprenden al menos un D-aminoácido dentro de los sitios centrales activos, se suministran preferiblemente en forma finamente dividida junto con un tensioactivo y un propelente. Por supuesto, el tensioactivo debe ser no tóxico, y preferiblemente soluble en el propelente. Los representantes de tales agentes son los ésteres o ésteres parciales de ácidos grasos que contienen de 6 a 22 átomos de carbono, tales como ácido caproico, octanoico, láurico, palmítico, esteárico, linoleico, linolénico, olestérico y oleico, con un alcohol alifático polihidroxilado o su anhídrido cítrico. Se pueden emplear ésteres mixtos, tales como glicéridos mixtos o naturales. También se puede incluir un vehículo, según se desee, como por ejemplo lecitina, para suministro intranasal.

Para las composiciones sólidas, se pueden usar vehículos sólidos no tóxicos convencionales. Los vehículos sólidos incluyen, por ejemplo, grados farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, talco, celulosa, glucosa, sacarosa, carbonato de magnesio, y similares.

Los polipéptidos pequeños, incluyendo SALLRSIPA y NAPVSIPQ, atraviesan la barrera hematoencefálica. Para polipéptidos más grandes que no atraviesan la barrera hematoencefálica, se conocen bien los métodos para administrar proteínas al cerebro. Por ejemplo, las proteínas, polipéptidos, otros compuestos y células se pueden suministrar al cerebro del mamífero vía inyección intracerebroventricular (ICV) o vía una cánula (vése, por ejemplo, Motta y Martín, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 168:62-64 (1981); Peterson et al., Biochem. Pharmacol. 31:2807-2810 (1982); Rzepczynski et al., Metab. Brain Dis. 3:211-216 (1988); Leibowitz et al, Brain Res. Bull. 21:905-912 (1988); Sramka et al., Stereotact. Funct. Neurosurg. 58:79-83 (1992); Peng et al., Brain Res. 632:57-67 (1993); Chem et al., Exp. Neurol. 125:72-81 (1994); Nikkhah et al., Neuroscience 63_57-72 (1994); Anderson et al., J. Comp. Neurol. 357:296-317 (1995); y Brecknell y Fawcett, Exp. Neurol. 138:338-344 (1996)). En particular, las cánulas se pueden usar para administrar factores neurotróficos a mamíferos (véase, por ejemplo, Motta y Martín, Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 168:62-64 (1981) (neurotensina); Peng et al., Brain Res. 632:57-67 (1993) (NGF); Anderson et al., J. Comp. Neurol. 357:296-317 (1995) (BDNF, NGF, neurotrofina-3).

Como alternativa, los polipéptidos del ADNF más grandes que no atraviesan la barrera hematoencefálica se pueden acoplar con un material que ayude al polipéptido del ADNF a atravesar la barrera hematoencefálica y atravesar la membrana plasmática de una célula, o la membrana de un compartimiento intracelular tal como el núcleo. Las membranas celulares están compuestas de bicapas de lípidos y proteínas que son totalmente permeables a pequeños compuestos lipófilos no iónicos, y son inherentemente impermeables a compuestos polares, macromoléculas, y agentes terapéuticos o de diagnóstico. Sin embargo, se han descrito proteínas y otros compuestos, tales como liposomas, que tienen la capacidad de desplazar a los polipéptidos, tales como los polipéptidos del ADNF, a través de una membrana celular.

Por ejemplo, "los polipéptidos que se desplazan a través de la membrana" tienen subsecuencias de aminoácidos anfifílicas o hidrófobas que tienen la capacidad de actuar como vehículos para desplazarse a través de la membrana. En una realización, las proteínas con homeodominio tienen la capacidad para desplazarse a través de las membranas celulares. Se encontró que el péptido internalizable más corto de una proteína con homeodominio, Antennapedia, era la tercera hélice de la proteína, desde la posición 43 a la 58 de aminoácidos (véase, por ejemplo, Prochiantz, Current Opinion in Neurobiology 6:629-634 (1996)). Se encontró que otra subsecuencia, el dominio hidrófobo de péptidos señales, tienen características similares de desplazamiento a través de las membranas celulares (véase, por ejemplo, Lin et al., J. Biol. Chem. 270:14255-14258 (1995)).

Los ejemplos de secuencias peptídicas que se pueden enlazar a un polipéptido del ADNF de la invención, para facilitar la captación de los polipéptidos del ADNF en las células, incluyen, pero no se limitan a: un péptido de 11 aminoácidos de la proteína tat del VIH (véase Schwarze et al., Science 285:1569-1572 (1999)); una secuencia peptídico de 20 restos que corresponde a los aminoácidos 84-103 de la proteína p16 (véase Fahraeus et al., Current Biology 6:84 (1996)); la tercera hélice del homeodominio de 60 aminoácidos de longitud de Antenapedia (Derossi et al., J. Biol. Chem. 269:10444 (1994)); la región h de un péptido señal tal como la región h del factor de crecimiento fibroblástico de Kaposi (K-FGF) (Lin et al., supra); o el dominio de traslocación de VP22 de HSV (Elliot y O'Hare, Cell 88:223-233 (1997)). También se pueden enlazar químicamente a los polipéptidos del ADNF otros restos químicos adecuados que proporcionen una mejor captación celular.

Las moléculas de toxina tienen la capacidad de transportar polipéptidos a través de las membranas celulares. A menudo, tales moléculas estás compuestas de al menos dos partes (denominadas "toxinas binarias"): un dominio o polipéptido de translocación o de unión, y un dominio o polipéptido de toxina separado. Típicamente, el dominio o polipéptido de translocación se une a un receptor celular, y después la toxina se transporta en la célula. Se han usado diversas toxinas bacterianas, incluyendo la toxina iota de Clostridium perfringens, la toxina de la difteria (DT), la exotoxina A de Pseudomonas (PE), la toxina pertussis (PT), la toxina de Bacillus anthracis, y la adenilatociclasa de pertussis (CYA), en un intento para suministrar péptidos al citosol celular como fusiones internas o aminoterminales (Arora et al., J. Biol. Chem., 268:3334-3341 (1993); Perelle et al., Infect. Immun., 61:5147-5156 (1996); Stenmark et al., J. Cell. Biol. 113:1025-1032 (1991), Donnelly et al., PNAS 90:3530-3534 (1993); Cartonetti et al., Abstr. Annu. Meet. Am. Soc. Microbiol. 95:295 (1995); Sebo et al., Infect. Immun. 63:3851-3857 (1995); Klimpel et al., PNAS U.S.A. 89:10277-10281 (1992); y Novak et al., J. Biol. Chem. 267:17186-17193 (1992)).

Tales subsecuencias se pueden usar para desplazar a los polipéptidos del ADNF a través de una membrana celular. Los polipéptidos del ANDF se pueden fusionar convenientemente o derivatizar con tales secuencias. Típicamente, la secuencia de translocación se proporciona como parte de una proteína de fusión. Opcionalmente, se puede usar un ligador para enlazar los polipéptidos del ADNF y la secuencia de translocación. Se puede usar cualquier ligador adecuado, por ejemplo, un ligador peptídico.

Los polipéptidos del ADNF también se pueden introducir en una célula de un animal, preferiblemente una célula de un mamífero, vía los liposomas y derivados liposómicos tales como inmunoliposomas. El término "liposoma" se refiere a vesículas que comprenden una o más bicapas lipídicas ordenadas concéntricamente, que encapsulan una fase de otra. La fase acuosa contiene típicamente el compuesto a suministrar a la célula, es decir, un polipéptido del ADNF.

El liposoma se fusiona con la membrana plasmática liberando de este modo los polipéptidos del ADNF en el citosol. Como alternativa, el liposoma es fagocitado o es recogido por las células en una vesícula de transporte. Una vez en el endosoma o fagosoma, el liposoma se degrada o se fusiona con la membrana de la vesícula de transporte y libera sus contenidos.

En los métodos actuales de suministro de fármacos vía los liposomas, el liposoma en último lugar se hace permeable y libera el compuesto encapsulado (en este caso, un polipéptido del ANDF) en el tejido o célula diana. Para el suministro sistémico o específico de tejidos, esto se puede lograr, por ejemplo, de manera pasiva, en la que la bicapa liposómica se degrada en el tiempo mediante la acción de diversos agentes en el cuerpo. Como alternativa, la liberación de fármaco activo implica el uso de un agente para inducir un cambio de la permeabilidad en las vesículas de los liposomas. Las membranas liposómicas se pueden construir de forma que se desestabilice cuando el entorno sea ácido cerca de la membrana liposómica (véase, por ejemplo, PNAS 84:7851 (1987); Biochemistry 28:908 (1989)). Cuando los liposomas son sometidos a endocitosis por una célula diana, por ejemplo, se desestabilizan y liberan sus contenidos. Esta desestabilización se denomina fusogénesis. La dioleoilfosfatidiletanolamina (DOPE) es la base de muchos sistemas "fusogénicos".

Tales liposomas comprenden típicamente un polipéptido del ADNF y un componente lipídico, por ejemplo, un lípido neutro y/o catiónico, que incluye opcionalmente una molécula de reconocimiento del receptor, tal como un anticuerpo, que se une a un receptor o ligando (por ejemplo, un antígeno) predeterminado de la superficie celular. Existe una variedad de métodos para preparar liposomas, como se describe en, por ejemplo, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), patentes U.S. n^{os} 4.186.183, 4.217.344, 4.235.571, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.541.728, 4.774.085, 4.837.028, 4.946.787, Publicación PCT nº WO 91/17424, Deamer y Bangham, Biochim. Biophys. Acta 443:629-634 (1976); Fraley, et al., PNAS 76:3348-3352 (1979); Hope et al., Biochim. Biophys. Acta 812:55-65 (1985); Mayer et al., Biochim Biophys. Acta 858:161-168 (1986); Williams et al., PNAS 85:242-246 (1988); Liposomes (Ostro (ed.), 1983, Capítulo 1); Hope et al., Chem. Phys. Lip. 40:89 (1986); Gregoriadis, Liposome Technology (1984) y Lasic, Liposomes: from Physics to Applications (1993)). Los métodos adecuados incluyen, por ejemplo, tratamiento por ultrasonido, extrusión, homogeneización a alta presión, microfluidización, diálisis con detergente, fusión inducida por calcio de vesículas liposómicas pequeñas, y métodos de fusión con éter, todos los cuales son bien conocidos en la técnica.

En ciertas realizaciones de la presente invención, es deseable seleccionar específicamente los liposomas de la invención usando restos seleccionadores que son específicos para un tipo de célula particular, tejido, y similares. La selección de liposomas usando una variedad de restos seleccionadores (por ejemplo, ligandos, receptores, y anticuerpos monoclonales) se ha descrito previamente (véase, por ejemplo, las patentes U.S. n^{os} 4.957.773 y 4.603.044). Se pueden usar métodos estándares para acoplar agentes seleccionadores a los liposomas. Estos métodos implican generalmente la incorporación en componentes lipídicos liposómicos, por ejemplo, fosfatidiletanolamina, que se pueden activar para la unión de agentes seleccionadores, o compuestos lipófilos derivatizados, tales como bleomicina derivatizada con lípidos. Los liposomas seleccionados con anticuerpos se pueden construir usando, por ejemplo, liposomas que incorporan proteína A (véase Renneisen et al., J. Biol. Chem., 265:16337-16342 (1990) y Leonetti et al., PNAS 87:2448-2451 (1990).

Como alternativa, también se pueden usar ácidos nucleicos que codifican ADNF, para proporcionar una dosis terapéutica de polipéptidos del ADNF. Estos ácidos nucleicos se pueden insertar en cualquier número de vectores bien conocidos para la transfección de células y organismos diana. Por ejemplo, los ácidos nucleicos se suministran como ADN plasmídicos, carentes de ácido nucleico, y se complejan con ácido nucleico mediante un vehículo de suministro tal como un liposoma. Los sistemas de suministro vectoriales víricos incluyen virus de ADN y ARN, que tienen genomas episódicos o integrados tras el suministro a la célula. Para un repaso de los procedimientos de terapia génica, véase Anderson, Science 256:808-813 (1992); Nabel y Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993); Mitani y Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993); Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993); Millar, Nature 357:455-460 (1992); Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988); Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995); Kremer y Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995); haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology Doerfler y Böhm (eds) (1995); y Yu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994).

Los métodos de suministro no vírico de ácidos nucleicos incluyen lipofección, microinyección, biolísticos, virosómicos, liposómicos, inmunoliposómicos, policatiónicos o conjugados de lípidos con ácidos nucleicos, ADN desnudo, viriones artificiales, y captación de ADN potenciado por agentes. La lipofección se describe en, por ejemplo, la patente U.S. nº 5.049.386, la patente U.S. nº 4.946.787; y la patente U.S. nº 4.897.355, y los reactivos para la lipofección se venden comercialmente (por ejemplo, Transfectam^{TM} y Lipofectin^{TM}). Los lípidos catiónicos y neutros que son adecuados para la lipofección eficiente mediante reconocimiento de receptor de polinucleótidos incluyen los de Felgner, documentos WO 91/17424 y WO 91/16024. El suministro se puede realizar a las células (administración ex vivo) o a tejidos diana (administración in vivo).

En las aplicaciones terapéuticas, los polipéptidos del ADNF de la invención se administran a un paciente en una cantidad suficiente para reducir la muerte celular neuronal asociada con diversos trastornos, para reducir el estrés oxidativo en un paciente, o para reducir una afección asociada con fetopatía alcohólica en un paciente in utero. Una cantidad adecuada para lograr esto se define como una "dosis terapéuticamente eficaz". Las cantidades eficaces para este uso dependerán, por ejemplo, del polipéptido del ADNF particular empleado, de las afecciones a tratar, del tipo de muerte celular neuronal o daño a evitar, de la manera de administración, del peso y del estado general de salud del paciente, y de juicio del médico que prescribe el fármaco. Por ejemplo, para la prevención o reducción de la muerte celular neuronal, una cantidad terapéuticamente eficaz será una cantidad de polipéptido del ADNF dentro del intervalo de 1 \mug a 50 \mug, preferiblemente 1 \mug a 10 \mug, dada oralmente una vez al día por ratón (por ejemplo, por la tarde). Esta dosis se basa en el peso corporal medio de los ratones, y una dosis apropiadas para seres humanos se puede extrapolar basándose en el peso medio del ser humano.

IV. Uso de los polipéptidos del ADNF de la presente invención para la fabricación de un medicamento para reducir la muerte celular neuronal

En otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de los polipéptidos del ADNF de la presente invención para la fabricación de un medicamento para reducir la muerte celular neuronal, que comprende poner en contacto a las células neuronales con un polipéptido del ANDF en una cantidad suficiente para reducir la muerte celular neuronal, en el que el polipéptido del ADNF comprende al menos un D-aminoácido en su sitio central activo, preferiblemente en el término N y/o el término C del sitio central activo. En este uso, el polipéptido del ANDF puede ser un polipéptido ADNF I, un polipéptido del ADNF III, o mezclas de los mismos.

En una realización, el uso comprende poner en contacto células neuronales con un polipéptido del ADNF, en el que el polipéptido del ANDF es un miembro seleccionado del grupo que consta de: (a) un polipéptido del ADNF I que comprende un sitio central activo que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1); (b) un polipéptido del ADNF III que comprende un sitio central activo que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO:2); y (c) una mezcla del polipéptido del ANDF I de la parte (a) y del polipéptido del ADNF III de la parte (b); en el que al menos uno del polipéptido del ADNF I y del polipéptido ADNF III comprende un sitio central activo que comprende al menos un D-aminoácido.

En otra realización, el uso comprende poner en contacto células neuronales con un polipéptido del ADNF I, en el que el sitio central activo del polipéptido del ADNF I comprende al menos un D-aminoácido, preferiblemente en el término N y/o el término C del sitio central activo. Es completamente aplicable la discusión previa que se refiere a la localización y el número de D-aminoácidos dentro del sitio central activo de ADNF I, así como la discusión de los D- y/o L-aminoácidos adicionales añadidos al sitio central activo del polipéptido del ADNF I, y de este modo no se repetirá con respecto a esta realización particular de la invención.

En aún otra realización, el uso comprende poner en contacto células neuronales con un polipéptido del ANDF III, en el que el sitio central activo del polipéptido del ADNF III comprende al menos un D-aminoácido, preferiblemente en el término N y/o el término C del sitio central activo. Es completamente aplicable la discusión previa que se refiere a la localización y el número de D-aminoácidos dentro del sitio central activo de ADNF III, así como la discusión de los D- y/o L-aminoácidos adicionales añadidos al sitio central activo del polipéptido del ADNF III, y de este modo no se repetirá con respecto a esta realización particular de la invención.

En aún otra realización, el uso comprende poner en contacto células neuronales con una mezcla de un polipéptido del ADNF I y un polipéptido del ADNF III, en el que al menos uno del polipéptido del ADNF I y del polipéptido del ADNF III comprende un sitio central activo que comprende al menos un D-aminoácido. Es completamente aplicable la discusión previa que se refiere a la localización y el número de D-aminoácidos en el sitio central activo de ADNF I o ADNF III, así como la discusión de los D- y/o L-aminoácidos adicionales añadidos al sitio activo del polipéptido del ADNF I o del polipéptido del ADNF III, y de este modo no se repetirá con respecto a esta realización particular de la invención.

Los polipéptidos de ADNF de la presente invención se pueden usar para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de trastornos neurológicos, y para la prevención de la muerte celular neuronal. Por ejemplo, los polipéptidos del ADNF en la presente invención se pueden usar para prevenir la muerte de células neuronales incluyendo, pero sin limitarse a, neuronas de la médula espinal, neuronas del hipocampo, neuronas corticales cerebrales y neuronas colinérgicas. Más particularmente, los polipéptidos del ADNF de la presente invención se pueden usar en la prevención de la muerte celular asociada con (1) gp120, la proteína de cubierta procedente del VIH; (2) ácido N-metil-D-aspártico (excitotoxicidad), (3) tetrodotoxina (bloqueo de la actividad eléctrica); y (4) péptido \beta-amiloide, una sustancia relacionada con la degeneración neuronal en la enfermedad de Alzheimer.

Como tales, los polipéptidos del ADNF de la presente invención se pueden usar para reducir la muerte celular neuronal inducida por gp120, administrando una cantidad eficaz de un polipéptido del ADNF de la presente invención a un paciente que está infectado con el virus del VIH. Los polipéptidos del ADNF de la presente invención también se pueden usar para reducir la muerte celular neuronal asociada con excitotoxicidad inducida por estimulación N-metil-D-aspartato, comprendiendo el uso poner en contacto células neuronales con un polipéptido del ADNF de la presente invención en una cantidad suficiente para prevenir la muerte celular neuronal. Los polipéptidos del ADNF de la presente invención también se pueden usar para reducir la muerte celular inducida por el péptido \beta-amiloide en un paciente que sufre o con problemas con la enfermedad de Alzheimer, comprendiendo el uso administrar al paciente un polipéptido del ADNF de la presente invención en una cantidad suficiente para prevenir la muerte celular neuronal. Los polipéptidos del ADNF también se pueden usar para aliviar el trastorno del aprendizaje producido por el bloqueo colinérgico en un paciente que sufre o padece la enfermedad de Alzheimer. Por ejemplo, los polipéptidos del ADNF se pueden usar para mejorar la memoria a corto plazo y/o de referencia en pacientes con Alzheimer.

De forma similar, será fácilmente manifiesto para los expertos en la técnica que los polipéptidos del ADNF de la presente invención se pueden usar de manera similar para evitar la muerte celular neuronal asociada con un número de otras enfermedades y deficiencias neurológicas. Las patologías que se beneficiarían de las aplicaciones terapéuticas y de diagnóstico de esta invención incluyen afecciones (enfermedades y gazapos) que conducen a la muerte celular neuronal y/o a la patología neuronal subletal, incluyendo, por ejemplo, lo siguiente:

enfermedades de los sistemas motores centrales incluyendo estados degenerativos que afectan a los ganglios basales (enfermedad de Huntington, enfermedad de Wilson, degeneración estriatoníglica, degeneración gangliónica corticobasal), síndrome de Tourette, enfermedad de Parkinson, parálisis supranuclear progresiva, parálisis bulbar progresiva, paraplejia espástica familiar, atrofia espinomuscular, ALS y variantes de la misma, atrofia dentatorrubral, atrofia olivo-ontocerebral, degeneración cereberal paraneoplástica, toxicidad por dopamina;

enfermedades que afectan a las neuronas sensoriales, tales como ataxia de Friedreich, diabetes, neuropatía periférica, degeneración neuronal retiniana;

enfermedades de los sistemas límbico y cortical, tales como amiloidosis cerebral, atrofia de dic, síndrome de Retts;

patologías neurodegenerativas que implican a sistemas neuronales múltiples y/o al tronco encefálico, incluyendo enfermedad de Alzheimer, demencia relacionada con SIDA, enfermedad de Leigh, enfermedad de cuerpos de Lewy difusa, epilepsia, atrofia de sistemas múltiples, síndrome de Guilain-Barre, trastornos del almacenamiento lisosómico tales como lipofuscinosis, etapas degenerativas tardías de síndrome de Down, enfermedad de Alper, vértigo como resultado de la degeneración del SNC;

patologías asociadas con el retraso del desarrollo y trastornos del aprendizaje, y síndrome de Down, y muerte neuronal inducida por estrés oxidativo;

patologías que surgen con el envejecimiento y toxicomanías crónicas debido al alcohol o a fármacos incluyendo, por ejemplo, con el alcoholismo la degeneración de neuronas en locus coeruleus, el cerebelo, prosencéfalo basal colinérgico; con el envejecimiento, la degeneración de neuronas del cerebelo y neuronas corticales, lo que conduce a trastornos cognitivos y motores; y con la toxicomanía crónica debido a anfetaminas, la degeneración de neuronas ganglionales basales, lo que conduce a trastornos motores;

cambios patológicos que resultan de trauma focal, tal como apoplejía, isquemia focal, insuficiencia vascular, encefalopatía isquémica hipóxica, hiperglicemia, hipoglicemia, trauma cerebral cerrado, o trauma directo;

patologías que surgen como un efecto secundario negativo de fármacos terapéuticos y tratamientos (por ejemplo, la degeneración de neuronas del cíngulo y del córtex endórnico como respuesta a dosis anticonvulsionantes del antagonistas de la clase de NMDA del receptor de glutamato).

V. Uso de péptidos del ADNF de la presente invención para la fabricación de un medicamento para reducir el estrés oxidativo

En aún otro aspecto, la presente invención proporciona el uso de péptidos del ADNF de la presente invención para la fabricación de un medicamento para tratar estrés oxidativo en un paciente, administrando al paciente un polipéptido del ADNF en una cantidad suficiente para prevenir o reducir el estrés oxidativo, en el que el polipéptido del ADNF comprende al menos un D-aminoácido en su sitio central activo, preferiblemente en el término N y/o el término C del sitio central activo. El estrés oxidativo ha sido implicado en varias enfermedades neurodegenerativas en seres humanos (Cassarmno y Bennet, Brain Res. Reviews 29:1-25 (1999)). Además, se ha asociado al estrés oxidativo producido por la administración de alcohol con la muerte del feto y anormalidades fetales (por ejemplo, afecciones asociadas con fetopatía alcohólica). Véase, por ejemplo, Henderson et al, Alcoholism: Clinical and Experimental Research 19:714-720 (1995). En estos usos, el polipéptido del ADNF puede ser un polipéptido del ADNF I, un polipéptido del ADNF III, o mezclas de los mismos. Mediante el uso de los polipéptidos del ADNF de la presente invención, se puede reducir el estrés oxidativo asociado con varias afecciones clínicas.

En una realización, el uso comprende tratar el estrés oxidativo en un paciente con un polipéptido del ADNF, en el que el polipéptido del ADNF es un miembro seleccionado del grupo que consta de: (a) un polipéptido del ADNF I que comprende un sitio central activo que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1); (b) un polipéptido del ADNF III que comprende un sitio central activo que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO:2); y (c) una mezcla del polipéptido del ANDF I de la parte (a) y del polipéptido del ADNF III de la parte (b); en el que al menos uno del polipéptido del ADNF I y del polipéptido ADNF III comprende un sitio central activo que comprende al menos un D-aminoácido, preferiblemente en el término N y/o el término C del sitio central activo.

En otra realización, el uso comprende tratar el estrés oxidativo en un paciente con un polipéptido del ADNF I, en el que el sitio central activo del polipéptido del ADNF I comprende al menos un D-aminoácido, preferiblemente en el término N y/o el término C del sitio central activo. Es completamente aplicable la discusión previa que se refiere a la localización y el número de D-aminoácidos dentro del sitio central activo de ADNF I, así como la discusión de los D- y/o L-aminoácidos adicionales añadidos al sitio central activo del polipéptido del ADNF I, y de este modo no se repetirá con respecto a esta realización particular de la invención.

En aún otra realización, el uso comprende tratar el estrés oxidativo de un paciente con un polipéptido del ADNF III, en el que el sitio central activo del polipéptido del ADNF III comprende al menos un D-aminoácido, preferiblemente en el término N y/o el término C del sitio central activo. Es completamente aplicable la discusión previa que se refiere a la localización y el número de D-aminoácidos dentro del sitio central activo de ADNF III, así como la discusión de los D- y/o L-aminoácidos adicionales añadidos al sitio central activo del polipéptido del ADNF III, y de este modo no se repetirá con respecto a esta realización particular de la invención.

En aún otra realización, el método comprende tratar el estrés oxidativo de un paciente con una mezcla de un polipéptido del ADNF I y de un polipéptido del ADNF III, en el que al menos uno del polipéptido del ADNF I y del polipéptido del ADNF III comprende un sitio central activo que comprende al menos un D-aminoácido. Es completamente aplicable la discusión previa que se refiere a la localización y el número de D-aminoácidos en el sitio central activo de ADNF I o ADNF III, así como la discusión de los D- y/o L-aminoácidos adicionales añadidos al sitio activo del polipéptido del ADNF I o del polipéptido del ADNF III, y de este modo no se repetirá con respecto a esta realización particular de la invención.

VI. Uso de los polipéptidos del ADNF de la presente invención para la fabricación de un medicamento para reducir una afección asociada con fetopatía alcohólica

En aún otro aspecto, la presente invención proporciona un uso de los polipéptidos del ADNF de la presente invención para la fabricación de un medicamento para reducir una afección asociada con fetopatía alcohólica en un paciente que está expuesto a alcohol in utero, comprendiendo el uso administrar al sujeto un polipéptido del ADNF en una cantidad suficiente para reducir la afección asociada con fetopatía alcohólica, en el que el polipéptido del ADNF comprende un sitio central activo que comprende al menos un D-aminoácido, preferiblemente en el término N y/o el término C del sitio central activo. En este uso, el polipéptido del ADNF puede ser un polipéptido del ADNF I, un polipéptido ADNF III, o mezclas de los mismos.

El tratamiento de un modelo bien caracterizado para FAS (por ejemplo, estirpe celular C57B1/6J de ratón) con un polipéptido del ADNF que comprende al menos un D-aminoácido en un sitio central activo reduce o previene la muerte del feto inducida por alcohol, la reducción del peso corporal y del cerebro, y la reducción de ARNm de VIP. De forma similar, el embrión humano, feto o paciente, se puede proteger de los efectos inducidos por el alcohol administrando un polipéptido del ADNF directamente al embrión, feto, o paciente, o administrando el polipéptido del ADNF indirectamente al feto mediante la administración del polipéptido a la madre. Preferiblemente, el polipéptido del ADNF se administra oralmente.

En una realización, el uso comprende administrar a un paciente que está expuesto a alcohol in utero un polipéptido del ADNF, en el que el polipéptido del ADNF es un miembro seleccionado del grupo que consta de: (a) un polipéptido del ADNF I que comprende un sitio central activo que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1); (b) un polipéptido del ADNF III que comprende un sitio central activo que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos: Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO:2); y (c) una mezcla del polipéptido del ANDF I de la parte (a) y del polipéptido del ADNF III de la parte (b); en el que al menos uno del polipéptido del ADNF I y del polipéptido ADNF III comprende un sitio central activo que comprende al menos un D-aminoácido, preferiblemente en el término N y/o el término C del sitio central activo.

En otra realización, el uso comprende administrar a un paciente que está expuesto a alcohol in utero un polipéptido del ADNF I, en el que el sitio central activo del polipéptido del ADNF I comprende al menos un D-aminoácido, preferiblemente en el término N y/o el término C del sitio central activo. Es completamente aplicable la discusión previa que se refiere a la localización y el número de D-aminoácidos dentro del sitio central activo de ADNF I, así como la discusión de los D- y/o L-aminoácidos adicionales añadidos al sitio central activo del polipéptido del ADNF I, y de este modo no se repetirá con respecto a esta realización particular de la invención.

En aún otra realización, el uso comprende administrar a un paciente que está expuesto in utero un polipéptido del ADNF III, en el que el sitio central activo del polipéptido del ADNF III comprende al menos un D-aminoácido, preferiblemente en el término N y/o el término C del sitio central activo. Es completamente aplicable la discusión previa que se refiere a la localización y el número de D-aminoácidos dentro del sitio central activo de ADNF III, así como la discusión de los D- y/o L-aminoácidos adicionales añadidos al sitio central activo del polipéptido del ADNF III, y de este modo no se repetirá con respecto a esta realización particular de la invención.

En aún otra realización, el método comprende administrar a un paciente que está expuesto a alcohol in utero una mezcla de un polipéptido del ADNF I y de un polipéptido del ADNF III, en el que al menos uno del polipéptido del ADNF I y del polipéptido del ADNF III comprende un sitio central activo que comprende al menos un D-aminoácido. Es completamente aplicable la discusión previa que se refiere a la localización y el número de D-aminoácidos en el sitio central activo de ADNF I o ADNF III, así como la discusión de los D- y/o L-aminoácidos adicionales añadidos al sitio activo del polipéptido del ADNF I o del polipéptido del ADNF III, y de este modo no se repetirá con respecto a esta realización particular de la invención.

Ejemplos A. Experimentos in vitro

Se usaron cultivos corticales cerebrales disociados, preparados como se describe por (Brenneman y Gozes, J. Clin. Invest. 97:2299-2307 (1996)), para comparar las acciones promotoras de la supervivencia de los péptidos derivados del ADNF I y ADNF III. Las comparaciones se realizaron con la forma D del péptido, y en combinación con la forma L de los péptidos. El método de ensayo consistió en la adición del péptido de ensayo en cultivos que se cotrataron con tetrodotoxina (TTX). La TTX produjo una muerte apoptótica en estos cultivos, y se usa como una sustancia modelo para demostrar la eficacia frente a esta "muerte celular programada" y todos los otros medios que producen este tipo de mecanismo de muerte. La duración del período de ensayo fue de 5 días, y las neuronas se contaron y se identificaron mediante morfología característica y mediante conformación con un marcador inmunocitoquímico para neuronas: enolasa específica de neuronas.

Como se muestra en la Figura 1, las formas D y L de SALLRSIPA (SAL) fueron idénticas tanto en potencia como en eficacia evitando la muerte celular neuronal asociada con el bloqueo eléctrico con TTX. Cada punto es la media de al menos tres determinaciones, y las barras de error son los errores estándares. De forma similar, las formas D y L de NAPVSIPQ (NAP) fueron muy similares, mostrando cada una una respuesta de dosis compleja con dos máximos aparentes (Figura 2A). Excepto que se indique de otro modo, L-SAL y D-SAL se refieren a un péptido que tiene un secuencia de aminoácidos de Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1) que comprende todos L-aminoácidos o todos D-aminoácidos, respectivamente. También, L-NAP y D-NAP se refieren a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos de Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO:2) que comprende todos L-aminoácidos o todos D-aminoácidos, respectivamente.

En la Figura 2B, se estudió el efecto de un péptido de ADNF que tiene restos de aminoácidos tanto en forma L como en forma D, a saber, D-NA{L-P}VSIPQ. En este péptido del ADNF, todos los aminoácidos de NAPVSIPQ estaban en forma D, excepto el tercer resto de prolina que estaba en forma L. se trataron cultivos corticales cerebrales con 1 \muM de TTX durante 5 días, que es un modelo de muerte apoptótica que es pertinente para la enfermedad neurodegenerativa. Los cultivos tratados con la toxina se administraron a diversas concentraciones de D-NA{L-P}VSIPQ. Al igual que NAPVSIPQ de todos L-aminoácidos y todos D-aminoácidos, ese péptido mixto D/L D-NA{L-P}VSIPQ retenía la actividad promotora de la supervivencia y era eficaz en un cultivo celular previniendo la celular neuronal en el modelo de TTX.

Como se ilustra en las Figuras 3A y 3B, también se estudiaron combinaciones de péptidos. Para todos los experimentos combinatorios, los dos péptidos se proporcionan en cantidades equimolares. En la Figura 3A, se muestra que el efecto de D-NAP y D-SAL produce una respuesta a la dosis diferente de la observada con cualquier agente sólo. De forma importante, no hubo ninguna atenuación aparente de la actividad promotora de la supervivencia a una concentración mayor de péptido. Esta sinergia aparente entre los péptidos es significativa debido a que indica que puede haber un intervalo terapéutico más amplio de concentraciones eficaces si se usan combinatoriamente ambos péptidos D. Experimentos similares, realizados con L-SAL y L-NAP, dieron como resultado una pérdida significativa de la eficacia, aunque aún era evidente la sinergia (Figura 3A).

Se realizó otra serie de experimentos para demostrar el efecto de la combinación de las formas L y D de NAP y SAL. Como se muestra en la Figura 3B, el uso de L-NAP y D-SAL mostró una eficacia total y una elevada potencia evitando la muerte apoptótica de neuronas tratadas con TTX. No hubo ninguna atenuación aparente de la actividad protectora a concentraciones elevadas (> 1 pM) de péptido; es decir, nuevamente fue evidente la sinergia. Por el contrario, el tratamiento con D-NAP y L-SAL dio como resultado una total eficacia, pero una atenuación de la actividad promotora de la supervivencia a una concentración > 0,1 pM. Estos datos indican una especificidad para las combinaciones de los péptidos D y L.

La Figura 4 ilustra que los polipéptidos del ADNF pueden proteger frente a la toxicidad por beta-amiloide in vitro. Se mantuvieron células PC12 (Solomon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:4107-4112 (1997)) en DMEM (medio de Eagles modificado por Dulbecco) suplementado con 8% de suero de caballo, 8% de suero fetal de ternera inactivado por calor, 2 mM de L-glutamina (todo adquirido de Sigma, Rehovot, Israel), 100 mg/ml de estreptomicina y 100 U/l de penicilina (Biological Industries, Beil Haemek, Israel). Los cultivos se mantuvieron a 37ºC/5% de CO_{2} como monocapas en matraces de 75 cm^{2}, y se exhibieron a una relación 1:12 dos veces a la semana. Para el tratamiento con beta-amiloide (aminoácidos 25-35), la siembra fue a 1,5 x 10^{5} células/ml en placas de 96 pocillos (100 ml/pocillo) en un medio que contiene: DMEM suplementado con 1% de penicilina/estreptomicina, 0,5 M de insulina (Sigma, Rehovot, Israel). Veinte horas después de la adición de péptidos 10-9 M (D-SAL y D-NAP en una mezcla 1:1 diluida hasta una concentración final de 1 nM), se añadió beta-amiloide a 2,5 mM, y se midió la viabilidad celular (actividad metabólica) 48 horas más tarde. La actividad metabólica se midió mediante un método colorimétrico usando un compuesto de tetrazolio, 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il-5-(3-carboximetoxi-fenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS), y un reactivo de acoplamiento electrónico, metasulfato de fenazina. El MTS es biorreducido por las células vidas a la forma de formazano, que se detecta a 490 nm (Promega, Medison WI, USA). Los resultados mostraron una pérdida significativa de afinidad en presencia de la toxina, y protección por los péptidos D-SAL+D-NAP.

B. Experimentos in vivo

Se utilizó una variedad de modelos experimentales para demostrar eficacia de D-NAP y D-SAL en animales. Se emplearon diversas vías de administración tanto en ratas como en ratones.

1. Fetopatía alcohólica (FAS) en ratones

Se usó un modelo bien establecido para FAS para estudiar la eficacia de los péptidos de ADNF I y del ADNF III en ratones (Webster et al., Neurobehav. Tox. 2:227-234 (1980), incorporado aquí como referencia). Este ensayo se diseña para estudiar la eficacia frente al estrés oxidativo importante producido por la administración de alcohol (Amini et al., Free Radical Biology and Medicine 21:357-365 (1996); Schlorff et al., Alcohol 17:97-105 (1999)). La muerte fetal y las anormalidades fetales están asociadas con la generación de radicales libres y daño oxidativo (Henderson et al., Alcoholism: Clinical and Experimental Research 19:714-720 (1995)). El modelo se ejerció por cuanto permitió una evaluación rápida y pertinente de los agentes eficaces frente al estrés oxidativo importante. Puesto que el estrés oxidativo ha sido implicado en varias enfermedades neurodegenerativas en seres humanos (Cassarmno y Bennett, Brain Res. Reviews 29:1-25 (1999)), la eficacia en FAS puede ser de valor predictivo en el tratamiento de la enfermedad de seres humanos.

Se administró intraperitonealmente una inyección única de alcohol etílico al 25% a 0,030 ml/g de peso corporal a ratones preñados en el octavo día embriónico. En la primera serie de experimentos, los péptidos se administraron 30 minutos antes de la administración de alcohol. Se administraron dosis de 2 \mug o 20 \mug. Se disolvieron D-NAP o L-NAP (0,5 mg) en 50 \mul de dimetilsulfóxido, y se diluyeron con disolución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) filtrada (0,22 \mu), hasta un volumen final de 5 ml. El volumen de la inyección fue 200 \mul. Se disolvió D-SAL o L-SAL en DPBS antes de la administración. La media de la camada se usó como una medida única para análisis estadístico. El tamaño medio de la camada fue 8, y no difirió entre los grupos de tratamiento.

La evaluación de los fetos supervivientes se realizó en el decimoctavo día embriónico. La evaluación de la eficacia se realizó mediante el número de fetos supervivientes (Figura 5), mediante el peso del cerebro (Figura 6A) y mediante el peso corporal total de los fetos (Figura 6B). Como se muestra en la Figura 5, el tratamiento con alcohol dio como resultad un 37% de defunciones fetales, en comparación con el 6% en los controles. El pretratamiento con 20 \mug de D-NAP, D-SAL o L-NAP + D-SAL (20 \mug cada uno), redujo significativamente la tase de defunciones fetales en comparación con aquellos en el grupo de alcohol (p < 0,03). Como se muestra en la Figura 6A, de los fetos supervivientes cuyas madres se habían tratado con alcohol, sólo aquellos cotratados con L-NAP y D-SAL tuvieron pesos cerebrales significativamente mayores en comparación con los del grupo del alcohol. Efectos protectores similares de L-NAP y D-SAL fueron evidentes según se determina por los pesos totales fetales (Figura 6B).

Para estudiar un período crítico de la administración de los péptidos que aún produjera una intervención efectiva, se administraron L-NAP (20 \mug) + L-SAL (20 \mug) una hora o tres horas después del tratamiento de alcohol de ratones gestantes en el día de gestación E8. Como se muestra en la Figura 7, el post-tratamiento a 1 hora con NAP + SAL evitó las defunciones observadas con el tratamiento de alcohol; sin embargo, el post-tratamiento a las 3 horas no dio como resultado ninguna prevención significativa de la defunción de los fetos a niveles de control. Además, el post-tratamiento NAP + SAL (1 hora y 3 horas) evitó la microcefalia (Figura 8), pero no la restricción del crecimiento asociada con FAS.

Para demostrar que D-NAP y D-SAL fueron eficaces a través de la administración oral, los péptidos se administraron mediante sonda nasogástrica (es decir, introduciendo los péptidos en el estómago mediante un tubo) a ratones gestantes en el octavo día de la gestación. Como se muestra en la Figura 9, se observó un aumento significativo de la supervivencia fetal tras el tratamiento oral con 40 \mug cada uno de D-NAP y D-SAL. Esta es la primera demostración de una acción protectora de embriones oralmente activos de un péptido.

Las Figuras 10A y 10B ilustran los efectos de la administración oral de polipéptidos del ADNF sobre el peso cerebral de las crías y la muerte fetal. Se inyectó a ratones gestantes con alcohol como un modelo para la fetopatía alcohólica según los métodos de Webster et al. (1980), supra. Se inyectó a los ratones gestantes alcohol al 25% a 0,030 ml/g de peso corporal. El péptido se disolvió en disolución salina tamponada con fosfato, y se administró oralmente mediante sonda nasogástrica 30 minutos antes del tratamiento con alcohol. Se encontró que D-SAL (todos D-aminoácidos de SALLRSIPA), a 40 \mug, evita la muerte fetal según se determina en E18.

2. Ratones Apo E deficientes: ensayos de comportamiento de desarrollo

Estudios recientes han demostrado que la herencia de la apolipoproteína E4 (ApoE4) portadora de lípidos es un factor de riesgo importante en la enfermedad de Alzheimer (Strittmatter y Rosses, Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:4725-4727 (1995)). Estos estudios, juntos con las investigaciones de animales ApoE deficientes indican que se requiere un sistema de funcionamiento de apolipoproteína E para el neurodesarrollo y función normales (Masliah et al., J. Exp. Neurol. 136:107-122 (1995)). La adquisición de tipos de desarrollo de comportamiento requiere una formación apropiada de la sinapsis y una conductividad apropiada del cerebro (Altman et al., Anim. Behav. 23:896-920 (1975)). Los animales ApoE deficientes han demostrado que son retrasados desde el punto de vista del desarrollo (Gozes et al., J. Neurobiol. 33:329-342 (1997), incorporada aquí como referencia) y ofrecen un sistema de ensayo para los efectos in vivo de sustancias neurotróficas putativas, tales como D-SAL y D-NAP.

Se estudiaron animales neonatos para el comienzo de tipos de desarrollo de neurocomportamiento según se describe previamente (Gozes et al., J. Neurobiol. 33:329-342 (1997); Bassan et al., J. Neurochem. 72:1283-1293 (1999)). Para estos experimentos, a los animales se les trato mediante aplicación oral o inyección subcutánea de D-SAL + D-NAP. Se disolvieron los péptidos (0,5 mg cada uno) en ácido acético 0,01 M (30 microlitros). Para ambas aplicaciones, se suministraron 0,5 microgramos de cada uno de los fármacos de ensayo; para la aplicación oral (sublingual), en disolución salina de 10 microlitros, y para la inyección en 20 microlitros. Este protocolo se usó para los primeros 4 días de vida. A partir del día 5 hasta el 10, se dobló la cantidad de los péptidos y el volumen de la disolución. Desde el día 11 al 14, la cantidad de péptidos fue 2 microgramos cada uno en 40 microlitros (oral) y en 80 microlitros (inyección). Los ensayos realizados diariamente incluyeron la evitación del precipicio, la geotaxia negativa, la ubicación y los comportamientos de alzamiento. Se compararon tanto la administración subcutánea como la administración oral del D-NAP y D-SAL. Como se muestra en la Figura 11, los que respondieron de forma más lenta a la evitación del precipicio fueron los animales ApoE deficientes. Esto confirman estudios previos que muestran que el desarrollo de comportamiento y el aprendizaje está retrasado en estos animales en comparación con los animales control (Gozes et al., J. Neurobiol. 33:329-342 (1997); Bassan et al., J. Neurochem. 72:1283-1293 (1999)). La administración de D-NAP + D-SAL mediante inyección subcutánea o mediante administración oral dio como resultado aumentos significativos en la puntuación del comportamiento, lo que indica una adquisición más rápida del tipo del desarrollo. Se observaron efectos similares para la geotaxia negativa (Figura 12) y comportamiento de ubicación (Figura 13).

A continuación se da una relación más detallada de los resultados. En lo siguiente, se usó para comparaciones estadísticas el análisis de una vía de varianza con comparación múltiple de las medias (método de Student-Newman-Keuls).

1.

Figura 11 (evitación del precipicio): la diferencia entre ratones ApoE deficientes y animales del control fue manifiesta solo en el quinto día de vida (p<0,001). La inyección de D-péptidos al control no dio como resultado ningún efecto, mientras que la inyección a los ratones deficientes dio como resultado un efecto sólo en el tercer primer día. La aplicación oral dio como resultado mejoras significativas sólo en el primer día, en ratones deficientes.

2.

Figura 12 (geotaxia negativa): Aunque no hubo diferencia en el primer día entre el control y los ratones ApoE deficientes (con quizás una diferencia en el tercer día, p< 0,006), el tratamiento de estos últimos (inyección u oral) dio como resultado mejoras significativas con la inyección en los días 1, 2, 4 y 5, y con el tratamiento oral en los días 1 y 5. (p < 0,001).

3.

Figura 13 (ubicación): la diferencia entre ratones ApoE deficientes y animales de control fue manifiesta sólo en el primer día de vida (p<0,001). De forma similar, la aplicación oral de la mezcla peptídico fue eficaz potenciando la respuesta solamente en el primer día de vida.

3. Colinotoxicidad de AF64A en ratas adultas

Otro interés de la presente invención son las propiedades neuroprotectoras de D-SAL y D-NAP en animales expuestos a la colinotoxina, etilcolina aziridio (AF64A), un agente bloquante de la recaptación de la colina (Fisher et al., Neurosci. Lett. 102:325-331 (1989)). Para la función cerebral normal se requiere un sistema colinérgico intacto, mientras que a la enfermedad de Alzheimer se le asocia con la muerte de células colinérgicas (Brumback y Leech, J. Okla. State Med. Assoc. 87:103-111 (1994)). Las ratas tratadas con AF64A proporcionan un modelo aceptado para estudiar la eficacia in vivo de fármacos que potencian al sistema colinérgico.

Aunque no se ha caracterizado completamente la identidad de las neuronas dependientes del ADNF, estudios previos indicaron que algunas neuronas colinérgicas están entre las afectadas (Gozes et al., Brain Res. Dev. 99:167-175 (1997)). En este contexto, los ratones ApoE deficientes (descritos anteriormente) mostraron una actividad reducida de colina acetil transferasa (Gordon et al., Neurosci. Lett. 199:1-4 (1995); Gozes et al., J. Neurobiol. 33:329-342 (1997)), y el tratamiento con L-NAP aumentó significativamente la función colinérgica hasta los niveles del control (Bassan et al., J. Neurochem. 72:1283-1293 (1999)), mientras que el tratamiento con L-SAL fue menos eficaz.

Se sometieron a ratas (Wistar macho, 300-350 g) a dos ensayos diarios en un laberinto de agua, que incluye una plataforma escondida (Morris, J. Neurosci. Methods 11:47-60 (1984) y Gordon et al., Neurosci. Lett. 199:1-4 (1995); Gozes et al., J. Neurobiol. 33:329-342 (1997)). Cada día del primer ensayo, tanto la plataforma como el animal se situaron en una nueva localización con respecto a la piscina (estando la piscina inmóvil). El experimento se realizó según lo siguiente: el animal se situó sobre la plataforma durante 0,5 minutos, y después se colocó en el agua. Se midió el tiempo requerido para alcanzar la plataforma (lo que indica aprendizaje y memoria de referencia intacta) (primer ensayo). Después de 0,5 minutos sobre la plataforma, el animal se colocó nuevamente en el agua (en la posición previa) para un segundo ensayo adicional y para la búsqueda de la plataforma escondida (mantenida en la posición previa). Se registró el tiempo requerido para alcanzar la plataforma en el segundo ensayo, lo que indica memoria a corto plazo (de trabajo). Todas las medidas se realizaron usando el sistema de laberinto de agua de HVS (HVS Image Ltd. Hampton, UK) asistido por vídeo computerizado. Los animales se estudiaron durante cuatro días para eliminar los animales al azar con defectos de memoria. A los que mejor realizaron el ensayo se les inyectó i.c.v. a un caudal de 0,21 \mul/minuto con la colinotoxina etilcolina aziridio (AF64A, 3 mmoles 2 \mul/lado), y los animales de control recibieron una inyección de disolución salina (Gozes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:427-432 (1996)).

Se dejó que los animales se recuperaran durante una semana, seguido de una exposición diaria a tres microgramos de D-SAL + tres microgramos de D-NAP, en 20 microlitros de disolución salina, aplicada oralmente sobre la lengua. después de una semana de aplicación oral de los péptidos, los animales se sometieron a dos ensayos diarios en el laberinto de agua (como antes). Durante el período de ensayo, a los animales también se les suministró una administración oral de péptidos o vehículo (excipiente) una hora antes del ensayo diario. Se demostró previamente que los animales tratados con AF64A muestran deficiencia de aprendizaje y de memoria en el ensayo del laberinto de agua de Morris (Gozes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:427-432 (1996)). Aquí, las ratas tratadas con AF64A sometidas a la aplicación oral de D-NAP + D- SAL mostraron una disminución de la latencia para hallar la plataforma escondida, lo que indica una mejora de la memoria de referencia (Figura 14A, primer ensayo diario). Además, las mismas ratas mostraron una mejora de la memoria de trabajo en un segundo ensayo diario (Figura 14B). Estos datos indican que la administración oral de una combinación de D-SAL y D-NAP dio como resultado aumentos significativos en el aprendizaje y la memoria en animales con trastornos colinérgicos químicamente inducidos.

La Figura 14C ilustra el efecto de la administración oral de D-SALLRSIPA sólo sobre el aprendizaje y la memoria en ratas tratadas con la colinotoxina AF-64A. Las ratas se trataron con la colinotoxina AF-64A y con D-SALLRSIPA como se describe en Gozes et al., J. Pharmacol. Exp. Therap. 293:1091-1098 (2000), excepto que el péptido D-SALLRSIPA se suministró a ratas tratadas con AF64A según lo siguiente: 10 microgramos de D-SALLRSIPA (D-SAL) por rata (250-300 g) por día en 50 microlitros de disolución salina bajo la lengua, usando una micropipeta. Los péptidos se aplicaron una vez al día durante tres días, una semana después de la lesión con AF64A. Después de la parada de dos días, los péptidos se aplicaron una vez al día durante cinco días y se analizaron desde el tercer día en adelante. Tras una parada adicional de dos días, los péptidos se aplicaron nuevamente de forma diaria durante dos días, y se estudiaron en el laberinto de agua de Morris. El gráfico muestra los resultados del ensayo de 5 días. En cada día, los animales se sometieron a dos ensayos consecutivos, y los resultados son una suma de los dos ensayos diarios. La significancia (ANOVA de una sola vía con comparación múltiple de Student-Neuman-Kuels de ensayo de media) es la siguiente.

Día 1: P < 0,04 D-SALLRSIPA-AF64A frente a AF64A;

Día 2: P < 0,04 AF64A frente a control (de forma fingida), el tratamiento con SALLRSIPA no fue significativamente diferente de los animales de AF64A o del control, sugiriendo cierta mejora;

Día 3: Sin diferencia;

Día 4: Sin diferencia;

Día 5: test de t: P < 0,04 D-SALLRSIPA-AF64A frente a AF64A.

Estos resultados sugieren que D-SALLRSIPA (D-SAL) es eficaz por sí solo.

4. Mejoras de la memoria en ratones ApoE deficientes

Se han descrito deficiencias de memoria y trastornos colinérgicos en ratones adultos ApoE deficientes. Estas deficiencias pueden imitar las condiciones encontradas en personas que son homocigóticas para apoliproteína E4, una afección en la que los pacientes tienen más tendencia a un comienzo prematuro de la enfermedad de Alzheimer, en contraste con las personas que contienen los alelos E2 o E3 (Gordon et al., Neurosci. Lett. 199:1-4 (1995)). Una semana después de detener el tratamiento, se estudiaron las funciones cognitivas en el laberinto de agua de Morris. Se observaron mejoras de las funciones cognitivas una semana después de cesar el tratamiento diario de dos semanas con D-SAL-D-NAP, es decir en ratones de 21 días expuestos a un protocolo de entrenamiento de 5 días (Figura 15). Se examinaron los procesos de memoria a corto plazo mediante comportamiento en el laberinto de agua, midiendo el tiempo requerido para encontrar la plataforma escondida en el segundo de los dos ensayos diarios. La localización de la plataforma y el punto de partida en el que se sitúa al animal en el agua se mantuvieron constantes dentro de cada par de ensayos diarios, pero ambas localizaciones se cambiaron cada día. En el segundo ensayo del primer día de ensayo, los ratones ApoE deficientes estaban significativamente retrasados en comparación con los controles (P < 0,04), y mejoraron tras la aplicación oral de D-SAL + D-NAP, encontrando la mayoría de los animales tratados la plataforma a una latencia de \leq 20 segundos.

Las Figuras 16A y 16B ilustran los resultados del primer ensayo y del segundo ensayo, respectivamente, del ensayo de laberinto de agua de Morris en ratones con apoliproteína E deficiente. Los experimentos se realizaron tras las inyecciones de una mezcla de D-NAP-D-SAL con un protocolo de inyección y un laberinto de agua de Morris según se describe en Gozes et al., J. Pharmacol. Exp. Therap. 293:1091-1098 (2000). Los resultados mostraron mejoras significativas en el día 1 y el día 2 (primer ensayo diario, y en el día tres, segundo ensayo) - P < 0,05.

Claims (50)

1. Un polipéptido del Factor I Neurotrófico Dependiente de la Actividad (ADNF I), comprendiendo el polipéptido del ADNF I un sitio central activo que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1),

en la que el sitio activo comprende al menos un D-aminoácido.

2. El polipéptido del ADNF I de la reivindicación 1, en el que bien un aminoácido N-terminal o un aminoácido C-terminal del sitio central activo es un D-aminoácido.

3. El polipéptido del ADNF I de la reivindicación 1, en el que tanto los aminoácidos N-terminales como los C-terminales de los sitios centrales activos son D-aminoácidos.

4. El polipéptido del ADNF I de la reivindicación 1, en el que el sitio central activo comprende todos D-aminoácidos.

5. El polipéptido del ADNF I de la reivindicación 1, en el que el polipéptido del ADNF I es Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1).

6. El polipéptido del ADNF I de la reivindicación 5, en el que el polipéptido del ADNF I comprende todos D-aminoácidos.

7. El polipéptido del ADNF I de la reivindicación 1, en el que el polipéptido del ANDF I se selecciona del grupo que consta de:

Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:14);

Val-Glu-Glu-Gly-Ile-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:15)

Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:16)

Gly-Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:17)

Gly-Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:18)

y

Gly-Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:19)

8. El polipéptido del ADNF I de la reivindicación 1, en el que el polipéptido del ADNF I comprende hasta 20 aminoácidos en cada uno de un término N y de un término C del sitio central activo.

9. El polipéptido del ADNF I de la reivindicación 8, en el que tanto los aminoácidos N-terminales como C-terminales del polipéptido del ADNF I son D-aminoácidos.

10. Un polipétido del Factor Neurotrófico III Dependiente de la Actividad (ADNF III), comprendiendo el polipéptido del ADNF III un sitio central activo que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO:2)

en la que el sitio central activo comprende al menos un D-aminoácido.

11. El polipéptido del ADNF III de la reivindicación 10, en el que bien un aminoácido N-terminal o un aminoácido C-terminal del sitio central activo es un D-aminoácido.

12. El polipéptido del ADNF III de la reivindicación 10, en el que tanto los aminoácidos N-terminales como C-terminales del sitio central activo son D-aminoácidos.

13. El polipéptido del ADNF III de la reivindicación 10, en el que el sitio central activo comprende todos D-aminoácidos.

14. El polipéptido del ADNF III de la reivindicación 10, en el que el polipéptido del ADNF III es Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO:2).

\newpage

15. El polipéptido del ADNF III de la reivindicación 14, en el que el polipéptido del ADNF III comprende todos D-aminoácidos.

16. El polipéptido del ADNF III de la reivindicación 10, en el que el polipéptido del ADNF III se selecciona del grupo que consta de:

Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO:20);

Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser (SEQ ID NO:21);

Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser (SEQ ID NO:22);

y

Ser-Val-Arg-Leu-Gly-Leu-Gly-Gly-Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln-Gln-Ser (SEQ ID NO:23)

17. El polipéptido del ADNF III de la reivindicación 10, en el que el polipéptido del ADNF III comprende hasta 20 aminoácidos en cada uno de un término N y de un término C del sitio central activo.

18. El polipéptido del ADNF III de la reivindicación 17, en el que tanto los aminoácidos N-terminales como C-terminales del polipéptido del ADNF III son D-aminoácidos.

19. Una composición farmacéutica que comprende un excipiente farmacéuticamente aceptable y un polipéptido del Factor Neurotrófico Dependiente de la Actividad (ADNF), en la que el polipéptido del ADNF es un miembro seleccionado del grupo que consta de:

(a)

un polipétido del ADNF I que comprende un sitio central activo que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1)

(b)

un polipéptido del ADNF III que comprende un sitio central activo que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO:2)

y

(c)

una mezcla del polipéptido del ADNF I de la parte (a) y del polipéptido del ADNF III de la parte (b);

en la que al menos uno del polipéptido del ADNF I y del polipéptido del ADNF III comprende un sitio central activo que comprende al menos un D-aminoácido.

20. La composición farmacéutica de la reivindicación 19, en la que el polipéptido del ADNF es un polipéptido del ADNF I, y en la que el sitio central activo del polipéptido del ADNF I comprende al menos un D-aminoácido.

21. La composición farmacéutica de la reivindicación 20, en la que tanto los aminoácidos N-terminales como C-terminales del sitio central activo del polipéptido del ADNF I son D-aminoácidos.

22. La composición farmacéutica de la reivindicación 20, en la que el sitio activo del polipéptido del ADNF I comprende todos D-aminoácidos.

23. La composición farmacéutica de la reivindicación 20, en la que el polipéptido del ADNF I es Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1).

24. La composición farmacéutica de la reivindicación 23, en la que el polipéptido del ADNF I comprende todos D-aminoácidos.

25. La composición farmacéutica de la reivindicación 19, en la que el polipéptido del ADNF es un polipéptido del ADNF III, y en la que el sitio central activo del polipéptido del ADNF III comprende al menos un D-aminoácido.

26. La composición farmacéutica de la reivindicación 25, en la que tanto los aminoácidos N-terminales como C-terminales del sitio central activo del polipéptido del ADNF III son D-aminoácidos.

27. La composición farmacéutica de la reivindicación 25, en la que el sitio central activo del polipéptido del ADNF III comprende todos D-aminoácidos.

\newpage

28. La composición farmacéutica de la reivindicación 25, en la que el polipéptido del ADNF III es Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO:2).

29. La composición farmacéutica de la reivindicación 28, en la que el polipéptido del ADNF III comprende todos D-aminoácidos.

30. La composición farmacéutica de la reivindicación 19, en la que el polipéptido del ADNF es una mezcla de un polipéptido del ADNF I de la parte (a) y un polipéptido de la parte (b), y en la que al menos uno del polipéptido del ADNF I y del polipéptido del ADNF III comprende un sitio central activo que comprende al menos un D-aminoácido.

31. La composición farmacéutica de la reivindicación 30, en la que tanto los aminoácidos N-terminales como C-terminales del sitio central activo del polipéptido del ADNF I son D-aminoácidos, y en la que tanto los aminoácidos N-terminales como C-terminales del sitio central activo del polipéptido del ADNF III son D-aminoácidos.

32. La composición farmacéutica de la reivindicación 30, en la que el sitio central activo del polipéptido del ADNF I comprende todos D-aminoácidos, y en la que el sitio central activo del polipéptido del ADNF III comprende todos D-aminoácidos.

33. La composición farmacéutica de la reivindicación 30, en la que el polipéptido del ADNF I es Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1), y en la que el polipéptido del ADNF III es Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO:2).

34. La composición farmacéutica de la reivindicación 33, en la que el polipéptido del ADNF I comprende todos D-aminoácidos, y en la que el polipéptido del ADNF III comprende todos D-aminoácidos.

35. La composición farmacéutica de la reivindicación 30, en la que el polipéptido del ADNF I comprende todos D-aminoácidos, y en la que el polipéptido del ADNF III comprende todos L-aminoácidos.

36. La composición farmacéutica de la reivindicación 30, en la que el polipéptido del ADNF I comprende todos L-aminoácidos, y en la que el polipéptido del ADNF III comprende todos D-aminoácidos.

37. La composición farmacéutica de la reivindicación 19, en la que la composición se formula para la administración intranasal, intraperitoneal, subcutánea, mediante sonda nasogástrica, sublingual, intravenosa, u oral.

38. La composición farmacéutica de una de las reivindicaciones 19, 22, 27 ó 32, en la que la composición se formula para la administración oral.

39. Composición farmacéutica, en particular como se define en al menos una de las reivindicaciones 19 a 38, para uso como un medicamento en el tratamiento para reducir la muerte celular neuronal, que comprende poner en contacto las células neuronales con un polipéptido del Factor Neurotrófico Dependiente de la Actividad (ADNF), en una cantidad suficiente para prevenir la muerte celular neuronal, en la que el polipéptido del ADNF es un miembro seleccionado del grupo que consta de:

(a)

un polipétido del ADNF I que comprende un sitio central activo que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1)

(b)

un polipéptido del ADNF III que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO:2)

y

(c)

una mezcla del polipéptido del ADNF I de la parte (a) y del polipéptido del ADNF III de la parte (b);

en la que al menos uno del polipéptido del ADNF I y del polipéptido del ADNF III comprende un sitio central activo que consta de al menos un D-aminoácido.

40. La composición farmacéutica para uso como un medicamento en el tratamiento según la reivindicación 39, en la que las células neuronales se seleccionan del grupo que consta de neuronas de la médula espinal, neuronas del hipocampo, neuronas cerebrocorticales y neuronas colinérgicas.

41. La composición farmacéutica para uso como un medicamento en el tratamiento según la reivindicación 39, en la que la muerte celular neuronal tiene lugar en un paciente infectado con el virus de la inmunodeficiencia, en particular en la que el virus de la inmunodeficiencia es el virus de la inmunodeficiencia humana.

42. La composición farmacéutica para uso como un medicamento en un tratamiento según la reivindicación 39, en la que la muerte celular neuronal está asociada con la excitotoxicidad inducida por estimulación con N-metil-D-aspartato.

43. La composición farmacéutica para uso como un medicamento en un tratamiento según la reivindicación 39, en la que la muerte celular neuronal está inducida por el péptido beta-amiloide en un paciente afectado con la enfermedad de Alzheimer.

44. La composición farmacéutica para uso como un medicamento en un tratamiento según la reivindicación 39, en la que la muerte celular neuronal está inducida por el bloqueo colinérgico en un paciente afectado con la enfermedad de Alzheimer, bloqueo colinérgico que da como resultado un deterioro del aprendizaje.

45. Composición farmacéutica, en particular como se define en al menos una de las reivindicaciones 19 a 38, para uso como un medicamento en un tratamiento del estrés oxidativo en un paciente, que comprende administrar al paciente un polipéptido del Factor Neurotrófico Dependiente de la Actividad (ADNF), en una cantidad suficiente para reducir el estrés oxidativo, en la que el polipéptido del ADNF es un miembro seleccionado del grupo que consta
de:

(a)

un polipétido del ADNF I que comprende un sitio central activo que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1)

(b)

un polipéptido del ADNF III que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO:2)

y

(c)

una mezcla del polipéptido del ADNF I de la parte (a) y del polipéptido del ADNF III de la parte (b);

en la que al menos uno del polipéptido del ADNF I y del polipéptido del ADNF III comprende un sitio central activo que comprende al menos un D-aminoácido.

46. Composición farmacéutica, en particular como se define en al menos una de las reivindicaciones 19 a 38, para uso como un medicamento en un tratamiento para reducir una afección asociada con fetopatía alcohólica en un paciente que está expuesto a alcohol in utero, que comprende administrar al paciente un polipéptido del Factor Neurotrófico Dependiente de la Actividad (ADNF) en una cantidad suficiente para reducir la afección asociada con fetopatía alcohólica, en la que el polipéptido del ADNF es un miembro seleccionado del grupo que consta de:

(a)

un polipétido del ADNF I que comprende un sitio central activo que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

Ser-Ala-Leu-Leu-Arg-Ser-Ile-Pro-Ala (SEQ ID NO:1)

(b)

un polipéptido del ADNF III que tiene la siguiente secuencia de aminoácidos:

Asn-Ala-Pro-Val-Ser-Ile-Pro-Gln (SEQ ID NO:2)

y

(c)

una mezcla del polipéptido del ADNF I de la parte (a) y del polipéptido del ADNF III de la parte (b);

en la que al menos uno del polipéptido del ADNF I y del polipéptido del ADNF III comprende un sitio central activo que comprende al menos un D-aminoácido.

47. La composición farmacéutica para uso como un medicamento en un tratamiento según la reivindicación 46, en la que la afección se selecciona del grupo que consta de: una disminución en el peso corporal de un paciente, una reducción en el peso del cerebro de un paciente, una disminución en el nivel de ARNm de VIP de un paciente; y la muerte de un paciente in utero.

48. Uso de la composición farmacéutica, en particular como se define en al menos una de las reivindicaciones 19 a 38, para la fabricación de un medicamento para reducir la muerte celular neuronal según al menos una de las reivindicaciones 39 a 44.

49. Uso de la composición farmacéutica, en particular como se define en al menos una de las reivindicaciones 19 a 38, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento del estrés oxidativo en un paciente según la reivindicación 45.

50. Uso de la composición farmacéutica, en particular como se define en al menos una de las reivindicaciones 19 a 38, para la fabricación de un medicamento para tratar de reducir una afección asociada con la fetopatía alcohólica en un paciente que está expuesto a alcohol in utero según al menos una de las reivindicaciones 46 a 47.