ES2220982T3 - Peptidos destinados a la deteccion del vih-1. - Google Patents
Peptidos destinados a la deteccion del vih-1.Info
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Abstract
SE DESCRIBEN PEPTIDOS HIV ACION PUNTUAL ENTRE LA POSICION 593 Y LA 611 DE LA SECUENCIA AMINOACIDICA DE GP 160 DE HIV. LA MUTACION PUNTUAL SE ENCUENTRA BIEN EN LA POSICION 604 O EN LA 610, O EN AMBAS. SE PROPORCIONAN INMUNOENSAYOS QUE UTILIZAN DICHOS PEPTIDOS, ASI COMO KITS DE TEST DE DIAGNOSTICO QUE CONTIENEN DICHOS PEPTIDOS.
Description
Péptidos destinados a la detección del
VIH-1.
Esta invención se refiere de manera general a
péptidos útiles para detectar anticuerpos hacia el
VIH-1 y, más particularmente, se refiere a la
detección de anticuerpos hacia VIH-1 subtipo O
mediante la utilización de una secuencia de aminoácidos de la región
inmunodominante (RID) de gp41 del VIH-1 que contiene
dos mutaciones puntuales, una en posición 604 y una en posición 610
de la secuencia de gp160 del VIH-1 subtipo B (la
numeración está de acuerdo con la del VIH-1 cepa LAI
publicada en Myers y col., infra).
Actualmente hay seis subtipos reconocidos
(denominados "vestidos") del VIH-1 denominados
A, B, C, D, E y F según está descrito en Myers y col., Human
Retroviruses and AIDS 1993: A Compilation and Analysis of Nucleic
Acid and Amino Acid Sequences (Los Alamos National Laboratory,
Los Alamos, NM) (1993).
J. Louwagie y col., "Genetic diversity of the
envelope glycoprotein from human immunodeficiency virus type I
isolates of African origin" Journal of Virology, Enero de
1995, vol. 69, pp. 263-271, describen la diversidad
genética de los aislados del virus de la inmunodeficiencia humana de
tipo I, incluyendo VIH-1 subtipo B y subtipo O.
Recientemente, se han descrito los subtipos
adicionales G y H. Ver, por ejemplo, Janssens y col., AIDS
Research and Human Retroviruses 10: 877 (1994); y Myers y col.,
supra. De particular importancia emergente es el
reconocimiento de un grupo notablemente divergente de secuencias del
VIH-1 denominado "O". El subtipo O del
VIH-1 fue descrito por primera vez en 1987 y fue
denominado "O" por "outlier" (valor atípico), ya que se
encontró que tenía solamente alrededor de un 50% de identidad de
secuencias a nivel de ácido nucleico del gen env con los
demás subtipos de VIH-1. Estos otros subtipos,
señalados anteriormente, contienen alrededor de un 75% de identidad
de secuencias a nivel de ácido nucleico del gen env entre sí.
Las descripciones más tempranas de la secuencia de los virus de tipo
O indicaba que en el árbol filogenético SIVCPZGAB está más próxima a
los demás VIH-1 que el grupo O; esto es, este virus
de chimpancé está entre el grupo M y el grupo O. Ver, por ejemplo,
Gürtler y col., J. Virology 68: 1581-1585
(1994); Vandem Haesevelde y col., J. Virology 68:
1586-1596 (1994); De Leys y col., J. Virology
64: 1207-1216 (1990); De Leys y col., Patente de
EE.UU. Nº 5.304.466; Gürtler y col., Publicación de Patente Europea
Nº 0591914A2. Las secuencias del grupo O son las más divergentes de
las secuencias del VIH-1 descritas hasta la fecha,
mientras que el subtipo B es el subtipo más común del
VIH-1.
La serología del VIH ha sido caracterizada en
gran parte por las secuencias de aminoácidos de las proteínas
víricas expresadas (antígenos), particularmente de aquéllas que
forman parte del núcleo central y de la envoltura. Antígenos que son
estructuralmente y funcionalmente similares pero que tienen
diferentes secuencias de aminoácidos, inducen anticuerpos que pueden
ser similares pero no idénticos en su especificidad por el antígeno.
Un ejemplo es la diferencia antigénica entre las RID de gp41 del
VIH-1 y del VIH-2, que puede ser
aprovechada de una variedad de formas para discriminar
serológicamente entre individuos expuestos a VIH-1
y/o VIH-2. Ver, por ejemplo, Hunt y col., AIDS
Research and Human Retroviruses 6: 883-898
(1990); Gnaan y col., Science 237: 1346-1349
(1987); Cot y col., AIDS Research and Human Retroviruses 4:
239-241 (1988); Hunt y col., Patente de EE.UU. Nº
------ (4656.US.CI) y WO90/07119 que describe polipéptidos
sintéticos similares a los del VIH basados en la región
inmunodominante de gp41 del VIH-1. De manera
similar, los virus VIH-1 del grupo O son
antigénicamente y serológicamente distinguibles de otros subtipos
del VIH-1. Loussert-Ajaka y col.,
The Lancet 343: 1393-1394 (1994); Gürtler y
col., J. Virology 68: 1581-1585 (1994);
Vandem Haesevelde y col., J. Virology 68:
1586-1596 (1994); De Leys y col., J. Virology
64 (supra); Patente de EE.UU. Nº 5.304.466; Gürtler y col.,
Publicación de la E.P.O. 0591914A2.
La capacidad para detectar VIH-1
subtipo O ha llegado a ser un asunto crítico en la comunidad de los
bancos de sangre. En un estudio, se describió que ensayos
comerciales capaces de detectar VIH-1 subtipo B no
eran capaces de detectar un panel de 9 muestras positivas para
VIH-1 subtipo O (I. Loussert-Ajaka y
col., The Lancet 343: 1393-1394 (1994)).
Además, EP 0591 914 y EP 673 948 describen antígenos peptídicos de
MVP-5180/91 (VIH-1 subtipo O) y su
utilización en la detección de anticuerpos
anti-VIH.
Aunque el número de casos reales confirmados de
infección debida a VIH-1 subtipo O es limitado, en
número y geográficamente, existen indicaciones de que este subtipo
está comenzando a propagarse desde Camerún, el lugar inicial del
virus, hacia países vecinos tales como Guinea Ecuatorial.
Sería ventajoso proporcionar un reactivo que
pudiera ser utilizado en un ensayo para detectar la presencia de
anticuerpos hacia VIH-1 subtipo O en muestras de
ensayo.
La presente invención proporciona un polipéptido
que tiene una mutación puntual en la RID del VIH-1
subtipo B en posición 604. Más específicamente, el punto del
polipéptido en posición 604 es una lisina (K). El polipéptido está
identificado por la SECUENCIA I.D. Nº 2. La presente invención
proporciona también un polipéptido que tiene una mutación puntual en
la RID del VIH-1 subtipo B en posición 610. Más
específicamente, el punto del polipéptido en posición 610 es una
tirosina (Y). El polipéptido está identificado por la SECUENCIA I.D.
Nº 3. Se proporciona también un polipéptido que tiene dos mutaciones
puntuales individuales en la RID del VIH-1 subtipo B
en las posiciones 604 y 610. Dicha mutación puntual en el
polipéptido en posición 604 es una lisina (K) y la mutación puntual
en la posición 610 es una tirosina (Y). El polipéptido está
identificado por la SECUENCIA I.D. Nº 4. Se proporcionan también los
polipéptidos de SECUENCIA I.D. Nº, SECUENCIA I.D. Nº 3 y SECUENCIA
I.D. Nº 4.
La presente invención proporciona un inmunoensayo
para detectar la presencia de anticuerpos hacia el VIH mediante la
puesta en contacto de dicha muestra de ensayo con una fase sólida a
la que se ha unido un polipéptido del VIH-1 que
tiene una mutación puntual entre las posiciones 593 y 611, y la
incubación durante un tiempo y en las condiciones suficientes para
formar complejos polipéptido/anticuerpo; la puesta en contacto de
dichos complejos polipéptido/anticuerpo con un reactivo indicador
que comprende un miembro de un par de unión específica de un
anticuerpo hacia el VIH unido a un compuesto generador de una señal
capaz de generar una señal medible y la incubación durante un tiempo
y en las condiciones suficientes para formar complejos
polipéptido/anticuerpo/reactivo indicador; la determinación de la
presencia de anticuerpos hacia el VIH mediante la detección de la
señal medible. La mutación puntual está en posición 604 o en
posición 610. O, las mutaciones puntuales están en las posiciones
604 y 610. La fase sólida es seleccionada del grupo que consta de
las paredes de pocillos de una placa de reacción, tubos de ensayo,
esferas de poliestireno, esferas magnéticas, tiras de nitrocelulosa,
membranas, micropartículas tales como partículas de látex, glóbulos
rojos sanguíneos de carnero (o de otro animal) y duracitas. El
compuesto generador de una señal del reactivo indicador es
seleccionado del grupo que consta de cromógenos, enzimas, compuestos
luminiscentes, compuestos quimioluminiscentes, elementos
radioactivos y marcas visuales directas. El miembro de un par de
unión específica de dicho reactivo indicador es preferiblemente
anti-IgG humana.
La presente invención proporciona un inmunoensayo
mejorado para detectar anticuerpos hacia el VIH en una muestra de
ensayo, que comprende la puesta en contacto de dicha muestra de
ensayo con un polipéptido del VIH-1 y la detección
de la presencia de dicho anticuerpo, en el que la mejora comprende
la utilización o el empleo de un polipéptido que tiene una mutación
puntual entre las posiciones 593 y 611 de la secuencia de gp160 del
VIH-1.
Se proporciona también un kit de ensayo para
diagnóstico capaz de detectar anticuerpos hacia el VIH, donde dicho
kit comprende un recipiente conteniendo un polipéptido que tiene una
secuencia seleccionada del grupo que consta de la SECUENCIA I.D. Nº
2, la SECUENCIA I.D. Nº 3 y la SECUENCIA I.D. Nº 4.
La Figura 1 muestra las reactividades relativas
mediante ELISA de la SECUENCIA I.D. Nº 1 (\blacktriangledown), la
SECUENCIA I.D. Nº 2 (\blacksquare), la SECUENCIA I.D. Nº 3
(\bullet) y la SECUENCIA I.D. Nº 4 (\blacktriangle) para la
muestra #193.
La Figura 2 muestra las reactividades relativas
mediante ELISA de la SECUENCIA I.D. Nº 1 (\blacktriangledown), la
SECUENCIA I.D. Nº 2 (\blacksquare), la SECUENCIA I.D. Nº 3
(\bullet) y la SECUENCIA I.D. Nº 4 (\blacktriangle) para la
muestra #267.
La Figura 3 muestra las reactividades relativas
mediante ELISA de la SECUENCIA I.D. Nº 1 (\blacktriangledown), la
SECUENCIA I.D. Nº 2 (\blacksquare), la SECUENCIA I.D. Nº 3
(\bullet) y la SECUENCIA I.D. Nº 4 (\blacktriangle) para la
muestra #341.
La Figura 4 muestra las reactividades relativas
mediante ELISA de la SECUENCIA I.D. Nº 1 (\blacktriangledown), la
SECUENCIA I.D. Nº 2 (\blacksquare), la SECUENCIA I.D. Nº 3
(\bullet) y la SECUENCIA I.D. Nº 4 (\blacktriangle) para la
muestra #655.
La Figura 5 muestra las reactividades relativas
mediante ELISA de la SECUENCIA I.D. Nº 2 (\blacksquare) y la
SECUENCIA I.D. Nº 3 (\bullet) para la muestra M.
Hemos identificado dos posiciones de aminoácidos
en la región inmunodominante (RID) de gp41 del VIH-1
subtipo B, en las cuales son críticas sustituciones de aminoácidos
específicas para detectar la presencia de VIH-1
subtipo O. Nosotros diseñamos y sintetizamos péptidos híbridos que
incorporaban al menos una de estas dos modificaciones de residuos en
una secuencia peptídica con características del
VIH-1 subtipo B. Estos péptidos híbridos son capaces
de reaccionar con los anticuerpos
anti-VIH-1 subtipo O presentes en un
panel de muestras de ensayo que se había confirmado que tenían
VIH-1 subtipo O, algunas de las cuales no eran
reactivas cuando se utilizó la secuencia del subtipo B no modificada
(SECUENCIA I.D. Nº 1). Estos péptidos están presentados en el
Listado de Secuencias como SECUENCIA I.D. Nº 2, SECUENCIA I.D. Nº 3
y SECUENCIA I.D. Nº 4. Estas secuencias tienen mutaciones puntuales
en una o en las dos posiciones 604 y 610 (numeración de acuerdo con
la cepa LAI, supra) de una secuencia de 19 aminoácidos de la
gp41 del VIH-1 subtipo B.
Los términos siguientes tienen los siguientes
significados a no ser que se indique de otro modo:
El término "muestra de ensayo" se refiere a
un componente del organismo de un individuo que es la fuente del
analito (tal como anticuerpos de interés o antígenos de interés).
Estos componentes son bien conocidos en la técnica. Estas muestras
de ensayo incluyen muestras biológicas que pueden ser analizadas
mediante los métodos descritos en la presente y que incluyen fluidos
corporales humanos y de animales tales como sangre completa, suero,
plasma, fluido cerebroespinal, orina, fluidos linfáticos y varias
secreciones externas de los tractos respiratorio, intestinal y
genitourinario, lágrimas, saliva, leche, glóbulos blancos
sanguíneos, mielomas y similares; y fluidos biológicos tales como
sobrenadantes de cultivos celulares; especímenes de tejido fijados y
especímenes celulares fijados.
"Analito", según se utiliza en la presente,
es la sustancia a detectar que puede estar presente en la muestra de
ensayo. El analito puede ser cualquier sustancia para la que exista
en la naturaleza un miembro de unión específica (tal como un
anticuerpo) o para la que pueda ser preparado un miembro de unión
específica. Por tanto, un analito es una sustancia que puede unirse
a uno o más miembros de unión específica en un ensayo.
"Analito" incluye también cualquier sustancia antigénica,
haptenos, anticuerpos y combinaciones de los mismos. Como miembro de
un par de unión específica, el analito puede ser detectado por medio
de parejas (pares) de unión específica que existan de manera
natural, tal como mediante la utilización de una proteína factor
intrínseco como miembro de un par de unión específica para la
determinación de Vitamina B12, la utilización de una proteína de
unión a folato para determinar ácido fólico, o la utilización de una
lectina como miembro de un par de unión específica para la
determinación de un carbohidrato. El analito puede incluir una
proteína, un péptido, un aminoácido un nucleótido diana y
similares.
La presente invención proporciona ensayos que
utilizan miembros de unión específica. Un "miembro de unión
específica", según se utiliza en la presente, es un miembro de un
par de unión específica. Esto es, dos moléculas diferentes, donde
una de las moléculas se une específicamente a la segunda molécula a
través de medios químicos o físicos. Por tanto, además de los pares
de unión específica de antígeno y anticuerpo de los inmunoensayos
comunes, otros pares de unión específica pueden incluir biotina y
avidina, carbohidratos y lectinas, secuencias de nucleótidos
complementarias, moléculas efectoras y receptoras, cofactores y
enzimas, inhibidores de enzimas y enzimas y similares. Además, los
pares de unión específica pueden incluir miembros que sean análogos
de los miembros de unión específica originales, por ejemplo un
análogo de un analito. La unión específica inmunorreactiva de una
proteína de unión a folato para determinar ácido fólico, o la
utilización de una lectina como miembro de un par de unión
específica para la determinación de un carbohidrato. El miembro del
par de unión específica puede incluir una proteína, un péptido, un
aminoácido, un nucleótido diana y similares. Además, los pares de
unión específica pueden incluir miembros que sean análogos de los
miembros de unión específica originales, por ejemplo un análogo de
un analito. Los miembros de unión específica inmunorreactivos
incluyen antígenos, fragmentos de antígenos, anticuerpos y
fragmentos de anticuerpos, monoclonales y policlonales, y complejos
de los mismos, incluyendo los formados por moléculas de ADN
recombinante. El término "hapteno", según se utiliza en la
presente, se refiere a un antígeno parcial o miembro de unión no
proteico que es capaz de unirse a un anticuerpo, pero que no es
capaz de inducir la formación de anticuerpos a no ser que esté
acoplado a una proteína transportadora.
El "reactivo indicador" comprende un
"compuesto generador de una señal" (marca) que es capaz de
generar, y genera, una señal medible detectable por un medio externo
conjugado (unido) a un miembro de unión específica para VIH.
"Miembro de unión específica", según se utiliza en la presente,
significa un miembro de un par de unión específica. Esto es, dos
moléculas diferentes, donde una de las moléculas se une a la segunda
molécula específicamente por medios químicos o físicos. Además de
ser un anticuerpo miembro de un par de unión específica para el VIH,
el reactivo indicador puede ser también un miembro de cualquier par
de unión específica, incluyendo sistemas
hapteno-anti-hapteno tales como
biotina o anti-biotina, avidina o biotina, un
carbohidrato o una lectina, una secuencia de nucleótidos
complementaria, una molécula efectora o una molécula receptora, un
cofactor enzimático y un enzima, un inhibidor enzimático o un enzima
y similares. Un miembro de unión específica inmunorreactivo puede
ser un anticuerpo, un antígeno o un complejo anticuerpo/antígeno que
sea capaz de unirse al VIH como en un ensayo de sándwich, al
reactivo de captura como en un ensayo competitivo o al miembro de
unión específica auxiliar como en un ensayo indirecto.
Los diferentes "compuestos generadores de
señal" (marcas) contemplados incluyen cromógenos, catalizadores
tales como enzimas, compuestos luminiscentes tales como fluoresceína
y rodamina, compuestos quimioluminiscentes tales como dioxetanos,
acridinios, fenantridinios y luminol, elementos radioactivos y
marcas visuales directas. Ejemplos de enzimas incluyen fosfatasa
alcalina, peroxidasa de rábano picante,
beta-galactosidasa y similares. La selección de una
marca particular no es crítica, pero será capaz de producir una
señal por sí misma o junto con una o más sustancias adicionales.
Las "fases sólidas" ("soportes
sólidos") son conocidas por los expertos en la técnica e incluyen
las paredes de los pocillos de una placa de reacción, tubos de
ensayo, esferas de poliestireno, esferas magnéticas, tiras de
nitrocelulosa, membranas, micropartículas tales como partículas de
látex, glóbulos rojos sanguíneos de carnero (o de otro animal),
duracitas y otras. La "fase sólida" no es crítica y puede ser
seleccionada por una persona experta en la técnica. Así, partículas
de látex, micropartículas, esferas magnéticas o no magnéticas,
membranas, tubos de plástico, paredes de pocillos de
microvaloración, chips de vidrio o silicona, glóbulos rojos
sanguíneos de carnero (o de otro animal adecuado) y duracitas, son
todos ejemplos adecuados. Los métodos adecuados para inmovilizar
péptidos en fases sólidas incluyen interacciones iónicas,
hidrofóbicas, covalentes y similares. Una "fase sólida", según
se utiliza en la presente, se refiere a cualquier material que sea
insoluble, o que pueda hacerse insoluble mediante una reacción
posterior. La fase sólida puede ser elegida por su capacidad
intrínseca para atraer e inmovilizar el reactivo de captura.
Alternativamente, la fase sólida puede retener un receptor adicional
que tenga capacidad para atraer e inmovilizar al reactivo de
captura. El receptor adicional puede incluir una sustancia cargada
que esté cargada de manera opuesta con respecto al propio reactivo
de captura o con respecto a una sustancia cargada conjugada al
reactivo de captura. Como otra alternativa más, la molécula de
receptor puede ser cualquier miembro de unión específica que esté
inmovilizado sobre (unido a) la fase sólida y que tenga capacidad
para inmovilizar al reactivo de captura mediante una reacción de
unión específica. La molécula de receptor permite la unión indirecta
del reactivo de captura a un material de fase sólida antes de la
realización del ensayo o durante la realización del ensayo. La fase
sólida puede ser por tanto un plástico, un plástico derivatizado, un
metal magnético o no magnético, la superficie de vidrio o silicona
de un tubo de ensayo, un pocillo de microvaloración, una lámina, una
esfera, una micropartícula, un chip, glóbulos rojos de carnero (o de
otro animal adecuado), duracitas y otras configuraciones conocidas
por aquellas personas con experiencia habitual en la técnica.
Se contempla, y está dentro del ámbito de la
invención, que la fase sólida pueda comprender también cualquier
material poroso adecuado con porosidad suficiente para permitir el
acceso a los anticuerpos de detección y una afinidad en la
superficie adecuada para unirse a antígenos. Se prefieren
generalmente estructuras microporosas, pero pueden utilizarse
también materiales con estructura de gel en estado hidratado. Estos
materiales pueden ser utilizados en las formas adecuadas tales como
películas, láminas o placas, o pueden ser revestidos sobre, o unidos
a, o laminados sobre, vehículos inertes apropiados tales como papel,
vidrio, películas de plástico o tejidos.
Se contemplan también, y están dentro del ámbito
de esta invención, otras realizaciones que utilizan otras fases
sólidas diferentes. Por ejemplo, pueden emplearse de acuerdo con la
presente invención procedimientos de captura iónica para inmovilizar
un complejo de reacción inmovilizable con un polímero cargado
negativamente, descritos en la Solicitud de Patente de EE.UU.
copendiente Nº de Serie 150.278 correspondiente a la publicación de
EP 0326100 y en la Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie
375.029 (publicación de EP Nº 0406473), con el fin de llevar a cabo
una reacción inmunoquímica en fase de solución rápida. Un complejo
inmune inmovilizable es separado del resto de la mezcla de reacción
mediante interacciones iónicas entre el polianión cargado
negativamente/complejo inmune y la matriz porosa cargada
positivamente previamente tratada, y detectado mediante la
utilización de varios sistemas generadores de señal previamente
descritos, incluyendo los descritos en las medidas de señales
quimioluminiscentes según se describió en la Solicitud de Patente de
EE.UU. copendiente Nº de Serie 921.979 correspondiente a la
Publicación de la EPO Nº 0 273 115.
Además, los métodos de la presente invención
pueden ser adaptados para ser utilizados en sistemas que emplean la
tecnología de micropartículas, incluyendo sistemas automatizados y
semiautomatizados en los que la fase sólida comprende una
micropartícula (magnética o no magnética). Tales sistemas incluyen
los descritos en las Solicitudes de Patente de EE.UU. pendientes
425.651 y 425.643, que corresponden a las solicitudes de la EPO
publicadas N^{os} EP 0 425 633 y EP 0 425 634,
respectivamente.
La utilización de microscopía con sondas de
barrido (SPM) para inmunoensayos es también una tecnología a la cual
son fácilmente adaptables los péptidos de la presente invención. En
la microscopía con sondas de barrido, en particular en la
microscopía de fuerza atómica, la fase de captura, por ejemplo, al
menos uno de los péptidos descritos en la presente, está adherida a
una fase sólida; una muestra de ensayo sospechosa de contener el
anticuerpo de interés es puesta en contacto con la fase sólida y se
utiliza un microscopio con sonda de barrido para detectar los
complejos antígeno/anticuerpo que puedan estar presentes sobre la
superficie de la fase sólida. La utilización de microscopía túnel de
barrido elimina la necesidad de las marcas que deben ser utilizadas
normalmente en muchos sistemas de inmunoensayo para detectar
complejos antígeno/anticuerpo. Tal sistema está descrito en la
Solicitud de Patente de EE.UU. pendiente Nº de Serie 662.147. La
utilización de SPM para monitorizar reacciones de unión específica
puede tener lugar de muchas formas. En una forma, un miembro de una
pareja de unión específica (sustancia específica del analito que es
un péptido descrito en la presente) es unido a una superficie
adecuada para barrido. La unión de la sustancia específica del
analito puede ser mediante adsorción a una pieza de ensayo que
comprenda una fase sólida de una superficie de plástico o metal,
siguiendo métodos conocidos por las personas con experiencia
habitual en la técnica. O bien puede utilizarse la unión covalente
de una pareja de unión específica (sustancia específica del analito)
a una pieza de ensayo, pieza de ensayo que comprende una fase sólida
de plástico, metal, silicona o vidrio derivatizados. Los métodos de
unión covalente son conocidos por los expertos en la técnica.
Además, pueden utilizarse interacciones polielectrolíticas para
inmovilizar una pareja de unión específica sobre una superficie de
una pieza de ensayo mediante la utilización de técnicas y de la
química descritas por las Solicitudes de Patente de EE.UU.
pendientes Nº de Serie 150.278, registrada el 29 de Enero de 1998, y
Nº de Serie 375.029, registrada el 7 de Julio de 1989. Después de la
fijación de un miembro de unión específica, la superficie puede ser
tratada adicionalmente con materiales tales como suero, proteínas u
otros agentes bloqueantes para minimizar la unión no específica. La
superficie puede ser también sometida a barrido en el lugar de
fabricación o en el punto de utilización con el fin de verificar su
idoneidad para los fines del ensayo. Se cree que el proceso de
barrido no altera las propiedades de unión específica de la pieza de
ensayo.
Se contempla que los reactivos empleados para el
ensayo pueden ser suministrados en forma de un kit de ensayo con uno
o más recipientes tales como viales o botellas, conteniendo cada
recipiente un reactivo separado tal como un péptido, o una mezcla de
péptidos, o un reactivo indicador cuando se emplee en el ensayo.
Pueden estar incluidos en tales kits de ensayo otros componentes
tales como tampones, controles y similares, conocidos por las
personas con experiencia habitual en la técnica.
Pueden diseñarse formatos de ensayo que utilicen
los péptidos detallados en la presente, incluyendo como antígenos en
inmunoensayos, como inmunógenos para la producción de anticuerpos y
similares. En un formato de ensayo para detectar la presencia de
anticuerpos contra un analito específico (por ejemplo,
VIH-1) en una muestra de ensayo humana, la muestra
de ensayo humana es puesta en contacto e incubada con una fase
sólida revestida con al menos un péptido del VIH-1
descrito en la presente. Si están presentes en la muestra de ensayo
anticuerpos específicos hacia el analito, formarán un complejo con
el péptido y serán fijados a la fase sólida. Una vez que se ha
formado el complejo, los materiales y reactivos no unidos son
eliminados mediante lavado de la fase sólida. Estos complejos son
posteriormente puestos en contacto, y se hacen reaccionar, con un
reactivo indicador y se dejan incubar durante un tiempo y bajo
condiciones suficientes para que se formen segundos complejos. La
presencia de anticuerpos hacia el péptido en la muestra de ensayo se
determina mediante la detección de la señal generada. Una señal
generada por encima de un valor de corte es indicativa de la
presencia de anticuerpo hacia el analito en la muestra de ensayo.
Con muchos reactivos indicadores, tales como enzimas, la cantidad de
anticuerpo presente es proporcional a la señal generada. Dependiendo
del tipo de muestra de ensayo, la muestra de ensayo puede ser
diluida con un reactivo tampón adecuado, concentrada o puesta en
contacto con la fase sólida sin ninguna manipulación ("pura").
Por ejemplo, se prefiere normalmente analizar muestras de suero o
plasma que hayan sido diluidas previamente, o concentrar especímenes
tales como orina, con el fin de determinar la presencia y/o la
cantidad de anticuerpo presente.
Además, puede utilizarse más de un péptido en el
formato de ensayo recién descrito con el fin de analizar la
presencia de anticuerpo contra un agente infeccioso específico
mediante la utilización de péptidos contra varios epítopos
antigénicos del genoma vírico del agente infeccioso bajo estudio.
Así, puede preferirse la utilización de péptidos que contengan
epítopos en una región antigénica vírica específica así como
epítopos de otras regiones antigénicas del genoma vírico con el fin
de proporcionar ensayos que tengan una sensibilidad incrementada, y
quizá una mayor especificidad, que la utilización de un péptido de
un epítopo. Tal ensayo puede ser utilizado como ensayo de
confirmación. En este formato de ensayo particular, una cantidad
conocida de muestra de ensayo es puesta en contacto con
cantidad(es) conocida(s) de al menos un soporte sólido
revestido con al menos un péptido descrito en la presente durante un
tiempo y bajo condiciones suficientes para formar complejos
péptido/anticuerpo. Estos complejos son posteriormente puestos en
contacto con cantidad(es) conocida(s) de
reactivo(s) indicador(es) apropiado(s) durante
un tiempo y bajo condiciones adecuadas para que tenga lugar una
reacción. Se genera una señal, y esta señal resultante es comparada
con una muestra de ensayo negativa para determinar la presencia de
anticuerpo hacia el analito en la muestra de ensayo. Se contempla
además que, cuando se utilizan ciertas fases sólidas tales como
micropartículas, cada péptido utilizado en el ensayo puede estar
unido a una micropartícula separada, y puede producirse una mezcla
de estas micropartículas combinando las diferentes micropartículas
revestidas, que pueden ser optimizadas para cada ensayo.
Variaciones de los formatos de ensayo
anteriormente descritos incluyen la incorporación de al menos uno de
los péptidos sintéticos descritos en la presente, así como de
proteínas recombinantes o péptidos sintéticos específicos para
diferentes analitos, unidos a la misma o a diferentes fases sólidas,
para la detección de la presencia de anticuerpos hacia cada analito
(por ejemplo, un péptido sintético descrito en la presente
específico para ciertas regiones antigénicas del
VIH-1 revestido sobre la misma fase sólida o sobre
una fase sólida diferente con proteínas recombinantes específicas
para cierta(s) región(es) antigénica(s) de un
agente infeccioso diferente, para detectar la presencia de uno (o
ambos) de los agentes infecciosos.
En otro formato de ensayo más, péptidos
conteniendo epítopos antigénicos son útiles en ensayos competitivos
tales como ensayos de neutralización. Con el fin de realizar un
ensayo de neutralización, un péptido que represente un epítopo de
una región antigénica del VIH-1, es solubilizado y
mezclado con un diluyente de muestra hasta una concentración final
de entre 0,5 y 50,0 \mug/ml. Se añade a un pocillo de reacción una
cantidad conocida de muestra de ensayo (por ejemplo 10 \mul),
diluida o no diluida, seguida, por ejemplo, por 400 \mul del
diluyente de la muestra conteniendo un péptido descrito en la
presente. Si se desea, la mezcla puede ser preincubada durante 15
minutos aproximadamente hasta dos horas. Se añade posteriormente al
pocillo de reacción una fase sólida revestida con el péptido
descrito en la presente y se incuba durante una hora a 40ºC
aproximadamente. Después de lavar, se añade una cantidad conocida de
un reactivo indicador, por ejemplo 200 \mul de
anti-IgG humana de cabra marcada con peroxidasa en
un diluyente de conjugado, y se incuba durante una hora
aproximadamente a 40ºC. Después de lavar y cuando se utiliza un
conjugado enzimático tal como el descrito, se añade a la mezcla un
sustrato del enzima, por ejemplo el sustrato OPD, y se incuba a
temperatura ambiente durante treinta minutos. La reacción es
finalizada mediante la adición al pocillo de reacción de un reactivo
de parada tal como ácido sulfúrico 1 N. Se lee la absorbancia a 492
nm. Las muestras de ensayo que contienen anticuerpos hacia el
péptido específico generan una señal reducida causada por la unión
competitiva de los péptidos a estos anticuerpos en solución. El
porcentaje de unión competitiva puede ser calculado comparando el
valor de la absorbancia de la muestra en presencia de péptido con el
valor de la absorbancia de la muestra analizada en ausencia de
péptido a la misma dilución. De este modo, la diferencia entre las
señales generadas por la muestra en presencia de péptido y por la
muestra de ensayo en ausencia de péptido es la medida utilizada para
determinar la presencia o ausencia de anticuerpos.
En otro formato de ensayo, los péptidos de la
invención pueden ser utilizados en sistemas de ensayo de
transferencia de inmunomanchas. El sistema de ensayo de
transferencia de inmunomanchas utiliza un panel de polipéptidos
recombinantes purificados o de péptidos sintéticos colocados en fila
sobre un soporte sólido de nitrocelulosa. El soporte sólido
preparado es puesto en contacto con una muestra de ensayo y
anticuerpos de captura específicos (miembro de unión específica)
hacia la proteína recombinante y/o hacia los péptidos sintéticos
(otro miembro de unión específica) para formar pares de miembros de
unión específica. Los anticuerpos capturados son detectados mediante
la reacción con un reactivo indicador. Preferiblemente, la reacción
específica del conjugado es cuantificada utilizando un montaje
óptico de reflectancia en un instrumento que ha sido descrito en la
Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 07/227.408, registrada el
2 de Agosto de 1988. Las Solicitudes de Patente de EE.UU.
relacionadas N^{os} de Serie 07/227.586 y 07/227.590 (ambas de las
cuales fueron registradas el 2 de Agosto de 1988) describían además
métodos específicos y aparatos útiles para realizar un ensayo de
transferencia de inmunomanchas, así como la Patente de EE.UU. Nº
5.075.077 (Nº de Serie de EE.UU. 07/227.272, registrada el 2 de
Agosto de 1988), que disfruta de propiedad común y se incorpora a la
presente por referencia. Brevemente, un cartucho de análisis con
base de nitrocelulosa es tratado con múltiples péptidos antigénicos.
Cada péptido está contenido en una zona de reacción específica en el
cartucho de ensayo. Una vez que se han colocado todos los
polipéptidos antigénicos sobre la nitrocelulosa, se bloquean los
sitios de unión en exceso en la nitrocelulosa. El cartucho de ensayo
es posteriormente puesto en contacto con una muestra de ensayo, de
tal manera que cada péptido antigénico de cada zona de reacción
reaccionará si la muestra de ensayo contiene el anticuerpo
apropiado. Después de la reacción, el cartucho de ensayo es lavado y
se identifica cualquier reacción antígeno-anticuerpo
utilizando reactivos adecuados bien conocidos. Según se describe en
las patentes y en las solicitudes de patente enumeradas en la
presente, el proceso completo es susceptible de ser automatizado.
Las especificaciones de estas solicitudes relacionadas con el método
y con el aparato para llevar a cabo un ensayo de transferencia de
inmunomanchas se incorporan a la presente por referencia.
Los péptidos descritos en la presente pueden ser
utilizados en ensayos que emplean un primer y un segundo soporte
sólido, según sigue, para detectar anticuerpos hacia un antígeno
específico de un analito en una muestra de ensayo. En este formato
de ensayo, una primera alícuota de una muestra de ensayo es puesta
en contacto con un primer soporte sólido revestido con un primer
péptido específico para un analito durante un tiempo y bajo
condiciones suficientes para formar complejos péptido/anticuerpo
hacia el analito. Posteriormente, estos complejos son puestos en
contacto con un reactivo indicador específico para el péptido. La
señal generada a partir del reactivo indicador es detectada para
determinar la presencia, si es que la hay, de anticuerpo hacia el
péptido presente en la muestra de ensayo. Después de esto, se
determina la presencia de un determinante antigénico diferente del
mismo analito poniendo en contacto una segunda alícuota de una
muestra de ensayo con un segundo soporte sólido revestido con un
péptido sintético o con una proteína recombinante para el segundo
anticuerpo durante un tiempo y bajo condiciones suficientes para
formar complejos proteína recombinante o péptido sintético/segundo
anticuerpo. Los complejos son puestos en contacto con un segundo
reactivo indicador específico para el anticuerpo del complejo. Se
detecta la señal generada a partir del reactivo indicador con el fin
de determinar la presencia de anticuerpo en la muestra de ensayo, en
la cual la presencia de anticuerpo hacia cualquiera de los analitos,
o hacia ambos, indica la presencia de anti-analito
en la muestra de ensayo. Se contempla también que los soportes
sólidos puedan ser analizados simultáneamente.
Pueden utilizarse haptenos para intensificar la
señal generada y, por tanto, la sensibilidad del ensayo. La
utilización de haptenos es conocida en la técnica. Se contempla que
pueden utilizarse también haptenos en ensayos que empleen los
péptidos descritos en la presente con el fin de incrementar el
rendimiento del ensayo.
Otro método de ensayo para la detección de
anticuerpos en una muestra de ensayo de acuerdo con la presente
invención incluye procedimientos de citometría de flujo y
procedimientos de recuento de partículas. Por ejemplo, en el
recuento de partículas, los analitos que son anticuerpos miembros de
pares de unión específica son cuantificados mezclando una alícuota
de muestra de ensayo sospechosa de contener un anticuerpo específico
con micropartículas revestidas con un reactivo de captura específico
para tal anticuerpo, tal como al menos uno de los péptidos descritos
en la presente, capaz de unirse al anticuerpo de interés como el
otro miembro del par de unión específica. Si el anticuerpo está
presente en la muestra de ensayo, se unirá a algunas de las
micropartículas revestidas con el reactivo de captura y se formarán
aglutinados. La concentración del analito es inversamente
proporcional al recuento de partículas no aglutinadas. Ver, por
ejemplo, Rose y col., eds., Manual of Clinical Laboratory
Immunology, 3ª edición, Capítulo 8, páginas
43-48, American Society for Microbiology,
Washington, D.C. (1986).
Los métodos de citometría de flujo que detectan
señales electrónicas y ópticas procedentes de células o partículas
que son iluminadas, permiten la determinación de características de
la superficie celular, del volumen y del tamaño de la célula. Los
anticuerpos presentes en, por ejemplo, una muestra de ensayo son
unidos a un péptido descrito en la presente y detectados con un
colorante fluorescente que está conjugado directamente al péptido o
que es añadido a través de una segunda reacción. Pueden utilizarse
diferentes colorantes, que pueden ser excitables a diferentes
longitudes de onda, con más de un péptido específico para diferentes
analitos, de tal manera que puede detectarse más de un analito en
una muestra. En citometría de flujo de fluorescencia, una suspensión
de partículas, típicamente las células de una muestra de ensayo, es
transportada a través de una celda de flujo en la que las partículas
individuales de la muestra son iluminadas con uno o más haces de luz
focalizados. Uno o más detectores detectan la interacción entre
el(los) haz(ces) de luz y las partículas marcadas que
fluyen a través de la celda de flujo. Comúnmente, algunos de los
detectores están diseñados para medir emisiones de fluorescencia,
mientras que otros detectores miden la intensidad de la dispersión o
la duración del pulso. De este modo, cada partícula que pasa a
través de la celda de flujo puede ser representada en un espacio de
características cuyos ejes son los colores de emisión, las
intensidades de la luz u otras propiedades, esto es, la dispersión,
medidas por los detectores. En una situación, las diferentes
partículas de la muestra están representadas en regiones distintas y
no solapantes del espacio de características, permitiendo que cada
partícula sea analizada sobre la base de su encuadre en el espacio
de características. Con el fin de preparar una muestra de ensayo
para análisis de citometría de flujo, el operador pipetea
manualmente un volumen de muestra de ensayo procedente del tubo de
ensayo en un tubo de análisis. Se añade un volumen del péptido
marcado con el fluorocromo deseado. Posteriormente, la mezcla
muestra/péptido es incubada durante un tiempo y bajo condiciones
suficientes para permitir que tengan lugar las uniones
anticuerpo/péptido. Después de la incubación, y si es necesario, el
operador añade un volumen de "RNS lyse" para destruir los
glóbulos rojos sanguíneos de la muestra. Después de la lisis, la
muestra es centrifugada y lavada para eliminar los desechos
celulares que queden de la etapa de lisis. La etapa de
centrifugación/lavado puede ser repetida varias veces. La mezcla es
resuspendida en un volumen de un fijador y la muestra pasa luego a
través del instrumento de citometría de flujo de fluorescencia. Un
método y un aparato para realizar un análisis de flujo automatizado
están descritos en la Solicitud de Patente de EE.UU. copropiedad Nº
de Serie 08/283.379, que se incorpora a la presente por referencia.
Está dentro del ámbito de la presente invención el que puedan
utilizarse microesferas en los métodos descritos en la presente,
etiquetadas o marcadas, y empleadas para aplicaciones de diagnóstico
in vitro. Está también dentro del ámbito de la presente
invención el que otras células o partículas, incluyendo bacterias,
virus, duracitas, etc., puedan ser etiquetadas o marcadas con los
PNAs o con un compuesto de morfolino según está descrito por la
presente invención y utilizadas en métodos de citometría de
flujo.
La presente invención será descrita ahora por
medio de ejemplos, que están destinados a ilustrar, pero no a
limitar, el espíritu y el ámbito de la invención.
Todos los péptidos fueron sintetizados en un
Sintetizador de Péptidos de ABI, Modelo 431A, utilizando la química
de FMOC, ciclos estándar y activación con DCC-HOBt.
Las condiciones de corte y desprotección fueron según sigue: la
resina fue añadida a 20 ml de ácido trifluoroacético, 0,3 ml de
agua, 0,2 ml de etanoditiol, 0,2 ml de tioanisol y 100 mg de fenol,
y se agitó a temperatura ambiente durante 1,5 horas. La resina fue
posteriormente filtrada mediante succión y el péptido fue obtenido
por precipitación de la solución de TFA con éter seguido por
filtración. Cada péptido fue purificado mediante HPLC preparativa de
fase reversa utilizando un gradiente de agua/acetonitrilo/TFA 0,1% y
liofilizado. El producto fue confirmado mediante espectrometría de
masas.
La formación de enlaces disulfuro fue realizada
utilizando condiciones de auto-oxidación, según
sigue. El péptido fue disuelto en una cantidad mínima de DMSO (10 ml
aproximadamente) antes de añadir el tampón (Tris 0,1 M, pH 6,2) a
una concentración de 0,3 - 0,8 mg/ml. La reacción fue monitorizada
por HPLC hasta la formación completa del enlace disulfuro, seguido
por HPLC preparativa de fase reversa utilizando un gradiente de
agua/acetonitrilo/TFA 0,1% y liofilización. El producto fue
confirmado posteriormente mediante espectrometría de masas. Todos
los péptidos contenían un bucle de disulfuro formado entre los dos
residuos de cisteína (C).
A. Obtención de Muestras. Las muestras
"M" y "E" de subtipo O pertenecían al panel francés
original de nueve muestras de subtipo O confirmado; son las mismas
que las muestras #7 y #2, respectivamente (I.
Loussert-Ajaka y col., The Lancet 343:
1393-1394 (1994)). Las muestras DUR, FAN y MAA eran
otras muestras de subtipo O del gobierno francés.
Las muestras #2901 y HA112 fueron obtenidas,
respectivamente, de los profesores Lutz Gürtler de Munich y Hartmut
Hampl de Berlin, Alemania. Las muestras #193, #267, #341 y #655
fueron obtenidas de Guinea Ecuatorial y se confirmó por PCR que eran
muestras de subtipo O auténticas.
B. EIA. Los péptidos fueron disueltos
primeramente en tampón de ácido morfolinoetano sulfónico (MES) 0,1
M, pH 5,5, a una concentración de 20 \muM. Para la etapa de
revestimiento, se añadieron 200 \mul de varias diluciones (de 0 a
5 veces) de las soluciones 20 \muM (en tampón MES 0,1 M, pH 5,5)
de cada péptido a los pocillos de placas Microtiter™ (Dynatech
Immunolon 4 poliestireno). Después de la incubación durante una
noche a temperatura ambiente, las placas fueron lavadas con una
solución de lavado que contenía leche seca desnatada al 0,5% en TBST
(solución salina tamponada con Tris, Tris 0,01 M, NaCl 0,15 M,
Tween-20® 0,05%, pH 8). La etapa de bloqueo requería
la adición de 300 \mul de una solución de leche seca desnatada al
10% en TBST a cada pocillo, seguido por una incubación de una hora a
temperatura ambiente. Las placas fueron luego lavadas con solución
de lavado, antes de que fueran añadidos a cada pocillo muestras de
150 \mul de suero/plasma diluidas 150 veces en leche al 10% en
TBST. Después de una incubación de dos horas a temperatura ambiente,
las placas fueron lavadas de nuevo con la solución de lavado y
posteriormente se añadieron a cada pocillo 100 \mul de una
dilución de 16.000 veces de conjugado (anti-IgG
humana de cabra-peroxidasa de rábano picante (HRPO),
1 mg/ml, Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc., Gaithersburg,
MD) en leche seca desnatada al 10% en TBST. Después de una
incubación de una hora, las placas fueron lavadas con la solución de
lavado. La producción de color se consiguió con la adición a cada
pocillo de 100 \mul de una solución de o-feniléndiamina
(OPD) en peróxido de hidrógeno y una incubación de diez minutos. La
reacción de producción de color fue amortiguada con 100 \mul de
ácido sulfúrico 1 N y se determinó la absorbancia con un lector de
placas Dynatech MR5000 a las longitudes de onda de 490 nm y 630 nm.
Las intensidades relativas de A_{490} - A_{630} de los pocillos
eran proporcionales a la eficacia con la cual un péptido particular
reaccionaba con una muestra particular de suero/plasma.
Este ejemplo demuestra la importancia de la
sustitución de S por K (SECUENCIA I.D. Nº 2) en la detección de
algunas muestras de VIH-1 subtipo O (#2901, #267 y
#655), la importancia de la sustitución de T por Y (SECUENCIA I.D.
Nº 3) en la detección de algunas otras muestras de
VIH-1 subtipo O (#193, "E" y HA112), y que la
SECUENCIA I.D. Nº 2 y la SECUENCIA I.D. Nº 3 eran ambas en general
superiores en funcionamiento a la SECUENCIA I.D.
Nº 1.
Nº 1.
El ensayo fue realizado según se describió en el
Ejemplo 2. Observar, por favor, que la concentración de péptido
utilizada para revestir los pocillos fue de 20 \muM y que las
diluciones de las muestras de suero/plasma fueron: 150 veces para
#193, #267, #341, #655, HA112 y DUR; 450 veces para #2901, las
muestras "E" y FAN; 750 veces para la muestra MAA; y 1500 veces
para la muestra "M". Se utilizaron como controles negativos
para este estudio muestras de VIH humanas confirmadas negativas.
Los valores de absorbancia presentados en las
Tablas 1, 2 y 3 fueron calculados como A_{490} - A_{630}.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Este ejemplo demostró que el péptido
disustituido, S por K y T por Y (SECUENCIA I.D. Nº 4), era
notablemente superior en funcionamiento a la SECUENCIA I.D. Nº 1 en
la detección de 10 de un total de 11 muestras de subtipo O.
El ensayo fue realizado según se describió en el
Ejemplo 2. Observar, por favor, que la concentración de péptido
utilizada para el revestimiento de los pocillos fue de 20 \muM y
las diluciones de las muestras de suero/plasma fueron: 150 veces
para #193, #267, #341, #655, HA112 y DUR; 450 veces para #2901,
muestras "E" y FAN; 750 veces para la muestra MAA y 1500 veces
para la muestra "M". Según se describió en el Ejemplo 3, se
utilizaron como controles negativos para este estudio muestras de
VIH humanas confirmadas negativas.
Los números presentados en las Tablas 4, 5 y 6
son valores de absorbancia (A_{490} - A_{630}).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A. Protocolo experimental. La
inmunorreactividad relativa de los péptidos sintéticos del VIH fue
medida utilizando placas de 96 pocillos revestidas durante 16 horas
a 4ºC con 100 \mul de cada uno de los péptidos siguientes
preparados según se describió en el Ejemplo 1: consenso B (SECUENCIA
I.D. Nº 1), B/O-7 (SECUENCIA I.D. Nº 2),
B/O-8 (SECUENCIA I.D. Nº 3) y B/O-2
(SECUENCIA I.D. Nº 4). Los péptidos fueron evaluados a las
concentraciones siguientes: 500 \muM, 50 \muM, 5 \muM, 0,5
\muM, 0,05 \muM y 0,005 \muM. El tampón utilizado para la
aplicación de estos péptidos fue ácido
morfolino-etano sulfónico 100 mM, pH 5,5. Los
pocillos revestidos con el péptido fueron luego lavados tres veces
con el tampón de lavado que constaba de fosfato de sodio 8 mM,
fosfato de potasio 2 mM, cloruro de sodio 140 mM, cloruro de potasio
10 mM, Tween 20 0,05%, seroalbúmina bovina 0,1%, pH 7,4.
Los pocillos fueron posteriormente bloqueados una
hora a temperatura ambiente con polvo de leche desnatada Carnation®
al 9% (p/v) en solución salina tamponada con fosfato: fosfato de
sodio 8 mM, fosfato de potasio 2 mM, cloruro de sodio 140 mM,
cloruro de potasio 10 mM, pH 7,4. Los pocillos fueron luego lavados
3 veces con el tampón de lavado.
Muestras de suero humano (#193, #267, #341, #655
y "M") fueron diluidas 150 veces con polvo de leche desnatada
Carnation® al 4,5% (p/v) en PBS. Se incubaron 100 \mul de estas
muestras en los pocillos a 37ºC durante 1 hora. Los pocillos fueron
luego lavados 3 veces con el tampón de lavado.
Las muestras positivas para anticuerpos que
contenían el complejo anticuerpo hacia el
VIH-antígeno peptídico, fueron detectadas utilizando
peroxidasa de rábano picante conjugada a anti-IgG
humana de cabra. Se añadieron a cada pocillo 100 \mul de conjugado
HRPO-anti-IgG humana de cabra,
diluido 1:5000 en el tampón de lavado, y se incubaron a temperatura
ambiente durante 1 hora. Los pocillos fueron luego lavados 3 veces
con tampón de lavado y se calculó la concentración de anticuerpo
hacia el VIH mediante lecturas de la absorbancia a 405 nm después de
exponer los pocillos a 100 \mul de una solución de ABTS (ácido
2,2'-azinobis-[3-etilbenzotizolina-6-sulfónico]
sal diamónica) de Pierce.
B. Análisis de los datos. Las lecturas de
la absorbancia a 405 nm fueron normalizadas respecto a la SECUENCIA
I.D. Nº 4 y se representaron gráficamente las reactividades
relativas frente al log de la concentración del péptido utilizada
para revestir los pocillos. Los datos fueron ajustados a una
ecuación que describe una curva sigmoidea según se encuentra en el
programa Origin creado por Microcal Inc.
y = (A_{1} -
A_{2})/\{1 + (x/x_{0}) ^ p \} +
A_{2}
en la cual x_{0} es el centro de
la curva, p es la velocidad, A_{1} es y inicial y A_{2} es y
final.
C. Resultados. Las Figuras 1, 2, 3 y 4
ilustran que la concentración de péptido de 20 \muM es suficiente
para generar una señal de saturación, validando así los datos
previos de los Ejemplos 3 y 4.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: Bridon, D.P.
\hskip3,9cmSze, I.S.Y.
\hskip3,9cmDaghfal, D.J.
\hskip3,9cmJaffe, K.D.
\hskip3,9cmColpitts, T.L.
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Péptidos para la Detección de VIH-1
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 4
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: ABBOTT LABORATORIES
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: ONE HUNDRED ABBOTT PARK ROAD
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: ABBOTT PARK
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: IL
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EE.UU.
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 60064-3500
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco magnético flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE REGISTRO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- INFORMACIÓN SOBRE EL REPRESENTANTE/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: POREMBSKI, PRISCILLA E.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 33207
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 5765.US.01
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 708-937-6365
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 708-938-2623
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys
Ser Gly Lys Leu}
\sac{Ile Cys Thr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys
Lys Gly Lys Leu}
\sac{Ile Cys Thr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys
Ser Gly Lys Leu}
\sac{Ile Cys Tyr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº:4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 19 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE HEBRA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys
Lys Gly Lys Leu}
\sac{Ile Cys Tyr Thr}
Claims (9)
1. El polipéptido que tiene una mutación puntual
en la RID del VIH-1 subtipo B y que tiene la
secuencia de la SECUENCIA ID Nº 2:
\sa{Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys
Lys Gly Lys Leu}
\sac{Ile Cys Thr Thr}.
2. El polipéptido que tiene una mutación puntual
en la RID del VIH-1 subtipo B y que tiene la
secuencia de la SECUENCIA ID Nº 3:
\sa{Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys
Ser Gly Lys Leu}
\sac{Ile Cys Tyr Thr}.
3. El polipéptido que tiene dos mutaciones
puntuales en la RID del VIH-1 subtipo B y que tiene
la secuencia de la SECUENCIA ID Nº 4:
\sa{Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys
Lys Gly Lys Leu}
\sac{Ile Cys Tyr Thr}.
4. Un inmunoensayo para detectar la presencia de
anticuerpos hacia VIH subtipo O en una muestra de ensayo, que
comprende:
a) la puesta en contacto de dicha muestra de
ensayo con una fase sólida a la cual ha sido fijado un polipéptido
del VIH-1 de acuerdo con las reivindicaciones
1-3 para formar una primera mezcla, y la incubación
de dicha primera mezcla durante un tiempo y bajo condiciones
suficientes para formar complejos polipéptido/anticuerpo;
b) la puesta en contacto de dichos complejos
polipéptido/anticuerpo con un reactivo indicador que comprende un
miembro de un par de unión específica unido a un compuesto generador
de señal capaz de producir una señal medible para formar una segunda
mezcla, y la incubación de dicha segunda mezcla durante un tiempo y
bajo condiciones suficientes para formar complejos
polipéptido/anticuerpo/reactivo indicador; y
c) la determinación de la presencia de
anticuerpos hacia VIH subtipo O en dicha muestra de ensayo mediante
la detección de la señal medible.
5. El inmunoensayo de la reivindicación 4, en el
cual dicha fase sólida es seleccionada del grupo que consta de las
paredes de los pocillos de una placa de reacción, tubos de ensayo,
esferas de poliestireno, esferas magnéticas, tiras de nitrocelulosa,
membranas, micropartículas tales como partículas de látex, glóbulos
rojos sanguíneos de carnero (o de otro animal) y duracitas.
6. El inmunoensayo de la reivindicación 4, en el
que dicho reactivo indicador comprende un compuesto generador de una
señal seleccionado del grupo que consta de cromógenos, enzimas,
compuestos luminiscentes, compuestos quimioluminiscentes, elementos
radioactivos y marcas visuales directas.
7. El inmunoensayo de la reivindicación 4, en el
que dicho miembro del par de unión específica de dicho reactivo
indicador es anti-IgG humana.
8. Un inmunoensayo para detectar anticuerpos
hacia el VIH de subtipo O en una muestra de ensayo, que comprende la
puesta en contacto de dicha muestra de ensayo con un polipéptido del
VIH-1 y la detección de la presencia de dicho
anticuerpo, en el que la mejora comprende la utilización de un
polipéptido de acuerdo con las reivindicaciones
1-3.
9. Un kit de ensayo para diagnóstico capaz de
detectar anticuerpos hacia el VIH de subtipo O, que comprende un
recipiente conteniendo un polipéptido que tiene una secuencia
seleccionada del grupo que consta de SECUENCIA ID Nº 2, SECUENCIA ID
Nº 3 y SECUENCIA ID Nº 4.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US47259795A | 1995-06-07 | 1995-06-07 | |
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|---|---|
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES96921412T Expired - Lifetime ES2220982T3 (es) | 1995-06-07 | 1996-06-07 | Peptidos destinados a la deteccion del vih-1. |
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