ES2220997T3

ES2220997T3 - Metodos para la deteccion de poblaciones clonales de celulas transformadas en una muestra celular genomicamente heterogenea.

Info

Publication number: ES2220997T3
Application number: ES96944531T
Authority: ES
Inventors: Stanley N. Lapidus; Anthony P. Shuber; Kevin M. Ulmer
Original assignee: Exact Sciences Corp
Current assignee: Exact Sciences Corp
Priority date: 1995-12-22
Filing date: 1996-12-20
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2016-12-20
Also published as: WO1997023651A1; CA2211702A1; JP3325270B2; JPH10503384A; EP0815263B1; EP0815263A1; ATE264922T1; AU1430797A; AU711754B2; DE69632252T2; CA2211702C; DE69632252D1

Abstract

SE PROPORCIONAN METODOS PARA LA DETECCION DE LA PRESENCIA DE SECUENCIAS MUTANTES EN UNA SUBPOBLACION DE SECUENCIAS GENETICAS EN UNA MUESTRA BIOLOGICA. ESTOS METODOS SON ESPECIALMENTE UTILES PARA LA IDENTIFICACION DE INDIVIDUOS CON MUTACIONES GENETICAS INDICATIVAS DE CANCER COLORRECTAL PRECOZ.

Description

Métodos para la detección de poblaciones clonales de células transformadas en una muestra celular genómicamente heterogénea.

Campo del invento

Este invento se refiere a métodos útiles para el diagnóstico de enfermedades detectando la presencia de mutaciones genéticas, incluyendo deleciones, en muestras celulares que contiene una pequeña cantidad de material genético mutado disperso dentro de una cantidad importante de material genético diagnósticamente irrelevante (normal). Los métodos del invento son especialmente útiles en la detección de mutaciones genéticas características del cáncer.

Antecedentes del invento

El cáncer es una enfermedad caracterizada por inestabilidad genómica. Generalmente, inestabilidad genómica define una amplia clase de alteraciones en las secuencias nucleotídicas genómicas. Tales alteraciones incluyen la pérdida de heterozigosidad (caracterizada normalmente por una pérdida masiva de ADN cromosómico), inestabilidad de los microsatélites (indicativa normalmente de defectos en los mecanismos de reparación del ADN), y mutaciones (que incluyen inserciones, deleciones, sustituciones, duplicaciones, reordenamientos, o modificaciones). Numerosas inestabilidades genómicas han sido asociadas con cáncer. Por ejemplo, mutaciones en un número de oncogenes y genes supresores de tumores han sido implicados en tumorigénesis. Duffy, Clin. Chem., 41: 1410-1413 (1993). Además la pérdida de heterozigosidad en el locus del supresor de tumores p53 ha sido correlacionada con diversos tipo de cáncer. Ridanpaa, y otros., Path. Res. Pract, 191: 399-402 (1995). La pérdida u otra mutación de los genes supresores de tumores apc y dcc ha sido también asociada con desarrollo de tumores. Blum, Europ. J. Cancer, 31A: 1369-372 (1995). Finalmente, la tumorigénesis ha sido también correlacionada con la inestabilidad de microsatélites.

Los cambios genéticos característicos de inestabilidad genómica pueden servir teóricamente como indicadores para las etapas tempranas de, por ejemplo, cáncer de colon, y pueden ser detectadas en ADN aislado de biopsias de epitelio del colon y en algunos casos de células transformadas liberadas a la materia fecal. Sidransky, y otros., Science, 256: 102-105 (1992).

Los métodos de detección propuestos en la técnica llevan demasiado tiempo y son caros. Duffy, supra. Por otro lado, los métodos según la técnica no pueden ser usados para identificar un pérdida de heterozigosidad o inestabilidad de microsatélites en pequeñas subpoblaciones de células cuando las células existen en una muestra heterogénea (es decir, clonalmente impura). Por ejemplo, en el documento de patente norteamericana Nº 5.527.676, se establece que las muestras tisulares en las cuales una mutación ha de ser detectada debería estar enriquecida en lo que se refiere a células tumorales para detectar la pérdida de heterozigosidad en un gen p53.

Las técnicas, tales como PCR, han sido usadas para detectar una pérdida de heterozigosidad resultante de deleciones masivas características de adenomas en estadio tardío. Véase, por ejemplo, el documento de patente norteamericana Nº 5.330,892. Tales técnicas requieren generalmente el uso de un gran número de pares de cebadores, y no funcionarán en absoluto en una muestra heterogénea. Una publicación reciente informa del uso de técnicas de PCR y de ELISA para realizar análisis cuantitativo de mutaciones en tumores en estadío temprano. Documento de patente norteamericana Nº 5.512.441. La identificación de una subpoblación anormal de células en una muestra heterogénea de células en su mayoría normales y restos celulares, subpoblación que se caracteriza por la pérdida de heterozigosidad o inestabilidad de microsatélites, es aún más difícil debido a que tal detección implica la identificación de una subpoblación de fragmentos nucleotídicos que son difíciles de distinguir del mar de material celular normal heterogéneo en el cual existen. Un problema adicional es que la mutación en cualquier locus de un número creciente de oncogenes diferentes o genes supresores de tumores puede dar como resultado un cáncer, y una aproximación por cribado capaz de hacer un barrido de todos o incluso la mayoría de loci en estos genes no está disponible actualmente.

La inestabilidad de microsatélites puede ser un indicador de cáncer. Los microsatélites se dispersan a través del genoma a una frecuencia promedio de alrededor de 1 en 100.000 pares de bases. Éstos comprenden repeticiones en tandem o trinucleótidos que normalmente se heredan en una forma estable. Véase por ejemplo, Charlesworth, y otros, Nature, 371: 215-220 (1994). Mientras que estas secuencias realizan funciones desconocidas en el genoma, muchas de ellas han sido situadas en el mapa genómico y han sido usadas como indicadores basados en sus polimorfismos de longitud de secuencia. Los cambios clonales en microsatélites del ADN asociados con defectos en las rutas de reparación de apareamientos incorrectos se piensa que son indicadores adecuados para el cáncer colorectal no polipósico hereditario (HNPCC). En muestras de tumores HNPCC, por ejemplo, se encontró que los microsatélites tienen múltiples inserciones y/o deleciones. La inestabilidad de microsatélites puede ser un indicador eficaz de fallo de reparación de apareamientos incorrectos en oncogenes o en genes supresores de tumores. Mientras que la inestabilidad de los microsatélites en sí misma no es indicativa de cáncer, hay evidencias de que las mutaciones pueden tener lugar en regiones que son críticas para el comienzo del cáncer. Quiere decir que la detección de la inestabilidad de microsatélites indica que el paciente está en riesgo de desarrollar una subpoblación clonal de células cancerosas.

El cáncer colorectal es una causa común de muerte en la sociedad occidental. Cualquier tumor o pólipo precanceroso que se desarrolla a lo largo de la longitud del colon o el recto libera células o ADN de células en el lumen del colon. Las células o ADN celular liberados son incorporados normalmente a las heces según las heces pasan a través del colon. En los estadíos tempranos del cáncer, las células cancerosas o precancerosas representan una fracción muy pequeñas de las células epiteliales o ADN liberados a las heces. Los métodos actuales para la detección de cáncer colorectal no se centran en detectar células cancerosas o precancerosas en las heces. Más bien, tales métodos se centran típicamente en indicios extracelulares de la presencia del cáncer, tal como la presencia de sangre fecal oculta o antígenos carcinoembrionarios circulantes en el suero.

Se sabe, sin embargo, que tanto los cánceres colorectales esporádicos como hereditarios son resultado de mutaciones en oncogenes y genes supresores de tumores. Tales mutaciones parecen tener lugar en un punto en la etiología de la enfermedad que es mucho mas temprana que el punto en el cual los indicios extracelulares o signos clínicos del cáncer son observados. Si se detecta tempranamente, el cáncer de colon puede ser tratado eficazmente mediante la eliminación quirúrgica del tejido canceroso. La eliminación quirúrgica del cáncer de colon de estadío temprano es normalmente exitosa debido a que el cáncer de colon empieza en células del epitelio del colon y se aísla de la circulación general hasta que tiene lugar la invasión a través del revestimiento epitelial. Así, la detección de las mutaciones tempranas en las células colorectales aumentaría enormemente la tasa de supervivencia.

Los métodos no invasivos actuales para la detección del cáncer de colon implican la detección de sangre fecal oculta y el antígeno carcinoembrionario. Estos métodos de cribado, con frecuencia fallan bien a la hora de detectar el cáncer colorectal o bien detectan el cáncer colorectal sólo después de que ha progresado a un estadío no tratable. Por otro lado, el antígeno carcinoembrionario se piensa que no es un pronosticador eficaz del cáncer sino meramente un indicador de cáncer recurrente.

Las técnicas invasivas, tales como la endoscopia, aunque son eficaces, son caras y dolorosas y tienen una baja conformidad del paciente. Consecuentemente, los métodos actuales de cribado de cáncer de colon no son prácticos para cribar segmentos grandes de la población. Véase, por ejemplo, Blum, Europ. J. Cancer, 31A: 1369-1372 (1995).

Por lo tanto, hay una necesidad en la técnica en lo que se refiere a métodos no invasivos simples y eficaces para el cribado a gran escala fiables para identificar individuos con cáncer de colon en estadío temprano. Tales métodos son proporcionados aquí.

Sumario del invento

El invento se refiere a un método para detectar la presencia de una subpoblación de células en una muestra biológica obtenida de un organismo que comprende las etapas de:

a) determinar a partir de la muestra biológica un número X de un primer polinucleótido silvestre característico de una región que no está mutada, en dicha subpoblación de células;

b) determinar a partir de la muestra biológica un número Y de un segundo polinucleótido silvestre que se sospecha que está mutado en dicha subpoblación de células; y

c) determinar si existe una diferencia estadísticamente significativa entre dicho número X en el que dicho número X es indicativo de la cantidad de un alelo de referencia en dicha muestra y dicho número Y en el que dicho número Y es indicativo de la cantidad de alelo diana silvestre en dicha muestra, siendo la presencia de una diferencia estadísticamente significativa indicativa de la presencia de una subpoblación de células en dicha muestra biológica.

El presente invento también proporciona métodos para detectar una subpoblación de células transformadas genómicamente o restos celulares. Tales métodos detectan la presencia en una muestra biológica de una subpoblación clonal de células que tienen un genoma diferente del de las células silvestres, y de los organismos bacterianos, parásitos, o contaminantes que pueden también estar presentes en la muestra. La práctica del invento permite, por ejemplo, la detección de una cantidad en trazas de ADN derivado de células cancerosas o precancerosas en una muestra biológica que contiene una mayoría de ADN "normal" o células completas. Un uso preferido de los métodos es detectar de modo fiable en una muestra fecal evacuada por un paciente la presencia de una cantidad en trazas de células y/o restos celulares que contienen ADN liberado en el colon en el sitio de una lesión precancerosa o cancerosa asintomática. El invento se aprovecha de varias ideas importantes que permiten, por ejemplo, una detección fiable de una deleción de ADN en un sitio genómico conocido característico de un tipo celular canceroso conocido.

En general, el invento comprende la medida comparativa de dos secuencias genómicas. Una secuencia genómica es estable a través de una transformación, (es decir, es idéntica tanto en las células malignas como en las silvestres, en la muestra). Una segunda secuencia genómica sufre típicamente cambios durante el transcurso de la transformación (es decir, se muta durante el desarrollo de células precursoras malignas). Las sondas de hibridación se usan para detectar la presencia de cada secuencia genómica. Si el número de eventos de hibridación que implican las dos secuencias genómicas es diferente, la diferencia puede ser debida a un fondo insignificante o puede ser debida a diferencias estadísticamente significativas en las cantidades de las dos secuencias genómicas en la población a partir de la que se saca la muestra. En el último caso, la diferencia puede correlacionarse, a un grado de confianza estadística definida, con la presencia en la muestra de una subpoblación de células que tienen una secuencia genómica alterada (es decir, no silvestre).

El invento puede dividirse en tres realizaciones generales. (1) En una primera realización general, una cantidad cuantitativa (número de copias) de un gen o fragmento génico de interés en una muestra (es decir, un gen cuya mutación se conoce o se sospecha que está asociada con cáncer) se compara con una cantidad cuantitativa de un gen o fragmento génico de referencia en la muestra, siendo el gen de referencia un gen que no está normalmente asociado con cáncer y que normalmente tiene una baja tasa de mutación. Una diferencia estadísticamente significativa entre las dos cantidades cuantitativas es indicativa de una inestabilidad genómica en una subpoblación celular en la muestra. (2) En una segunda realización general del invento, una cantidad cuantitativa de una región en un alelo materno se compara con una cantidad cuantitativa de la región correspondiente en un alelo paterno. Una diferencia estadísticamente significativa entre las dos cantidades cuantitativas es indicativa de inestabilidad genómica. (3) En una tercera realización general, el número de repeticiones de microsatélites en un locus particular es comparada entre los alelos maternos y paternos. Una diferencia estadísticamente significativa en esos números es indicativo de un error en los mecanismos de reparación de apareamientos incorrectos en una subpoblación de células en la muestra o puede indicar que la pérdida alélica ha tenido lugar. Como se establece anteriormente, errores en la reparación de apareamientos incorrectos pueden dar como resultado mutaciones en genes supresores de tumores o en oncogenes. La detección del cáncer en cualquiera de las tres realizaciones del invento se logra midiendo el número de hibridaciones entre al menos dos sondas nucleotídicas diferentes y sus secuencias genómicas respectivas.

Una característica del invento es que ahora se ha reconocido que los materiales de células que recubren el colon (por ejemplo, un pólipo o lesión) son liberados a las heces que se están formando sólo en una región que comprende una banda longitudinal a lo largo de la longitud de las heces. Así, a menos que la muestra fecal en investigación sea unas heces completas o comprenda al menos una sección transversal de unas heces, la muestra sólo contendrá la información diagnóstica relevante por casualidad. El colon contiene numerosos dobleces y pliegues a lo largo de toda su longitud. Véase, la solicitud de patente norteamericana con número de serie, ____________ (Expediente del agente No. EXT-002), presentada conjuntamente en la misma fecha. Las células epiteliales que recubren el colon migran normalmente desde una posición basal en criptas del colon, en las que las células madre se dividen por mitosis, hasta la cima de las criptas y son entonces liberadas al lumen. Las células epiteliales del colon que recubren el lumen intestinal son típicamente regeneradas cada cuatro o cinco días como resultado de la rápida tasa de recambio a través del epitelio. Consecuentemente, las células epiteliales liberadas o su ADN están siendo depositadas constantemente en las heces en formación según pasan a través del lumen. Según proceden las heces hacia el recto y se vuelve progresivamente más sólidas (desde un estado líquido inicial), las células epiteliales son sólo liberadas en la porción de las heces que tiene contacto con la porción del lumen que previamente contenía esas células en su recubrimiento epitelial. Las células epiteliales de un pólipo (un pólipo es un crecimiento precanceroso; aunque que no todos los pólipos se vuelven cancerosos, casi todos los cánceres surgen de pólipos) sufren el mismo ciclo de vida y liberación rápidos descritos anteriormente para células epiteliales del colon normales. Consecuentemente, las células liberadas de los pólipos son típicamente absorbidas sólo en la superficie de las heces en formación que hacen contacto con el pólipo. Sin embargo, si las heces están en un estado líquido, la mezcla de células de pólipo liberadas a través de todas las heces tiene lugar automáticamente.

Consecuentemente, el presente invento proporciona métodos para detectar cambios genómicos en una subpoblación de células en una muestra de material biológico. Los métodos del invento son útiles para la detección de cambios en la secuencia nucleotídica de un alelo en una subpoblación pequeña de células presentes en una muestra grande, heterogénea de material biológico diagnósticamente irrelevante. Los métodos del invento son útiles para la detección y diagnosis de una anormalidad genética, tal como una pérdida de heterozigosidad o, más generalmente, una mutación, que puede correlacionarse con una enfermedad, tal como el cáncer. Para propósitos del presente invento, a menos que el contexto lo requiera de otra manera, una "mutación" incluye modificaciones, reordenamientos, deleciones, sustituciones, y adiciones en una porción de ADN genómico o su mARN correspondiente.

En una realización preferida, el invento proporciona métodos para detectar una subpoblación clonal de células transformadas contenidas en, o que se sospecha que están contenidas en, una muestra biológica obtenida de un organismo, tal como un humano. Los métodos comprenden las etapas de determinar a partir de la muestra biológica, un número X de un primer polinucleótido silvestre que se conoce o se sospecha que no está mutado ni en células silvestres ni en células transformadas. Una etapa adicional comprende determinar a partir de la muestra biológica, un número Y de un segundo polinucleótido silvestre que se sospecha que está mutado en una subpoblación de células en la muestra biológica. Entonces, se determina si existe una diferencia estadísticamente significativa entre X e Y. En una muestra normal no hay mutaciones y así no hay diferencias estadísticamente significativas entre el número de cada uno de los genes somáticos en una célula normal. Como resultado, X e Y no son diferentes el uno del otro en un sentido estadísticamente significativo. Por el contrario, la presencia de una diferencia estadísticamente significativa entre X e Y es indicativa de la presencia de una subpoblación clonal de células transformadas en la muestra biológica que expresa una mutación. La significancia estadística puede determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica. Sin embargo, no se necesita realizar una medida formal de la significancia estadística en conexión con cualquier ensayo dado. Más bien, los ensayos están diseñados para detectar un número suficientemente grande de eventos de unión tales que al menos una diferencia umbral entre los números sea indicativa del resultado de la presencia de una subpoblación mutante de células a cualquier nivel deseado de certeza.

También, en una realización preferida, las células transformadas que se busca detectar usando métodos según el invento son células malignas. Las células transformadas detectadas según los métodos del invento pueden ser transformantes inducidas, trasformadas, por ejemplo, por un virus, por radiación, o por medios químicos u otros medios carcinogénicos. Los métodos del invento puede realizarse sobre una muestra biológica, incluyendo muestras de tejidos y fluidos corporales. Las muestras biológicas particularmente preferidas incluyen pus, esputos, semen, sangre, saliva, fluido cerebroespinal, y orina. En una realización importante del invento la muestra son heces que se analizan para detectar cáncer o precáncer colorectal. Los métodos del invento pueden ser practicados exponiendo la muestra biológica a una o más sondas oligonucleotídicas para detectar de manera separada el número X de un primer polinucleótido y el número Y de un segundo polinucleótido. Las sondas para usar en el invento están marcadas de modo detectable. Las marcas preferidas incluyen marcas fluorescentes unidas, por ejemplo, mediante pares de unión por afinidad (tales como carbohidratos/lectina o avidina/biotina). Las marcas altamente preferidas son partículas microscópicas que se cuentan mediante un aparato de detección, preferiblemente un aparto electrónico de alta velocidad como se describe aquí. Los números X e Y son preferiblemente proporcionales y más preferiblemente iguales al número de eventos de detección de polinucleótidos diana que tienen lugar en la muestra biológica.

Los métodos del invento son especialmente útiles para la detección de cáncer colorectal o células precancerosas en humanos. Para propósitos del presente invento, las células precancerosas son células que tienen una mutación que está asociada con cáncer, y que hace tales células susceptibles de volverse cancerosas. Tales métodos comprenden determinar si las células o restos nucleótidicos en una muestra de heces incluyen una deleción de un polinucleótido normalmente presente en un genoma silvestre del humano u otro mamífero. La muestra puede exponerse a una pluralidad de primeras y segundas sondas oligonucleotídicas en condiciones de hibridación, a modo de hibridar (i) la primera sonda con copias de un primer segmento polinucleotídico característico de una región genómica silvestre que se conoce o se sospecha que no está deleccionada en las células de la muestra y (ii) la segunda sonda con copias de un segmento polinucleotídico característico de la región genómica silvestre que se sospecha que está mutada en la muestra. El número de dúplex formados con cada una de las primeras y segundas sondas se detecta entonces y se cuenta. La presencia de una diferencia estadísticamente significativa en esos dos números es indicativo de la presencia en la muestra de una mutación que puede ser característica de cáncer colorectal. La endoscopia u otros procedimientos de examen visual están entonces indicados.

En una realización preferida, las sondas son marcadas con bolas o partículas. En esta realización, las sondas usadas para la detección de segmentos polinucleotídicos genómicos en una muestra están preferiblemente unidos a tales bolas en una relación de una sonda por una bola, y las bolas unidas a la primera y segunda sonda son distinguibles, por ejemplo, por tamaño. El uso de tales bolas o partículas de hibridación facilita la detección cuantitativa de segmentos polinucleotídicos genómicos en la muestra usando, por ejemplo, un contador de impedancia, tal como un "contador Coulter".

Los métodos según el invento puede ser usados también para detectar una pérdida de heterozigosidad en un alelo mediante la determinación de cantidades de alelos materno y paternos que comprenden un locus génico que incluye al menos un polimorfismo de bases únicas. Una diferencia estadísticamente significativa en las cantidades de cada alelo es indicativa de una mutación en una región alélica que abarca el polimorfismo de bases únicas. En este método, una región de un alelo que comprende un polimorfismo de bases únicas se identifica, usando, por ejemplo, una base de datos, tal como el GenBank, o por otros métodos conocidos en la técnica. Las sondas son diseñadas para hibridar con regiones correspondientes tanto en alelos paternos como maternos inmediatamente 3' del polimorfismo de bases únicas como se muestra en la Figura 3. Después de la hibridación, una mezcla de al menos dos de los cuatro didesoxinucleótidos comunes son añadidos a la muestra, cada uno marcado con una marca detectable diferente. También se añade una ADN polimerasa. Usando ADN alélico adyacente al nucleótido polimórfico como molde, la sonda hibridada se extiende mediante la adición de un didesoxinucleótido único que es la pareja de unión para el nucleótido polimórfico. Después de lavar para eliminar los didesoxinucleótidos no incorporados, los didesoxinucleótidos que han sido incorporados en la extensión de sonda se detectan determinando el número de sondas extendidas unidas que llevan cada uno de los dos didesoxinucleótidos en, por ejemplo, un citómetro de flujo o un contador de impedancia. La presencia de un número casi igual de dos marcas diferentes significa que hay heterozigosidad normal en el nucleótido polimórfico.

La presencia de una diferencia estadísticamente significativa entre los números detectados de las dos marcas significa que una deleción de la región que abarca el nucleótido polimórfico ha tenido lugar en uno de los alelos.

Los métodos del invento pueden ser usados para determinar si un paciente es un candidato para un seguimiento de diagnóstico invasivo u otros procedimientos, tales como endoscopia. Por ejemplo, los métodos del invento pueden ser usados para detectar una mutación en un gen supresor de tumores o en un oncogén en una subpoblación de células en una muestra de heces obtenida de un paciente. Un procedimiento de endoscopia puede ser entonces realizado en pacientes diagnosticados con una mutación. Un resultado endoscópico positivo es seguido entonces de una polipectomía, cirugía, u otros tratamientos para eliminar el tejido canceroso o precanceroso.

Consecuentemente, es un objeto del invento proporcionar métodos para detectar inestabilidad genómica en una subpoblación de células en una muestra celular. Es un objeto adicional del invento proporcionar métodos para detectar un cambio genómico en una subpoblación de células, en la que el cambio genómico es indicativo de cáncer. Es otro objeto del invento detectar una pérdida de heterozigosidad en una región genómica asociada con cáncer, tal como una región supresora de tumores. Es aún otro objeto del invento proporcionar métodos para detectar heterozigosidad y la pérdida de la misma en ácidos nucleicos polimórficos de bases únicas. Finalmente, es un objeto del invento proporcionar métodos para la detección del cáncer, y particularmente cáncer colorectal mediante la detección de células o restos celulares indicativos de cáncer en una muestra heterogénea, tal como una muestra de heces.

Aspectos adicionales del invento serán evidentes tras consideración de la siguiente descripción detallada y de los dibujos.

Descripción de los dibujos

La Figura 1 es una gráfica de flujo que muestra las etapas secuenciales en los métodos del invento.

La Figura 2 es un diagrama esquemático de un contador de impedancia multiorificios del tipo útil de acuerdo con el invento para contar eventos de hibridación; en el que el número de referencia 1 indica la dirección del flujo a través de la columna; el número de referencia 2 indica un embolo que se emplea para forzar el material hacia abajo en la columna; los números de referencia 3 y 4 son bolas de hibridación de tamaño diferente: el número de referencia 5 es un filtro opcional para extraer partículas no deseadas; el número de referencia 6 indica una disposición de orificios para medir la impedancia diferencial; y el número de referencia 7 es una cámara de recolección.

La Figura 3 muestra cuatro posibles sitios de unión de sondas en regiones alélicas caracterizadas por tener un polimorfismo de bases únicas. En la Figura 3, la secuencia M1 es la SEQ ID NO: 1; la secuencia M2 es la SEQ ID NO: 2, la secuencia M3 es la SEQ ID NO: 3; la secuencia M4 es la SEQ ID NO: 4; la secuencia F1 es la SEQ ID NO: 5; la secuencia F2 es la SEQ ID NO: 6; la secuencia F3 es la SEQ ID NO: 7; la secuencia F4 es la SEQ ID NO: 8.

Las Figuras 4A y 4B son distribuciones modelo Gaussiano que muestran regiones de baja probabilidad estadística.

La Figura 5 es la gráfica que muestra los valores probables de N para una población heterogénea de células en las que el 1% de las células están mutadas.

Descripción detallada del invento

Los métodos según el presente invento son útiles para la detección de inestabilidad genómica en una muestra celular heterogénea en la que la inestabilidad genómica tiene lugar sólo en una pequeña subpoblación de células en la muestra. Usando los métodos de detección tradicionales, tal subpoblación sería difícil, si no imposible, de detectar, especialmente si la mutación que es la causante de la inestabilidad genómica es desconocida en el momento de la detección o si se usa una población celular clonalmente impura. Véase, por ejemplo, el documento de patente norteamericana Nº. 5.527.676 (presentando que una población clonal de células debería usarse para detectar una deleción en un gen p53). Los métodos tradicionales para la detección de mutaciones implicadas en carcinogénesis dependen del uso de una población clonalmente pura de células y tales métodos son mejores a la hora de detectar mutaciones que tienen lugar en "puntos calientes" conocidos en oncogenes, tales como k-ras. Véase, Sidransky, supra. Usando los métodos basados en PCR de la técnica, un número extremadamente grande de cebadores tendría que ser diseñado y la muestra tendría que ser ensayada numerosas veces para detectar la inestabilidad genómica en una muestra celular que es clonalmente impura (es decir, una muestra heterogénea tal como heces) y en la que la mutación que ha de ser detectada es desconocida y existe en un número muy pequeño de células. Por otro lado, la PCR no es útil para la detección de la ausencia de una secuencia genética, como en el caso de los métodos presentes para detectar la pérdida de heterozigosidad. Aun después de tales ensayos repetidos, un método basado en PCR puede no detectar una mutación en un pequeño número de células en una población clonalmente impura si, por ejemplo, los cebadores que lindan con el sitio de la mutación no se usan. Así, en adenomas de estadio temprano (cuando la población de células mutadas es muy pequeña), los métodos de la técnica son, en el mejor de los casos, imprácticos y pueden no funcionar en absoluto.

Por el contrario, los métodos del presente invento son capaces de detectar inestabilidad genómica en un pequeño número de células en una población celular impura debido a que tales métodos no se ven afectados por la presencia en una muestra de ADN heterogéneo. Por ejemplo, en la pérdida de heterozigosidad, la deleción tiene lugar a lo largo de grandes porciones de los genomas y alelos enteros pueden perderse (o al menos lo suficiente de un alelo puede estar perdido para hacer al alelo no funcional). Los métodos del invento comprenden contar un número de un gen que se sospecha que está mutado y se compara ese número con el número de un gen que se conoce que no está mutado en la misma muestra. Todo lo que se necesita saber es al menos una porción de la secuencia de un gen silvestre en el que se sospecha que la mutación tiene lugar y al menos una porción de la secuencia silvestre de un gen de referencia en el que se sospecha que la mutación no ha tenido lugar.

Consecuentemente, los métodos del presente invento son útiles para la detección de cambios en una secuencia nucleotídica genómica presente en una subpoblación de células o restos de las mismas en una muestra. Tales cambios tiene lugar generalmente como una mutación (es decir, una sustitución, modificación, deleción, adición, o reordenamiento) en una secuencia alélica silvestre en una subpoblación de células. En el caso de un gen supresor de tumores, la mutación típicamente toma la forma de una deleción masiva característica de la pérdida de heterozigosidad. Frecuentemente, como es el caso de ciertas formas de cáncer, mutaciones causantes de enfermedades tiene lugar inicialmente en una única célula que produce entonces una pequeña subpoblación de células mutantes. Para cuando las manifestaciones clínicas de la mutación se detectan, la enfermedad puede haber progresado hasta un estadío incurable. Los métodos del invento permiten la detección de una mutación cuando la mutación existe como sólo un pequeño porcentaje de las células totales o restos celulares en una muestra.

Los métodos del invento comprenden una comparación de dos secuencias silvestres que se espera que estén presentes en la muestra en igual número en células normales (no mutadas). En una realización preferida, la comparación es entre (1) una cantidad de un segmento polinucleotídico genómico que se conoce o se sospecha que no está mutado en células de la muestra (la "referencia") y (2) una cantidad de un segmento polinucleotídico genómico silvestre (no mutado) que se sospecha que está mutado en una subpoblación de células en la muestra (la "diana"). Una diferencia estadísticamente significativa entre las cantidades de los dos segmentos polinucleotídicos genómicos indica que una mutación ha tenido lugar. Específicamente, en el caso de una deleción en un gen supresor de tumores, la cantidad detectada del gen de referencia es significativamente mayor que la cantidad detectada del gen diana. Si una secuencia diana se amplifica, como en el caso de ciertas mutaciones oncogénicas, la cantidad detectada de diana es mayor que la cantidad detectada del gen de referencia por un margen estadísticamente significativo.

Los métodos según la técnica requieren generalmente el uso de numerosas sondas, normalmente en la forma de cebadores de PCR y/o sondas de hibridación, para detectar una deleción o una mutación puntual. Sin embargo, debido a que los métodos del presente invento implican detección cuantitativa de secuencias nucleotídicas y comparaciones cuantitativas entre secuencias que se conoce que son estables y aquellas que se sospecha que son inestables, sólo unas pocas sondas deben ser usadas para evaluar de manera precisa el riesgo de cáncer. De hecho, un juego único (par) de sondas es todo lo que es necesario. El riesgo de cáncer se indica por la presencia de una mutación en una región genética que se conoce o sospecha que está implicada en oncogénesis. Los pacientes que se identifica como que están en riesgo, basado en los ensayos realizados según los métodos del invento son entonces dirigidos a otros procedimientos, típicamente invasivos, para la confirmación y/o tratamiento de la enfermedad.

Un muestreo cuantitativo de una secuencia nucleotídica que está distribuida uniformemente en una muestra biológica sigue típicamente una distribución de Poisson. Para grandes poblaciones, tales como el número típico de segmentos polinucleotídicos genómicos en una muestra biológica, la distribución de Poisson es similar a una curva normal (Gaussiana) con una media, N, y una desviación estándar que puede aproximarse como la raíz cuadrada de N.

La significancia estadística entre números de genes diana y de referencia obtenida a partir de una muestra biológica puede ser determinada mediante un método apropiado. Véanse, por ejemplo, Steel, y otros, Principles and Procedures of Statistics, A Biometrical Approach (McGraw-Hill, 1980).

Un método ejemplar es determinar, basado en un nivel de especificidad deseado (tolerancia de falsos positivos) y sensibilidad (tolerancia de falsos negativos) y dentro de un nivel de confianza seleccionado, la diferencia entre números de genes diana y de referencia que deben ser obtenidos para alcanzar un nivel elegido de significancia estadística. Un valor umbral en tal determinación es el número mínimo, N, de genes (para cada diana y referencia) que debe estar disponible en una población para permitir una determinación de significancia estadística. El número N dependerá de la suposición de un número mínimo de alelos mutantes en una muestra que contiene alelos mutantes (se supone aquí que son al menos un 1%) y la suposición adicional que las muestras normales no contienen alelos mutantes. Se supone también que unas diferencias umbrales entre los números de genes de referencia y genes diana deben ser al menos un 0,5% para una diagnosis de que hay una mutación presente en una subpoblación de células en la muestra. Basado en las suposiciones anteriores, es posible determinar cómo de grande debe ser N de modo que una diferencia detectada entre los números de los alelos mutantes y de referencia de menos del 0,5% es verdaderamente un resultado negativo (es decir no hay una subpoblación mutante en la muestra) el 99,9% del tiempo.

El cálculo de N en lo que se refiere a especificidad, se basa entonces, en la probabilidad de una medida de la muestra que está en la porción de la distribución Gaussiana que abarca el 3,16% inferior de la población (el área marcada "A" en la figura 4A) y la probabilidad de que la otra medida de muestra esté en la porción de la distribución Gaussiana que abarca el 3,16% superior de la población (el área marcada "B" en la figura 4B). Puesto que las dos medidas de muestra son eventos independientes, la probabilidad de que ambos eventos tengan lugar simultáneamente es aproximadamente 0,001 o 0,1%. Así, el 93,68% de la distribución Gaussiana (100%- 2 x 3,16%) recae entre las áreas marcadas A y B en la figura 5A. Las tablas estadísticas indican que tal área es equivalente a desviaciones estándar de 3,72. Consecuentemente, 0,5% N es igual a 3,72 sigma. Puesto que sigma (la desviación estándar) es igual a \surdN, la ecuación puede resolverse para N como 553,536. Esto quiere decir que si el inferior de los dos números que representan la referencia y la diana es al menos 553,536 y si el paciente es normal, la diferencia entre los números será menos que el 0,5% alrededor del 99,9% de las veces.

Para determinar el N mínimo requerido para un 99% de sensibilidad se realiza un análisis similar. Esta vez, las tablas de distribución Gaussiana de cola única muestran que desviaciones estándar 1,28 (sigma) de la media abarcan el 90% de la distribución Gaussiana. Por otro lado, hay un 10% (la raíz cuadrada de 1%) de probabilidades de que uno de los números (referencia o diana) estén tanto en el área marcada "A" en la figura 5 o en el área marcada "B" en la figura 5. Si las medias de las dos poblaciones son un total de 1% diferentes y si debe haber al menos un 0,5% de diferencia entre el número de genes diana y de referencia, entonces la distancia desde cualquier media al umbral de significancia estadística es equivalente a 0,25%N (Véase la Figura 5) para un 99% de sensibilidad. Como se muestra en la Figura 5, un 0,25%N corresponde con alrededor de 40% de un lado de la distribución Gaussiana. Las tablas estadísticas de cola única revelan que el 40% de la distribución Gaussiana corresponde a desviaciones estándar 1,28. Por lo tanto, 1,28 sigma es igual a 0,0025N, y N es igual a 262,144. Así, para muestras anormales, la diferencia excederá un 0,5% al menos un 99% de las veces si el inferior de los dos números es al menos 262,144. Por el contrario, una diagnosis negativa errónea se hará sólo un 1% de las veces en estas condiciones.

Para tener tanto el 99,9% de especificidad (evitar falsos positivos) como el 99% de sensibilidad (evitar falsos negativos), una muestra con al menos 553,536 (o aproximadamente mayores que 550.000) de ambos alelos diana y de referencia debería ser usada. Una diferencia de al menos 0,5% entre los números obtenidos es significativa en un nivel de confianza del 99,9% en lo que se refiere a sensibilidad y una diferencia de menos del 0,5% entre los números es significativa en un nivel de confianza del 99,9% en lo que se refiere a especificidad. Como se observa anteriormente, otros ensayos estadísticos estándar pueden ser usados para determinar significancia estadística y el anterior representa uno de tales ensayos.

Basado en la explicación anterior, el profesional experto aprecia que los métodos del invento son útiles para detectar mutaciones en una subpoblación de un polinucleótido en una muestra biológica. Por ejemplo, los métodos aquí descritos pueden ser usados para detectar la pérdida alélica (la pérdida de heterozigosidad) asociada con enfermedades tales como cáncer. Adicionalmente, los métodos del invento pueden ser usados para detectar una deleción o una mutación de sustitución de bases causante de un error metabólico, tal como una pérdida completa o parcial de actividad enzimática. Para propósitos de ejemplificación, lo siguiente proporciona detalles del uso de métodos según el presente invento en la detección del cáncer de colon. Los métodos del invento son especialmente útiles en la detección temprana de una mutación (y especialmente una gran deleción típica de la pérdida de heterozigosidad) en un gen supresor de tumores.

Los métodos según el invento comprenden preferiblemente uno de los tres tipos de regímenes de detección. En un primer régimen de detección preferido, una cantidad de un polinucleótido que se conoce o sospecha que está mutado se compara con una cantidad de un polinucleótido de referencia que se conoce o sospecha que no está mutado. En un segundo régimen de detección preferido, una cantidad de un nucleótido polimórfico en un alelo materno se compara con una cantidad del nucleótido polimórfico correspondiente en el alelo paterno correspondiente. Finalmente, un tercer régimen de detección comprende una comparación de una región repetida de microsatélites en un alelo normal con la correspondiente región microsatélite en un alelo que se conoce o sospecha que está mutado. Los tres medio de detección del ejemplo comprenden determinar si existe una diferencia entre las cantidades de cada ácido nucleico que está siendo medido. La presencia de una diferencia estadísticamente significativa es indicativa de que una mutación ha tenido lugar en uno de los ácidos nucleicos que está siendo medido. Así, los métodos descritos a continuación son generalmente aplicables a todas las formas del invento, las variaciones de las cuales se muestran en la figura 1.

I. Preparación de una muestra de heces

Una muestra preparada a partir de heces evacuadas por un paciente debería comprender al menos una sección transversal de las heces evacuadas. Como se observa anteriormente, las heces no son homogéneas con respecto a células liberadas. Según pasan las heces a través del colon, éste absorbe las células liberadas de las regiones del epitelio del colon con el que hace contacto. Así, las células liberadas de un pólipo son absorbidas sobre sólo una superficie de las heces en formación (excepto cerca del ciego donde las heces son aún liquidas y se homogeneizan mediante peristalsis intestinal). Tomando una muestra de heces representativa (es decir, al menos una sección transversal) y homogeneizarlas asegura que las células liberadas de todas las superficies epiteliales del colon estarán presentes para análisis en la muestras de heces procesadas. Las heces son evacuadas en un receptáculo que es preferiblemente lo suficientemente pequeño para ser transportado a una instalación de ensayos. El receptáculo puede ser adaptado a un inodoro convencional de tal modo que el receptáculo acepte heces evacuadas en una manera convencional. El receptáculo puede comprender una malla o una pantalla de tamaño suficiente y una colocación tales que las heces sean retenidas mientras que la orina se deja que pase a través de la malla o pantalla y dentro del inodoro. El receptáculo puede comprender adicionalmente medios para homogeneizar las heces evacuadas. Por otro lado, el receptáculo puede comprender medios para introducir tampones de homogeneización o uno o más conservantes, tales como alcohol o una disolución con alta concentración de sal, para neutralizar las bacterias presentes en las muestras de heces e inhibir la degradación del ADN.

El receptáculo, si está adaptado para encajar en un inodoro o simplemente adaptado para recibir las muestras de heces evacuadas, tiene preferiblemente medios de sellado suficientes para contener las muestras de heces evacuadas y cualquier disolución allí añadida y para impedir la emanación de olores. El receptáculo puede tener un marco de soporte que se coloca directamente sobre un inodoro. El marco de soporte tiene unido a ello una cubierta articulable que puede estar colocada en una posición erguida, para la deposición de la muestra o una posición cerrada (no mostrada) para sellar las heces evacuadas dentro del receptáculo. El marco de soporte tiene adicionalmente una apertura central que atraviesa desde una superficie superior hasta una superficie inferior del marco de soporte. La superficie inferior comunica directamente con una superficie superior del inodoro. El extenderse desde la superficie inferior del marco de soporte y el abarcar la circunferencia entera de la apertura central es un medio para capturar las heces evacuadas: los medios para capturar las heces evacuadas pueden estar unidos fijamente al marco de apoyo o pueden estar unidos de modo separable para una eliminación subsiguiente a la deposición de las heces.

Una vez obtenida, la muestra de heces se homogeneiza en un tampón apropiado, tal como tampón fosfato salino o una disolución salina caotrópica. Los medios de homogeneización y los materiales para homogeneizaciones son conocidos generalmente en la técnica. Véase por ejemplo, el documento de patente norteamericana No. 4.101.279. Así, los métodos de homogeneización particulares pueden ser seleccionados por el profesional experto. Los métodos para un procesamiento adicional y el análisis de una muestra biológica, tal como una muestra de heces se presentan a continuación.

II. Métodos para la detección del cáncer o precáncer de colon A. Referencia-Diana

Para ejemplificación, los métodos del invento se usan para detectar una deleción u otra mutación en el gen supresor de tumores p53 en células obtenidas de una muestra de heces representativa. El gen p53 es una buena elección debido a que la pérdida de heterozigosidad en p53 está asociada frecuentemente con el cáncer colorectal. Una secuencia de mARN correspondiente a la región de ADN codificante para p53 se presenta como No. de acceso del GenBank M92424. El profesional experto comprende que los métodos aquí descritos pueden ser usados para detectar mutaciones en cualquier gen y que la detección de una deleción de p53 es ejemplo de tales métodos. Al menos una sección transversal de una muestra de heces evacuadas se obtiene y se prepara como se describe justo antes. El ADN o ARN pueden ser opcionalmente aislados a partir de la muestra según los métodos conocidos en la técnica. Véase, Smith-Ravin, y otros, Gut, 36: 81-86 (1995).

Sin embargo, los métodos del invento pueden realizarse sobre heces no procesadas

Los ácidos nucleicos pueden ser rotos o cortados en pequeños fragmentos mediante, por ejemplo, digestión por restricción. El tamaño de los fragmentos de ácidos nucleicos producidos no es crítico, sometido a las limitaciones descritas a continuación. Un alelo diana que se sospecha que está mutado (p53 en este ejemplo) y un alelo de referencia son elegidos. Un alelo de referencia pueden ser cualquier alelo que se conoce o se sospecha que no está mutado en células de cáncer de colon. Los fragmentos de ácidos nucleicos de hebra única pueden prepararse usando métodos bien conocidos. Véase, por ejemplo Sambrook, y otros, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989).

Tanto las porciones de una hebra codificante como de su complementaria pueden detectarse en métodos según el invento. Para ejemplificación, se describe la detección de la hebra codificante de p53 y el alelo de referencia. La complementaria a tanto el p53 como el alelo de referencia son eliminados mediante hibridación con sondas oligonucleotídicas anti-complementario (sondas de aislamiento) y subsiguiente eliminación de dúplex formados de ese modo. Los métodos para eliminar las hebras complementarias de una mezcla de oligonucleótidos de hebra única son conocidos en la técnica e incluyen técnicas tales como cromatografía de afinidad. Tras convertir el ADN de doble hebra a ADN de hebra única, la muestra se pasa a través de una columna de afinidad que comprende una sonda de aislamiento unida que es complementaria a la secuencia que ha de ser aislada a partir de la muestra. Una columna de cromatografía convencional es apropiada para el aislamiento de la complementaria. Una columna de afinidad empaquetada con sefarosa o cualesquiera otros materiales con nucleótidos complementarios unidos puede ser usada para aislar el ADN complementario en la columna, mientras se deja que el ADN que ha de ser analizado pase a través de la columna. Véase Sambrook, Supra. Como una alternativa, las bolas de aislamiento pueden usarse para excluir el complementario como se trata en detalle a continuación.

Después de la eliminación de las hebras complementarias, se obtienen primeras sondas oligonucleotídicas que hibridan con al menos una porción del alelo p53 y segundas sondas oligonucleotídicas que hibridan con al menos una porción del alelo de referencia. Las sondas son marcadas con una marca detectable, tal como fluoresceína o partículas detectables. Se prefieren marcas distintas para las sondas.

Las sondas marcadas son entonces expuestas a la muestra en condiciones de hibridación. Tales condiciones son bien conocidas en al técnica. Véase, por ejemplo, Wallace, y otros, Nucleic Acids Res., 6: 3543-3557 (1979).

Las primeras y segundas sondas oligonucleotídicas que son marcadas de modo distinto (es decir con diferentes isótopos radioactivos, medios fluorescentes, o con bolas de tamaño diferente, véase infra) son aplicadas a una alícuota única de muestra. Después de la exposición de las sondas a la muestra en condiciones de hibridación, la muestra se lava para eliminar cualquier sonda no hibridada. Después, las sondas hibridadas son detectadas de manera separada para híbridos p53 e híbridos de alelos de referencia. Los estándares pueden usarse para establecer el fondo y para equilibrar resultados. También, si se usan las marcas fluorescentes diferenciales, el número de sondas puede ser determinado mediante contaje diferencial de eventos fluorescentes en una muestra que ha sido diluida suficientemente para permitir la detección de eventos fluorescentes únicos en la muestra. Las muestras duplicadas pueden analizarse para confirmar la precisión de los resultados obtenidos.

Si hay una diferencia estadísticamente significativa entre la cantidad de p53 detectada y la cantidad del alelo de referencia detectada, pueden suponerse que una mutación ha tenido lugar en p53 y el paciente está en riesgo de desarrollar o ha desarrollado cáncer de colon. Una significancia estadística puede determinarse mediante cualquier método conocido. Un método preferido se perfila anteriormente.

La determinación de una mutación en p53 permite a un profesional en clínica recomendar un tratamiento adicional, tal como procedimientos de endoscopia, para diagnosticar y, si fuera necesario, tratar el estado del paciente. Los siguientes ejemplos ilustran métodos del invento que permiten una cuantificación directa de eventos de hibridación.

1. Métodos para una cuantificación aumentada de polinucleótidos diana y de referencia

Una cuantificación potenciada de eventos de unión entre sondas de hibridación y diana o referencia se realiza acoplando sondas de hibridación a partículas, tales como bolas (bolas de hibridación).

Para obtener una medida cuantitativa precisa de la cantidad de un polinucleótido en una muestra, las bolas de hibridación son construidas previas a llevar a cabo las hibridaciones, de tal modo que cada bola tenga unida a ella un sonda oligonucleotídica única.

a. Método para la preparación de combinaciones sonda-bola

Una sonda única es unida a una bola incubando un gran exceso de bolas de hibridación con sondas oligonucleotídicas de un tipo dado (es decir, tanto primeras como segundas sondas oligonucleotídicas). El acoplamiento de la sonda a la bola se realiza usando un par de unión por afinidad. Por ejemplo, las bolas pueden ser recubiertas con avidina o estreptavidina y las sondas pueden ser marcadas con biotina para efectuar la unión de la sonda a la bola. La mezcla de bolas y sondas se agita de modo que virtualmente el 100% de las sondas están unidas a las bolas. La mezcla se expone entonces a una matriz, tal como una columna de afinidad o una membrana recubierta con oligonucleótidos que son complementarios a la sonda. Solamente las bolas que tienen una sonda unida se adherirán a la matriz, el resto serán eliminadas en el lavado. Las bolas con sonda acoplada son entonces liberadas de la matriz fundiendo las hibridaciones entre la sonda y la complementaria. Múltiples exposiciones a la matriz y el prelavado de la columna reduce las uniones inespecíficas. Por otro lado, las bolas desnudas (es decir, sin sonda unida) pueden exponerse a la matriz para determinar un número de fondo de bolas que se puede esperar que se unan a la matriz en ausencia de sonda.

Usando un vasto exceso de bolas relativo a sondas como se describe anteriormente, se espera que la vasta mayoría de bolas recuperadas sólo tendrán una sonda unida. Por ejemplo, si una mezcla tiene una relación de 1 sonda por 1000 bolas, se espera que sólo alrededor de 1 bola en un millón tendrá unidas dos sondas y aún menos de una bola en un millón tendrá más de dos sondas unidas. Consecuentemente, las bolas de hibridación son proporcionadas en una relación eficaz 1:1 con sondas, lo que permite una cuantificación precisa del polinucleótido diana y de referencia como se describe a continuación.

Para cada ensayo descrito a continuación, se usan dos bolas de hibridación distintas. Una primera bola de hibridación tiene unida a ella una primera sonda oligonucleotídica única que es complementaria a al menos una porción de un polinucleótido diana (por ejemplo, un alelo p53). Una segunda bola de hibridación, de un tamaño distinto del de la primera bola de hibridación, tiene unida a ella una segunda sonda oligonucleotídica única que es complementara a al menos una porción de un polinucleótido de referencia (es decir, uno que se conoce o se sospecha que no está mutado en la muestra).

b. Uso de las bolas para cuantificar polinucleótidos diana y de referencia

El ADN se funde (desnaturalizado para formar ADN de hebra única) mediante métodos bien conocidos. Véase, por ejemplo, Gyllensten, y otros, en Recombinant DNA Methodology II; 565-578 (Wu, ed., 1995).

Según métodos del invento, uno puede detectar tanto una hebra codificante como su complementaria para cuantificar polinucleótidos diana y/o de referencia. Para propósitos de ilustración, el presente ejemplo supone la detección de la hebra codificante.

2. Eliminación de la complementaria

La hebra única complementaria del polinucleótido diana (por ejemplo p53) y el polinucleótido de referencia son eliminados de la muestra uniéndolos a sondas oligonucleotídicas que son complementarias a las complementarias de la diana o de referencia. Tales sondas, referidas aquí como sondas de aislamiento, son unidas a bolas de aislamiento previo a su introducción en la muestra. Las bolas pueden ser magnetizadas. Así, cuando las bolas de aislamiento magnetizadas [con sonda(s) de aislamiento unidas] son introducidas en la muestra, las sondas de aislamiento unidas hibridan con la complementaria de la diana o de la referencia (o viceversa). Las bolas de aislamiento son introducidas preferiblemente en un vasto exceso para saturar la unión de la complementaria. Una vez que la hibridación se completa, se aplica un campo magnético a la muestra, arrastrado así las bolas de aislamiento magnetizadas (tanto con como sin la complementaria hibridada) hacia afuera de la muestra. Suponiendo que se ha introducido una cantidad suficiente de bolas de aislamiento en la muestra, la eliminación de las bolas de aislamiento elimina eficazmente toda la complementaria diana y de referencia de la muestra. En una realización alternativa para la eliminación de la complementaria, un exceso de sonda oligonucleotídica con biotina unida se expone a la muestra deshibridada en condiciones de hibridación. Una vez que la hibridación se completa, la muestra se expone a una columna recubierta con avidina. La sonda unida a biotina, bien libre o hibridada a la complementaria, se une por avidina a la columna. Lo restante del ADN, incluyendo hebras codificantes diana y de referencia que ha de ser detectado, se pasa a través de la columna. Contrariamente a la descripción de bolas de hibridación anterior, las bolas para la eliminación de la complementaria pueden construirse de modo que numerosos oligonucleótidos estén unidos a una única bola.

3. Detección y cuantificación de dianas y referencia

Dos juegos de bolas de hibridación se preparan como se describe anteriormente. Cada miembro de un primer juego de bolas de hibridación (todas los cuales son idénticas la una a la otra) tiene unido a él una sonda oligonucleotídica única que es complementaria a al menos una porción del polinucleótido diana. Cada miembro de un segundo juego de bolas de hibridación idénticas (todas las cuales son idénticas las unas a las otras pero no con el primer juego) tiene unido a él una sonda oligonucleotídica única que es complementaria a al menos una porción del polinucleótido de referencia. Los miembros del segundo juego de bolas de hibridación son de un tamaño o color distinto del de los miembros del primer juego de bolas de hibridación. Las primeras y segundas bolas de hibridación pueden también ser distinguidas en base a otras características. Por ejemplo, las bolas pueden tener unidos marcadores fluorescentes que se distinguen por su fluorescencia en diferentes longitudes de onda. Las bolas con distintas cargas electroquímicas pueden ser también usadas. La modalidad precisa usada para distinguir las bolas no es esencial en el invento en la medida que es posible distinguir entre la primera y la segunda sonda en base a distinciones entre la primera y la segunda bola unidas.

Ambos juegos de bolas de hibridación con sondas unidas se exponen a la muestra en condiciones de hibridación, permitiendo de ese modo que la sonda unida hibride con la referencia o diana. Una vez que la hibridación se completa, la muestra se lava para eliminar las combinaciones bola/sonda no hibridadas. Las combinaciones bola/sonda no hibridadas son eliminadas mediante, por ejemplo, el paso de la muestra a través de una columna que comprende ADN complementario a la secuencia de las sondas. Así, cualquier combinación bola/sonda no hibridada es retenida en la columna mientras que el dúplex pasa a través de la columna. Subsiguientemente, la muestra se expone a medios para contaje diferencial de bolas de hibridación para cuantificar las primeras y segundas sondas de hibridación que han formado dúplex. Los números obtenidos proporcionan una estimación precisa del número de copias de los polinucleótidos de referencia y diana en la población debido a que el contaje diferencial significa contar bolas individuales. Una bola es igual a una sonda que, a su vez, significa una copia del ácido nucleico que está siendo medido.

Un ejemplo de medios de contaje diferencial es un aparato de medida de la impedancia tal como un contador
Coulter (Coulter Electronics, Inc., Miami, Florida). La muestra se pasa a través del aparato que detecta diferencialmente los dos tipos de bolas de hibridación midiendo su impedancia diferencial de una corriente eléctrica. Alternativamente, el aparato puede medir fluorescencia, color u otros cambios. Para aumentar la velocidad del ensayo, un aparato multiorificio puede ser usado. Un contador de impedancia multiorificio se muestra esquemáticamente en la figura 2. Una disposición multiorificio se coloca en un extremo de una columna rellena con un fluido conductor de electricidad, tal como salino. Las bolas de hibridación tanto con los segmentos diana hibridados como con los segmentos de referencia hibridados se insertan en un extremo opuesto de la columna. Cada orificio es lo suficientemente grande para acomodar sólo una bola de hibridación por vez y lo suficientemente ancho para permitir medidas de impedancia fiables. Se pasa un voltaje eléctrico a través de cada orificio. Cada bola de hibridación (que no es conductora), según pasa a través de uno de los orificios, desplaza un volumen de salino, creando así un breve cambio de impedancia que es proporcional al tamaño de la bola, esto, a su vez, crea una disminución mensurable en la corriente que se correlaciona directamente con el tamaño de la bola. Acoplando el número de cada uno de los dos eventos de impedancia distintos, se obtiene una estimación precisa del número de bolas de hibridación y, por lo tanto, el número de las sondas de cada tipo en la población.

Tras la medida cuantitativa de la primera y segunda bolas de hibridación, los datos se analizan como se trata anteriormente para determinar si existe cualquier diferencia estadísticamente significativa entre las cantidades de la primera y segunda bolas de hibridación (con sonda hibridada unida). Una reducción estadísticamente significativa en la cantidad de diana es indicativa de una mutación en el alelo diana. Donde el gen de p53 es el alelo diana, tal mutación es indicativa de un estado canceroso o precanceroso. Una profesional clínico puede usar tales resultados como base para prescribir un tratamiento adicional, tal como procedimientos de endoscopia y polipectomía.

B. Detección de mutaciones en polimorfismos de bases únicas

El método básico descrito anteriormente puede ser aplicado para detectar una pérdida de heterozigosidad u otra mutación en un sitio polimórfico de bases únicas entre los alelos maternos y paternos. Tal detección es típicamente una indicación de una deleción mayor u otra mutación. Sin embargo, una mutación en un nucleótido polimórfico único puede ser todo lo que se necesita para inhibir la función génica en uno de los dos alelos. Una deleción asociada con pérdida de heterozigosidad puede ser difícil de detectar debido a un fenómeno recientemente descubierto llamado reduplicación complementaria. En la reduplicación complementaria, la pérdida de uno de los dos alelos en un locus particular tiene como resultado una "reduplicación" del alelo superviviente. La reduplicación tiene lugar normalmente en el cromosoma que contiene el alelo superviviente e implica la producción de una o más copias del alelo superviviente en cercana proximidad en el cromosoma con la posición del alelo superviviente. En el caso de un locus que manifiesta uno o más polimorfismos alélicos de bases únicas (es decir, la heterozigosidad en el locus se determina en virtud de una o más diferencias de bases únicas en una o más regiones del locus), la reduplicación complementaria da como resultado la inserción en el cromosoma que contiene el alelo superviviente de un duplicado de la secuencia correspondiente a la que ha sido delecionada. Aún en las condiciones de hibridación más rigurosas, algunas de las sondas dirigidas frente a la secuencia delecionada se unirá a la secuencia reduplicada en un locus de un polimorfismo de bases únicas. Consecuentemente, en tales circunstancias, la deleción puede no ser detectada debido a que cualquier diferencia verdadera en el número de sondas que se unen al sitio polimórfico (es decir, la región alélica que abarca el polimorfismo de bases únicas ) puede estar oculta por un aumento resultante de la región reduplicada del otro alelo.

Los problemas asociados con la reduplicación complementaria, y con la unión inespecífica de las sondas se solucionan generalmente por los métodos del invento. Tales métodos permiten la detección de una deleción en uno de los dos alelos presentes en un locus específico en una subpoblación de células contenida en una muestra biológica. Numerosos alelos, incluyen alelos supresores de tumores, que contienen nucleótidos polimórficos únicos en el contexto de una región de ácidos nucleicos constante. Los individuos normalmente pueden ser bien homozigotos o bien heterozigotos en lo que se refiere a un nucleótido polimórfico particular. Puesto que numerosos sitios nucleotídicos polimórficos de bases únicas existen en la mayoría de los alelos, la probabilidad de que un individuo dado sea heterozigoto en al menos uno de los sitios polimórficos de bases únicas es alta. Una reducción estadísticamente significativa en uno de los dos nucleótidos en un sitio polimórfico de bases únicas (en el que el individuo es heterozigoto) se usa como un marcador para una deleción en el alelo que abarca ese sitio.

Las regiones genómicas que contienen polimorfismos de bases únicas conocidos se identifican mediante referencia en una base de datos nucleotídica, tal como GenBank, EMBL, o cualquier otra base de datos apropiada. Para propósitos del invento, un polimorfismo de bases únicas se desea que sea un nucleótido polimórfico único adyacente a una región no polimórfica del alelo sin reparar en si el nucleótido polimórfico único forma parte de un sitio polimórfico más grande (es decir, el polimorfismo de bases únicas puede ser el nucleótido terminal de un polimorfismo polinucleotídico más grande). Para la detección del cáncer, las regiones consideradas son regiones en las que la pérdida de heterozigosidad es dominante, tal como genes supresores de tumores. Un individuo dado pueden ser homozigoto o heterozigoto para un nucleótido polimórfico en cualquier región polimórfica de bases únicas identificada. Consecuentemente, si un número de regiones polimórficas de bases únicas se identifica, la probabilidad aumenta de modo que al menos una región polimórfica de bases únicas heterozigota se encuentra en una muestra.

Una vez que los sitios polimórficos de bases únicas se identifican, una muestra se obtiene de un paciente para determinar cual de esos sitios es heterozigoto en células normales (es decir, no cancerosas o precancerosas). Entonces, se prepara la muestra como se describe anteriormente. El ADN de doble hebra en la muestra se convierte a ADN de hebra única. Luego, tanto la hebra codificante como la hebra anticodificante para ambos alelos se aísla de la muestra. Como será evidente a partir de la siguiente deliberación, los métodos descritos aquí son indiferentes en lo que se refiere a si la hebra codificante o la hebra anticodificante son retenidas en la muestra.

Una sonda oligonucleotídica se construye de modo que es complementaria a la porción de la región de polimorfismo de bases únicas, acabando dicha porción en el nucleótido que está inmediatamente 3' al nucleótido polimórfico, sin reparar en si la hebra 5'-3' (codificante) o la hebra 3'-5' (anticodificante) es usada como molde. La Figura 3 muestra cuatro posibles sondas que están inmediatamente 3' al nucleótido polimórfico para cada una de las cuatro posibles hebras molde como se describe anteriormente (las Secuencias en la Figura 3 son hipotéticas y no se pretende que representen ninguna secuencia actual). Mientras que cualquier hebra puede ser usada como molde para unión de sondas para determinar la heterozigosidad y/o la pérdida de la misma, la secuencia de la sonda que se hibrida al molde será diferente dependiendo de la hebra usada. Las sondas pueden ser de cualquier longitud que permita una hibridación eficaz y específica de sonda a diana. La Figura 3 ilustra las cuatro sondas que son útiles par la hibridación con la hipotética secuencia mostrada. La longitud de las secuencias de las sondas puede determinarse como apropiada para cada región genómica que se analiza. Una longitud preferida está entre alrededor de 10 y alrededor de 100 nucleótidos. El tamaño de la sonda dependerá también del tamaño de la región que rodea el polimorfismo de bases únicas (es decir, la región 5' o 3' al siguiente polimorfismo adyacente, si lo hay). Los detalles que conciernen a la construcción e hibridación de las sondas oligonucleotídicas son conocidos en la técnica.

Una vez construidas, las sondas únicas para cada región polimórfica hibridará con regiones de alelos tanto maternos como paternos hasta, pero sin incluirlos, el nucleótido polimórfico que, en un heterozigoto, será diferente en los alelos maternos y paternos. La Figura 3 ilustra el procedimiento de hibridación anterior. La Figura 3 muestra sólo una pequeña porción de la región que rodea al nucleótido polimórfico. Los alelos mostrados en la Figura 3 son heterozigotos en el sitio polimórfico (mostrado en negrita en la Figura 3).

La sonda se hibrida con su ADN molde específico (véase anteriormente) por métodos estándar en la técnica. La muestra puede ser opcionalmente lavada para eliminar la sonda sin hibridar. Para determinar si cada región polimórfica de bases únicas a la que la sonda se ha unido, es heterozigota u homozigota en el nucleótido polimórfico, se usa una modificación del método de terminación de cadena por didesoxi como se documenta en Sanger, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 74; 54634-5467 (1977). El método implica usar al menos dos de los cuatro 2',3'-didesoxinucleósidos trifosfato (ddATP, ddCTP, ddGTP, y ddTTP). Una marca detectable diferente se une a cada uno de los didesoxinucleósidos trifosfato (ddNTP) según métodos conocidos en la técnica. Los ddNTPs marcados diferencialmente están disponibles de Perkin Elmer Corporation (no Cat. 401456). Al menos dos ddNTPs marcados se exponen entonces a cada muestra que tiene la sonda hibridada con alelos maternos y paternos como se describe anteriormente. La elección de los dos ddNTPs que se usan dependerá de los nucleótidos en el sitio polimórfico heterozigoto. Una ADN polimerasa, tal como una Sequenasa^{TM} (Perkin-Elmer), se añade también a la mezcla de la muestra. Usando las hebras alélicas como cebadores, la polimerasa añadirá un ddNTP al extremo 3' de la sonda, siendo el ddNTP incorporado complementario al nucleótido que existe en el sitio polimórfico de bases únicas. Debido a que los ddNTPs no tienen 3' hidroxilo, una elongación adicional de la sonda hibridada no tendrá lugar. Después de completarse, la muestra se lava para eliminar el exceso de ddNTPS. La marca se cuenta entonces en cada muestra. La presencia de dos ddNTPs marcados diferencialmente en una muestra es indicativo de heterozigosidad en el sitio polimórfico. Cualquier nucleósido trifosfato modificado en 3' puede ser usado en los métodos descritos anteriormente con tal de que la modificación en 3' impida la unión de un nucleótido adicional en 3' (es decir, extensión de sonda) y no inhiba la unión del nucleótido modificado al extremo 3' de la sonda.

No es necesario determinar la cantidad de cada marca presente en la muestra para establecer heterozigosidad u homozigosidad. Por ejemplo, los desoxinucleósidos trifosfato marcados diferencialmente pueden ser usados para una determinación de heterozigosidad u homozigosidad. El mero hecho de que dos didesoxinucleósidos trifosfato marcados diferente se incorporen en la sonda significa que el sitio polimórfico de bases únicas que está siendo analizado es heterozigoto. Sin embargo, la determinación de los sitios en los que un paciente es polimórfico es útil para establecer una línea base de polimorfismos que puede ser usada en futuros ensayos para detectar cambios en sitios polimórficos que pueden ser indicativos de cáncer. La existencia de polimorfismos puede ser determinada mediante métodos enseñados aquí, electroforesis en gel o mediante otros métodos estándar.

En el caso en que exista heterozigosidad en el sitio polimórfico, el contaje de la cantidad de cada uno de los dos ddNTPs marcados diferencialmente permite una determinación de si hay una pérdida de heterozigosidad (es decir, una deleción) en una subpoblación de células en la muestra. En una muestra normal (es decir, no cancerosa) que contiene células que son heterozigotas en el sitio polimórfico de bases únicas, se espera que la cantidad detectada de cada uno de los dos ddNTPs añadidos a la sonda será idéntica (dentro de los límites elegidos de significancia estadística). Sin embargo, si una deleción ha tenido lugar en uno de los dos alelos en una subpoblación de células en la muestra, habrá una diferencia estadísticamente significativa entre las cantidades de cada uno de los dos alelos detectados por vía de los ddNTPs incorporados (marcados). La detección de tal diferencia es indicativa de inestabilidad genómica dentro de la muestra. Tal inestabilidad genómica indica la posibilidad de células cancerosas o precancerosas en la muestra.

Para mejorar la capacidad para contar alelos, de modo preciso, a los que están unidos los ddNTPs, los ddNTPs están marcados con bolas del tipo hibridación de diferentes tamaños como se describe anteriormente. Los alelos con sonda unida que comprenden un ddNTP marcado son contados como se describe anteriormente usando un aparato de contaje, tal como un contador Coulter. También como se ha descrito anteriormente, las marcas fluorescentes diferenciales u otros medios de contaje pueden ser usados para detectar separadamente ddNTPs.

La detección de heterozigosidad en sitios polimórficos de bases únicas y la detección de la pérdida de heterozigosidad pueden determinarse en etapas separadas. Por ejemplo, las sondas pueden hibridarse inmediatamente adyacentes, pero sin incluir, el nucleótido que se ha determinado que ha de ser polimórfico como se describe anteriormente. Los cuatro ddNTPs pueden ser entonces añadidos a la muestra, lavados, y la presencia o ausencia de cada marca puede ser detectada. La detección de sólo una marca indica que el individuo del cual se obtiene la muestra es homozigoto en el sitio del nucleótido polimórfico. La detección de dos marcas significa que el individuo es heterozigoto. Se anotan los loci heterozigotos. Como se observa anteriormente, las determinaciones de la línea base de heterozigosidad puede hacerse usando desoxinucleótidos estándar. Una vez que se establece la línea base, los futuros ensayos en ese individuo se realizan en los loci heterozigotos para detectar una pérdida de heterozigosidad como se describe justo antes. Para la detección del cáncer, los loci heterozigotos son típicamente genes supresores de tumores, incluyendo p53, dcc, apc, y otros. Usando los métodos del invento, una "huella dactilar" de los loci supresores de tumores puede ser construida. Una futura desviación a partir de la huella dactilar (es decir, deleciones) proporciona información valiosa en lo que se refiere al desarrollo del cáncer.

Un uso preferido de los métodos anteriores está en la detección del cáncer de colon. Una muestra representativa de heces se prepara como se describe anteriormente. Al menos una sección transversal de la muestra de heces se coloca en tampón y se homogeneiza. Un ADN de hebra doble se convierte a ADN de hebra única y el complementario de la hebra que va a ser detectada es eliminado de la muestra mediante cualquiera de los métodos descritos anteriormente. El ADN de hebra única restante se expone a múltiples copias de una sonda diseñada en base a polimorfismos de bases únicas conocidos en un alelo asociado al cáncer, tal como un alelo supresor de tumores, de modo que la sonda hibrida con un número deseado de nucleótidos inmediatamente adyacentes al nucleótido polimórfico como se describe anteriormente. Después de que la hibridación se completa, la muestra se lava y se expones a ddNTPs marcados de modo diferencial y a una ADN polimerasa. La muestra se lava entonces para eliminar los ddNTPs no incorporados. La presencia de cualesquiera ddNTPs marcados se determina. Si dos marcas son detectadas, el individuo del que se ha obtenido la muestra es heterozigoto en el nucleótido polimórfico. La heterozigosidad del alelo y la secuencia de la sonda que se empareja al sitio inmediatamente adyacente al alelo polimórfico son anotados para referencia en futuros ensayos para la pérdida de heterozigosidad. Alternativamente, una vez que se determina que el paciente es heterozigoto en un locus, se puede realizar inmediatamente un ensayo en la manera descrita anteriormente para determinar la presencia de una pérdida de heterozigosidad en una subpoblación de células en la muestra.

C. Análisis de inestabilidad de microsatélites

Los microsatélites son repeticiones de di- o trinucleótidos que se encuentran a lo largo de todo el genoma. Una disposición particular de repeticiones microsatélites está frecuentemente asociada con una secuencia genómica particular y es heredada establemente en condiciones normales. Las expansiones del número de copias microsatélites están típicamente asociadas con defectos en reparaciones de apareamientos incorrectos. Consecuentemente, los cambios en unas regiones microsatélites indican que el paciente está en riesgo de una mutación en otras regiones genómicas, que pueden conducir al cáncer.

Para detectar inestabilidad de microsatélites como un indicador de una mutación en un gen asociado al cáncer, se debe identificar primero una región microsatélite asociada con el gen de interés. Tales regiones se identifican típicamente en una base de datos, tal como GenBank, EMBL, y otras. Una vez que la región microsatélite silvestre asociada con, por ejemplo, el gen supresor de tumores p53 se identifica, se construye una sonda oligonucleotídica que se extiende por la región microsatélite y las regiones inmediatamente 5' e inmediatamente 3' a la región microsatélite. La longitud precisa de sondas pueden ser determinada por el experimentador. Las sondas están construidas de modo que hibridan con la región microsatélite, incluyendo las extensiones 5' y 3', tanto en los alelos maternos como paternos en los que el microsatélite se asocia con, por ejemplo, p53.

Una muestra apropiada de tejido o fluido corporal es obtenida y procesada como se describe aquí. Un ADN de doble hebra se desnaturaliza y un exceso de sondas maternas y paternas, como se describe anteriormente, son introducidas en la muestra en condiciones de hibridación. Las sondas son detectablemente marcadas como se describe anteriormente. El complementario de las hebras que van a ser detectadas puede ser opcionalmente eliminado mediante métodos descritos anteriormente. La muestra se lava entonces para eliminar la sonda no hibridada y la cantidad de sonda hibridada es detectada cuantitativamente.

La detección cuantitativa puede ser realizada por cualquiera de los medios aquí descritos. Por ejemplo, las sondas pueden ser unidas a bolas de hibridación de tal modo que las sondas que se unen a los alelos maternos están unidas a bolas de un tamaño y sondas que se unen al alelo paterno están unidas a bolas de un segundo tamaño que se distinguen de las bolas del primer tamaño. Las bolas con sonda unida pueden ser contadas como se describe anteriormente.

La detección de una diferencia estadísticamente significativa entre la cantidad de la sonda que se une al alelo materno y la cantidad de sonda que se une al alelo paterno es indicativa de inestabilidad de microsatélites. Como se menciona anteriormente, la inestabilidad de microsatélites es indicativa de una mutación en el locus en el que reside el microsatélite. Si la región microsatélite se asocia con un gen supresor de tumores o un oncogén, la detección de inestabilidad de microsatélites en un alelo en una subpoblación de células en una muestra biológica es indicativa del potencial para el cáncer o que el cáncer o precáncer puede haberse desarrollado ya. Ensayos adicionales como se describen aquí (tanto por medio invasivos como por medios no invasivos) pueden ser entonces llevados a cabo.

En una realización alternativa, una "huella dactilar" de Microsatélites es tomada de regiones asociadas con genes que causan cáncer en una muestra obtenida de un paciente. La huella dactilar comprende la secuencia de microsatélites silvestres asociados con el gen o genes causantes del cáncer. Una vez obtenida, la huella dactilar se almacena y se usa en futuros ensayos de muestras del mismo paciente para monitorizar cambios en regiones microsatélites (es decir, inestabilidad de microsatélites) que puede estar asociada con el desarrollo del cáncer. Los cambios en longitud y/o secuencia de microsatélites a lo largo del tiempo puede ser usada para prescribir ensayos y/o tratamientos adicionales para detectar y eliminar tejido canceroso en cualquier estadío de su etiología.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: EXACT LABORATORIES, INC.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 12 OLD EVERGREEN ROAD

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: BEDFORD

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: NEW HAMPSHIRE

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EEUU

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL (ZIP): 03110

\vskip0.500000\baselineskip

(G): TELÉFONO:

\vskip0.500000\baselineskip

(H): TELEFAX:

\vskip0.500000\baselineskip

(I): TELEX:

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DEL INVENTO: MÉTODOS PARA LA DETECCIÓN DE POBLACIONES CLONALES DE CÉLULAS TRANSFORMADAS EN UNA MUESTRA CELULAR GENÓMICAMENTE HETEROGÉNEA.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 8

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN POSTAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A):: DESTINATARIO: PATENT ADMINISTRATOR, TESTA, HURWITZ & THIBEAULT, LLP

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 125 HIGH STREET

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: BOSTON

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: MA

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EEUU

\vskip0.500000\baselineskip

(F): ZIP: 02110

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMATO DE LECTURA EN COMPUTADOR

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO MEDIO: Disquette

\vskip0.500000\baselineskip

(B): COMPUTADOR: IBM compatible con PC

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS DE SOLICITUD ACTUALES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN DEL ABOGADO/AGENTE

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: MEYERS, THOMAS C

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 36.989

\vskip0.500000\baselineskip

(C): REFERENCIA/NÚMERO DE ETIQUETA: EXT-001PC

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (617) 248-7000

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (617) 248- 7100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID No: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPOS: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..9

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: / nota: "M1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCATCGCA

\hfill

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID No: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..19

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "M2"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCGGCTTAC TGCGATGCC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID No: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRAS: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..19

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "M3"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCATCGCAG TAAGCCGAT

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID No: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..9

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota= "M4"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCGGCTTA

\hfill

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓNPARA LA SECUENCIA ID No: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..9

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "F1"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCATCGCA

\hfill

9

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID No: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..19

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "F2"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCGGCTTAT TGCGATGCC

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID No: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 19 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..19

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "F3"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GGCATCGCAA TAAGCCGAT

\hfill

19

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SECUENCIA ID No: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 9 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácidos nucleicos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE HEBRA: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICAS:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): SITUACIÓN: 1..9

\vskip0.500000\baselineskip

(D): OTRA INFORMACIÓN: /nota = "F4"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID No: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCGGCTTA

\hfill

9

Claims

1. Un método para detectar la presencia de una subpoblación de células en una muestra biológica obtenida de un organismo, que comprende las etapas de:

c) determinar si existe una diferencia estadísticamente significativa entre dicho número X, en el que dicho número X es indicativo de la cantidad de un alelo de referencia en dicha muestra, y dicho número Y, en el que dicho número Y es indicativo de la cantidad de alelo diana silvestre en dicha muestra, siendo la presencia de una diferencia estadísticamente significativa indicativa de la presencia de una subpoblación de células en dicha muestra biológica.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa a) comprende además la exposición de la muestra a una pluralidad de una primera sonda oligonucleotídica complementaria con al menos una porción de secuencia nucleotídica de dicho primer polinucleótido y a una pluralidad de una segunda sonda oligonucleotídica, complementaria con al menos una porción de la secuencia nucleotídica de dicho segundo polinucleótido en condiciones de hibridación, para hibridar y detectar de esa manera un primer número de dúplex formados entre dicha primera sonda y dicho primer segmento y un segundo número de dúplex formados entre dicha segunda sonda y dicho segundo segmento, siendo el número de dúplex formados entre la primera sonda y el primer polinucleótido y entre la segunda sonda y el segundo polinucleótido, indicativo del número X y el número Y, y opcionalmente en el que dicha muestra es un tejido de mamífero.

3. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, para detectar la pérdida alélica de un alelo diana en dicha subpoblación en la que dicha muestra biológica es una muestra heterogénea de material celular en el que dicha pluralidad de una primera sonda oligonucleotídica es una pluralidad de primeras sondas de hibridación capaces cada una de hibridar sólo con al menos una porción de o bien:

una hebra codificante de dicho alelo de referencia o de una complementaria de una hebra codificante de dicho alelo de referencia, y en el que dicha pluralidad de una segunda sonda oligonucleotídica es una pluralidad de segundas sondas de aislamiento capaces cada una de hibridar sólo con al menos una porción de o bien:

una hebra codificante de dicho alelo diana, o de una complementaria de una hebra codificante de dicho alelo diana.

4. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, para detectar una deleción en un locus polimórfico en dicha subpoblación de células en las que o bien el número X o el número Y es indicativo de la cantidad de alelo materno en un locus polimórfico; y en el que el otro número X o Y es indicativo de la cantidad de alelo paterno en un locus polimórfico, y en el que la diferencia es indicativa de una deleción en el locus polimórfico en dicha subpoblación de células.

5. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que dicha subpoblación de células son malignas.

6. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que dicha muestra es un tejido o fluido corporal de mamífero y en el que la presencia de dicha diferencia estadísticamente significativa es indicativa de la presencia de un cáncer colorectal o lesión precancerosa en dicha muestra.

7. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, en el que dicha muestra biológica se selecciona a partir del grupo que consiste en pus, esputo, semen, orina, sangre, saliva, fluido cerebroespinal, heces y tejidos de biopsias.

8. Un método de acuerdo con cualesquiera de las reivindicaciones 2-7, en el que dicha primera sonda oligonucleotídica es marcada de modo detectable con una primera marca, y en el que dicha segunda sonda oligonucleotídica es marcada de modo detectable con una segunda marca.

9. Un método de acuerdo con cualesquiera de las reivindicaciones 2-8, que comprende además la eliminación en dicha muestra biológica de cualquier primera o segunda sonda oligonucleotídica no hibridada.

10. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende además, previamente a la etapa a), la etapa de convertir el ADN de doble hebra en dicha muestra en ADN de hebra única y eliminar la complementaria a dichos primer y segundos segmentos polinucleotídicos.

11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la eliminación de dicha complementaria comprende hibridar dicha complementaria con una sonda de ácidos nucleicos unidos a partículas magnéticas y subsiguientemente eliminar dichas partículas magnéticas de la muestra.

12. El método según cualesquiera de las reivindicaciones 2 a 11, en el que dichos primeros oligonucleótidos están unidos a una primera partícula en una relación de una primera sonda oligonucleotídica por una partícula y dichas segundas sondas oligonucleotídicas están unidas a una segunda partícula diferenciada de modo detectable de dicha primera partícula en una relación de una segunda sonda oligonucleotídica por una segunda partícula y en el que dicha etapa de detección comprende separar las primeras y segundas sondas oligonucleotídicas no hibridadas de las hibridadas y pasar subsiguientemente las primeras y segundas sondas oligonucleotídicas hibridadas a través de un detector para determinar X e Y; y opcionalmente o bien dicha primera y segunda sonda son de colores diferentes de modo detectable, o dichas primeras y segundas partículas son de tamaños diferentes de modo detectable.

13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3-12, en el que dicho alelo diana es un alelo supresor de tumores, opcionalmente dicho alelo supresor de tumores es un alelo p53.

14. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 5 a 12, siendo el locus polimórfico identificado a partir de una base de datos de secuencias nucleotídicas.