ES2220935T3 - Reguladores de la transcripcion vegetal a partir de circovirus. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION ESTA DIRIGIDA A REGULADORES DE TRANSCRIPCION Y A SECUENCIAS TIPO REGULADOR DE TRANSCRIPCION DE ORIGEN CIRCOVIRUS. COMO SE UTILIZA EN LA ESPECIFICACION, SE CONSIDERA QUE EL GRUPO CIRCOVIRUS INCLUYE VIRUS DE ATROFIA DE TREBOL SUBTERRANEO (SCSV), VIRUS DE PUTREFACCION FOLIAR DE COCO (CFDV), VIRUS SUPERIOR RACIMOSO DE BANANA (BBTV), VIRUS ENANO DE ASTRAGALO (MDV) Y VIRUS AMARILLO NECROTICO DE JUDIA HABA (FBNYV). LOS REGULADORES DE TRANSCRIPCION Y LAS SECUENCIAS TIPO REGULADOR DE TRANSCRIPCION DE LA PRESENTE INVENCION SON UTILES EN INGENIERIA GENETICA DE VEGETALES Y EN PARTICULAR EN PLANTAS LEGUMINOSAS PARA FACILITAR O CONTROLAR LA EXPRESION DE GENES EXTRAÑOS. LOS REGULADORES DE TRANSCRIPCION Y SECUENCIAS TIPO REGULADOR DE TRANSCRIPCION DE LA PRESENTE INVENCION SON TAMBIEN UTILES EN FACILITAR DIFERENTES NIVELES DE EXPRESION EN DIFERENTES TIPOS DE TEJIDO DE VEGETAL.

Description

Reguladores de la transcripción vegetal a partir de circovirus.

La presente invención se refiere generalmente a un nuevo conjunto de reguladores de la transcripción y secuencias de tipo reguladoras de la transcripción operables en plantas. De forma más particular, la presente invención se dirige a reguladores de la transcripción y a secuencias de tipo reguladoras de la transcripción de origen vírico e, incluso más particularmente, de origen circovírico. Los reguladores de la transcripción y las secuencias de tipo reguladoras de la transcripción, de la actual invención, son útiles en ingeniería genética de plantas, y en particular en plantas leguminosas para facilitar o controlar la expresión de genes foráneos. Los reguladores de la transcripción y las secuencias de tipo reguladoras de la transcripción, de la presente invención, también son útiles facilitando niveles diferentes de expresión en diferentes tipos de tejidos vegetales.

Los datos bibliográficos de las publicaciones citadas en esta memoria descriptiva se recogen al final de la descripción. Los números de identidad de las secuencias (SEQ ID N^{OS}) para las secuencias nucleotídicas citadas en la memoria descriptiva se definen después de la bibliografía.

A lo largo de esta memoria descriptiva, excepto que el contexto requiera lo contrario, se entenderá que la palabra "comprende", o variaciones tales como "que comprende", implica la inclusión de un elemento citado o un número entero o grupo de elementos o números enteros, pero no la exclusión de cualquier otro elemento o entero o grupo de elementos o enteros.

Los reguladores de la transcripción son moléculas, y generalmente moléculas a base de nucleótidos, que facilitan y modulan la expresión de secuencias genéticas en la transcripción. Los reguladores de la transcripción incluyen promotores y secuencias de terminación y de poliadenilación, entre otros efectores y agentes que facilitan la transcripción.

Los promotores son secuencias nucleotídicas específicas a las que se une el ARN polimerasa para iniciar la síntesis de ARN en las células. Los promotores contienen el sitio de partida para la síntesis de ARN, y contienen las señales genéticas para iniciar la síntesis de ARN mediada por polimerasas. Además, se supone que las proteínas que se unen al ADN, específicas de las secuencias, inhiben o estimulan la iniciación de la síntesis de ARN uniéndose de forma próxima al promotor y efectuando la unión de la polimerasa al promotor. Las secuencias terminadoras se refiere a las secuencias de terminación y de poliadenilación, y son necesarias para la transcripción de ARNm funcionales. Las secuencias de terminación están localizadas en dirección (es decir, hacia el extremo 3') de un gen, y son reconocidas por el ARN polimerasa como una señal para detener la síntesis de ARNm. Las secuencias de poliadenilación son señales necesarias para la poliadenilación de moléculas de ARNm eucariota después de la transcripción.

Un promotor vírico ampliamente usado para facilitar la expresión génica foránea en plantas es el promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) (Odell et al., 1985), que deriva de un virus de plantas que posee un ADN de doble cadena. El uso de este promotor en plantas y en células vegetales está bien documentado (Benfey y Chua, 1990; Higgins y Spencer, 1991). Sin embargo, a pesar de la aparente utilidad de este promotor, no es funcional en todas las plantas, y es particularmente poco operable en plantas leguminosas. Por lo tanto, existe la necesidad de identificar otros promotores, tales como los de origen vírico, que sean operables en plantas y particularmente en plantas leguminosas. También existe una necesidad de modular niveles de expresión de genes y otras secuencias genéticas dentro de las células vegetales.

En consecuencia, un aspecto de la presente invención se dirige a un constructo genético que comprenda un promotor circovírico o secuencia de tipo promotora, y que sea operable en una célula vegetal.

En un aspecto relacionado de la presente invención, se proporciona un constructo genético que comprende un promotor circovírico o una secuencia de tipo promotora y una secuencia de terminación y/o de poliadenilación, secuencias las cuales son operables en una célula vegetal.

Un circovirus es un virus de plantas con un ADN de una sola cadena (ss), no geminado (Tabla 1), distinto de los caulimovirus que tienen un genoma de doble cadena, y de los geminivirus, los otros únicos virus de plantas con ADNss conocidos, que tienen partículas geminadas (Chu et al., 1994). Como se usa aquí, se considera que el grupo de circovirus incluye el virus de la atrofia del trébol subterráneo (SCSV) (Chu y Helms, 1988), el virus de la caída foliar del cocotero (CFDV) (Rohde et al., 1990), el virus del copo racimoso del banano (BBTV) (Thomas y Dietzgen, 1991; Harding et al., 1991; 1993; Burns et al., 1993), el virus de enanismo de arveja lechosa (MDV) (Isogai et al., 1992; Sano et al., 1993) y el virus de amarilleo necrótico del haba (FBNYV) (Katul et al., 1993).

En una realización particularmente preferida, el circovirus contemplado para uso según la presente invención comprende más de dos componentes o segmentos de ADN.

La presente invención se dirige particularmente y se describe en lo sucesivo con referencia al virus de la atrofia del trébol subterráneo (en lo sucesivo abreviado como "SCSV") como un representante del grupo de los circovirus. Sin embargo, esto se hace con la comprensión de que la referencia a SCSV incluye la referencia a todos los otros miembros adecuados del grupo de circovirus a los que se extiende la actual invención. Los miembros preferidos del grupo de los circovirus tales como SCSV comprenden más de dos componentes o segmentos de ADN. La referencia en lo sucesivo a "SCSV" también incluye y se extiende a todos los mutantes de origen natural o inducidos artificialmente, derivados, partes, fragmentos, homólogos o análogos del virus, que aún retengan al menos una secuencia promotora y/o de terminación y/o de poliadenilación adecuada.

En consecuencia, una realización particularmente preferida de la presente invención contempla un constructo genético que comprende un promotor de SCSV o una secuencia de tipo promotora, y que es operable en una célula vegetal.

Un aspecto relacionado de la presente invención se dirige a un constructo genético que comprende un promotor de SCSV o una secuencia de tipo promotora y una secuencia de terminación y/o de poliadenilación, secuencias las cuales son operables en una célula vegetal.

La expresión "constructo genético" se usa en su sentido más amplio para incluir cualquier molécula de ácido nucleico recombinante tal como una molécula de ácido nucleico aislada, un vector, un vector de expresión o un vector binario. Puede comprender solamente el promotor del circovirus, o puede contener uno o más promotores en asociación con secuencias reguladoras y/o informadoras.

El constructo genético puede ser ADN de doble cadena o de una sola cadena, en forma lineal o circular cerrada covalentemente. Como se establece anteriormente, puede comprender sólo el promotor o la secuencia de tipo promotora, o puede tener otras secuencias reguladoras de la transcripción heterólogas u homólogas y/o secuencias génicas estructurales heterólogas incluyendo promotores asociados con SCSV. Por "homóloga" se quiere decir una secuencia génica asociada naturalmente con el promotor de SCSV. "Heteróloga" significa un gen "foráneo" con relación al promotor, o un gen no asociado normalmente de otro modo con el promotor de SCSV. En una realización preferida, el gen foráneo también es foráneo para SCSV. Los ejemplos de genes foráneos incluyen genes que facilitan la resistencia a insectos u otras infestaciones de plagas, potencian la resistencia a insecticidas o herbicidas, promueven la resistencia a la congelación, alteran el color de la flor o de los pétalos, disminuyen la velocidad de envejecimiento, especialmente en flores cortadas, aumentan o potencian los niveles de ciertas proteínas y/o ribozimas. Más particularmente, los genes foráneos incluyen:

a)

un gen de resistencia frente a virus, bacterias, hongos, nemátodos y otros patógenos de las plantas;

b)

un gen de resistencia a virus de las plantas, que incluye un gen sintético procedente del virus del mosaico de la alfalfa, del virus de la atrofia del trébol subterráneo, del virus del moteado del trébol subterráneo, del virus de la hoja roja del trébol subterráneo, del virus de enrollamiento de la hoja de la patata, del virus del bronceado del tomate, del virus del mosaico amarillo del haba, del virus del mosaico blanco del trébol, virus de las venas amarillas del trébol, de los virus x, y, s, m y a de la patata, del virus del mosaico del pepino, del virus de la atrofia desigual del arroz y del virus del enanismo amarillo de la cebada, y contra los mismos;

c)

un gen para mejorar el valor nutritivo de las plantas, tales como el gen SF8 del girasol con alto contenido en azufre;

d)

un gen de resistencia al hinchamiento;

e)

un gen de tipo anticuerpo;

f)

un gen proteínico que inactiva la tionina y ribosoma de cereales;

g)

un gen de resistencia a insectos, que incluye el gen de la toxina BT y el gen de inhibidor de proteinasa procedente de Nicotiana alata;

h)

un gen marcador seleccionable, tal como los que confieren resistencia a canamicina, fosfinotricina, espectinomicina e higromicina;

i)

un gen informador, tal como GUS, CAT y genes de tipo pigmentos;

j)

un gen que codifica una proteína reguladora que modula la expresión de un gen en las células vegetales.

La presente invención contempla además un constructo genético que comprende dos genes heterólogos enlazados operablemente al mismo o diferentes promotores circovíricos operables en una célula vegetal. Preferiblemente, el promotor o diferentes promotores proceden de un circovirus con un genoma que comprende más de dos componentes o segmentos. Lo más preferible, el promotor o diferentes promotores proceden de SCSV y, en particular, se seleccionan de los segmentos 1 a 7 de SCSV como se definen mediante los SEQ ID N^{os} 1 a 7 (véase más abajo). Los constructos genéticos también pueden comprender una secuencia de terminación o de poliadenilación enlazada operablemente a uno o ambos de los genes heterólogos. En una realización, la secuencia de terminación y/o de poliadenilación es la misma para cada gen. En una realización alternativa, la secuencia de terminación y/o de poliadenilación es diferente para cada gen. Lo más preferible, la secuencia de terminación y de poliadenilación se selecciona de segmentos 1 a 7 de SCSV como se definen mediante los SEQ ID N^{os} 1 a 7 (véase más abajo). En aún otra realización, al menos una secuencia de terminación y de poliadenilación proviene del gen MeA 3 de Flaveria bidentis (véase más abajo).

La expresión "regulador de la transcripción" se usa en su sentido más amplio para incluir secuencias promotoras, de terminación y de poliadenilación, y otros efectores y agentes que facilitan la transcripción de secuencias genéticas. En cuanto a los promotores contemplados por la presente invención, las secuencias de terminación y de poliadenilación pueden ser de origen SCSV, y se pueden asociar naturalmente con un promotor correspondiente procedente de SCSV, o se pueden asociar con otro promotor de SCSV. Como alternativa, las secuencias de terminación y/o de poliadenilación pueden derivar de fuentes que no sean de SCSV. Un terminador particularmente preferido comprende la secuencia nucleotídica 3' del gen MeA 3 de Flaveria bidentis, que codifica una enzima NADP-málica de la fotosíntesis C4 (Hatchi, 1987). En la Figura 15 se muestra la secuencia nucleotídica de la región terminadora del gen MeA. La combinación de un promotor de SCSV con, por ejemplo, la secuencia terminadora del gen MeA de F. bidentis da como resultado un nivel elevado de expresión, especialmente en plantas monocotiledoneas, con relación a constructos sin la secuencia terminadora.

El gen extraño también puede estar en la orientación antisentido para facilitar niveles reducidos de productos génicos vegetales endógenos. A este respecto, "gen" puede tener diez pares de bases de longitud, cientos de pares de bases de longitud, o puede ser un gen de longitud completa o casi completa, pero en una orientación inversa con relación al promotor. El gen extraño también se puede colocar en la orientación del "sentido" para la cosupresión de un gen diana.

Según otro aspecto de la presente invención, se proporciona un constructo genético que comprende un promotor de SCSV o secuencia semejante a promotor operable en una célula vegetal, y al menos un sitio de restricción de endonucleasa en dirección de dicho promotor para facilitar la inserción de un gen heterólogo de forma que dicho gen esté enlazado operablemente a dicho promotor. En una realización alternativa, el constructo genético comprende un promotor de SCSV, o secuencia semejante a promotor, operable en una célula vegetal, y un gen heterólogo enlazado operablemente a dicho promotor. En ambas realizaciones, el término "gen" incluye aquellos que se dirigen a la síntesis de oligonucleótidos, tales como los útiles en técnicas de antisentido así como ribozimas.

En aún una realización adicional de la presente invención, se contempla un constructo genético que comprende un promotor de SCSV, o secuencia semejante a promotor, operable en una célula vegetal, y al menos un sitio de restricción de endonucleasa en dirección de dicho promotor para facilitar la inserción de un gen heterólogo de forma que dicho gen esté enlazado operablemente a dicho promotor, y una secuencia de terminación y/o de poliadenilación situada de forma que la misma secuencia esté en el extremo 3' con relación a dicho gen heterólogo para facilitar la expresión de dicho gen heterólogo. Preferiblemente, la secuencia de terminación procede de SCSV. Como alternativa, la secuencia terminadora procede del gen MeA 3 de F. bidentis.

Las plantas contempladas por la presente invención incluyen especies tanto monocotiledoneas como dicotiledoneas. La presente invención también se extiende a plantas leguminosas y no leguminosas, aunque se prefieren las plantas leguminosas.

El genoma de SCSV comprende al menos siete componentes distintos de ADNss circular descritos como segmentos 1-7. El tamaño de estos segmentos oscila de alrededor de 988 hasta alrededor de 1022 nucleótidos. Cada uno de los siete componentes de ADN de SCSV contiene un marco de lectura abierta principal del sentido vírico, y una región no codificante de diversas longitudes que contiene una raíz potencial conservada y una estructura de bucle (Figuras. 1 y 2; Tabla 2). Cada unidad de transcripción contiene una caja TATA típica y una señal de poliadenilación para comenzar y terminar la transcripción, respectivamente (Figura 2, Tabla 2).

Debido a que los ADN son circulares, las secuencias en estas regiones no codificantes comprenden los promotores y las señales terminadoras que varían con los diferentes componentes de ADN (Tabla 2). Las cajas TATA y los bucles de tallo de las dos proteínas génicas asociadas a replicasa en los segmentos 2 y 6 son bastante diferentes de aquellos de los otros genes. Por el contrario, los tallos-bucles y cajas de TATA son las mismas en los segmentos 1, 3, 4, 5 y 7. Todos los ADN, excepto aquellos de los segmentos 2 y 6, también comparten una secuencia común (conocida como la región común) en la región no codificante (Figuras 1 y 2).

Por lo tanto, la presente invención se extiende a cada uno de los siete promotores y a las secuencias de terminación y de poliadenilación en los segmentos 1-7 de SCSV. Las secuencias nucleotídicas de los segmentos 1-7 se muestran en la Figura 6, y se definen en las SEQ ID NO:1-7, respectivamente.

El segmento 5 se identificó como el gen proteínico de revestimiento basado en una secuencia de aminoácido N-terminal y los datos de composición de aminoácidos (Chu et al., 1993a). Los segmentos 2 y 6 codifican proteínas que contienen los motivos característicos de unión a NTP, y de este modo se predice que son genes proteínicos asociados a la replicación (RAP) víricos putativos. Los 4 componentes de ADN restantes no están relacionados entre sí o con el segmento 2, 5 y 6, basado en su secuencia de aminoácidos deducida distinta. Los ADN de SCSV no tienen homología significativa de secuencia nucleotídica con los genomas de geminivirus, aunque existe cierta homología al nivel de aminoácidos deducidos.

Se ha demostrado la competencia replicativa de SCSV (Chu et al., 1993b). Puesto que el ADN del virión de SCSV es de una sola cadena, y los transcriptos tienen el sentido vírico, el primer suceso biosintético probable después del desrevestimiento es la síntesis del ADN de forma replicativa usando ADN polimerasa del hospedante (los ADN de SCSV tienen la capacidad de autocebarse en la síntesis de ADNds [Chu y Helms, 1988]). Se piensa que la ARN polimerasa del hospedante se une a los promotores que inician la transcripción de ARN seguido de la síntesis de las proteínas víricas requeridas para la multiplicación de los virus.

En una realización particularmente preferida de la presente invención, se contempla un promotor de SCSV, o secuencia semejante a promotor, que comprende una secuencia nucleotídica seleccionada de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6 y SEQ ID NO: 7 y/o constructos genéticos que comprenden a las mismas.

Una "secuencia semejante a promotor" como se usa aquí incluye cualquier mutante funcional, derivado, parte, fragmento, homólogo o análogo de un promotor de SCSV de origen natural. Las secuencias semejantes a promotores contempladas aquí incluyen sustituciones sencillas o múltiples nucleotídicas, eliminaciones y/o adiciones a un promotor de SCSV, con tal de que dichas secuencias semejantes a promotores retengan al menos 35%, preferiblemente al menos 45%, más preferiblemente al menos 55%, incluso más preferiblemente al menos 65-70%, y aún más preferiblemente al menos 85-95% o más de la actividad promotora, comparado con el promotor de SCSV de tipo silvestre correspondiente.

En aún otra realización, se proporciona un constructo genético que comprende un promotor de SCSV, o secuencia semejante a promotor, y que es operable en una célula vegetal, correspondiendo dicho promotor o secuencia semejante a promotor a todo o parte de una cualquiera de la SEQ ID NO: 1 a 7, o capaz de hibridarse en un intervalo de condiciones restrictivas, que oscila desde condiciones muy restrictivas a poco restrictivas, hasta al menos una de las SEQ ID NO: 1 a 7. Convenientemente, un mutante, derivado, parte, fragmento, homólogo o análogo de un promotor de SCSV se define como funcional en una célula vegetal, y es capaz de hibridarse en un intervalo de condiciones al menos desde elevadas hasta poco restrictivas a al menos una de SEQ ID NO: 1 a 7.

En una realización particularmente preferida, el constructo genético comprende además una secuencia de terminación y/o de poliadenilación procedente de SCSV, o de una fuente que no es SCSV, y que potencia o facilita de otro modo la expresión de un gen enlazado operablemente a dicho promotor.

Para los fines de la definición del nivel de restricción, se puede hacer referencia convenientemente a Sambrook et al (1989) que se incorpora aquí como referencia, en el que las etapas de lavado de las páginas 9.52-9.57 se consideran de restricción elevada. Una baja restricción se define aquí como 0,1-0,5% p/v de SDS a 37-45ºC durante 2-3 horas. Dependiendo de la fuente y de la concentración de ácido nucleico implicado en la hibridación, se pueden emplear condiciones alternativas de restricción, tal como condiciones restringentes del medio que se considera aquí que son 0,25-0,5% p/v de SDS a \geq 45ºC durante 2-3 horas, o condiciones muy restrictivas como se describe por Sambrook et al (1989).

Otra realización de la presente invención contempla un método para expresar un gen extraño en una célula vegetal, comprendiendo dicho método introducir en dicha célula vegetal un constructo genético que comprende un promotor de SCSV o secuencia semejante a un promotor operable en dicha célula vegetal y enlazado operablemente a dicho gen extraño. En una realización adicional, se usan múltiples promotores de SCSV para hacer funcionar a uno o más transgenes sin antagonismo. En aún una realización adicional, el promotor de SCSV está asociado con el gen de segmento 2 de SCSV a fin de potenciar la expresión del gen extraño. En otra realización, los constructos genéticos comprenden además una o más secuencias de terminación y/o de poliadenilación que están localizadas en el extremo 3' del gen extraño. Estas secuencias potencian o facilitan de otro modo la expresión del gen extraño. El segmento de terminación y/o de poliadenilación puede ser de SCSV o de otra fuente tal como el gen MeA de F. bidentis.

En aún otra realización adicional, la presente invención contempla una planta transgénica que contiene un promotor de SCSV o una secuencia semejante a promotor como se define aquí anteriormente en su genoma, y opcionalmente una secuencia de terminación y/o de poliadenilación para potenciar la expresión de un gen en dirección de dicho promotor. Preferiblemente, la planta transgénica muestra características alteradas debido a la expresión de una secuencia genética tal como un gen, oligonucleótido o ribozima en dirección del promotor de SCSV.

La presente invención se describe adicionalmente mediante referencia a las siguientes figuras y/o ejemplos no limitantes. La referencia aquí a una región promotora de SCSV se abrevia como "S" para SCSV, el número de segmento del genoma (por ejemplo 1, 3, 4, 5 y 7), y "nc" para la región no codificante. Por ejemplo, el promotor procedente del segmento 1 del genoma de SCSV se define como "S1nc". Las secuencias terminadoras para segmentos particulares del genoma de SCSV se indican, por ejemplo, según lo siguiente: "SC1Tr" o "SC5Tr" para las secuencias terminadoras para los segmentos 1 y 5, respectivamente. Los constructos genéticos que comprenden un promotor de SCSV, un gen informador tal como GUS y una secuencia terminadora tal como la procedente de SCSV, se abrevian como "SCSV:GUS:SCTr" o "SCSV:GUS:SCSVTr". Los promotores y secuencias de terminación específicos se definen como antes, por ejemplo "S4nc:GUS:SC1Tr o S4nc:GUS:Me3", "S4nc:GUS:Me3". En el último constructo, se usa la secuencia terminadora procedente del gen MeA de Flaveria bidentis, denominado aquí como "Me3".

En las Figuras:

La Figura 1 muestra las estructuras y unidades de transcripción encontradas en un componente de ADN representativo de un geminivirus típico y SCSV, los cuales contienen ambos un genoma de ADNss.

La Figura 2 muestra los siete segmentos de ADN encontrados en el genoma de SCSV en una forma lineal, que indica las posiciones de la estructura del tallo-bucle, la región común, la ventana de lectura abierta (ORF), la caja TATA y las señales de terminación y de poliadenilación en cada ADN.

La Figura 3 muestra la construcción de los siete vectores de expresión de fusión de la región no codificante de ADN de SCSV: \beta-glucuronidasa (GUS) para la transformación en plantas de tabaco. Los fragmentos de PCR amplificados se clonaron separadamente en frente del gen GUS en pHW9 en los sitios BamHI (B) y NcoI (N) según se indica. Los vectores pHW9 recombinantes resultantes se cortaron en el sitio EcoRI, y se clonaron en el sitio EcoRI para el vector binario PGA470 receptor.

La Figura 4 muestra la construcción de los vectores de expresión de la fusión de los segmentos 5 y 7 del promotor:GUS, y sus derivados de eliminación para estudios de protoplastos. Los ADN que corresponden a las regiones no codificantes de longitud completa se obtuvieron mediante PCR y se clonaron en pKGO enfrente de GUS mediante ligación del extremo romo en el sitio SalI según se indica. Los derivados de eliminación se obtuvieron digiriendo los clones pKGO que contienen la secuencia de longitud completa con HindIII o PstI en el vector y las enzimas de restricción apropiadas sobre la secuencia de SCSV según se indica. Los constructos de pKGO eliminados se religaron después del llenado de los extremos, según se requiera.

La Figura 5 muestra la construcción del vector pTAB10 binario recombinante (pBS150) que contiene el gen de fusión del promotor de segmento 7 (57nc):GUS para la transformación en plantas de trébol subterráneo. El casete de expresión 57nc:GUS se separó por escisión a partir del constructo de pKGO (Fig. 4) mediante digestión con HindIII y BamHI, y se ligaron los extremos romos al pTAB10 en el sitio EcoRI después del llenado de los extremos de los ADN.

La Figura 6 muestra las secuencias completas de los siete círculos de ADN de SCSV. Se subraya la secuencia de la región no codificante en cada ADN usado en la construcción de los casetes de expresión.

La Figura 7 muestra la expresión de GUS detectada mediante tinción histoquímica sobre hojas de tabaco y de trébol subterráneo transgénicos transformadas con el casete de expresión de fusión del promotor de seg 7 de SCSV (S7nc):GUS.

Las Figuras 8A a 8F son representaciones fotográficas de la tinción histoquímica para la actividad GUS en plantas transgénicas - campo brillante. Las exposiciones de campo brillante de trozos de hoja teñidos (L), secciones del tallo (S), raíces (R), y polen (P) de plantas de tabaco transformadas con los constructos de fusión GUS que contienen las regiones promotoras de SCSV para los fragmentos 1, 3, 4, 5 y 7 denominados como regiones promotoras S1nc, S3nc, S4nc, S5nc y S7nc, y de plantas no transformadas (NT). La coloración azul indica expresión de GUS. En cada hoja, tallo o raíz se representa un transformante independiente (excepto los dos trozos de raíces de S5nc de la parte superior que no se pudieron separar fácilmente) y las muestras de polen fueron mezclas de dos o más transformantes. La Fig. 8a muestra la expresión diferencial de GUS en plantas transformadas con regiones S4nc o S5nc comparado con una planta no transformada (NT).

Las Figuras 9A a 9E son representaciones fotográficas que muestran la tinción histoquímica para actividad GUS en plantas transgénicas - campo oscuro. Las secciones delgadas transversales (T) y longitudinales (L) de trozos de tallo teñidos, embebidos, de plantas de tabaco transformadas con los constructos de fusión GUS que contienen los componentes 1 (S1nc), 3 (S3nc), 4 (S4nc), 5 (S5nc), y 7 (S7nc) de las regiones promotoras, vistas con un campo oscuro. Los cristales rosas indican la expresión GUS. Los trozos de tallo usados para las secciones transversales y longitudinales representan transformantes independientes. Los aumentos son: 375X en S1nc T y L, S3nc L, S4nc T, S5nc T y L, y S7nc L; 480X en S3nc T; 200X en S4nc L; y 300X en S7nc T.

La Figura 10 es una representación gráfica de un ensayo fluorométrico para la expresión GUS. El ensayo fluorométrico resulta de extractos de hoja de plantas de tabaco transformadas con los constructos de fusión GUS que contienen el componente 1 (S1nc), 3 (S3nc), 4 (S4nc), 5 (S5nc), y 7 (S7nc) de las regiones promotoras. Cada columna representa un transformante independiente. Las actividades GUS se midieron con Labsystems Fluoroskan a 5 ó 10 minutos de intervalos durante 60 minutos (o 30 minutos para S4nc) usando 4-metilumbeliferil-\beta-D-glucurónido (MUG) como sustrato. Los índices de actividad de GUS se expresan como unidades fluorométricas (Fl.U.) por minuto por mg de proteína. 1000 Fl.U. es aproximadamente igual a 825 pmoles de 4-metilumbeliferona (MU).

La Figura 11 es una representación diagramática del constructo del promotor (S2nc) del segmento 2 de SCSV capaz de dirigir la expresión de GUS en protoplastos del tabaco. Se fusionó un fragmento de ADN de segmento 2 procedente de NcoI-XBaI a un vector GUS sin promotor, pKGO. Pr, promotor, seg 2, segmento 2 de SCSV.

Las Figuras 12a y 12b son representaciones diagramáticas que muestran constructos de vectores de expresión SCSV:GUS:SCSV Tr. Las secuencias de terminación/ poliadenilación para el segmento 3 de SCSV (SC3Tr) y segmento 5 (SC5Tr) se amplificaron mediante PCR y se cortaron con las enzimas de restricción respectivas, y entonces se clonaron en el vector pKGO recombinante según se indica. El constructo SC3Tr se clonó como un fragmento EcoRI-XhoI en el vector pKGO que contiene S1nc:GUS:OCS3' para obtener S1nc:GUS:SC3Tr. El constructo SSC5TR se obtuvo como un fragmetno EcoRV en el vector pKGO que contiene S4nc:GUS:OCS3' para obtener S4nc:GUS:S5Tr.

Las Figuras 13A a 13D son representaciones fotográficas que muestran la expresión de GUS en tejidos de plantas de patata dirigida por el promotor de segmento 4 de SCSV (S4nc). A, tallo; B, hoja; C, estolón; y D. tubérculo.

La Figura 14 es una representación fotográfica de la expresión de GUS en hoja de algodón dirigida por el promotor de segmento 7 de SCSV (S7nc).

La Figura 15 es una representación de la secuencia terminadora de MeA3 del gen MeA de Flaveria bidentis (Me3). El codón stop se muestra en tipo de cara en cursiva al comienzo de la secuencia. Esta secuencia se sometió a ingeniería genética en el constructo quimérico para incluir un sitio EcoRI: GAATTCGTTTAG.... Los constructos quiméricos contuvieron de este modo una secuencia que comienza AATTCGTTTAG.

La Figura 16 es una representación diagramática de los vectores de expresión de GUS (ME20 y ME29) que contienen los elementos reguladores del gen MeA de Flaveria bidentis indicado.

La Figura 17 es una representación diagramática de la construcción del plásmido de S4nc pBS237 que contiene el casete de expresión S4nc:GUS:Me3'. Se digirió el plásmido pBS218 con EcoR1 para eliminar la región OCS3', y se ligó con un EcoR1.

La Figura 18 es una representación diagramática de la construcción del plásmido pBS246 que contiene el casete de expresión S1nc:nptII:SC3Tr. El fragmento SalI-SalI tiene aproximadamente 8,5-9 kpb; B_{L} tiene aproximadamente 0,5 kpb; B_{R} tiene aproximadamente 0,6 kpb; el SC1nc:nptII:SC3Tr tiene alrededor de 1,7 kpb.

Las Figuras 19a-c son representaciones diagramáticas de la construcción del plásmido pKHAN4 a partir de pKHAN2 y pKSB.bar1. pKHAN4: un segmento HindIII-EcoR1 que contiene S7nc (572 pb), la región codificante nptII (978 pb) y el extremo 3' de vicillina (276 pb) de pKHAN2 se insertó en el plásmido binario pKSB.bar1 para producir pKHAN4:pKHAN2. La región codificante nptII (978 pb, fragmento BamHI-SmaI) procedente de p35SKN se clonó en el sitio Asp718 (que se hizo romo con el fragmento Klenow) de pKHAN1 para crear pKHAN2. Pro de SCSV = S7nc; pKSB. Bar 1: pTAB10.MCSori1B digerido con EcoR1 según se ligan juntos.

La Figura 20 es una representación fotográfica de una selección de plantas de tabaco resistente a canamicina en medio de regeneración transformadas con vectores binarios que contienen el promotor 35S:NPTII:secuencia terminadora 35S (35SPrm:NPTII:35STrm) o el casete de expresión S1nc:NPTII:SC3Tr. (En las Figuras, las abreviaturas son 35S Principalmente NPTII35STrm y SC1 Principalmente NPTII Sc3 Trm, respectivamente.

La Figura 21 es una representación diagramática de un vector de clonación que utiliza señales reguladoras de transcripción de ADN de SCSV.

La Figura 22 es una representación diagramática de un constructo dimérico de segmento 2 de SCSV pBS2. Este constructo se creó clonando una pareja repetida del segmento 2 de ADN de SCSV (que contiene una unidad de transcripción seg 2 funcional completa) en el sitio del poliligador de pGEM7 que entonces se clonó en una versión reducida del vector binario de pMCP3 (Khan et al., 1994).

En la Tabla 19 se muestra un resumen de las actividades de transcripción facilitadas por los elementos reguladores de transcripción de SCSV.

Ejemplo 1 Determinación de la secuencia de ADN de SCSV

Para la determinación de la secuencia se usó el aislado clínico F de SCSV (Chu et al. 1993a). Se crearon clones de longitud completa de los componentes del genoma de SCSV a partir del ADN de forma replicativa (RF) como se describe por Chu et al. (1993a). Se crearon otros clones a partir de la RF mediante PCR con cebadores específicos de SCSV diseñados a partir de secuencias conocidas.

Se usó el método de terminación de cadena con didesoxi (Sanger et al., 1977) para secuenciar moldes de ADNss de M13 (Sambrook et al., 1989) o moldes de ADNds preparados mediante el método de CTAB (Del Sal et al., 1989) a partir de los clones descritos anteriormente. El análisis de la secuencia se llevó a cabo usando el Paquete de Programa de Ordenador para Análisis de Secuencia del Wisconsin Genetics Computer Group (Devereaux et al., 1984).

Ejemplo 2 Construcción del plásmido

Las técnicas de manipulación de ADN usadas fueron como se describe por Sambrook et al. (1989). Las regiones no codificantes completas de los 7 segmentos de ADN de SCSV se amplificaron mediante PCR usando cebadores específicos (véase la Tabla 8) con sitios de reconocimiento de enzimas de restricción apropiadas para clonar en vectores del plásmido. Los fragmentos de ADN amplificados se clonaron separadamente en los respectivos vectores de expresión en dirección del gen informador de GUS sin promotor en la orientación apropiada para producir los constructos de fusión del promotor de SCSV-GUS como se muestran en las Figuras 3 y 4. Se usó el vector de expresión pHW9 (Fig. 3) seguido de la clonación en el vector binario pGA470 (An et al., 1985) para la transformación del tabaco. Se usó el vector de expresión pKGO para la expresión de GUS en protoplastos (Fig. 4), y se usó el vector binario pTAB10 para la transformación de trébol subterráneo (Fig. 5). El pKGO se construyó clonando el fragmento XhoI de pKIWI101 (Janssen y Gardner, 1989) que contiene el gen GUS y la secuencia terminadora de OCS en el sitio SalI de pJKKm (Kirschman y Cramer, 1988). Como controles se usaron los plásmidos correspondientes que contienen el promotor 35S fusionado a GUS. Los empalmes de los clones se comprobaron mediante secuenciación. Como control se usó un constructo de GUS sin promotor.

Se obtuvieron derivados de eliminación de los promotores de segmentos 5 y 7 de SCSV digiriendo la secuencia no codificante de longitud completa con una enzima apropiada para producir la eliminación deseada (Fig. 4).

Para investigar el fenómeno de la transactivación, se separó por escisión el casete de expresión S5nc:GUS de constructos de pKGO recombinantes, y se clonó en un plásmido pGEM que contiene la región codificante RAP seg 2 expresada a partir del promotor 35S. El plásmido resultante que contiene tanto el promotor SCSV:GUS como el promotor 35S:casetes de expresión seg 2 RAP se electroporó en protoplastos.

Ejemplo 3 Aislamiento de protoplastos y expresión transitoria de genes

Los plásmidos recombinantes se extrajeron de E. coli mediante lisis alcalina seguida de la purificación a través de columnas Qiagen como se describe en el Manual Para Plásmidos de Qiajen.

Se usaron cultivos de células en suspensión para aislar protoplastos de Nicotiana plumbaginifolia (Last et al. 1991) y trébol subterráneo, variedad Woogenellup (Chu et al. 1993b). Los plásmidos purificados se electroporaron en protoplastos de trébol subterráneo o Nicotiana plumbaginifolia como se describe por Taylor y Larkin (1988). Los protoplastos se cosecharon 3 días más tarde y se analizaron fluorométricamente para determinar la actividad transitoria de GUS usando como sustrato el 4-metil-umbeliferil-\beta-glucurónido (véase más abajo). Todos los experimentos se realizaron usando muestras duplicadas por tratamiento.

Ejemplo 4 Transformación de tabaco con constructos de fusión de promotor SCSV-GUS

Se transformaron separadamente constructos binarios pGA470 recombinantes que contienen los diversos casetes de expresión de promotor de SCSV:GUS en la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens (Hoekema et al. 1983) mediante electroporación como se describe por Nagel et al. (1990). Se transformó Nicotiana tobacum variedad Wisconsin 38, y se regeneró como se describe mediante Ellis et al. (1987).

Ejemplo 5 Transformación de trébol subterráneo con constructo de fusión de promotor de SCSV-GUS

El vector binario pTAB10 recombinante que contiene el constructo de fusión S7nc:GUS (pBS150) se transformó en la cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens (Lazo et al. 1991) mediante emparejamiento triparental (Ditta et al. 1980). Se transformó trébol subterráneo, variedad Larisa, mediante transformación mediada por Agrobacterium, y se regeneró como se describe por Khan et al. (1994).

Ejemplo 6 Ensayos de GUS

Se lisaron los protoplastos mediante ultrasonidos en presencia de 0,3% v/v de Tritón X-100 inmediatamente después de la cosecha. Se determinó la actividad de GUS del extracto soluble en un ensayo fluorométrico usando el sustrato 4-metil-umbeliferil-\beta-D-glucurónido (MUG) (Jefferson et al., 1987). La fluorescencia se midió usando un espectrofotómetro Labsystem Fluoroskan II.

La expresión de GUS en tejidos transgénicos intactos se detectó mediante tinción histoquímica en ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-glucurónico (X-gluc) (Jefferson et al., 1987), y mediante ensayo fluorométrico del extracto soluble usando MUG.

Ejemplo 7 Secuencia de la región no codificante de SCSV

Se determinaron las secuencias completas de los 7 círculos conocidos de ADN de SCSV (Fig. 6). Cada ADN contiene una región no codificante con señales (cajas TATA) para la actividad promotora (Tabla 2). Estas secuencias no se han descrito o aislado antes. La comparación de las secuencias de las regiones no codificantes que comprenden estos promotores mostró que los segmentos 3 y 5 son muy similares, compartiendo 258 nucleótidos conservados de una media de 491 nucleótidos en las regiones no codificantes de los ADN. Las secuencias 3, 4, 5 y 7 contenían 170 bases conservadas entre ellas, mientras que sólo se conservaron 152 bases entre los segmentos 1, 3, 4, 5 y 7. Las variaciones de secuencias en las regiones no codificantes de los ADN de SCSV sugieren que la transcripción y replicación de los diferentes genes de SCSV pueden estar reguladas diferentemente.

Ejemplo 8 Actividad transitoria de promotores de SCSV en protoplastos

Se han demostrado directamente las actividades promotoras de dos regiones no codificantes de ADN de SCSV mediante expresión transitoria de GUS usando constructos de fusión de promotor de SCSV:GUS en protoplastos de trébol subterráneo (Tabla 3) y del tabaco (Tabla 4). Estos resultados mostraron que los promotores de ambos segmentos 5 y segmento 7 son funcionales en ausencia de otros componentes de ADN de SCSV. Los promotores de SCSV también son funcionales en protoplastos tanto de un hospedante natural (trébol subterráneo) como de un no hospedante (tabaco). En protoplastos del tabaco, el promotor del segmento 7 fue similar en actividad al promotor 35S, mientras que el promotor del segmento 5 (proteína de revestimiento) mostró consistentemente actividad alrededor de la mitad que la del promotor 35S de CaMV (Tabla 4). Sin embargo, la actividad de ambos promotores fue mayor en protoplastos de trébol subterráneo, mostrando la actividad del promotor del segmento 7 hasta varias veces la del promotor 35S (Tabla 3), sugiriendo que los promotores de SCSV funcionan mejor en ciertas leguminosas que el promotor 35S ampliamente usado. La actividad del promotor del segmento 7 también pareció ser más variable en protoplastos de trébol subterráneo que los otros ensayados.

También se construyeron (Fig. 4) plásmidos que contienen diversos derivados de eliminación de la secuencia no codificante de los segmentos 5 y 7 fusionados a GUS, y se electroporaron en protoplastos (Tabla 5). Los ensayos de GUS de protoplastos transfectados por estos constructos mostraron que ni el bucle del tallo ni la región común fueron necesarios para promover la actividad, aunque esta última se necesitó para la actividad completa (Tabla 5). La secuencia de ADN requerida para la actividad promotora de alto nivel parece ser menor que 300 pb que es más pequeña que la requerida para otros promotores, tales como el promotor 35S (Odell et al., 1985).

Ejemplo 9 Transactivación de la actividad del promotor de SCSV mediante el producto génico del segmento 2 de SCSV

Cuando se coelectroporaron con un constructo de promotor 35S:gen RAP seg 2, las actividades de GUS accionadas por el promotor seg 5 aumentaron aparentemente en alrededor de 2 veces tanto en protoplastos de trébol subterráneo como de tabaco (Tabla 6). La actividad del promotor del segmento 7 también se puede incrementar cuando se coelectropora con el constructo 35S:seg 2 RAP, pero son necesarios experimentos adicionales para confirmar esto.

También se observó aparentemente la transactivación de la actividad de GUS cuando el constructo S5nc:GUS se coelectroporó con un plásmido de vector binario (pBS2) que contiene una pareja repetida (dímero) del ADN de segmento 2 (Tabla 6). En la Figura 22 se muestra un mapa del constructo dimérico del segmento 2 de SCSV-pBS2. Este constructo se creó clonando una pareja repetida del ADN del segmento 2 de SCSV (que contiene una unidad de transcripción seg 2 completa funcional) en el sitio del poliligador de pGEM7 que entonces se clonó en una versión reducida del vector binario pMCP3 (Khan et al., 1994). Los resultados sugieren que ambos promotores de SCSV se expresaron concurrentemente. De este modo, se pueden usar diferentes promotores de SCSV en combinación con un promotor de 35S, o se pueden usar simultáneamente para facilitar la expresión concurrente de múltiples transgenes en las plantas. Por el contrario, se ha observado actividad transgénica reducida cuando se usa el promotor 35S en transgenes de múltiples copias o múltiples transgenes (Linn et al., 1990; Matzke y Matzke, 1991; Scheid et al., 1991; Carvalho et al., 1992).

Ejemplo 10 Actividad de los promotores de SCSV en plantas transgénicas

Se ha encontrado que todos los promotores de SCSV, excepto aquellos de los segmentos 2 y 6, son capaces de accionar la expresión de transgenes en plantas de tabaco (Fig. 7). El nivel de actividad de los promotores medido por el ensayo de MUG varió de una planta a otra, y de un promotor a otro, pero generalmente es menor que el del promotor 35S (Tabla 7).

La tinción histoquímica de tejidos de tabaco transgénicos intactos mostró que la actividad del promotor S4nc parece ser constitutiva, y se detectó actividad de GUS en todos los órganos de la planta. Los otros se restringen generalmente a los tejidos vasculares, aunque también se detectó expresión en el polen.

En plantas de trébol subterráneo transgénicas que expresan el constructo génico S7nc:GUS, la tinción histoquímica mostró que la actividad GUS se encuentra en las hojas, tallos y pecíolos. La distribución de la actividad GUS es principalmente constitutiva, aunque en algunos tejidos la actividad se encuentra con mucho en los tejidos vasculares (Figura 7). En estas plantas, el nivel de actividad del promotor también varía de una planta a otra, pero la actividad es generalmente comparable a la del promotor 35S.

Estos resultados indican que los promotores de SCSV proporcionan una elección de promotores que se puede usar independiente o simultáneamente para controlar la expresión de uno o más genes extraños en una amplia variedad de plantas y tipos de tejidos. Las leguminosas son una diana importantísima de aplicación. La actividad de estos promotores también se puede potenciar por la presencia del producto génico seg 2. De este modo, parece que estos promotores tienen ventajas significativas con respecto al promotor 35S de CaMV, tanto en los niveles de expresión, tamaño y en la superación de algunas características negativas del promotor 35S. Serían aplicables en una amplia variedad de aplicaciones transgénicas.

TABLA 1 Propiedades de los virus de plantas con ADNss circulares pequeños y con múltiples encapsidamientos (circovirus de plantas)

1

2

Compilado de los datos presentados en el Sexto Congreso Internacional de Patología de Plantas, Montreal, Julio de 1993. FBNYV = virus de amarillamiento necrótico de la haba, MDV = virus de enanismo de arveja lechosa, SCSV = virus de la atrofia del trébol subterráneo, BBTV = virus del copo racimoso del banano, CFDV = virus de la caída foliar del cocotero.

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

3

TABLA 3 Promotor de SCSV dirigido a la actividad de GUS en protoplastos de trébol subterráneo

4

Todos los experimentos se realizaron usando muestras duplicadas por tratamiento. La actividad GUS se midió usando un espectrofotómetro Labsystem Fluoroskan II, y se presenta tanto en actividad absoluta (Act) como un porcentaje de la actividad de 35S:GUS (% de 35S).

Los constructos se representan como "promotor:gen informador". Por ejemplo, "35S:GUS" es el promotor 35S y el gen informador GUS. "S5nc" y "S7nc" son los promotores de los segmentos 5 y 7, respectivamente, de SCSV.

TABLA 4 Promotor de SCSV dirigido a actividad GUS en protoplastos de tabaco

5

Todos los experimentos se realizaron usando muestras duplicadas por tratamiento. La actividad GUS se midió usando un espectrofotómetro Labsystem Fluoroskan II, y se presenta tanto en actividad absoluta (Act) como un porcentaje de la actividad de 35S:GUS (% de 35S).

\newpage

TABLA 5 Actividades del promotor (niveles de expresión de GUS) de derivados de eliminación de regiones no codificantes de los segmentos 5 y 7 en protoplastos

Los niveles se expresan como porcentajes de la actividad de la secuencia no codificante de longitud completa respectiva.

6

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 6 Transactivación de la actividad del promotor de segmento 5 (expresión de GUS) en protoplastos de tabaco y de trébol subterráneo mediante el producto génico de segmento 2

7

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 7 Actividad relativa de GUS en extractos de hojas de plantas de tabaco transgénicas independientes que contienen diferentes constructos de promotor:GUS, según se determina mediante ensayos fluorométricos^{a}

8

Ejemplo 11 Caracterización adicional de las actividades del promotor de SCSV en plantas transgénicas

Se estudiaron plantas transgénicas de tabaco transformadas con los cinco casetes de fusión del promotor de SCSV (Segmentos 1, 3, 4, 5 y 7):GUS para determinar la actividad de GUS tanto en los ensayos histoquímicos (Figs. 8 y 9) como fluorométricos (Fig. 10). Las muestras tomadas de plantas que se hicieron crecer en material de vidrio joven y de tejido cultivado produjeron el mismo patrón de expresión de GUS. La actividad de GUS se observó en todas las partes de la planta, incluyendo raíces, tallos, hojas, pecíolos, y todas las partes de la flor. El constructo del promotor 5 dio una expresión de GUS relativamente menor en el polen que otros promotores. Los resultados de los ensayos fluorométricos confirmaron los datos previos mostrando que el promotor del segmento 4 fue el mayor expresor, con una actividad 10 veces o más mayor que la del resto (Fig. 10), pero aún es menor que la del promotor 35S. Los niveles de expresión de los promotores de segmento 1, 3, 5 y 7 fueron comparables a los del promotor rolC específico de floema en tabaco (Schmulling et al., 1989; Sugaya et al., 1989). Las plantas transformadas con el constructo GUS sin promotor no expresaron GUS por ninguno de los métodos de ensayo. Los ensayos histoquímicos mostraron que la expresión de todos los constructos del promotor fue la mayor en tejidos vasculares, siendo los mayores expresores más constitutivos que los expresores menores que están más limitados vascularmente (Fig. 8). En general, los constructos de los promotores 1, 3, 5 y 7 se expresan mayormente en los tejidos vasculares. En particular, la expresión de GUS por los constructos del promotor 1 y 3 están restringidos principalmente a tejidos de floema. Sin embargo, para todos los promotores, la tinción histoquímica de las hojas mostró que la expresión de GUS en estos tejidos a menudo está enrojecida (constitutiva y limitada vascularmente), y es variable entre las hojas de la misma planta. La microscopía del campo oscuro (Jacobsen-Lyon et al., 1995) también mostró que ninguno estará estrictamente limitado de forma vascular (Fig. 9).

Se caracterizaron además veinte plantas transgénicas de trébol subterráneo que expresan el gen del promotor del seg 7:GUS mediante ensayos histoquímicos (Tabla 9). Estos ensayos mostraron que la actividad de GUS se observaron en todas las partes de la planta, incluyendo las raíces, tallos, hojas y pecíolos. La expresión de GUS fue la mayor en los tejidos vasculares, siendo algunas hojas más constitutivas y enrojecidas que otros órganos, y siendo las plantas que expresan GUS de forma elevada más constitutivas que las que expresan de forma escasa. Las muestras tomadas a partir de plantas que se hicieron crecer en material de vidrio y de tejido cultivado produjeron el mismo patrón de expresión de GUS.

Ejemplo 12 Detección de la actividad de promotor en ADN de segmento 2 del SCSV

Los experimentos mostraron que las regiones no codificantes procedentes de los ADN de segmento 2 y 6 de SCSV fueron incapaces de llevar a cabo la expresión del gen GUS en tabaco transgénico. Estas regiones tienen una longitud de 179 y 159 nucleótidos, respectivamente, y es probable que se requieran secuencias adicionales para la actividad del promotor. Para estudiar esta hipótesis, se construyó una nueva secuencia del promotor de segmento 2 que consta del fragmento de ADN procedente de los nucleótidos 526 a 46, y se fusionó al vector pKGO de GUS sin promotor (Fig. 11). El constructo de fusión se electroporó en protoplastos de tabaco. Se detectó actividad de GUS en protoplastos de tabaco electroporado a niveles similares a los del constructo del promotor de segmento 5:GUS (Tabla 10).

También se transformó en plantas de tabaco, como se describe en el Ejemplo 4, un vector binario que contiene el ADN de fusión del promotor SRnc:GUS. La tinción histoquímica de varias plantas de tabaco transformadas mostró que la expresión de GUS fue principalmente vascular. Estos resultados mostraron que la secuencia adicional procedente de la región codificante de ADN de segmento de 2 de SCSV es necesaria para la función del promotor. Puesto que el segmento 6 de SCSV es una variante del segmento 2, es de esperar que un constructo similar, que comprende la región no codificante y parte de la región codificante de este ADN, producirá un promotor activo. De este modo, es de esperar que todos los promotores de SCSV sean adecuados para accionar la expresión génica en plantas.

Ejemplo 13 Potenciación de la expresión génica mediante señales de terminación y de poliadenilación de la transcripción de SCSV

La expresión génica eficaz requiere no sólo un promotor, sino también secuencias nucleotídicas específicas en el extremo 3' de la región codificante del gen, conocidos como las señales de terminación y de poliadenilación (Messing et al., 1983; Joshi 1987b; Gil y Proudfoot, 1984; Rothnie et al., 1994). Estas secuencias especiales se requieren para señalar al ARN polimerasa para que detenga la transcripción, y para permitir el procesamiento posterior del transcripto de ARN. La actividad de las señales de terminación y de poliadenilación puede afectar a la eficacia de la transcripción y a la estabilidad del ARN que se transcribe. Algunas secuencias de terminación/poliadenilación ampliamente usadas incluyen aquellas procedentes de los genes NOS (Depicker et al., 1982), OCS (Janssen y Gardner, 1989) y 35S de CaMV (Pietrzak et al., 1986).

Cada uno de los segmentos (o componentes) de ADN de SCSV contenía una secuencia terminadora que comprende una secuencia de señal de terminación y poliadenilación en la región no codificante (Tabla 11; Figura 2). Para demostrar la actividad de las señales de terminación/poliadenilación en ADN de SCSV, se construyeron vectores de expresión de GUS que contienen la señal de poliadenilación y de terminación del segmento 3 o del segmento 5 (Fig. 12), y se sometieron a expresión transitoria y protoplastos de tabaco. La secuencia terminadora respectiva se amplificó mediante PCR con varios sitios de restricción incorporados en los cebadores (Fig. 12). Los fragmentos terminadores amplificados se cortaron con las enzimas de restricción indicadas, y se clonaron en el plásmido recombinante pKGO que contiene tanto los constructos del promotor S1nc o S4nc:GUS:OCS3', a partir de los cuales se ha borrado la secuencia OCS3' (Fig. 12). Los constructos resultantes S1nc:GUS:SC3Tr (el promotor del segmento 1 aquí tiene una eliminación del fragmento HindIII de nucleótidos 641-782 que no tiene efecto sobre la actividad de GUS) y S4nc:GUS:S5Tr se electroporaron en protoplastos de tabaco, y se analizaron para determinar la actividad de GUS. Los resultados mostraron que la actividad de GUS aumentó 2 a 3 veces cuando se usó la secuencia de terminación/poliadenilación de SCSV en lugar de la secuencia de terminción/poliadenilación de OCS habitualmente usada, en el mismo constructo (Tabla 12). En el mismo experimento, el constructo S1nc:GUS:S3Tr produjo una actividad aproximadamente dos veces mayor que el constructo 35S:GUS:OCS3' (Tabla 12). Estos resultados indican que cada uno de los componentes de ADN de SCSV contiene una secuencia de señal de terminación y de poliadenilación diferente que se puede usar en diversas combinaciones con los promotores de SCSV para regular y/o potenciar la expresión de genes foráneos en plantas. Al igual que con la secuencia de SCSV, las secuencias de terminación/poliadenilación de SCSV son ventajosas con respecto a las secuencias de terminación/poliadenilación actualmente disponibles por sus tamaños pequeños (160-170 nucleótidos) y la disponibilidad de un amplio intervalo de reguladores de la transcripción con potencias diferentes y especificidades de tejidos para la manipulación genética. Los resultados también muestran que el uso de un promotor de SCSV, en combinación con una secuencia terminadora de SCSV, da mayores niveles de expresión génicas que los constructos que usan el promotor 35S en combinación con una de las secuencias terminadoras de la transcripción habituales.

Ejemplo 14 Actividad de los promotores de SCSV en plantas de patata transgénicas

Se usó un vector binario pGA470, que contiene el constructo de fusión S4nc:GUS:NOS clonado en pHW9 (Figura 3), para transformar plantas de patata. El pHW9 deriva de pHW8 (Dolferus et al., 1994) en el cual se inserta el poliligador de pGEM3zf(+). El vector binario recombinante se transformó en la cepa LBA4404 de Agrobacterium tumefaciens por electroporación (Nagel et al., 1990). Se transformaron variedades cultivadas de patata Atlantic y Sebago, y se regeneraron esencialmente como se describe por Wenzler et al. (1989) excepto por las siguientes modificaciones. Se usaron trozos de tallo en lugar de trozos de hoja para la transformación, y se usaron 10 mg/l de bencilaminopurina (BAP) en lugar de 2,24 mg/l durante el cocultivo. Después del cocultivo, el medio de la etapa 1 se suplementó con 100 mg/l de cefotaxima y nada de canamicina o carbenicilina. El medio de la etapa II contenía 2 mg/l de BAP, 5 mg/l de GA3, 100 mg/l de canamicina y 100 mg/l de cefotaxima.

Se transfirieron seis plantas transformadas, que comprenden 5 variedades cultivadas Atlantic y una variedad cultivada de Sebago, y se hicieron crecer en un invernadero durante 10-11 semanas hasta que se formaron pequeños tubérculos. Se estudiaron tejidos procedentes de diferentes partes de las plantas, mediante tinción GUS histoquímica. Los resultados mostraron que GUS se expresó de forma elevada en todas las partes de las plantas, incluyendo raíces, estolones, tubérculos, tallos y hojas, pero la expresión fue predominantemente vascular, incluyendo los elementos de floema y algunos elementos de xilema (Fig. 13). Al igual que en otros hospedantes transgénicos, la expresión de GUS en tejidos nos vasculares de materiales vegetales muy activos para GUS, especialmente tubérculos jóvenes, son más evidentes que en tejidos menos activos cuando se compara con plantas transformadas con el constructos 35S:GUS:NOS, y la expresión de GUS dirigida por el promotor SCSV en tubérculos fue al menos tan elevada como la del constructo 35S:GUS.

Ejemplo 15 Actividad del promotor de segmento 7 de SCSV en plantas de algodón transgénicas

Se usó el vector binario pGA470, que contiene el constructo de fusión S7nc:GUS:NOS clonado en pHW9, para transformar plantas de algodón. El vector binario recombinante se transformó en la cepa AGL1 de Agrobacterium tumefaciens, mediante emparejamientos triparentales. Se transformó la variedad cultivada coker 315 de algodón (Gossypium hirsutum), y se regeneró como se describe por Cousins et al. (1991).

Las plantas transformadas se hicieron crecer en un invernadero, y se analizaron tejidos de hojas procedentes de 18 plantas transgénicas independientes para determinar la actividad de GUS mediante tinción histoquímica. La actividad de GUS varió entre plantas. Cinco de estas plantas mostraron una fuerte expresión de GUS, en un intervalo similar a la expresión de GUS accionada por el promotor 35S, y fue predominantemente en los tejidos vasculares (Fig. 14). La actividad de GUS fue especialmente fuerte en glándulas llenas de gosipol. Al igual que en otros hospedantes transgénicos, la tinción de GUS en tejidos altamente expresados también era constitutiva.

Entonces se tiñeron una variedad de tejidos procedentes de estas plantas, y se observó la expresión vascular en todos los órganos, incluyendo raíces, tallos, pecíolos, pétalos y otras partes florales vascularizadas. La expresión parece ser particularmente elevada en capullos de flores jóvenes. Se realizaron los plantones de una de las líneas para determinar la actividad de GUS. Todas las 10 progéneres se tiñeron fuertemente en raíces y hojas, indicando que el gen que se heredó y que la línea probablemente contenía más de un sitio de inserción independiente.

Ejemplo 16 Estabilidad del cassete de expresión del promotor SCSV:GUS transformado en plantas transgénicas

Se caracterizó adicionalmente la estabilidad de la expresión de GUS accionada por los diversos promotores de SCSV en tabaco y trébol subterráneo transgénicos, en plantones de generación T1 de plantas de trébol subterráneo y de tabaco.

En el tabaco, los plantones T1 procedentes de 10 líneas transgénicas independientes se estudiaron mediante tinción histoquímica. Los resultados mostrados de la expresión del gen GUS accionado por los cinco promotores (segmentos 1, 3, 4, 5 y 7) fue estable en los plantones T1, manteniéndose el patrón de expresión en todos los casos entre los tejidos de plantas T0 y T1 de la misma edad. En tallos muy jóvenes, en los que los tejidos vasculares no están bien diferenciados, la expresión de todos los otros promotores fue muy elevada, y se detectó en todos los tejidos de los tallos. Con la edad aparece una limitación gradual vascular, y con el aumento de la diferenciación de los haces vasculares. Al igual que con las plantas T0, la expresión de GUS mediada por el promotor de segmento 4 fue más constitutiva que las otras.

Se estudiaron cincuenta plantones T1 de 2-3 meses, procedentes de 15 plantas de trébol subterráneo transgénicas independientes, que expresan el constructo de fusión S7nc:GUS, para determinar la actividad de GUS mediante ensayos histoquímicos y fluorométricos. Los resultados mostraron que la expresión del ges GUS accionada por el promotor de segmento 7 fue estable en plantones T1, manteniéndose el patrón de expresión entre tejidos de plantas T0 y T1 de la misma edad. Se encontró que la expresión de GUS generalmente se segrega a la relación esperada de 3:1. Los resultados preliminares de los ensayos fluorométricos confirmaron los datos histoquímicos, sugiriendo que el constructo del promotor de segmento 7 tuvo una actividad de GUS en cierto modo menor que la del promotor 35S en hojas y pecíolos (Tabla 13). Sin embargo, la actividad de GUS en tallos de trébol subterráneo fue 3 veces mayor que en pecíolos, y 6 veces mayor que en hojas (Tabla 14). La edad de las plantas en el momento del ensayo fue de 2 a 3 meses.

Ejemplo 17 Actividad transitoria del promotor de SCSV en hojas de haba de soja

El constructo de promotor SCSV:GUS usado (Tabla 15) derivó del plásmido pKGO de GUS sin promotor (Figura 4; pJKKmf(-) K1W1 GUS:OCS) descrito previamente, mientras que el constructo del promotor 35S:GUS fue pGUS. El pGUS deriva de la clonación del gen Gus a partir de pKIWI101 en el vector de expresión pDH51 de plantas (Pietrzak et al., 1986).

Para la expresión transitoria de GUS en tejidos de haba de soja, los constructos de GUS se introdujeron en tejidos mediante bombardeo de partículas usando el sistema de suministro de partículas Bio-Rad Biolistic PDS-1000/He, como antes. Se disparó 50 \mul de suspensión que contiene 3 mg de una relación 1:1 de 1 y 5 \mu partículas de oro más 6 \mug de ADN sobre placas que contienen 3 hojas cada una. Las hojas completamente extendidas en estos experimentos se prepararon a partir de plantas de haba de soja de 24 días, variedad Wayne. Después del bombardeo de partículas, se analizó la actividad de GUS 24 horas después mediante infiltración a vacío de las hojas con X-Gluc (Craig, 1992).

Los resultados (Tabla 15) mostraron que, en la expresión transitoria en hojas de haba de soja, el promotor de segmento 4 de SCSV fue más activo (25-35 manchas/hojas) que el promotor 35S (10-15 manchas/hoja) cuando se dispararon los plásmidos respectivos en hojas de haba de soja.

Ejemplo 18 Ensayo de promotores de SCSV para la expresión específica de callos

Las siete secuencias no codificantes de SCSV se clonaron en el vector pHW9 de GUS sin promotor. Los vectores binarios que contienen cada uno uno de los siete constructos de fusión del promotor de SCSV:GUS se transformaron en tejidos de tabaco mediante transferencia de genes mediada por Agrobacterium. A las 2-3 semanas después de la transformación, los callos que contienen primordios de brotes transformados se sometieron a tinción histoquímica de GUS. Se observó la mejor expresión en callos transformados con el segmento 1 seguido de los constructos S4nc:GUS:OCS. Este resultado sugiere que el promotor de segmento 1 es el más adecuado para la expresión del gen marcador seleccionable, y que el promotor de segmento 4 es el mejor para la expresión génica.

Ejemplo 19 Caracterización de las secuencias reguladoras del gen MeA de Flaveria bidentis

En Flaveria bidentis (Chitty et al., 1994), el gen MeA es el gen que codifica la enzima NADP-málica adaptada para la fotosíntesis de C4. La estructura y las secuencias putativas del promotor y de señal de terminación/poliadenilación de la transcripción de este gen se ha aislado, y se ha determinado la secuencia terminadora (Fig. 15). Las actividades potenciales del elemento promotor putativo (secuencias MeA 5' [Mea 5'] y las secuencias terminadoras MeA 3' [MeA 3']) del gen MeA F. bidentis se estudiaron en plantas transgénicas de F. bidentis usando vectores de expresión de GUS (Fig. 16). En estos experimentos se usó una región larga de la secuencia terminadora de MeA 3' (MeA 3'L = 5,5 kb a partir de codón stop). En la Fig 16, el cassette de expresión de GUS ME 20 se ligó al vector binario pGA470 (An et al., 1985), mientras que el ME29 se clona en pGA482 (An, 1986). Las plantas se transformaron con estos vectores como se describe por Chitty et al. (1994).

El estudio de la actividad de GUS de las plantas transformadas mediante tinción histoquímica y ensayos fluorométricos mostró que la secuencia MeA 3' del gen es necesaria para un nivel elevado de expresión de GUS en hojas de plantas de F. bidentis transgénicas (Tabla 16). Las secuencias 5' del gen no parece que contribuyan a la expresión génica en las hojas, pero parece que dirigen la expresión en meristemos y tallos en presencia de una secuencia adecuada de señal de terminación/poliadenilación de la transcripción, tal como la OCS 3' (Tabla 16).

Ejemplo 20 Uso de las secuencias señales de terminación/poliadenilación de MeA 3' en constructos del promotor de SCSV para aumentar la expresión génica en plantas monocotiledóneas

Debido a que la mayoría de los elementos de control génico están localizados en el extremo 5', la actividad de la secuencia de MeA 3' se ensayó en combinación con el promotor de SCSV S4nc con vista a aumentar la expresión génica dirigida por los promotores de SCSV. Para estos experimentos, se usó una región corta de la secuencia terminadora de MeA 3' (MeA 3'S; 900 bases a partir del codón stop), para preparar vectores de expresión de GUS que contienen el promotor de S4nc con la secuencia de señal de terminación/poliadenilación de la transcripción de OCS 3', del segmento 5' de SCSV 3' (SC5Tr) o de MeA 3'. Estos constructos derivaron del plásmido pKGO de GUS sin promotor descrito anteriormente, y el plásmido recombinante pBS237, que contiene el constructo S4nc:GUS:MeA3', se presenta en la Fig. 17. La actividad de GUS conferida por estos constructos se ensayó en callos de arroz japonés variedad Taipei 309. Los constructos se introdujeron en los callos de arroz mediante bombardeo de partículas, usando el sistema de suministro de partículas Bio-Rad Biolistic PDS-1000/He (Bio-Rad Laboratories), y se comparó con los resultados obtenidos en tejidos de dicotiledóneas tales como hojas de haba de soja y protoplastos de tabaco (Tabla 17). Para los experimentos de bombardeo con partículas del arroz, se dispararon 4 mg de una relación 1:1 de partículas de oro de 1 y 5 micrómetros más 5 \mug de ADN en un total de 50 \mul sobre seis placas de callo. El ADN estaba formado con una relación molar 4:1 de cada uno de los vectores que contiene el gen GUS al vector que contiene el gen marcador seleccionable. El vector que contiene el marcador seleccionable fue pTRA151 (Zheng et al., 1991). Cada placa contenía 50-100 callos secundarios recientes derivados de embriones maduros. cuarenta horas después del bombardeo de ADN, se detectó la actividad de GUS colocando los callos en una disolución de X-Gluc al 0,3% p/v en 100 mM de tampón de fosfato. Se contaron las manchas azules después de la incubación toda la noche.

Para la expresión transitoria de GUS en tabaco y haba de soja, sólo se introdujeron los constructos de GUS en protoplastos y tejidos de hojas, respectivamente. Después de la electroporación, los protoplastos de tabaco se analizaron para determinar la actividad de GUS como se describió previamente. Los constructos se introdujeron en tejidos de haba de soja mediante bombardeo de partículas como se describe anteriormente.

Los resultados mostraron que en los tejidos de arroz monocotiledóneas, se obtenía una actividad 16 veces mayor que el constructo de MeA 3' comparada con el terminador de SCSV (Tabla 17). En experimentos similares, un constructo de GUS altamente expresado, que contiene el cassette promotor:GUS:NOS de ubiquitina (Christensen et al., 1992), tiene una actividad alrededor de 4 veces mayor que la del constructo SC4:GUS:MeA3'.

En los tejidos dicotiledóneos, se obtuvieron actividades similares con ambos de estos constructos en protoplastos de tabaco y en hojas de haba de soja. Sin embargo, ambos tenían una actividad 2 veces mayor que la obtenida con el terminador de OCS en protoplastos de tabaco (Tabla 17).

Estos resultados sugieren que la secuencia de MeA3' se puede usar para permitir la expresión génica dirigida por promotores de SCSV en monocotiledóneas.

Ejemplo 21 Uso de nuevos vectores que contienen los promotores de SCSV y terminadores para accionar un gen marcador seleccionable en plantas transgénicas

Se analizó en plantas de tabaco la idoneidad del uso de los promotores de SCSV para accionar un gen marcador seleccionable como base para seleccionar plantas transgénicas después de la transformación y regeneración. El marcador seleccionable usado es el gen de resistencia a canamicina, nptII. Se construyeron vectores binarios, que contienen un segmento 1 de SCSV (pBS246) (Fig. 18) o un promotor de segmento 7 de SCSV (pKHAN4) (Fig. 19) fusionado al gen de nptII, a partir del pART27 (Gleave, 1992) y pKSB.bar1 (Figura 19), respectivamente. Estos se transformaron separadamente en plantas de tabaco (Ellis et al., 1987), y las plantas transgénicas putativas se seleccionaron en selección de canamicina usando 100 \mug/ml de canamicina (Fig. 20). La resistencia a canamicina se confirmó en plantas transgénicas mediante ensayo de transferencia de mancha para la actividad del gen nptII (McDonnell et al., 1987) y la supervivencia de las plantas transgénicas en 100 \mug/ml de canamicina en un medio formador de raíces. Los resultados mostraron que el constructo del promotor de segmento de SCSV produjo al menos tantas plantas resistentes a canamicina como el constructo del promotor 35S usado en el mismo experimento, y por lo tanto es tan eficaz como el promotor 35S para selecciona plantas de tabaco transgénicas basadas en la resistencia a canamicina (Tabla 18). El tabaco transformado con pKHAN4 es resistente a 100 \mug/ml de canamicina en el medio de regeneración, y 50 \mug/ml de canamicina en el medio formador de raíces. En la Figura 19 se muestran los mapas de restricción de pKSB.barl y pKHAN2 usados para producir pKHAN4.

Ejemplo 22 Desarrollo de un nuevo sistema de vector de expresión génico vegetal

Se ha construido un nuevo vector de expresión, que comprende un promotor de segmento 4 de SCSV y un terminador de segmento 5 de SCSV que accionan cualquier gen útil de interés (pICAN 1) (Fig. 21), a partir del derivado de pGEM, y el cassette de expresión resultante se puede insertar en los vectores binarios pBS246 y pKHAN4. Los vectores binarios resultantes se pueden usar entonces para transformar plantas de importancia económica, especialmente algodón, trébol subterráneo, patata y trébol blanco, bajo selección de canamicina. Se pueden construir otros vectores binarios a partir de diferentes combinaciones de promotores y terminadores de SCSV para producir un intervalo completo de sistemas de vectores binarios para la expresión génica de plantas.

9

TABLA 9 Actividad de GUS del constructo del promotor de segmento 7 de SCSV:GUS en plantas de trébol subterráneo transgénicas primarias (To)

10

Las plantas se analizaron dos meses después de transferir a las plantas al invernadero desde el cultivo de tejidos. Se determinó la resistencia a basta (fosfinotricina - [PPT]) pintando basta a 1 gm de PPT/litro sobre hojas jóvenes totalmente sin doblar, y la reacción se analizó después de una semana.

R	sin daño;
MR	daño moderado a la hoja;
S	muerte de la hoja;
N.d.	no determinada

TABLA 10 Actividad de GUS en protoplastos de tabaco dirigida por el promotor de segmento 2 de SCSV a protoplastos de tabaco, con relación al promotor 35S

11

TABLA 11 Señales de poliadenilación y de terminación putativas en componentes de ADN de SCSV

12

13

TABLA 13 Ensayo fluorométrico de GUS de generación T1 independiente de plantas de trébol subterráneo transgénicas que expresan el constructo S7nc:GUS o el 35S:GUS

14

Las plantas tenían 2-3 meses cuando se ensayaron.

Los resultados muestran la expresión diferencial en diferentes tejidos.

TABLA 14 Distribución de la actividad de GUS en una planta de trébol subterráneo transgénica de generación T1, que expresa el constructo S7nc:GUS

15

Las plantas tenían 2-3 meses cuando se ensayaron.

Los resultados muestran la expresión diferencial en diferentes tejidos.

TABLA 15 Expresión transitoria de Gus en hojas de haba de soja dirigida por un promotor de SCSV

16

TABLA 16 Caracterización de la actividad de GUS dirigida por la secuencia MeA 3'L (versión de 5,5kb) en plantas transgénicas de Flaveria bidentis

17

TABLA 17 Expresión transitoria de GUS en callo de arroz, hojas de haba de soja y protoplastos de tabaco que muestra el aumento de la actividad del promotor de SCSV mediante las secuencias MeA 3' en callo de arroz

18

19

20

Bibliografía

An, G. (1986). Development of plant promoter expression vectors and their use for analysis of differential activity of nopaline synthase promoter in transformed cells. Plant Physiol. 81, 86-91.

An, G., Watson, B.D., Stachel, S., Gordon, M.P. and Nester, E.W. (1985). New cloning vehicles for transformation of higher plants. EMBO J. 4, 277-284.

Benfey, P.N. and Chua, N.-H. (1990). The cauliflower mosaic virus 35S promoter: combinatorial regulation of transcription in plants. Science 250, 959-966.

Burns, T.M., Harding, R.M., Hafner, G., Beetham, P. and Dale, J.L. (1993). Single-stranded DNA genome organisation of banana bunchy top virus. IXth International Congress of Virology, Glasgow, Abstract W62-8.

Chitty, J.A., Burbank, R.T., Marchall, J.S., Chen, Z. and Taylor, W.C., Genetic Transformation of the C^{4} Plant, Flaveria bidentis, The Plant Journal 6: 949-956, 1994.

Chu, P., Boevink, P., Surin, B., Larkin, P., Keese, P and Waterhouse, P. (1994). Non-germinated single stranded DNA plant viruses. In "Pathogenesis and host-parasite specificity in plant diseases: Vol III. Viruses and Viroids". Pergamon Press.

Chu, P.W.G. and Helms, K. (1988). Novel virus-like particles containing circular single-stranded DNA associated with subterranean clover stunt disease. Virology 167, 38-49.

Chu, P.W.G., Keese, P., Qiu, B.S., Waterhouse, P.M. and Gerlach, W.L. (1993a). Putative full-length clones of the genomic DNA segments of subterranean clover stunt virus and identification of the segment coding for the viral coat protein. Virus Research 27, 161-171.

Chu, P.W.G., Qiu, B.S., Li., Z-y and Larkin, P. (1993b). Replication of subterranean clover stunt virus in pea and subterranean clover protoplasts. Virus Research 27, 173-183.

Christensen, A.H., Sharrock, R.A. and Quail, P.H. (1992). Maize polyubiquitin genes: structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promoter activity following transfer to protoplasts by electroporation. Plant Mol. Biol. 18, 675-689.

Cousin, Y,L., Lyons, B.R. and Llewellyn, D.J. (1991). Transformation of an Australian cotton cultivar: prospects for cotton improvement through genetic engineering. Aus. J. PI. Physiol. 18, 481-494.

Craig, S., (1992) The GUS Reporter Gene - Application to light and transmission electron microscopy. In GUS protocols: using the GUS gene as a reporter of gene expression. S.R. Gallagher, Ed. Academic Press, Inc., Page 115.

Das, A. (1993). Control of transcription termination by RNA-binding proteins. Ann. Rev. Biochem. 62, 893-930.

de Carvalho, F., Gheysen, G., Kushnir, S., Van Montagu, M., Inze, D. and Castresana, C. (1992). Suppression of \beta-1,3-glucanase transgene expression in homozygous plants. The EMBO J. 11, 2595-2602.

Depicker, A., Satchel, S., Dhaese, P., Zambryski, P. and Goodman, H. (1982). Nopaline synthase:transcript mapping and DNA sequence. J.Mol. Appl. Genet. 1, 561-575.

Del Sal, G., Manfioletti, G. and Schnider, C. (1989). The CTAB-DNA precipitation method: a common mini-scale preparation of template DNA from pagemids, phages or plasmids suitable for sequencing. Biotechniques 7, 514-518.

Devereaux, J., Haeberli, P. and Smithies, O. (1984). A comprehensive set of sequence analysis programs for the VAX. Nucleic acids Res. 12, 387-395.

Ditta, G., Stanfield, S., Corbin, D. and Helsinki, D.R. (1980). Broad host range DNA cloning system for gram-negative bacteria: construction of a gene bank of Rhizobium meliloti. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 7347-7351.

Dolferus, R., Jacobs, M., Peacock, J.W., and Dennis, L.S. (1994). Differential interactions of promoter elements in stress responses of the Arabidopsis Adh Gene. Plant Physiol. 105, 1075-1087.

Ellis, J.G., Llewellyn, D.J., Dennis, E.S. and Peacock, W.J. (1987). Maize Adh-1 promoter sequences control anaerobic regulation: addition of upstream promoter elements from constitutive genes is necessary for expression in tobacco. EMBO J. 6, 11-16.

Gil, A. and Proudfoot, N.J. (1984). Nature 312, 473-474.

Gil, A. and Proudfoot, N.J. (1984). A sequence downstream of AAUAAA is required for rabbit \beta-globin mRNA 3'-end formation.

Gleave, A. P. (1992). A versatile binary vector system with a T-DNA organisational structure conducive to efficient integration of cloned DNA into the plant genome. Plant Molecular Biology 20, 1203-1207.

Harding, R.M., Burns, T.M. and Dale, J.L. (1991). Virus-like particles associated with banana bunchy top disease contain small single-stranded DNA. J. Gen. Virol. 72, 225-230.

Harding, R.M., Burn, T.M., Hafner, G., Dietzgen, R.G. and Dale, J.L. (1993). Nucleotide sequence of one component of the banana bunchy top virus genome contains a putative replicase gene. J. Gen. Virology 74, 323-328.

Hatch, M.D. (1987) C4 photosynthesis: A unique blend of modified biochemistry, anatomy and ultrastructure. Biochim. Biophys. Acta 895:81-106.

Higgins, T.J.V. and Spencer, D. (1991). The expression of a chimeric cauliflower mosaic virus (CaMV) 35S-pea vicilin gene in tobacco. Plant Sci. 74, 89-98.

Hoekema, A., Hirsch, P.R., Hooykaas, P.J.J. and Schilperoott, R.A. (1983). A binary plant vector strategy based on separation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature 303, 179-180.

Isogai, M., Sano, Y. and Kojima, M. (1992). Identification of the unique DNA species in the milk vetch dwarf virus-infected leaves. Ann. Phytopath. Soc. Japan 58, 631-632, Abstract.

Jacobsen-Lyon, K. Jesen, E.O., Jorgensen, J-E., Marcker, K.A., Peacock, W.J. and Dennis, E.S. (1995). Symbiotic and nonsymbiotic hemoglobin genes of Casurina glauca. Plant Cell 7, 213-223.

Janssen, B.J. and Gardner, R.C. (1989). Localised transient expression of GUS i leaf discs following co-cultivation with Agrobacterium. Plant Mol. Biol. 14, 61-72.

Jefferson, R.A., Kavanagh, T.A. and Bevan, M.W. (1987). GUS fusions: b-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 6, 3901-3907.

Joshi, C.P. (1987). Putative polyadenylation signals in nuclear genes of higher plants: a compilation and analysis. Nucleic Acids Research. 15, 9627-9640.

Katul, L., Vetten, H.J., Maiss, E., Makkouk, K.M. Lesemann, D.-E. and Casper, R. (1993). Characterisation and serology of virus-like particles associated with faba bean necrotic yellows. Ann. Appl. Biol. 123, 629-647.

Khan, M.R.I., Tabe, L.M., Heath, L.C., Spencer, D. and Higgins, T.J.V. (1994). Agrobacterium-mediated transformation of subterranean clover (Trifolium subterraneum L.). Plant Physiol 105, 81-88.

Kirschman, J.A. and Cramer, J.H. (1988). Two new tools:multi-purpose cloning vectors carry kanamycin or spectinomycin/streptomycin resistance markers. Gene 58, 163-165.

Last, D.I., Brettell, R.I.S., Chaudhury, A.M., Chamberlain, D.A., Larkin, P.J., Marsh, E.L., Peacock, J.W. and Dennis, E.S. (1991). pEmu: an improved promoter for gene expression in cereal cells. Theor Appl Genet 81, 581-588.

Lazo, G.R., Stein, P.A. and Ludwig, R.A. (1991). A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium. Biotechnol. 9, 963-967.

Linn, F., Heidmann, I., Saedler, H. and Meyer, P. (1990). Epigenetic changes in the expression of the maize Z1 gene in Petunia hybrida: Role of numbers of integrated gene copies and state of methylation. Mol. Gen. Genet. 222, 329-336.

McDonnell, R.E., Clark, R.D., Smith, W.A. and Hinchee, M.A. (1987). A simplified method for the detection of neomycin phosphotransferase II activity in transformed plant tissues. Plant Mol. Biol. Rep. 5, 380-386.

Matzke, M.A. and Matzke, A.J.M. (1991). Differential inactivation and methylation of a transgene in plants by two suppressor loci containing homologous sequences. Plant Mol. Biol. 16, 821-830.

Messing, J., Geraghty, D., Heidecker, G., Hu, N-T., Kridl, J. and Rubenstein, I. (1983). Plant gene structure. In: "Genetic engineering of plants. An agricultural perspective."Kosuge, T., Meredith, C.P. and Hollaender, A. (eds). Plenum Press, New York. pp 211-277.

Nagel, R., Elliot, A., Masel, A., Birch., R.G. and Manners, J.M. (1990). Electroporation of binary Ti plasmid vector into Agrobacterium tumefaciens and Agrobacterium rhizogenes. FEMS Microbiology Letters 67, 325-328.

Odell, J.T., Nagy, F. and Chua, N.-H. (1985). Identification of DNA sequences required for activity of cauliflower mosaic virus 35S promoter. Nature 313, 810.

Pietrzak, M., Shillito, R.D., Hohn, T. and Potrykus, I. (1986). Expression in plants of two bacterial antibiotic resistance genes after protoplast transformation with a new plant expression vector. Nucleic Acids Res. 14, 5857-5868.

Richardson, J. P. (1993). Transcription termination. Critical Review in Biochem. and Mol. Biol. 28, 1-30.

Rhode, W., Randles, J.W., Langridge, P. and Hanold, D. (1990). Nucleotide sequence of a circular single-stranded DNA associated with coconut foliar decay virus. Virology 176, 648-651.

Rothnie, H.M., Reid, J. and Hohn, T. (1994). The contribution of AAUAAA and the upstream element UUUGUA to the efficiency of mRNA 3'-end formation in plants. EMBO J. 13, 2200-2210.

Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. (1989). Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York.

Sanger, F., Nicklen, S. and Coulson, A.R. (1977). DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467.

Sano, Y., Isogai, M., Satoh, S. and Kojima. M. (1993). Small virus-like particles containing single-stranded DNAs associated with milk vetch dwarf disease in Japan. 6th Int. Cong. of Plant Path., Montreal, Canada, July 28 - August 6, 1993. Abs. 17.1.27.

Scheid, O.M., Paszkowski, J. and Potrykus, I. (1991). Reversible inactivation of a transgene in Arabidopsis thaliana. Mol. Gen. Genet. 228, 104-112.

Schmulling, T., Schell, J. and Spena, A. (1989). Promoters of the rolA, B, and C genes of Agrobacterium rhizogenes are differentially regulated in plants. Plant Cell 1, 665-670.

Sugaya, S., Hayakawa, K., Handa, T. and Uchimiya, H. (1989). Cell-specific expression of the rolC gene of the TL-DNA of Ri plasmid in transgenic tobacco plants. Plant Cell Physiol. 30, 649-653.

Taylor, B.H. and Larkin, P.J. (1988). Analysis of electroporation efficiency in plant protoplants. Aust. J. Biotech.1,52-57.

Thomas, J.E. and Dietzgen, R.G. (1991). Purification, characterization and serological detection of virus-like particles associated with banana bunchy top disease in Australia. J. Gen. Virol. 72, 217-224.

Wenzler, H., Mignery, G., May, G. and Park, W. (1989). A rapid and efficient transformation method for the production of large numbers of transgenic potato plants. Plant Science 63, 79-85.

Zheng, Z., Hayashimoto, A., Li, Z. and Murai, N. (1991). Hygromycin resistance gene cassette for vector construction and selection of transformed rice protoplasts. Plant Physiol. 97, 832-835.

(1) INFORMACIÓN GENERAL

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

SOLICITANTE: COMMONWEALTH SCIENTIFIC AND INDUSTRIAL RESEARCH ORGANISATION

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: NUEVOS PROMOTORES DE PLANTAS Y SUS USOS

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 7

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

DESTINATARIO: DAVIES COLLISON CAVE

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

DIRECCIÓN: 1 LITTLE COLLINS STREET

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: MELBOURNE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

ESTADO: VICTORIA

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: AUSTRALIA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CÓDIGO POSTAL: 3000

\vskip0.800000\baselineskip

(v)

FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: DISQUETE

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, versión #1.25

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

DATOS DE LA PRESENTE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: AU PROVISIONAL

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 07 DE NOVIEMBRE DE 1994

\vskip0.800000\baselineskip

(vii)

DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NÚMERO DE SOLICITUD: PM7770/94

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FECHA DE PRESENTACIÓN: 30 DE AGOSTO DE 1994

\vskip0.800000\baselineskip

(viii)

INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: HUGHES DR, E. JOHN L.

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE REFERENCIA/CASO: EJH/EK

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

INFORMACIÓN TELEFÓNICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TELÉFONO: +61 3 9254 2777

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

FAX: +61 3 9254 2770

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1001 BASES PARES

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1022 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 991 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1002 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 998 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 1017 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 988 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\newpage

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

27

Claims (25)

1. Un constructo genético que comprende un promotor circovírico a partir de un circovirus que comprende un genoma de ADN en múltiples componentes, siendo dicho promotor operable en una célula vegetal, y un gen heterólogo enlazado operablemente a dicho promotor.

2. Un constructo genético según la reivindicación 1, en el que dicho gen heterólogo se inserta en un sitio de endonucleasa de restricción en dirección de dicho promotor.

3. Un contracto genético según la reivindicación 1 o reivindicación 2, en el que el genoma del circovirus comprende más de dos componentes o segmentos de ADN.

4. Un constructo genético según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el circovirus se selecciona del grupo que consta de virus la atrofia del trébol subterráneo (SCSV), virus del copo racimoso del banano (BBTV), virus de enanismo de arveja lechosa (MDV) y virus del amarilleamiento necrótico del haba (FBNYV).

5. Un constructo genético según la reivindicación 4, en el que el circovirus es el virus de atrofia del trébol subterráneo (SCSV).

6. Un constructo genético según la reivindicación 5, en el que el promotor se selecciona de uno de los segmentos 1 a 7 de SCSV (SEQ ID N^{os}: 1 a 7), o es capaz de hibridarse a estos en condiciones de baja restricción.

7. Un constructo genético según la reivindicación 6, en el que el promotor se selecciona de uno de los segmentos 1, 3-5 y 7 de SCSV (SEQ ID N^{os}. 1, 3-5 y 7), o es capaz de hibridarse a ellos en condiciones de baja restricción.

8. Un constructo genético según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende además una secuencia de terminación y/o de poliadenilación, estando dicha secuencia operablemente enlazada a dicho gen heterólogo.

9. Un constructo genético según la reivindicación 8, en el que la secuencia de terminación y/o de poliadenilación es de origen SCSV.

10. Un constructo genético según la reivindicación 8 ó 9, en el que la secuencia de terminación y/o de poliadenilación se selecciona de uno de los segmentos 1 a 7 de SCSV (SEQ ID N^{os}: 1 a 7), o es capaz de hibridarse a los mismos en condiciones de baja restricción.

11. Un constructo genético según la reivindicación 8, en el que la secuencia de terminación y/o de poliadenilación procede del gen MeA de Flaveria bidentis.

12. Un constructo genético según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que el constructo comprende dos genes heterólogos enlazados operablemente al mismo o a diferentes promotores circovíricos.

13. Un constructo genético según una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, en el que el constructo comprende dos genes heterógolos, cada uno de los cuales está enlazado operablemente al mismo o a diferentes promotores circovíricos, y una secuencia de terminación y/o de poliadenilación, que puede ser la misma o diferente, enlazada operablemente a uno o ambos genes heterólogos.

14. Un constructo genético según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que el gen heterólogo, o cada uno de ellos, se selecciona de:

a)

un gen de resistencia frente a virus, bacterias, hongos, nemátodos y otros patógenos de las plantas;

b)

un gen de resistencia a virus de las plantas, que incluye un gen sintético procedente del virus del mosaico de la alfalfa, del virus de la atrofia del trébol subterráneo, del virus del moteado del trébol subterráneo, del virus de la hoja roja del trébol subterráneo, del virus de enrollamiento de la hoja de la patata, del virus del bronceado del tomate, del virus del mosaico amarillo del haba, del virus del mosaico blanco del trébol, virus de las venas amarillas del trébol, de los virus x, y, s, m y a de la patata, del virus del mosaico del pepino, del virus de la atrofia desigual del arroz y del virus del enanismo amarillo de la cebada;

c)

un gen para mejorar el valor nutritivo de las plantas;

d)

un gen de resistencia al hinchamiento;

e)

un gen de tipo anticuerpo;

f)

un gen proteínico que inactiva la tionina y ribosoma de cereales;

g)

un gen de resistencia a insectos;

h)

un gen marcador seleccionable;

i)

un gen informador;

j)

un gen que codifica una proteína reguladora que modula la expresión de un gen en las células vegetales.

15. Un constructo genético según la reivindicación 14, en el que:

(i)

el gen para mejorar el valor nutricional de las plantas es el gen SF8 de girasol con alto contenido en azufre;

(ii)

el gen de resistencia a insectos es el gen de la toxina BT o el gen inhibidor de proteinasa procedente de Nicotiana alata;

(iii)

el gen marcador seleccionable es el gen que confiere resistencia a canamicina, fosfinotricina, espectinomicina e higromicina;

(iv)

el gen informador es el gen GUS, CAT y el gen de pigmentos.

16. Un constructo genético que comprende dos o más genes heterógolos enlazados operablemente al mismo o a diferentes promotores circovíricos operables en una célula vegetal, en el que cada promotor circovírico procede de un circovirus que comprende un genoma de ADN de múltiples componentes y es operable en una célula vegetal.

17. Un constructo genético según la reivindicación 16, en el que promotor se define además en una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7.

18. Un constructo genético según la reivindicación 16 ó 17, que comprende además una secuencia de terminación y/o de poliadenilación enlazada operablemente a uno o más de dichos genes heterólogos.

19. Un constructo genético según la reivindicación 18, en el que la secuencia de terminación y/o de poliadenilación es como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11.

20. Un constructo genético según la reivindicación 18 ó 19, en el que las secuencias de terminación y/o de poliadenilación son las mismas para cada gen.

21. Un constructo genético según la reivindicación 18 ó 19, en el que las secuencias de terminación y/o de poliadenilación son diferentes para cada gen.

22. Un constructo genético según una cualquiera de las reivindicaciones 16 a 21, en el que los genes heterólogos se seleccionan del grupo que consta de:

a)

un gen de resistencia frente a virus, bacterias, hongos, nemátodos y otros patógenos de las plantas;

b)

un gen de resistencia a virus de las plantas, que incluye un gen sintético procedente del virus del mosaico de la alfalfa, del virus de la atrofia del trébol subterráneo, del virus del moteado del trébol subterráneo, del virus de la hoja roja del trébol subterráneo, del virus de enrollamiento de la hoja de la patata, del virus del bronceado del tomate, del virus del mosaico amarillo del haba, del virus del mosaico blanco del trébol, virus de las venas amarillas del trébol, de los virus x, y, s, m y a de la patata, del virus del mosaico del pepino, del virus de la atrofia desigual del arroz y del virus del enanismo amarillo de la cebada;

c)

un gen para mejorar el valor nutritivo de las plantas;

d)

un gen de resistencia al hinchamiento;

e)

un gen de tipo anticuerpo;

f)

un gen proteínico que inactiva la tionina y ribosoma de cereales;

g)

un gen de resistencia a insectos;

h)

un gen marcador seleccionable;

i)

un gen informador;

j)

un gen que codifica una proteína reguladora que modula la expresión de un gen en las células vegetales.

23. Un constructo genético según la reivindicación 22, en el que:

(i)

el gen para mejorar el valor nutricional de las plantas es el gen SF8 de girasol con alto contenido en azufre;

(ii)

el gen de resistencia a insectos es el gen de la toxina BT o el gen inhibidor de proteinasa procedente de Nicotiana alata;

(iii)

el gen marcador seleccionable es el gen que confiere resistencia a canamicina, fosfinotricina, espectinomicina e higromicina;

(iv)

el gen informador es el gen GUS, CAT y el gen de pigmentos.

24. Un método para expresar un gen foráneo en una célula vegetal, comprendiendo dicho método introducir en dicha célula vegetal un constructo genético según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.

25. Una planta transgénica que comprende el constructo genético de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 23.