ES2221065T3

ES2221065T3 - Proteinas de fusion de clase ii del mhc, solubles, monovalentes o polivalentes, y sus usos.

Info

Publication number: ES2221065T3
Application number: ES97938386T
Authority: ES
Inventors: Kai W. Wucherpfennig; Jack L. Strominger
Original assignee: Harvard University
Current assignee: Harvard University
Priority date: 1996-08-16
Filing date: 1997-08-15
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2017-08-15
Also published as: CA2263195A1; JP2000516470A; ATE272070T1; DK0935607T3; AU4072397A; NZ333915A; DE69730038T2; DE69730038D1; EP0935607B1; AU730457B2; WO1998006749A3; EP0935607A2; PT935607E; WO1998006749A2

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE AL CAMPO DE LA INMUNOLOGIA, ESPECIALMENTE AL DISEÑO, PRODUCCION Y UTILIZACION DE PROTEINAS DE FUSION RECOMBINANTES, DERIVADAS EN PARTE DE LAS PROTEINAS DEL COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD (MHC) HUMANO.

Description

Proteínas de fusión de clase II del MHC, solubles, monovalentes o polivalentes, y sus usos.

Campo del invento

El presente invento está dirigido al campo de la inmunología. En concreto, el presente invento está dirigido al diseño, producción y uso de proteínas de fusión recombinantes derivadas, en parte, de las proteínas del Complejo Principal de Histocompatibilidad humano.

Antecedentes del invento

Las moléculas del MHC son proteínas diméricas, altamente polimórficas, que determinan la especificidad de las respuestas inmunitarias mediadas por las células T, uniéndose a péptidos procedentes de antígenos extraños en un compartimento de procesamiento intracelular, y presentando estos péptidos en la superficie de células presentadoras de antígenos, en donde estos péptidos pueden ser reconocidos por receptores de células T (TCR) especializados (revisión de los mismos en Strominger y Wiley, 1995). Por ejemplo, el gen de la cadena \beta de DR del MHC de Clase II, con 137 alelos DRB1 conocidos (Marsh y Bodmer, 1995), es el gen humano más polimórfico que ha sido identificado. Como era de esperar, los residuos polimórficos de estas proteínas están agrupados en dominios de unión a péptidos que definen el vasto repertorio de péptidos que pueden ser presentados a las células T (Bjorkman y col., 1987; Stern y col., 1994). Aunque las células T normalmente no deben reaccionar contra péptidos propios presentados en moléculas singeneicas del MHC, se piensa que algunos alelos de los genes del MHC de Clase II confieren una susceptibilidad de padecer enfermedades autoinmunitarias a través de la presentación de péptidos propios patogénicos. Así, por ejemplo, los subtipos HLA-DR2 confieren un riesgo aumentado de padecer esclerosis múltiple (MS) (del inglés, " Multiple Sclerosis"), mientras que los subtipos de HLA-DR4 confieren susceptibilidad de padecer la artritis reumatoide (revisión bibliográfica en Todd y col., 1988; Wucherpfenning y Strominger, 1995b).

La producción de moléculas del MHC de Clase II solubles y "vacías" (es decir, moléculas que no llevan unidos péptidos en el interior de los dominios de unión al péptido del MHC de Clase II) sería de gran utilidad para producir preparaciones homogéneas de complejos MHC/péptido "cargados" con una única variedad de péptido. Esos complejos solubles MHC/péptido presentan varios usos importantes tanto para el campo de la investigación como para aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, se requieren moléculas del MHC de Clase II solubles para estudios cristalográficos de complejos MHC/péptido individuales, y para estudiar la interacción bioquímica de complejos MHC/péptido particulares con sus TCR cognados. La caracterización estructural de la unidad de reconocimiento MHC/péptido/TCR proporcionará conocimientos importantes sobre los mecanismos mediante los que las moléculas de MHC confieren susceptibilidad de padecer autoinmunidad. Además, los complejos MHC/péptido solubles son útiles en el tratamiento de enfermedades autoinmunitarias. Por ejemplo, estudios realizados en el modelo murino de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) han mostrado que una enfermedad autoinmunitaria puede ser tratada con la administración de complejos MHC/péptido solubles, cargados con el péptido autoantigénico (Sharma y col., 1991). Se confía en que estos complejos sean útiles en el tratamiento de varias enfermedades autoinmunitarias humanas, que incluyen la esclerosis múltiple (MS) y la artritis reumatoide (RA).

Se han seguido varias estrategias para obtener moléculas purificadas, solubles y vacías del MHC de Clase II. Por ejemplo, las moléculas del MHC de Clase II pueden purificarse a partir de células de mamíferos mediante una cromatografía de afinidad posterior a la solubilización con detergente de las membranas de las células B (Gorga y col. 1987). Sin embargo, las moléculas del MHC purificadas a partir de líneas de células B, ya han pasado por el compartimento intracelular del MHC de Clase II en el que se cargan los péptidos, y por lo tanto, se encuentran ya cargadas con un conjunto diverso de péptidos (Chicz y col., 1992). Además, la separación de estos péptidos de los complejos del MHC derivados de células B (p. ej., mediante un tratamiento a pH bajo) es muy difícil, y típicamente produce la desnaturalización de las proteínas del MHC. En otra estrategia, se han expresado moléculas HLA-DR1 y HLA-DR4, solubles y truncadas, en el sistema constituido por baculovirus/células de insectos, usando construcciones de cDNA correspondientes a los dominios extracelulares DR\alpha y DR\beta sin los dominios transmembranales hidrófobos (Stern y Wiley, 1992). Estas moléculas se asociaron y se secretaron pero presentaron tendencia a agregarse a menos que estuvieran cargadas con un péptido de alta afinidad. Desgraciadamente, esta estrategia no ha no se ha conseguido con las moléculas HLA-DR2. Por ejemplo, el producto de los genes DRA y DRB5*0101 mostró una fuerte tendencia a agregarse incluso cuando se añadían péptidos de alta afinidad (Vranovsky y Strominger, observaciones no publicadas). Además, cuando esta estrategia se intentó realizar con las moléculas DR2 formadas por los productos de los genes DRA y DRB1*1501, las cadenas DR\alpha y DR\beta no consiguieron asociarse (Wucherpfenning, observaciones no publicadas). En otra estrategia más, Wettstein y col. (1991) expresaron un heterodímero (E^{k}) murino de Clase II en forma de una quimera unida a glucano-fosfatidilinositol que podía ser escindida de las células CHO por acción de la fosfolipasa C para obtener una forma soluble, pero esta forma requería concentraciones de péptido 100 veces más altas para producir niveles de estimulación de células T de dos a cuatro veces inferiores. La expresión de moléculas I-A solubles de ratón (I-A^{u} e I-A^{g7}, que confieren susceptibilidad de padecer EAE y diabetes respectivamente) también ha sido difícil. Cuando los dominios extracelulares de estas moléculas del MHC se fusionaban con un anclaje de glucano-fosfatidilinositol y luego se separaban por escisión de la superficie de las células transfectadas, tenía lugar una agregación irreversible incluso cuando las células se habían incubado con péptidos de unión I-A antes de la escisión (L. Fugger y H. McDevitt, comunicación personal). Todas estas observaciones obtenidas con moléculas truncadas del MHC sugieren que, para algunas de estas proteínas pero no para todas, las regiones transmembranales de hélice \alpha de las cadenas \alpha y \beta del MHC de Clase II, son esenciales para la asociación normal del heterodímero \alpha\beta (Cosson y Bonifacino, 1992).

Se ha sugerido que "dominios de dimerización" de proteínas diméricas estables conocidas pueden construirse por ingeniería genética en forma de proteínas de fusión que promueven la formación de proteínas de fusión diméricas estables. Por ejemplo, se observó que péptidos sintéticos de los dominios de dimerización de cremallera de leucina Fos y Jun aislados, que llevaban añadidos residuos de cisteína N-terminales y fragmentos enlazadores (Gly)_{2}, se asociaban en forma de heterodímeros solubles que contenían puentes disulfuro intercatenarios (O'Shea y col., 1989). Proteínas de fusión que incluían dominios de dimerización de cremallera de leucina artificiales se utilizaron asimismo para expresar heterodímeros \alpha\beta de los dominios extracelulares de TCR, que contenían puentes disulfuro intercatenarios (Chang y col., 1994). Aunque estas quimeras de TCR se unían a anticuerpos contra los TCR naturales, se observó que no guardaban la especificidad en los complejos MHC/péptido. En otra estrategia, Grégiore y col., (1991) produjeron heterodímeros \alpha\beta solubles de dominios extracelulares de TCR, coexpresando proteínas en las que los dominios variable y constante (el primer exón solamente) de las cadenas \alpha y \beta de los TCR, se encontraban cada uno de ellos fusionado al mismo dominio constante de una cadena ligera \kappa de inmunoglobulina. De nuevo, aunque los heterodímeros de fusión eran reconocidos por anticuerpos contra el TCR natural, estos autores fueron incapaces de medir la unión directa del heterodímero de fusión a su antígeno del MHC cognado, y encontraron que el heterodímero de fusión no conseguía impedir de manera reproducible que las células T que portaban el TCR natural reconocieran a las células que portaban el antígeno del MHC cognado. Por último, Weber y col. (1992), usando una estrategia similar, no consiguieron detectar la unión directa al MHC de un heterodímero de fusión de los TCR pero dedujeron una unión de baja afinidad resultante de los experimentos de unión competitiva.

Sumario del invento

El presente invento está dirigido a proteínas de fusión monovalentes y multivalentes que comprenden dominios de unión del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II humano, que llevan o no unidos péptidos de unión al MHC, que son útiles en métodos diagnósticos y terapéuticos, así como en análisis de laboratorio.

En uno de los aspectos, el presente invento proporciona una proteína soluble de fusión del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II, que comprende:

un primer polipéptido que comprende una fusión de, en dirección al extremo N-terminal, al menos un dominio de unión del MHC de Clase II, de una cadena \alpha del MHC de Clase II y, en dirección al extremo C-terminal, un primer dominio de dimerización de estructura superenrollada; y

un segundo polipéptido que comprende una fusión de, en dirección al extremo N-terminal, al menos un dominio de unión del MHC de Clase II, de una cadena \beta del MHC de Clase II y, en dirección al extremo C-terminal, un segundo dominio de dimerización de estructura superenrollada;

en la que dichos polipéptidos primero y segundo se asocian en condiciones fisiológicas para formar una molécula heterodimérica del MHC de Clase II, que es capaz de unirse de manera selectiva a un péptido de unión al MHC para formar un complejo MHC/péptido.

En uno de los aspectos, el presente invento proporciona proteínas de fusión de proteínas de las cadenas \alpha y \beta del MHC de Clase II en las que sustancialmente la totalidad de los dominios transmembranales y citoplásmicos C-terminales han sido sustituidos por dominios de dimerización y, opcionalmente, por secuencias enlazadoras interpuestas.

Por lo tanto, se proporciona una proteína de fusión del MHC de Clase II, que comprende una fusión de, en dirección al extremo N-terminal, al menos un dominio de unión del MHC de Clase II, de una cadena \alpha del MHC de Clase II y, en dirección al extremo C-terminal, un dominio de dimerización. En las realizaciones preferidas, el dominio de unión del MHC de Clase II comprende un dominio extracelular de una cadena alfa del MHC de Clase II, preferiblemente al menos los residuos 5-180 de una cadena alfa del MHC de Clase II, más preferiblemente los residuos 5-190, y muy preferiblemente los residuos 5-200. Las cadenas alfa del MHC de Clase II de las que pueden derivar las proteínas de fusión del invento incluyen las cadenas alfa de HLA-DR1, HLA-DR2, HLA-DR4, HLA-DQ1, HLA-DQ2 y HLA-DQ8, y en particular las cadenas alfa codificadas por los alelos DRA*0101, DRA*0102, DQA1*0301 o DQA1*0501.

De manera similar, se proporciona una proteína de fusión del MHC de Clase II, que comprende una fusión de, en dirección al extremo N-terminal, al menos un dominio de unión del MHC de Clase II, de una cadena \beta del MHC de Clase II y, en dirección al extremo C-terminal, un dominio de dimerización. En las realizaciones preferidas, el dominio de unión del MHC de Clase II comprende un dominio extracelular de una cadena beta del MHC de Clase II, preferiblemente al menos los residuos 5-185 de una cadena beta del MHC de Clase II, más preferiblemente los residuos 5-195, y muy preferiblemente los residuos 5-205. Las cadenas beta del MHC de Clase II de las que pueden derivar las proteínas de fusión del invento incluyen las cadenas beta de HLA-DR1, HLA-DR2, HLA-DR4, HLA-DQ1, HLA-DQ2 y HLA-DQ8, y en particular las cadenas beta codificadas por los alelos DRB1*01, DRB1*15, DRB1*16, DRB5*01, DQB1*03 y DQB1*02.

En algunas realizaciones preferidas, los dominios de dimerización de las proteínas de fusión del MHC de Clase II comprenden dominios de dimerización de estructura superenrollada, tales como dominios de cremallera de leucina. Preferiblemente, los dominios de cremallera de leucina incluyen al menos cuatro héptadas de leucinas. En una de las realizaciones preferidas, el dominio de cremallera de leucina es un dominio de cremallera de leucina de Fos o Jun.

En otras realizaciones que no forman parte del invento que se reivindica, el dominio de dimerización es un dominio constante Fab de inmunoglobulinas, tal como una región constante C_{H}1 de cadena pesada de inmunoglobulinas o una región constante de cadena ligera de inmunoglobulinas.

En cada una de las realizaciones anteriores, un fragmento enlazador molecular flexible puede opcionalmente estar interpuesto entre, y unir covalentemente, la cadena del MHC de Clase II y el dominio de dimerización. Preferiblemente, el fragmento enlazador molecular flexible comprende una secuencia peptídica de 1-15 residuos de aminoácidos, más preferiblemente de 5-7 residuos de aminoácidos. Además, cuando se utilizan fragmentos enlazadores polipeptídicos, se prefiere que la mayor parte de los residuos de aminoácidos presentes en el fragmento enlazador sean residuos de alanina, glicina, serina, leucina, isoleucina o valina.

Además, en cada una de las realizaciones anteriores, un péptido de unión al MHC de Clase II de manera opcional puede ir unido covalentemente al extremo N-terminal de la cadena alfa o de la cadena beta del MHC de Clase II, de manera que el péptido de unión es capaz de unirse de manera selectiva a una molécula del MHC de Clase II formada por la cadena alfa o la cadena beta y por otra cadena (beta o alfa, respectivamente) del MHC de Clase II. De este modo, el péptido de unión al MHC y las cadenas del MHC de Clase II forman un complejo MHC/péptido. Preferiblemente, el péptido de unión al MHC está unido al extremo N-terminal de la cadena beta. Esencialmente todos los péptidos de unión al MHC pueden estar unidos al extremo N-terminal de las cadenas del MHC de Clase II con las que se unen de manera selectiva en la naturaleza. En realizaciones particularmente preferidas que tienen importancia médica para la esclerosis múltiple, sin embargo, la molécula del MHC de Clase II es una molécula HLA-DR2 y el péptido de unión se selecciona entre los residuos 85-99, 84-102 y 148-162 de la proteína básica de la mielina humana. De manera similar, en realizaciones particularmente preferidas que tienen importancia médica para el pénfigo vulgar, la molécula del MHC de Clase II es una molécula HLA-DR4 o HLA-DQ1 y dicho péptido de unión se selecciona entre los residuos 78-93, 97-111, 190-204, 206-220, 251-265, 512-526 y 762-786 de la proteína desmogleína 3 humana.

En cada una de las realizaciones anteriores que emplean en la proteína de fusión un péptido de unión al MHC unido covalentemente, un fragmento enlazador molecular flexible puede opcionalmente estar interpuesto entre, y unir covalentemente, la cadena del MHC de Clase II y el péptido de unión al MHC. Preferiblemente, el fragmento enlazador es una secuencia polipeptídica de 10-20 residuos de aminoácidos, más preferiblemente de 12-18 residuos de aminoácidos. Cuando se utiliza un fragmento enlazador polipeptídico, se prefiere que la mayor parte de los residuos de aminoácidos sean residuos de alanina, glicina, serina, leucina, isoleucina y valina.

En otro aspecto, el presente invento proporciona proteínas de fusión del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II que comprenden un heterodímero formado por una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica; en el que la primera cadena polipeptídica comprende una fusión de, en dirección al extremo N-terminal, al menos un dominio extracelular de una cadena \alpha del MHC de Clase II y, en dirección al extremo C-terminal, un primer dominio de dimerización, y la segunda cadena polipeptídica comprende una fusión de, en dirección al extremo N-terminal, al menos un dominio extracelular de una cadena \beta del MHC de Clase II y, en dirección al extremo C-terminal, un segundo dominio de dimerización. En estas realizaciones, el primer dominio de dimerización y el segundo dominio de dimerización se asocian en una disolución en condiciones fisiológicas para formar un heterodímero capaz de unirse de manera selectiva a un péptido de unión al MHC. Los dominios de dimerización, según se ha descrito anteriormente, pueden ser dominios de dimerización de estructura superenrollada y, preferiblemente, dominios de cremallera de leucina. Fragmentos enlazadores moleculares flexibles, según se han descrito anteriormente, pueden estar interpuestos entre, y unir covalentemente, las cadenas del MHC y los dominios de dimerización, y los péptidos de unión al MHC pueden estar unidos covalentemente a una sola de las cadenas de MHC.

En otro aspecto, que no forma parte del invento que se reivindica, se proporciona una proteína de fusión del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II que comprende un heterodímero formado por una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, en el que la primera cadena polipeptídica comprende una fusión de, en dirección al extremo N-terminal, al menos un dominio extracelular de una cadena \alpha del MHC de Clase II y, en dirección al extremo C-terminal, una región constante C_{H}1 de cadena pesada de inmunoglobulinas, y la segunda cadena polipeptídica comprende una fusión de, en dirección al extremo N-terminal, al menos un dominio extracelular de una cadena \beta del MHC de Clase II y, en dirección al extremo C-terminal, una región constante de cadena ligera de inmunoglobulinas. En estas realizaciones, la región constante C_{H}1 de cadena pesada de inmunoglobulinas y la región constante de cadena ligera de inmunoglobulinas dimerizan en disolución en condiciones fisiológicas para formar un heterodímero capaz de unir de manera selectiva un péptido de unión al MHC. Como alternativa, se proporciona una proteína de fusión del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II que comprende un heterodímero formado por una primera cadena polipeptídica y una segunda cadena polipeptídica, en el que la primera cadena polipeptídica comprende una fusión de, en dirección al extremo N-terminal, al menos un dominio extracelular de una cadena \alpha del MHC de Clase II y, en dirección al extremo C-terminal, una región constante de cadena ligera de inmunoglobulinas, y la segunda cadena polipeptídica comprende una fusión de, en dirección al extremo N-terminal, al menos un dominio extracelular de una cadena \beta del MHC de Clase II y, en dirección al extremo C-terminal, una región constante C_{H}1 de cadena pesada de inmunoglobulinas. En estas realizaciones, lo mismo que antes, la región constante C_{H}1 de cadena pesada de inmunoglobulinas y la región constante de cadena ligera de inmunoglobulinas dimerizan en disolución en condiciones fisiológicas para formar un heterodímero capaz de unir de manera selectiva un péptido de unión al MHC. En cada una de estas realizaciones, la proteína de fusión del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II puede comprender además una región Fc de inmunoglobulinas que va unida covalentemente a la región constante C_{H}1 de cadena pesada de inmunoglobulinas. Esas regiones Fc pueden ser de regiones Fc de IgE o IgM, y un fragmento enlazador molecular flexible puede opcionalmente estar interpuesto entre, y unir covalentemente, la región constante C_{H}1 de cadena pesada de inmunoglobulinas y la región Fc de inmunoglobulinas. De manera alternativa, las regiones Fc pueden ser regiones Fc de IgA, IgD o IgG. Lo mismo que antes, un fragmento enlazador molecular flexible puede opcionalmente estar interpuesto entre, y unir covalentemente, la región constante C_{H}1 de cadena pesada de inmunoglobulinas y la región Fc de inmunoglobulinas y, en estas realizaciones, pueden ser regiones bisagra de inmunoglobulinas.

En otras realizaciones que no forman parte del invento que se reivindica, se proporciona una proteína de fusión multivalente del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II, que comprende dos proteínas de fusión del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según se han descrito anteriormente, en la que las regiones Fc están unidas covalentemente por al menos un enlace disulfuro. Muy preferiblemente, se proporciona una proteína de fusión multivalente del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II, que comprende cinco pares de proteínas de fusión del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II, en la que las regiones Fc son regiones de IgM, cada par está unido covalentemente por al menos un enlace disulfuro entre las regiones Fc de cada par, y los cinco pares están unidos covalentemente por puentes disulfuro para formar una estructura en anillo tal que cada par adyacente en el anillo está unido por al menos un enlace disulfuro.

En cada una de las realizaciones anteriores, la proteína de fusión del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II puede comprende además una secuencia señal de secreción N-terminal, unida covalentemente al extremo N-terminal de la proteína de fusión. En realizaciones preferidas, la secuencia señal de secreción comprende una señal de secreción del factor sexual \alpha de levaduras o una señal de secreción de una proteína del MHC de Clase II humano.

En otro aspecto, el presente invento proporciona un complejo MHC/péptido del presente invento, soluble, monovalente o multivalente, para usar en un método terapéutico.

En otro aspecto, el presente invento proporciona un método para detectar células T que poseen una especificidad definida para el complejo MHC de Clase II-péptido, que comprende proporcionar una proteína de fusión del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II, monovalente o multivalente, según se ha descrito anteriormente, y que comprende el complejo MHC de Clase II-péptido definido, poner en contacto una población de células T con la proteína de fusión, y detectar la presencia o ausencia de unión de la proteína de fusión y de las células T en la población. También se proporciona un método que además comprende aislar células T reactivas con el complejo MHC-péptido definido, de entre la población de células T, por medio de, por ejemplo, clasificación de células activadas por fluorescencia.

En otro aspecto el presente invento proporciona un complejo MHC/péptido del presente invento, soluble, monovalente o multivalente, para conferir a un sujeto inmunidad adoptiva frente a una proteína diana que comprende dicho péptido de unión al MHC.

En otro aspecto, el presente invento proporciona un método in vitro para estimular o activar las células T reactivas contra un complejo MHC de Clase II-péptido definido, que comprende proporcionar una proteína de fusión del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II, monovalente o multivalente, según se ha descrito anteriormente y que comprende el complejo MHC de Clase II-péptido definido, y poner en contacto una población de células T con una cantidad inmunogénica de la proteína de fusión.

En otro aspecto, el presente invento proporciona un complejo MHC/péptido del presente invento, soluble, monovalente o multivalente, para estimular o activar a las células T reactivas contra un complejo MHC/péptido definido.

En las realizaciones preferidas, la proteína de fusión se pone en contacto con la población de células T in vivo en un sujeto humano, y la proteína de fusión del MHC de Clase II comprende un dominio de unión del MHC de Clase II que es singeneico en relación con el sujeto.

En otro aspecto, que no forma parte del invento que se reivindica, se proporciona un método para destruir de manera selectiva células T reactivas frente a un complejo MHC de Clase II-péptido definido, que comprende proporcionar una proteína de fusión del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II, monovalente o multivalente, según se ha descrito anteriormente y que comprende el complejo MHC de Clase II-péptido definido, y poner en contacto una población de células T con la proteína de fusión, en el que la proteína de fusión comprende un dominio de una inmunoglobulina eficaz para activar un sistema de complemento y hacer que el sistema del complemento destruya las células T.

En otro aspecto, el presente invento proporciona un método in vitro para destruir de manera selectiva células T reactivas frente a un complejo MHC de Clase II-péptido definido, que comprende proporcionar una proteína de fusión del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II, monovalente o multivalente, según se ha descrito anteriormente y que comprende el complejo MHC de Clase II-péptido definido, y poner en contacto una población de células T con la proteína de fusión, en el que la proteína de fusión comprende una sustancia citotóxica unida covalentemente a la proteína y capaz de destruir las células T a las que la proteína de fusión se une de manera selectiva.

En otro aspecto, el presente invento proporciona un complejo MHC/péptido del presente invento, soluble, monovalente o multivalente, para destruir de manera selectiva células T reactivas frente a un complejo MHC/péptido definido, en el que dicho complejo MHC/péptido comprende además una sustancia citotóxica unida covalentemente.

En otro aspecto, el presente invento proporciona un complejo MHC/péptido del presente invento, soluble, monovalente o multivalente, para inducir tolerancia en un sujeto humano frente a un péptido definido de unión a la Clase II del MHC.

En algunas realizaciones preferidas, la proteína de fusión del MHC de Clase II comprende un dominio de unión del MHC de Clase II que es singeneico en relación con el sujeto. En otras realizaciones preferidas, sin embargo, la proteína de fusión con el MHC de Clase II comprende un dominio de unión del MHC de Clase II que es alogénico en relación con el sujeto.

En otro aspecto el presente invento proporciona secuencias de ácido nucleico que codifican las proteínas de fusión del MHC de Clase II anteriormente descritas.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1. Esta figura es una representación esquemática de una proteína de fusión del MHC, monovalente, del invento. En ella, un dominio extracelular o de unión al péptido, de una cadena \alpha 10 del MHC de Clase II ha sido unido a un primer dominio de dimerización 30 de estructura superenrollada, un dominio extracelular o de unión al péptido, de una cadena \beta 20 del MHC de Clase II ha sido unido a un segundo dominio de dimerización 40 de estructura superenrollada, y estas dos construcciones de fusión se han asociado para formar una molécula heterodimérica que puede unirse a un péptido 110 de unión al MHC en la hendidura formada por los dominios de unión del MHC de Clase II de las cadenas \alpha y \beta, 10 y 20. Fragmentos enlazadores moleculares flexibles, no mostrados, opcionalmente pueden estar interpuestos entre los dominios del MHC (10, 20) y los dominios de dimerización (30, 40).

Figura 2. Esta figura es una representación esquemática de una construcción del invento de una proteína de fusión divalente MHC-inmunoglobulina. En ella, un dominio extracelular o de unión al péptido, de una cadena \alpha 10 del MHC de Clase II ha sido unido a un primer dominio de dimerización 30 de estructura superenrollada, y un dominio extracelular o de unión al péptido, de una cadena \beta 20 del MHC de Clase II ha sido unido a un segundo dominio de dimerización 40 de estructura superenrollada. Como se observa, el dominio 30 fusionado al dominio 10 de la cadena \alpha del MHC, está además fusionado a la región bisagra 50 (opcional) y a la región Fc 60 de una cadena de inmunoglobulina. Como alternativa, no mostrada, los dominios 10 y 20 de las cadenas \alpha y \beta del MHC pueden cambiarse de manera que el dominio de la cadena \beta del MHC se fusiona con los dominios 50 y 60 de la cadena pesada de las inmunoglobulinas. Los dominios de dimerización 30 y 40 promueven la asociación de estas dos construcciones de fusión para formar una estructura heterodimérica que puede unirse a un péptido 110 de unión al MHC en la hendidura formada por los dominios de unión del MHC de Clase II de las cadenas \alpha y \beta, 10 y 20. Fragmentos enlazadores moleculares flexibles, no mostrados, opcionalmente pueden estar interpuestos entre los dominios del MHC (10, 20) y los dominios de dimerización (30, 40), y/o entre el dominio de dimerización 30 y la región bisagra 50 o la región Fc 60 de las inmunoglobulinas. Las regiones Fc 60 y 60' de dos de estas proteínas de fusión MHC-inmunoglobulina heterodiméricas, se han asociado del mismo modo que un anticuerpo para formar una construcción de una proteína divalente de fusión del MHC. Las líneas horizontales entre las regiones Fc 60 y 60' representan puentes disulfuro entre los dominios de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas.

Figura 3. Esta figura es una representación esquemática de una construcción del invento, de una proteína de fusión decavalente MHC-inmunoglobulina IgM. En ella, un dominio extracelular o de unión al péptido, de una cadena \alpha 10 del MHC de Clase II, ha sido unido a un primer dominio de dimerización 30 de estructura superenrollada, un dominio extracelular o de unión al péptido, de una cadena \beta 20 del MHC de Clase II ha sido unido a un segundo dominio de dimerización 40 de estructura superenrollada, y estas dos construcciones de fusión se han asociado para formar una molécula heterodimérica que puede unirse a un péptido 110 de unión al MHC en la hendidura formada por los dominios de unión del MHC de Clase II de las cadenas \alpha y \beta, 10 y 20. Como se observa, el dominio 30 fusionado al dominio 10 de la cadena \alpha del MHC está además fusionado a un dominio Fc de IgM (C_{H}2, C_{H}3, C_{H}4) 60. Como alternativa, no mostrada, los dominios 10 y 20 de las cadenas \alpha y \beta del MHC pueden cambiarse de manera que los dominios de las cadenas \beta del MHC se fusionan con los dominios 60 de las cadenas pesadas de la inmunoglobulina. Las regiones Fc 60 y 60' de dos proteínas de fusión MHC-inmunoglobulina heterodiméricas se han asociado de la misma manera que una subunidad de IgM sencilla para formar una estructura de fusión divalente MHC-IgM unida por un enlace disulfuro. Cinco de estas subunidades de fusión divalentes MHC-IgM se han asociado para formar un pentámero de IgM característico, unido por enlaces disulfuro 90 entre las subunidades de IgM y que incluye un péptido 100 de cadena J, y dando como resultado una estructura de fusión decavalente MHC-IgM. Fragmentos enlazadores moleculares flexibles, no mostrados, opcionalmente pueden estar interpuestos entre los dominios del MHC (10, 20) y los dominios de estructura superenrollada (30, 40), y/o entre los dominios (30) y los dominios Fc (60) de las IgM.

Figura 4. Esta figura es una representación esquemática de una construcción del invento de una proteína de fusión tetravalente MHC-secuencia marcadora. En ella, un dominio extracelular o de unión al péptido, de una cadena \alpha 10 del MHC de Clase II ha sido unido a un primer dominio de dimerización 30 de estructura superenrollada, un dominio extracelular o de unión al péptido, de una cadena \beta 20 del MHC de Clase II ha sido unido a un segundo dominio de dimerización 40 de estructura superenrollada, y estas dos construcciones de fusión se han unido asociado para formar una molécula heterodimérica que puede unirse a un péptido 110 de unión al MHC en la hendidura formada por los dominios de unión del MHC de Clase II de las cadenas \alpha y \beta, 10 y 20. Como se observa, el dominio 30 fusionado al dominio 10 de la cadena \alpha del MHC está además fusionado a una secuencia marcadora biotinilada 70 que se une a avidina o estreptavidina 80. Como alternativa, no mostrada, los dominios 10 y 20 de las cadenas \alpha y \beta del MHC pueden cambiarse de manera que el dominio de la cadena \beta del MHC se fusiona con la secuencia marcadora biotinilada 70. Debido a que cada molécula de avidina o estreptavidina puede unirse a cuatro restos de biotina, estos complejos MHC-secuencia marcadora-biotina/(estrept)avidina son tetravalentes. Fragmentos enlazadores moleculares flexibles, no mostrados, opcionalmente pueden estar interpuestos entre los dominios del MHC (10, 20) y los dominios de dimerización (30, 40), y/o entre el dominio de dimerización (30) y la secuencia marcadora biotinilada (70).

Figura 5. Esta figura presenta gráficamente los resultados de experimentos que demuestran la asociación y secreción de proteínas de fusión de HLA-DR2 recombinantes en Pichia pastoris. La expresión de proteínas de fusión de DR2 (DR\alpha-Fos y DR\beta-Jun) se estudió mediante un análisis de ELISA en sándwich, de sobrenadantes de cultivos celulares (gráfica superior) o de lisados de cultivos celulares (gráfica inferior) usando para la captura un mAb (L243) específico para el heterodímero \alpha\beta de DR2, y usando para la detección un antisuero policlonal específico para DR. La unión del anticuerpo secundario se cuantificó con un antisuero anti-IgG de conejo, conjugado con peroxidasa, con ABTS como sustrato de la peroxidasa y una detección a 405 nm. Los resultados son los de células transfectadas con: sólo DR\alpha-Fos, cuadrados en blanco; sólo DR\beta-Jun, círculos en negro; y tanto DR\alpha-Fos y DR\beta-Jun, círculos en blanco.

Figura 6. Esta figura presenta los resultados de experimentos que demuestran la especificidad de unión de un péptido, a proteínas de fusión HLA-DR2 recombinantes (r-DR2). La unión de péptidos se estudió usando un péptido MBP(85-99) ("MBP") que se había observado previamente que se unía con una alta afinidad a DR2 soluble en detergente. Los complejos rDR2-MBP se capturaron en una placa de ELISA usando un mAb (L243) específico para DR, y el MBP biotinilado unido a DR se cuantificó utilizando estreptavidina marcada con peroxidasa, usando ABTS como sustrato de la peroxidasa y una detección a 405 nm. La gráfica superior muestra el efecto de la concentración de rDR2 sobre la unión del péptido con: péptido MBP biotinilado 2 \muM, círculos en blanco; péptido MBP biotinilado 2 \muM junto con péptido MBP no biotinilado 100 \muM como competidor, triángulos en negro; y ausencia de péptido, cuadrados en negro. El mismo análisis de ELISA se utilizó con rDR2 200 nM y MBP biotinilado 2 \muM para demostrar la especificidad de la unión. La gráfica inferior muestra el efecto de concentraciones variables de los péptidos competidores sobre la unión del péptido MBP biotinilado a proteínas de fusión rDR2: MBP competidor no biotinilado, cuadrados en blanco; MBP competidor Val 89\rightarrowAsp, círculos en negro.

Figura 7. Esta figura presenta los resultados de experimentos que demuestran las cinéticas de la unión de péptidos a proteínas de fusión recombinantes de HLA-DR2 (r-DR2). Las cinéticas de la unión de los péptidos se compararon en el caso de rDR2 y en el caso de DR2 soluble en detergente y purificada procedente de una línea de células B transformada con EBV. Las proteínas DR2 (200 nM) se incubaron con péptido MBP biotinilado (2 \muM) a 37ºC durante diferentes períodos de tiempo; la cantidad de péptido unido a DR se estudió por análisis de ELISA usando un anticuerpo específico para DR para la captura y estreptavidina-peroxidasa para la cuantificación del péptido unido, utilizando ABTS como sustrato de la peroxidasa y una detección a 405 nm. La gráfica muestra la unión del péptido MBP biotinilado a lo largo del tiempo para: fusiones con DR2 recombinante, cuadrados en blanco; moléculas DR2 procedentes de células B solubilizadas en detergente, triángulos en negro.

Descripción detallada del invento I. Definiciones

Con el fin de describir de manera más clara y concisa e indicar el tema objeto del invento que se reivindica, se aportan las siguientes definiciones de expresiones específicas que se utilizan en la siguiente descripción y en las reivindicaciones adjuntas.

Según aquí se utiliza, la expresión "Clase II del MHC" o "Clase II" se refiere a las proteínas, péptidos de unión o genes del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II humano. La región del MHC humano, también denominada HLA, se encuentra en el cromosoma seis e incluye la región de Clase I y la región de Clase II. Dentro de la región del MHC de Clase II se encuentran las subregiones DP, DQ y DR correspondientes a los genes de la cadena \alpha y de la cadena \beta de Clase II (es decir, DP\alpha, DP\beta, DQ\alpha, DQ\beta, DR\alpha y DR \beta). Según aquí se utiliza, la expresión "molécula del MHC de Clase II" significa un complejo unido por enlaces covalentes o no covalentes, constituido por una cadena \alpha del MHC de Clase II y por una cadena \beta del MHC de Clase II. Las moléculas del MHC de Clase II unen péptidos en un compartimento de procesamiento intracelular y presentan estos péptidos a las células T sobre la superficie de células presentadoras de antígenos. Los péptidos son unidos en una conformación extendida, igual a la de las hélices de poliprolina levógiras de tipo II. La mayoría de los péptidos unidos tienen una longitud de 13-18 aminoácidos pero son las cadenas laterales de los péptidos, de un segmento central de aproximadamente nueve aminoácidos (de P1 a P9) las que ocupan las cavidades del dominio de unión del MHC de Clase II y determinan la especificidad de la unión (Brown y col., 1993; Stern y col., 1994).

Según aquí se utiliza, la expresión "cadena \alpha del MHC de Clase II" se refiere a un polipéptido presente en la naturaleza, o a un polipéptido codificado por un gen \alpha mutado de manera artificial, que corresponde esencialmente a al menos los dominios extracelulares \alpha_{1} y \alpha_{2} de uno de los productos génicos de un gen \alpha del MHC de Clase II (p. ej., un gen \alpha de DP, DQ o DR). Ya que las porciones transmembranal y citoplásmica C-terminales de la cadena \alpha no son necesarias para la unión del péptido antigénico en el presente invento, pueden ser suprimidas conservándose aun así la actividad biológica. Además, la expresión "cadena \alpha del MHC de Clase II" tiene la intención de incluir variantes con y sin la glicosilación usual de los dominios \alpha_{1} y \alpha_{2}. Esta expresión tiene intención en particular de incluir todas las variantes alélicas de los genes \alpha de Clase II, así como todos los equivalentes que puedan producirse por métodos de síntesis o métodos recombinantes, por ejemplo, por mutagénesis dirigida a un sitio, de una variante presente en la naturaleza.

Según aquí se utiliza, la expresión "cadena \beta del MHC de Clase II" se refiere a un polipéptido presente en la naturaleza, o a un polipéptido codificado por un gen \beta mutado de manera artificial, que corresponde esencialmente a al menos el dominio extracelular \beta_{1} y \beta_{2} de uno de los productos génicos de un gen \beta del MHC de Clase II (p. ej., un gen \beta de DP, DQ o DR). Ya que las porciones transmembranal y citoplásmica C-terminales de la cadena \beta no son necesarias para la unión del péptido antigénico en el presente invento, pueden ser suprimidas conservándose aun así la actividad biológica. Además, la expresión "cadena \beta del MHC de Clase II" tiene la intención de incluir variantes con y sin la glicosilación usual del dominio \beta_{1}. Esta expresión tiene intención en particular de incluir todas las variantes alélicas de los genes \beta de Clase II, así como todos los equivalentes que puedan producirse por métodos de síntesis o métodos recombinantes, por ejemplo, por mutagénesis dirigida a un sitio, de una variante presente en la naturaleza.

Según aquí se utiliza, la expresión "dominio de unión del MHC de Clase II" se refiere a las regiones de las moléculas del MHC de Clase II que son necesarias para unir un péptido antigénico. El dominio de unión del MHC de Clase II está formado principalmente por los dominios \alpha_{1} y \beta_{1} de las cadenas \alpha y \beta del MHC de Clase II y, por lo tanto, un dominio de unión del MHC de Clase II incluye como mínimo estas regiones. Sin embargo, los dominios \alpha_{2} y \beta_{2} de estas proteínas, también se cree que son importantes para estabilizar la estructura completa de la hendidura de unión del MHC y, por lo tanto, un dominio de unión del MHC de Clase II del presente invento preferiblemente incluye estas regiones. Un dominio de unión del MHC de Clase II también puede definirse esencialmente como el dominio extracelular de una molécula del MHC de Clase II, distinguiéndose de los dominios transmembranal y citoplásmico, aunque es probable que alguna porción del dominio extracelular pueda ser suprimida conservándose aun así la actividad biológica.

Según aquí se utiliza, la expresión "péptido de unión al MHC de Clase II" se refiere a un polipéptido que es capaz de unirse selectivamente en el interior de la hendidura formada por las cadenas \alpha y \beta de una molécula específica del MHC de Clase II para formar un complejo MHC de Clase II-antígeno peptídico. Un péptido de unión al MHC de Clase II puede ser un péptido propio o no propio, procesado o puede ser un péptido sintético. Para las proteínas del MHC de Clase II, los péptidos típicamente tienen una longitud de 10-25 aminoácidos, y más típicamente tienen una longitud de 13-18 residuos, aunque péptidos más largos y más cortos pueden ser efectivos.

Según aquí se utiliza, la expresión "complejo MHC/péptido" se refiere a un complejo terciario unido por enlaces covalentes o no covalentes, formado por el dominio de unión de una molécula del MHC de Clase II y un péptido de unión a la Clase II del MHC que se une a ese dominio de unión del MHC de Clase II.

Según aquí se utiliza, la expresión "fragmento enlazador molecular flexible" o "fragmento enlazador" se refiere a un resto químico que tiene una longitud igual o mayor que la de tres enlaces carbono-carbono e incluye al menos un enlace de libre rotación a lo largo de dicha longitud. Preferiblemente, un fragmento enlazador molecular flexible está formado por uno o más residuos de aminoácidos pero no es imprescindible que así sea. En algunas realizaciones preferidas, los fragmentos enlazadores moleculares flexibles del invento comprenden al menos tres residuos de aminoácidos y, más preferiblemente, al menos siete residuos de aminoácidos.

Según aquí se utiliza, la expresión "que se une selectivamente" significa que es capaz de unirse de la misma manera electroespecífica y estereoespecífica como se une un anticuerpo a un antígeno o un ligando a un receptor. Con relación a un péptido de unión al MHC, la unión selectiva conlleva la unión no covalente de cadenas laterales específicas del péptido en el interior de las cavidades de unión presentes en el dominio de unión del MHC, con el fin de formar un complejo MHC-péptido (véase, p. ej., Brown y col., 1993); Stern y col., 1994).

Según aquí se utiliza, la expresión "sustancialmente puros", significa, con relación a los péptidos de unión al MHC y a las diferentes proteínas de fusión del invento, que estos péptidos o estas proteínas se encuentran esencialmente libres de otras sustancias en un grado práctico y apropiado para el uso deseado. En particular, los péptidos y proteínas están suficientemente puros y suficientemente libres de otros constituyentes biológicos de sus células hospedadoras, de manera que son útiles, por ejemplo, para generar anticuerpos o para producir preparaciones farmacéuticas. Una preparación sustancialmente pura de los péptidos o proteínas del invento no necesita estar absolutamente libre del resto de proteínas o componentes celulares y, para fines de su administración, puede estar relativamente diluida. Una persona con una experiencia normal en la técnica puede producir esas preparaciones sustancialmente puras mediante la aplicación o la aplicación en serie de métodos muy conocidos que incluyen, pero sin limitarse a ellos, HPLC, cromatografía de afinidad o separación electroforética. Las preparaciones sustancialmente puras del invento pueden también comprender otros componentes activos y, por lo tanto, el porcentaje en peso de los péptidos de unión al MHC y/o de las diferentes proteínas de fusión del MHC del invento puede estar reducido en esas preparaciones.

II. Realizaciones preferidas

El presente invento depende, en parte, del descubrimiento de que proteínas de fusión, que comprenden dominios de proteínas del MHC de Clase II y dominios de estructura superenrollada, pueden producirse por métodos recombinantes, y que estas proteínas de fusión pueden formar heterodímeros que incluyen dominios de unión del MHC de Clase II, biológicamente funcionales, en proteínas monovalentes o multivalentes. En particular, se describe que (1) dominios extracelulares de algunas moléculas del MHC de Clase II que con anterioridad no habían podido producirse en forma de heterodímeros vacíos, solubles y estables, pueden producirse usando proteínas de fusión que incorporan dominios de dimerización de estructura superenrollada, y (2) dominios de unión heterodiméricos del MHC de Clase II pueden producirse en forma de proteínas multivalentes, incorporándolos como fusiones en estructuras multivalentes con inmunoglobulinas o con biotina/estreptavidina. De particular importancia, es el resultado inesperado de que los dominios de unión del MHC de Clase II de estas proteínas de fusión conservan su actividad biológica a pesar del requerimiento funcional de interacciones de las estructuras terciaria y cuaternaria, altamente específicas, dentro y entre las cadenas \alpha y \beta de la molécula del MHC, y a pesar de la sustitución de los dominios transmembranales hidrófobos naturales de las proteínas del MHC de Clase II por dominios de fusión relativamente grandes y relativamente hidrófilos.

Así, en una primera serie de realizaciones, el presente invento proporciona la producción de proteínas de fusión de proteínas de las cadenas \alpha y \beta del MHC de Clase II en las que sustancialmente la totalidad de los dominios transmembranales y citoplásmicos C-terminales han sido sustituidos por dominios de dimerización de estructura superenrollada y, opcionalmente, secuencias enlazadoras interpuestas. La Figura 1 ilustra de manera esquemática ese tipo de proteína de fusión monovalente del MHC de Clase II. Al menos el dominio de unión al péptido, y preferiblemente el dominio extracelular completo, de una cadena \alpha 10 del MHC de Clase II, puede estar fusionada a un primer dominio de dimerización 30 (p. ej., un dominio de cremallera de leucina). Del mismo modo, al menos el dominio de unión al péptido y preferiblemente el dominio extracelular completo, de una cadena \beta 20 del MHC de Clase II, puede estar fusionada a un segundo dominio de dimerización 40 (p. ej., un dominio de cremallera de leucina).

Los dominios de dimerización (30 y 40) se asocian en disolución para promover la formación de una proteína de fusión heterodimérica en la que los componentes de las cadenas \alpha y \beta (10 y 20) del MHC de Clase II se asocian de manera estable para formar un dominio de unión del MHC de Clase II, biológicamente activo, que es capaz de unirse, o de ser "cargado" con péptidos 110 de unión al MHC de manera que se forma un complejo estable MHC/péptido que es capaz de unirse selectivamente a los receptores cognados de células T y activar selectivamente a clones de células T que portan los TCR cognados. Opcionalmente, fragmentos enlazadores moleculares flexibles pueden estar interpuestos entre los componentes del MHC (10 y 20) y los dominios de dimerización (30 y 40) con el fin de una mejor aproximación a la distancia normal entre los componentes del MHC y sus dominios transmembranales naturales del MHC, y/o para proporcionar la libre rotación entre los componentes del MHC y los dominios de dimerización de manera que la geometría de la asociación entre los dominios de dimerización no constriña ni interfiera con la geometría de la asociación de los dominios del MHC.

En otra serie de realizaciones, el presente invento proporciona la producción de proteínas de fusión divalentes, de proteínas de las cadenas \alpha y \beta del MHC de Clase II, en las que sustancialmente la totalidad de los dominios transmembranales y citoplásmicos C-terminales han sido sustituidos por dominios de dimerización de estructura superenrollada y, opcionalmente, secuencias enlazadoras interpuestas.

Los dominios constantes de las inmunoglobulinas se eligen con el fin de promover la formación de moléculas divalentes similares a anticuerpos, que portan dos dominios de unión del MHC de Clase II y, opcionalmente, de promover determinadas funciones efectoras (p. ej., la activación del complemento, la unión celular). La Figura 2 ilustra esquemáticamente ese tipo de proteína de fusión divalente del MHC de Clase II. Al menos el dominio de unión al péptido, y preferiblemente el dominio extracelular completo, de una cadena \alpha 10 del MHC de Clase II, puede estar fusionado con un primer dominio de dimerización 30 (p. ej., un dominio de cremallera de leucina). De manera similar, al menos el dominio de unión al péptido, y preferiblemente el dominio extracelular completo, de una cadena \beta 20 del MHC de Clase II puede estar fusionado con un segundo dominio de dimerización 40 (p. ej., un dominio de cremallera de leucina).

Los dominios de dimerización (30 y 40) se asocian en disolución para promover la formación de una proteína de fusión heterodimérica en la que los componentes \alpha y \beta (10 y 20) del MHC de Clase II se asocian de manera estable para formar un dominio de unión del MHC de Clase II, biológicamente activo, que es capaz de unirse, o de ser "cargado" con péptidos 110 de unión al MHC, de manera que se forma un complejo estable MHC/péptido que es capaz de unirse selectivamente a los receptores de células T cognados y activar selectivamente a clones de células T que portan los TCR cognados. Sin embargo, según se ha indicado anteriormente, algunas moléculas del MHC de Clase II (p. ej., HLA-DR1, HLA-DR4) pueden ser expresadas mediante el método de Stern y Wiley (1992) en forma de heterodímeros estables y solubles que carecen de sus dominios transmembranales y citoplásmicos.

Después, una de las dos proteínas de fusión del MHC comprende además una región Fc 60 de inmunoglobulina, con o sin una región bisagra 50 de inmunoglobulina interpuesta, apropiada para la región Fc (las moléculas IgA, IgD e IgG incluyen regiones bisagra; las moléculas IgE e IgM no las incluyen). Preferiblemente, es la proteína de fusión de la cadena \alpha del MHC de Clase II la que se fusiona con la región Fc de una cadena pesada de la inmunoglobulina, debido a que las cadenas \alpha del MHC de Clase II son menos variables que las cadenas \beta y, por lo tanto, esa proteína de fusión de una cadena \alpha podría utilizarse junto con varias proteínas de fusión diferentes de la cadena \beta del MHC de Clase II, para formar una variedad de moléculas divalentes diferentes que presentan una especificidad de HLA diferente. Sin embargo, hay que señalar que no existe motivo para que la construcción con la cadena \beta no pueda incluir las regiones Fc de las inmunoglobulinas. Por último, fragmentos enlazadores moleculares flexibles opcionalmente pueden estar interpuestos entre los componentes del MHC (10 y 20), los dominios de dimerización (30 y 40), y/o los componentes de la inmunoglobulina (50 y/o 60) con el fin de una mejor aproximación a la distancia normal entre los componentes del MHC y sus dominios transmembranales naturales del MHC, y/o para proporcionar la libre rotación entre los componentes del MHC, los dominios de dimerización, y/o los dominios de la inmunoglobulina, de manera que la geometría de la asociación entre cualquier par de componentes que dimerice, no constriña ni interfiera con la geometría de la asociación o dimerización de los otros pares. Como se observa en la Figura 2, las regiones Fc 60 y 60' de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas de dos de estas proteínas de fusión del MHC de Clase II, se asocian y forman una estructura divalente, que lleva una o más uniones disulfuro entre las cadenas, análoga a la estructura de los anticuerpos naturales.

En otra serie de realizaciones, el presente invento proporciona la producción de proteínas de fusión decavalentes de proteínas de las cadenas \alpha y \beta del MHC de Clase II, en las que sustancialmente la totalidad de los dominios transmembranales y citoplásmicos C-terminales han sido sustituidos por dominios de dimerización de estructura superenrollada y, opcionalmente, secuencias enlazadoras interpuestas.

Estas realizaciones son esencialmente las mismas que las que se acaban de describir en lo que antecede, excepto en que (1) los dominios constantes de inmunoglobulina se eligen que sean específicamente cadenas de IgM, que forman subunidades divalentes que después se asocian formando pentámeros decavalentes, y (2) las células que producen estas fusiones MHC-IgM serán sometidas a cotransfección con un gen de la cadena J con el fin de facilitar la asociación y secreción de las moléculas de IgM (Matsuuchi y col., 1986). La Figura 3 ilustra esquemáticamente ese tipo de proteína de fusión decavalente del MHC de Clase II. Lo mismo que en el caso anterior, al menos los dominios de unión al péptido, y preferiblemente los dominios extracelulares completos, de las cadenas \alpha 10 y \beta 20 del MHC de Clase II, pueden estar fusionados con dominios de dimerización 30 y 40 (p. ej., un dominio de cremallera de leucina). Los dominios de dimerización (30 y 40) se asocian en disolución para promover la formación de una proteína de fusión heterodimérica en la que los componentes \alpha y \beta (10 y 20) del MHC de Clase II se asocian de manera estable para formar un dominio de unión del MHC de Clase II, biológicamente activo, que es capaz de unirse, o de ser "cargado" con péptidos 110 de unión al MHC. Después, lo mismo que en el caso anterior, la construcción con la cadena \alpha o la construcción con la cadena \beta comprende además una región Fc 60 de inmunoglobulina que, en estas realizaciones, es una región Fc de IgM (CH_{2}, CH_{3}, CH_{4}). Por último, lo mismo que en el caso anterior, fragmentos enlazadores moleculares flexibles opcionalmente pueden estar interpuestos entre los componentes del MHC (10 y 20), los dominios de dimerización (30 y 40), y/o los componentes Fc de IgM (60) con el fin de una mejor aproximación a la distancia normal entre los componentes del MHC y sus dominios transmembranales naturales del MHC, y/o para proporcionar la libre rotación entre los componentes del MHC, los dominios de dimerización, y/o los dominios de la inmunoglobulina. Como se observa en la Figura 3, las regiones Fc 60 y 60' de las cadenas pesadas de la inmunoglobulina de dos de estas proteínas de fusión MHC-IgM, se asocian para formar una estructura divalente que lleva una o más uniones disulfuro entre las cadenas. Sin embargo, estas subunidades divalentes se asociarán de nuevo para formar un multímero que lleva uno o más enlaces disulfuro 90 entre las subunidades divalentes. En presencia de la proteína 100 de cadena J, las subunidades de IgM se asocian formando pentámeros decavalentes como se muestra en la Figura 3, análogos a los pentámeros de IgM presentes en la naturaleza.

Por último, en otra serie de realizaciones, el presente invento proporciona la producción de proteínas de fusión tetravalentes de proteínas de las cadenas \alpha y \beta del MHC de Clase II, en las que sustancialmente la totalidad de los dominios transmembranales y citoplásmicos C-terminales han sido sustituidos por dominios de dimerización de estructura superenrollada y, opcionalmente, secuencias enlazadoras interpuestas, y en las que una secuencia "marcadora", biotinilada y C-terminal, permite que hasta cuatro fusiones MHC-secuencia marcadora como máximo se unan a avidina (o a estreptavidina) y formen un complejo tetravalente de proteínas de fusión del MHC. La Figura 4 ilustra esquemáticamente ese tipo de complejo de proteínas de fusión tetravalentes del MHC. Lo mismo que en las realizaciones anteriores, al menos el dominio de unión al péptido, y preferiblemente el dominio extracelular completo, de las cadenas \alpha 10 y de las cadenas \beta 20 del MHC de Clase II, pueden estar fusionados a dominios de dimerización 30 y 40 (p. ej., un dominio de cremallera de leucina). Los dominios de dimerización (30 y 40) se asocian en disolución para promover la formación de una proteína de fusión heterodimérica en la que los componentes \alpha y \beta (10 y 20) del MHC de Clase II se asocian de manera estable para formar un dominio de unión del MHC de Clase II biológicamente activo, que es capaz de unirse, o de ser "cargado" con péptidos 110 de unión al MHC. Además, una secuencia de reconocimiento para la biotina-ligasa o "secuencia marcadora" está fusionada al extremo C-terminal de al menos una de las cadenas del MHC que intervienen en la fusión. Esta secuencia marcadora puede estar biotinilada por acción de enzimas del interior de las células que producen estas proteínas de fusión del MHC, o puede biotilinarse posteriormente in vitro. La secuencia marcadora 70 biotinilado puede utilizarse para hacer que las proteínas de fusión monovalentes del MHC se unan a avidina (o a estreptavidina) 80. Debido a que cada molécula de avidina (o estreptavidina) es capaz de unir hasta cuatro restos de biotina, puede producirse un complejo de proteínas de fusión MHC-biotina/avidina(estreptavidina) que es tetravalente (con valencias más bajas y con menores relaciones molares biotina:avidina(estraptavidina)). Lo mismo que en el caso anterior, fragmentos enlazadores moleculares flexibles opcionalmente pueden estar interpuestos entre los componentes del MHC (10 y 20), los dominios de dimerización (30 y 40), y/o la secuencia marcadora que lleva biotina, con el fin de una mejor aproximación a la distancia normal entre los componentes del MHC y sus dominios transmembranales naturales del MHC, y/o para proporcionar la rotación entre los componentes del MHC, los dominios de dimerización, y/o la secuencia marcadora biotinilada. Como resultará evidente para alguien con una experiencia normal en la técnica, pueden utilizarse otras secuencias marcadoras y otros complejos de ligandos en lugar de biotina/avidina(estraptavidina), para producir complejos multiméricos similares de proteínas de fusión del MHC.

En cada una de las realizaciones anteriores, el péptido 110 de unión al MHC puede ir unido covalentemente a cualquiera de los componentes \alpha o \beta (10 y 20) del MHC de Clase II con un fragmento enlazador molecular flexible (no mostrado en las Figuras). Preferiblemente, esos fragmentos enlazadores moleculares flexibles son secuencias polipeptídicas de 10-20 residuos de aminoácidos, más preferiblemente de 12-18 residuos de aminoácidos. Cuando los fragmentos enlazadores moleculares flexibles son polipéptidos, el péptido de unión al MHC, el fragmento enlazador y los componentes \alpha o \beta del MHC de Clase II pueden ser expresados todos ellos en forma de una proteína de fusión única, que comprende además dominios de dimerización en dirección al extremo C-terminal.

En relación con cada una de las realizaciones anteriormente descritas, el presente invento proporciona (a) secuencias de ácidos nucleicos aisladas que codifican esas proteínas de fusión; (b) vectores para transfectar células hospedadoras de manera transitoria o de manera estable con estos ácidos nucleicos; (c) células hospedadoras transformadas con estas secuencias o vectores; (d) métodos para producir las proteínas de fusión empleando estas secuencias, vectores y células hospedadoras; y (e) las propias proteínas de fusión sustancialmente purificadas. Además, el presente invento proporciona varias utilidades de estos productos y procedimientos que incluyen, pero que no se limita a ellos, el tratamiento de enfermedades alérgicas y autoinmunitarias, la detección y/o aislamiento de células T que presentan especificidades definidas para el complejo MHC-péptido, y la activación, anergización o destrucción selectivas de células T que presentan especificidades definidas para el complejo MHC-péptido.

A. Elección de los componentes del MHC

Los métodos y los productos del presente invento pueden practicarse con todas las proteínas del MHC de Clase II de mamíferos. Principalmente, sin embargo, se espera que el presente invento tenga su mayor utilidad en el diagnóstico y tratamiento de enfermedades humanas y, por ello, las proteínas del MHC de Clase II son preferiblemente proteínas HLA de Clase II humanas. Así, por ejemplo, el presente invento puede practicarse con cualquiera de los alelos HLA-DRA conocidos (DRA*0101 y DRA*0102), con cualquiera de los aproximadamente 160 alelos HLA-DRB conocidos (que incluyen al menos 137 alelos HLA-DRB1 conocidos), con cualquiera de los aproximadamente 15 alelos HLA-DQA1 conocidos, con cualquiera de los aproximadamente 25 alelos HLA-DQB1 conocidos, con cualquiera de los aproximadamente 8 alelos HLA-DPA1 conocidos o con cualquiera de los aproximadamente 65 alelos HLA-DPB1 conocidos. Una compilación de las secuencias de nucleótidos conocidas de los HLA de Clase II humanos ha sido publicada por Marsh y Bodmer (1995) y una compilación de las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos conocidas de los HLA de Clase II se encuentra disponible a través de transferencia electrónica desde la EMBL Data Library, Cambridge, UK (solicítese "HELP HLA" por correo electrónico a "netserv@ebi.ac.uk"). Todas estas secuencia, por lo tanto, no se reproducen en el presente documento. Además, toda la nomenclatura de secuencias aquí utilizada coincide con la utilizada en Marsh y Bodmer (1995), y en Bodmer y col. (1995).

Las realizaciones que utilizan dominios de dimerización de estructura superenrollada se prefieren de manera particular para usar con los dominios de unión del MHC de Clase II que, en ausencia de sus dominios transmembranales y citoplásmicos, no forman heterodímeros estables en disolución. En el caso de estas proteínas, los dominios de estructura superenrollada añaden estabilidad al heterodímero a la vez que permiten la producción de proteínas solubles no agregadas. Entre estas proteínas se encuentran los serotipos HLA-DR2 (p. ej., los codificados por los alelos DRA y DRB1*15 o DRB1*16), HLA-DQ8 (codificados, por ejemplo, por los alelos DQA1*0301 y DQB1*0302), y HLA-DQ2 (codificados, por ejemplo, por los alelos DQA1*0501 y DQB1*02012). No obstante, los dominios de dimerización de estructura superenrollada pueden utilizarse con cualquiera de los dominios de unión del MHC de Clase II, incluyendo aquellos dominios que en trabajos previos han sido expresados correctamente en forma de heterodímeros estables y solubles sin sus dominios transmembranales (p. ej., DR1 y DR4).

B. Elección de los puntos de corte en el MHC

De acuerdo con el presente invento, los puntos de corte para los componentes de MHC de las proteínas de fusión del MHC de Clase II deben elegirse de manera que incluyan una secuencia N-terminal suficiente para la correcta formación de los dominios de unión del MHC, al mismo tiempo que excluyan la mayor parte, si no la totalidad, de los dominios transmembranales y citoplásmicos C-terminales de las cadenas del MHC. Como es bien conocido en la técnica, las cadenas \alpha y \beta del MHC de Clase II se caracterizan cada una de ellas por dos dominios extracelulares, globulares, N-terminales (\alpha1 y \alpha2 o \beta1 y \beta2), seguidos de un bucle corto o péptido de conexión, un dominio transmembranal hidrófobo, y un dominio citoplásmico hidrófilo C-terminal. La hendidura de unión de las moléculas del MHC de Clase II se forma principalmente por la interacción de los dominios \alpha1 y \beta1 del heterodímero y, por lo tanto, estos dominios deben como mínimo estar incluidos en las proteínas de fusión del presente invento. Los dominios \alpha2 y \beta2, no obstante, también se incluyen preferiblemente debido a que pueden cooperar a estabilizar el dominio de unión del MHC, se piensa que están implicados en la formación de dímeros de las cadenas del MHC, y se piensa que están implicados en la unión a los receptores CD4.

Por lo tanto, en las realizaciones preferidas, los puntos de corte para los péptidos de fusión del MHC de Clase II se eligen de manera tal que estén en las regiones situadas aproximadamente entre los extremos de los dominios \alpha2 o \beta2 y los comienzos de los dominios transmembranales. Para la mayoría de las cadenas \alpha del MHC de Clase II, esto corresponde a aproximadamente las posiciones 180-200 de los residuos de aminoácidos y para la mayoría de las cadenas \beta esto corresponde a aproximadamente las posiciones 185-205 de los residuos de aminoácidos. Por ejemplo, en el caso de las cadenas \alpha de HLA-DR, codificadas por los alelos DRA (DRA*0101 o DRA*0102), los dominios transmembranales esencialmente comienzan detrás de residuo de Glu situado en la posición 191 o detrás del residuo de Asn situado en la posición 192. En el caso de las cadenas \beta de HLA-DR, codificadas por los alelos DRB1*01 (p. ej., DRB1*0101) de subtipo DR1, y por los alelos DRB1*15 y DRB1*16 (p. ej., DRB1*1501) de subtipo DR2, los dominios transmembranales esencialmente comienzan detrás de residuo de Lys situado en la posición 198 o detrás del residuo de Met situado en la posición 199. De manera similar, para los subtipos DQ2 y DQ8, los dominios transmembranales de HLA-DQA1 esencialmente comienzan detrás de residuo de Glu situado en la posición 195 o detrás del residuo de Thr situado en la posición 196, y los dominios transmembranales de HLA-DQB1 esencialmente comienzan detrás de residuo de Lys situado en la posición 200 o detrás del residuo de Met situado en la posición 201. En algunas de las variantes alélicas, por supuesto, pueden haber inserciones o deleciones de aminoácidos delante de estos sitios, las cuales alteran la numeración de los residuos. El péptido de conexión y las regiones transmembranales de las cadenas \alpha y \beta del MHC de Clase II no son, sin embargo, muy polimórficas y, de hecho, aparecen invariables en todos los alelos DRA y DRB conocidos (véase Marsh y Bodmer, 1995). Por lo tanto, trabajando con cualquier cadena determinada de las cadenas \alpha y \beta del MHC de Clase II, una persona con una experiencia normal en la técnica es capaz de identificar fácilmente los dominios transmembranales tanto por su homología con los alelos anteriormente descritos como por su naturaleza hidrófoba esencial.

Aunque no es lo preferido, es aceptable que las proteínas de fusión del presente invento incluyan varios residuos procedentes del dominio transmembranal o que algunos residuos de los dominios \alpha2 o \beta2 sean suprimidos. Por ejemplo, la inclusión de los residuos 1-5 del dominio transmembranal puede incluirse en el presente invento y aun así producir una proteína de fusión soluble, pero esto no es lo preferido. De manera similar, la supresión, por ejemplo, de los residuos 1-5 de los dominios \alpha2 o \beta2 puede no producir alteraciones estructurales que trastoquen la unión del péptido al MHC, la formación de heterodímeros o las interacciones con las células T. De hecho, si se sustituyen por residuos adecuados que conservan la estructura global de la molécula del MHC, pueden suprimirse porciones más extensas de los dominios estructurales \alpha2 y \beta2 de acuerdo con el presente invento (p. ej., sustituyendo porciones de los dominios \alpha2 o \beta2 de Clase II por las porciones equivalentes de las proteínas \alpha3-microglobulinas o \beta2-microglobulinas de Clase I). Por lo tanto, reconociendo que se puede también incluir o suprimir la totalidad o una parte del bucle o del péptido de conexión de 5-7 aminoácidos que en la naturaleza une los dominios \alpha2 y \beta2 con sus respectivos dominios transmembranales, se pueden producir proteínas de fusión en las que el punto de corte está situado en cualquier lugar entre aproximadamente los residuos 180-200 de la cadena \alpha y aproximadamente los residuos 185-205 de la cadena \beta, tolerándose supresiones C-terminales de mayor extensión si se proporcionan secuencias sustitutivas apropiadas. Por último, los residuos 1-5 pueden ser suprimidos o sustituidos en el extremo N-terminal de un dominio de unión de cadena \alpha o de cadena \beta del MHC de Clase II, aunque esto no es lo recomendado.

En las realizaciones preferidas, sin embargo, los puntos de corte se eligen de modo que estén situados dentro de la secuencia del bucle o del péptido de conexión, cerca del extremo N-terminal del dominio transmembranal. En las realizaciones más preferidas, los dominios extracelulares completos de las cadenas \alpha y \beta del MHC de Clase II están incluidos en las proteínas de fusión del MHC del invento.

C. Fusiones con péptidos de unión al MHC

En relación con cualquiera de las realizaciones anteriores, se puede también crear una proteína de fusión en la que el péptido de unión al MHC está unido covalentemente al extremo N-terminal de la cadena \alpha o de la cadena \beta de modo que el péptido de unión es capaz de unirse selectivamente en el interior del dominio de unión formado por las cadenas \alpha y \beta dadas del MHC de Clase II. Preferiblemente, el péptido de unión al MHC se une al extremo N-terminal de la cadena beta porque, cuando las cadenas alfa y beta se asocian para formar la molécula heterodimérica del MHC, el extremo N-terminal de la cadena beta queda más accesible que el extremo N-terminal de la cadena alfa. Además, las cadenas beta de las moléculas del MHC de Clase II son más polimórficas que las cadenas alfa y, por ello, la especificidad de un dominio de unión del MHC depende más de la cadena beta que está incluida en la molécula.

El péptido de unión al MHC se une preferiblemente al dominio de unión del MHC usando un fragmento enlazador molecular flexible, como se describe más adelante. En las realizaciones preferidas, el fragmento enlazador molecular flexible es una secuencia polipeptídica de aproximadamente 10-20 residuos de aminoácidos, más preferiblemente de 12-18 residuos de aminoácidos, que une el péptido de unión y los dominios de unión del MHC por medio de uniones polipeptídicas estándar para formar una proteína de fusión de mayor tamaño que puede estar codificada por una única construcción de ácido nucleico y puede expresarse en forma de una única proteína de fusión. Además, se prefiere que los aminoácidos se elijan entre los residuos relativamente pequeños (p. ej., alanina, glicina, serina, leucina, isoleucina, valina) con el fin de minimizar la posibilidad de impedimento estérico.

Como se ha indicado anteriormente, el péptido de unión al MHC se elige de manera que es capaz de unirse selectivamente a la molécula del MHC a la que se adiciona. En la técnica se conocen miles de combinaciones de péptidos de unión al MHC y moléculas del MHC, y pueden identificarse con métodos estándar (véase, o. ej., Chicz y col., 1993). De interés particular son los pares de péptidos de unión al MHC y moléculas del MHC que están implicados en enfermedades, que incluyen infecciones y enfermedades autoinmunitarias. Por ejemplo, péptidos específicos de unión al MHC, derivados de la proteína básica de la mielina humana (p. ej., los residuos 85-99, 84-102 y 148-162) y alelos particulares del MHC (p. ej., HLA-DR2 o DRA/DRB1*1501) han sido implicados en el desarrollo de la esclerosis múltiple. Por lo tanto, en una de las realizaciones preferidas, se producen proteínas de fusión, monovalentes o multivalentes, del MHC de Clase II, en las que un péptido inmunogénico de la proteína básica de la mielina (MBP) está unido covalentemente por medio de una secuencia enlazadora polipeptídica al extremo N-terminal del dominio de unión al péptido de una proteína HLA-DRB1*1501, y esta fusión está unida covalentemente, con o sin un fragmento enlazador molecular flexible interpuesto, a un dominio de dimerización. Esta proteína de fusión puede entonces dimerizarse con una proteína de fusión de cadena \alpha del HLA-DRA correspondiente, de modo que el péptido MBP se une en la hendidura formada por la asociación de las cadenas \alpha y \beta del MHC de Clase II. De manera similar, determinados residuos de la proteína desmogleína 3 humana (p. ej., los residuos 78-93, 97-111, 190-204, 206-220, 251-265, 512-526 y 762-786) y determinados alelos del MHC (p. ej., HLA-DR4 o DRA/DRB1*0402, y HLA-DQ1 o DQA/DQB1*05032) han sido implicados en el desarrollo del pénfigo vulgar (véase, p. ej., el documento WO 96/27387). En los casos de otras enfermedades autoinmunitarias, que incluyen la artritis reumatoide (RA) y el lupus eritematoso sistémico (SLE), pueden identificarse péptidos propios inmunodominantes que se unen selectivamente a moléculas particulares del MHC de Clase II. En cada una de estas enfermedades autoinmunitarias, pueden producirse proteínas de fusión, monovalentes o multivalentes, del MHC de Clase II, que llevan péptidos autoinmunogénicos de unión al MHC, unidos covalentemente a los dominios de unión del MHC, y estas proteínas de fusión pueden utilizarse, como se describe de manera más amplia más adelante, para hacer que la respuesta inmunitaria sea tolerante o anérgica frente a los autoantígenos.

D. Elección de los dominios de los fragmentos enlazadores

De acuerdo con el presente invento, pueden producirse proteínas de fusión del MHC que incluyen opcionalmente fragmentos enlazadores moleculares flexibles que unen covalentemente, según se ha descrito anteriormente, (1) dominios de unión del MHC con dominios de dimerización del MHC; (2) dominios de dimerización con dominios Fc de inmunoglobulinas o con dominios que contienen "secuencias marcadoras" para biotina-ligasa; o (3) péptidos de unión al MHC con dominios de unión del MHC de Clase II. Los fragmentos enlazadores apropiados incluyen, pero no se limitan a ellos, cadenas polipeptídicas cortas que pueden ser codificadas junto con los dominios del MHC en construcciones de DNA recombinante. De modo más general, no obstante, los fragmentos enlazadores apropiados incluyen cualquiera de los restos químico-orgánicos relativamente pequeños (p. ej., <2 kDa, preferiblemente <1 kDa) que son flexibles debido a que incluyen al menos un enlace localizado entre los extremos terminales y alrededor del cual hay libre rotación. Así, por ejemplo, pueden utilizarse moléculas bifuncionales (p. ej., un ácido \alpha,\omega-dicarboxílico o una \alpha,\omega-diamina) de una cadena de alquilo inferior, y esos fragmentos enlazadores moleculares flexibles pueden hacerse reaccionar con los extremos C-terminales de los componentes del MHC y con los extremos N-terminales de los componentes de estructura superenrollada, de inmunoglobulinas o de biotina (o con grupos reactivos de las cadenas laterales de los aminoácidos de cualquiera de estos componentes). Por supuesto, en la técnica se conocen muchos otros agentes formadores de enlaces cruzados y pueden utilizarse como equivalentes sustanciales.

Sin embargo, preferiblemente los fragmentos enlazadores moleculares flexibles del presente invento comprenden una serie de residuos de aminoácidos que pueden ser codificados en una construcción de genes de fusión. Por ejemplo, un fragmento enlazador de 1-15 residuos de aminoácidos generalmente pequeños (p. ej., alanina, glicina, serina, leucina, isoleucina, valina), que incluye opcionalmente uno o más residuos hidrófilos (p. ej., aspartato, glutamato, lisina), puede utilizarse como fragmento enlazador. La longitud del fragmento enlazador puede elegirse de manera que mantenga, aproximadamente, el espaciado encontrado en la naturaleza entre los dominios de unión del MHC y los dominios transmembranales de las proteínas del MHC y, por lo tanto, la longitud del fragmento enlazador puede depender de si algunos o todos los residuos del bucle o los residuos de conexión presentes en la naturaleza, entre los dominios de unión y los dominios transmembranales, han sido incluidos u suprimidos. Además, como resultará evidente al experto en la técnica, las secuencias enlazadoras pueden elegirse de manera particular con el fin de que incluyan sitios de escisión específicos para proteasas en la proteína o, para facilitar las manipulaciones del DNA recombinante, de que introduzcan sitios específicos para endonucleasas de restricción en la construcción recombinante. Así pues, por ejemplo, se pueden incluir los péptidos del bucle o los péptidos de conexión presentes en la naturaleza, de 5-7 aminoácidos, de una molécula del MHC, y también se puede incluir un fragmento enlazador de 5-7 aminoácidos. Como alternativa, la porción incluida del bucle o del péptido de conexión puede variar, la longitud del fragmento enlazador puede variar, o el péptido del bucle y/o el fragmento enlazador pueden suprimirse por completo. Usando técnicas estándar adecuadas de mutagénesis dirigida a sitios específicos, o de restricción y ligación de construcciones recombinantes utilizando varias endonucleasas diferentes, una persona con una experiencia normal en la técnica es capaz de producir fácilmente muchas variaciones en las construcciones de las proteínas de fusión y, como se describe más adelante, realizar enseguida ensayos con ellas para determinar su unión a TCR y/o la activación de células T. Así, aunque algunas de las realizaciones actualmente preferidas emplean los dominios extracelulares completos de las moléculas del MHC, unidos por fragmentos enlazadores particulares a dominios de estructura superenrollada, a dominios de inmunoglobulinas o a dominios con biotina, el invento no se limita a esas realizaciones.

E. Elección de los dominios que intervienen en la formación de heterodímeros

Los superenrollamientos son características estructurales comunes de proteínas diméricas en las que dos polipéptidos con estructura de \alpha-hélice ("espirales") se enrollan uno sobre otro ("enrollados"), formando una estructura cuaternaria mayor o "estructura superenrollada" (véase, p. ej., Hu y col., 1990; Oas y Endow, 1994). De hecho, las regiones transmembranales de las cadenas \alpha y \beta de HLA-DR se piensa que son hélices \alpha que se asocian en forma de un superenrollamiento dentro del entorno hidrófobo de la membrana celular (Cosson y Bonifacino, 1992). Otros superenrollamientos, sin embargo, son hidrófilos y pueden encontrarse en proteínas secretadas, citosólicas y nucleares. Por ejemplo, las "cremalleras de leucina" son dominios de estructura superenrollada que están presentes en un gran número de proteínas de unión a DNA y que pueden mediar en la formación de homodímeros o de heterodímeros (véanse, p. ej., Ferré-D'Amaré y col., 1993; O'Shea y col., 1989; O'Shea y col., 1991). Además, diversos investigadores en la actualidad han diseñado dominios de estructura superenrollada artificiales, que incluyen pares de hélices anfipáticas acídicas y cremalleras de leucina artificiales, que han sido expresados y se han asociado formando proteínas homidiméricas o heterodiméricas recombinantes (véanse, p. ej., Pack y Pluckthun, 1992; Chang y col., 1994).

En realizaciones preferidas del presente invento, los dominios de dimerización son dominios de cremallera de leucina. Estas cremalleras de leucina se caracterizan por contener al menos 4 y, preferiblemente, al menos 5-7 residuos de leucina que están espaciados de manera periódica aproximadamente cada siete residuos (repetición de héptadas), contribuyendo cada repetición de la héptada a dos vueltas de la \alpha-hélice (3,5 residuos/vuelta). Los residuos de leucina parecen tener una función especial en la dimerización de los superenrollamientos, y forman parte de la interfase hidrófoba entre las dos hélices \alpha del superenrollamiento. Los dominios de cremallera de leucina de 40 aminoácidos de las proteínas Fos y Jun son ejemplos preferidos de dominios de dimerización de cremallera de leucina. Cada uno de estos dominios contiene cinco residuos de leucina espaciados exactamente cada siete residuos, llevando varios residuos hidrófilos en las posiciones interpuestas (la secuencia de Fos incluye tres leucinas adicionales que no entran en el patrón de la repetición de héptadas y que, por lo tanto, se supone que no contribuyen a la formación de heterodímeros). Las modificaciones de estos dominios, o incluso las secuencias completamente artificiales, que mantienen la naturaleza helicoidal global de estas secuencias (p. ej., que no incluyen prolina ni vueltas en horquilla), que conservan el carácter hidrófilo global de las hélices, y que conservan la repetición aproximada de héptadas de residuos de leucina, pueden también utilizarse de acuerdo con el invento. (Nótese que la hélice anfipática scHLX de Pack y Pluckthun (1992) se ensayó en una construcción de fusión recombinante de HLA-DR2 pero no condujo a la formación correcta de heterodímeros).

F. Elección de los dominios de inmunoglobulinas

Las inmunoglobulinas humanas se dividen en cinco amplias clases (IgA, IgD, IgE, IgG e IgM) y cualquiera de ellas puede utilizarse en las construcciones de MHC-inmunoglobulina del presente invento. Las estructuras básicas de estas moléculas son homodímeros unidos por enlaces disulfuro, extremadamente bien caracterizados, de heterodímeros formados por cadenas pesadas y ligeras. Por lo tanto, la unidad básica de la inmunoglobulina se asemeja a la proteína de la Figura 2, en la que un par de cadenas pesadas, que corresponden a los elementos 50 y 60, están unidas entre sí por enlaces disulfuro.

Las porciones de las dos cadenas pesadas que están más estrechamente asociadas entre sí, 60 y 60', se denominan fragmento Fc. En algunas clases de inmunoglobulinas (es decir, en IgA, IgD e IgG), existe una región bisagra 50 entre los fragmentos Fab y Fc. Por último, dentro de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas, existen regiones de una gran variabilidad y regiones de una gran constancia. Cada una de las cadenas pesadas incluye tres o cuatro dominios constantes, de C_{H}1 a C_{H}4, que corresponden esencialmente a los elementos 50 y 60 (pero no a escala). (Véase, de modo general, Kuby, 1994). Los dominios constantes de las inmunoglobulinas, como su nombre implica, son relativamente invariables en la población humana. Tomando como base las diferencias habidas en sus regiones constantes, las cadenas ligeras se clasifican en sentido amplio en \kappa o \lambda y, en seres humanos, las cadenas \lambda se dividen además en cuatro subtipos. De manera similar, las diferencias en las regiones constantes de las cadenas pesadas de las inmunoglobulinas son la base de la división de estas moléculas en cinco amplias clases (cadenas \alpha, \delta, \varepsilon, \gamma y \mu en IgA, IgD, IgE, IgG e IgM respectivamente). Tomando como base diferencias menores en las secuencias de aminoácidos en seres humanos, las cadenas \gamma se subdividen además en cuatro subclases, y las cadenas \alpha en dos subclases. Las secuencias de aminoácidos de estos dominios constantes de las cadenas ligera y pesada de las diferentes inmunoglobulinas se conocen en la técnica desde hace tiempo (véase, p. ej., Kabat y col., 1979) y no serán aquí reproducidas.

En algunas realizaciones preferidas, las proteínas de fusión MHC-inmunoglobulina del presente invento incluyen las regiones Fc de IgG (subtipos 1, 2 ó 3) o de IgM, debido a que estos dominios Fc son capaces de activar la ruta clásica del complemento y, por lo tanto, son más útiles en algunos de los métodos terapéuticos que se describen más adelante. Sin embargo, en utilidades en las que la activación del complemento no se desea o es irrelevante, puede utilizarse cualquiera de los isotipos de las inmunoglobulinas. Además, como se muestra en la Figura 3, los isotipos de IgM son los preferidos en algunas realizaciones porque son capaces de formar pentámeros de proteínas de fusión divalentes MHC-IgM.

G. Sistemas de expresión

Las proteínas de fusión del MHC del presente invento pueden expresarse en cualquier sistema estándar de expresión de proteínas que permita el plegamiento y la secreción correctos de las moléculas deseadas, o que permita su recuperación en forma de moléculas correctamente plegadas, a partir de cuerpos de inclusión. En sentido general, se prefieren los sistemas de expresión eucariotas debido a que es más probable que produzcan un alto rendimiento de moléculas correctamente plegadas, glicosiladas y unidas por enlaces disulfuro. Las líneas celulares de mamíferos, en especial aquellas que están perfectamente caracterizadas en cuanto a la expresión de proteínas (p. ej., células CHO, células COS) o aquellas que se sabe que secretan inmunoglobulinas correctamente plegadas, glicosiladas y unidas por enlaces disulfuro (p. ej., cualquier línea celular productora de mAb), pueden preferirse para algunos usos. Generalmente, sin embargo, estas líneas celulares expresan cantidades de proteína demasiado escasas para aplicaciones terapéuticas y comerciales. Por lo tanto, pueden preferirse otros sistemas de expresión eucarióticos, tales como el sistema en la levadura Pichia pastoris, que se describe más adelante. Además, resultados preliminares han mostrado altos niveles de expresión de una proteína de fusión del MHC en un sistema de células Schneider en Drosophila. Incluidas plenamente en el talento y criterio del experto en la técnica, sin una experimentación excesiva, está elegir un sistema de expresión apropiado o favorito.

De manera similar, una vez elegido un diseño (es decir, una secuencia primaria de aminoácidos) para las proteínas de fusión del MHC del presente invento, una persona con una experiencia normal en la técnica es capaz de diseñar fácilmente las construcciones de DNA recombinante apropiadas que codifiquen las proteínas deseadas, teniendo en consideración factores tales como los sesgos experimentales de codones en el hospedador elegido, la necesidad de secuencias señal de secreción en el hospedador (p. ej., una señal de secreción del factor sexual \alpha para la expresión en levaduras), la introducción de sitios de escisión para proteinasas dentro de la secuencia señal, y factores similares. Estas construcciones de DNA recombinante pueden insertarse en el marco de lectura en cualquiera de los varios vectores de expresión apropiados para el hospedador elegido. La elección de un vector de expresión apropiado o favorito es, nuevamente, una cuestión que cae plenamente dentro del talento y criterio del practicante experto. Preferiblemente, por supuesto, el vector de expresión incluirá un promotor potente que dirija la expresión de las construcciones recombinantes y, opcionalmente, varios genes marcadores que simplifiquen la identificación y/o la selección de los transformantes.

H. Usos de proteínas de fusión monovalentes y multivalentes del MHC de Clase II

Algunos alelos particulares del MHC se han asociado con diversas enfermedades, que incluyen la esclerosis múltiple (MS) (del inglés, " Multiple Sclerosis"), artritis reumatoide (RA), pénfigo vulgar (PV) y lupus eritematoso sistémico (SLE), y se ha postulado que estas enfermedades son, al menos en parte, de naturaleza autoinmunitaria. Es decir, se ha sugerido que algunas proteínas particulares del MHC reconocen "indebidamente" péptidos propios procesados y presentados a las células T en forma de complejos con moléculas del MHC de Clase I o Clase II. Con el fin de demostrar esto, pueden utilizarse proteínas solubles del MHC de Clase II, que pueden estar cargadas con un péptido propio aislado, implicado en la enfermedad. Por ejemplo, utilizando esos complejos MHC-péptido, se pueden hacer pruebas en lesiones de pacientes con MS para determinar si las células T infiltrantes son reactivas frente a un péptido propio particular que está unido a una molécula singeneica particular del MHC. De modo más general, las proteínas de fusión del MHC de Clase II del invento pueden utilizarse para detectar células T que presentan alguna especificidad definida, construyendo una proteína de fusión del MHC cargada con el péptido de unión al MHC apropiado (unido covalentemente o no covalentemente) y detectando la unión y/o la activación de las células T que se ponen en contacto con la proteína de fusión.

Por lo tanto, en uno de los aspectos, el presente invento proporciona un método para aislar células T de una especificidad para con el complejo MHC-péptido definido, que comprende poner en contacto una población de células T con proteínas de fusión, monovalentes o multivalentes, del MHC de Clase II del invento, según se han descrito en lo que antecede, que están cargadas con un péptido particular de unión al MHC y que, por lo tanto, definen un complejo MHC-péptido particular. La activación o proliferación de las células T puede luego determinarse y utilizarse, junto con un control apropiado, como indicación de si la población de células T incluye células T específicas para el complejo MHC-péptido definido. Como alternativa, las proteínas de fusión monovalentes o multivalentes del MHC de Clase II del invento, que tienen una especificidad definida, pueden ser inmovilizadas sobre un sustrato, y una población de células T puede ponerse en contacto con las proteínas de fusión inmovilizadas. Después de dejar un período de tiempo para que tenga lugar la unión, en caso de que se produzca, de las células T específicas para el complejo MHC-péptido definido, las células no unidas pueden eliminarse mediante lavado y la presencia o ausencia de células T unidas puede utilizarse como indicación de si la población de células T incluye células T específicas para el complejo MHC-péptido definido. En otra realización, las proteínas de fusión monovalentes o multivalentes del MHC de Clase II del invento, pueden ponerse en contacto con una población de células T y, después de dejar un período de tiempo para que tenga lugar la unión, en caso de que se produzca, de las proteínas de fusión del MHC de Clase II a las células T específicas para el complejo MHC-péptido definido, las proteínas de fusión no unidas pueden eliminarse mediante lavado y la presencia o ausencia de proteínas de fusión unidas puede utilizarse como indicación de si la población de células T incluye células T específicas para el complejo MHC-péptido definido. En todas estas realizaciones, el marcaje de las células T, de las proteínas de fusión, o de los complejos formados por el complejo MHC-péptido con un receptor de células T reactivas, con marcadores fluorescentes, radiactivos u otros marcadores, se prefiere para simplificar la detección. En particular, pueden utilizarse marcadores fluorescentes en conjunción con técnicas de FACS (del inglés, " Fluorescence-Activated Cell Sorting") (clasificación de células activadas por fluorescencia) para aislar la subpoblación de células T deseada que presenta una especificidad para el complejo MHC-péptido definido.

En una realización particularmente preferida, las células T que son reactivas frente a un complejo MHC-péptido específico y definido, se detectan y aíslan como se ha descrito anteriormente, y después se utilizan, preferiblemente después de su proliferación in vitro, para una inmunoterapia adoptiva. De este modo, puede obtenerse una población de células T procedente de un hospedador (ya sea el sujeto que ha de ser tratado o un donante singeneico). Las células T que son reactivas frente a un complejo MHC-péptido particular, se detectan después y se aíslan utilizando los métodos anteriormente descritos. Las células, preferiblemente después de varias rondas de proliferación para aumentar su número, se administran luego (p. ej., por vía intravenosa, intraperitoneal) al sujeto para que le confieran inmunidad adoptiva. Este procedimiento puede tener una particular utilidad en la estimulación de la inmunidad adoptiva contra antígenos débiles tales como antígenos asociados a tumores.

En otro aspecto, el presente invento proporciona métodos para estimular o activar células T, in vitro.

En otro aspecto del presente invento, se proporciona un complejo MHC-péptido, soluble, monovalente o multivalente, para estimular o activar células T reactivas frente a un complejo MHC/péptido definido.

Como se ha indicado anteriormente, el presente invento proporciona la producción de proteínas de fusión solubles del MHC de Clase II, de las que no existen descritas previamente contrapartidas no solubles. Así, estas proteínas de fusión solubles del MHC de Clase II, cargadas con péptidos de unión al MHC apropiados y que definen un complejo MHC-péptido específico, pueden ahora ponerse en contacto con células T en disolución, in vivo o in vitro, para estimular o activar de manera específica a las células T que son reactivas frente al complejo MHC-péptido definido. Según se ha indicado anteriormente, las proteínas de fusión multivalentes del MHC de Clase II del invento se espera que sean particularmente potentes para estos fines. Cuando esto se lleva a cabo in vivo (p. ej., cuando la proteína de fusión del MHC de Clase II del invento se administra en forma de una preparación farmacéutica), este método sirve como método de vacunación contra el péptido de unión al MHC cuando éste se presenta en el complejo MHC-péptido definido. Cuando se utiliza con fines de vacunación contra patógenos que incluyen, por supuesto, el péptido de unión al MHC, los componentes del MHC de Clase II de la proteína de fusión se eligen de manera que sean singeneicos en relación con el sujeto que va a ser vacunado.

En otro aspecto, las proteínas de fusión monovalentes o multivalentes del MHC de Clase II del presente invento, pueden utilizarse in vitro para destruir o para hacer anérgicas a las células T reactivas frente a un complejo MHC-péptido definido, o para hacer tolerante a un individuo frente a un complejo MHC-péptido particular.

En otro aspecto del presente invento se proporciona un complejo MHC/péptido del presente invento, soluble, monovalente o multivalente, para destruir de manera selectiva a células T reactivas frente a un complejo MHC/péptido definido, en el que dicho complejo MHC/péptido comprende además una sustancia citotóxica unida covalentemente. Por ejemplo, las proteínas de fusión del MHC de Clase II pueden incluir regiones Fc que activan el sistema del complemento y, de este modo, producen la destrucción de las células T que se unan a ellas. Como alternativa, las proteínas de fusión pueden construirse por ingeniería genética de manera que incluyan una sustancia citotóxica añadida, por ejemplo, al extremo C-terminal o algún otro punto que no interfiera con la unión del complejo MHC-péptido a los receptores de las células T (p. ej., en cualquier lugar a lo largo del dominio Fc). Esas sustancias citotóxicas incluyen, por ejemplo, las toxinas genisteina, ricina, toxina diftérica, toxinas de Pseudomonas e isótopos radiactivos (p. ej., ^{125}I). Dosis elevadas de muchos de los antígenos tienen un efecto tolerizante más que un efecto estimulante. Así, la administración de dosis elevadas de una proteína de fusión del MHC de Clase II del invento puede producir tolerización frente al complejo MHC-péptido, aun cuando dosis más bajas producirían sensibilización (es decir, vacunación o inmunización). Cuando el objetivo es hacer tolerante a un individuo frente a un antígeno que normalmente es presentado por las moléculas del MHC propias del sujeto, los componentes del MHC de Clase II de la proteína de fusión se eligen de manera que sean singeneicos con respecto al hospedador. Estas circunstancias incluirían la tolerización frente a antígenos que producen reacciones alérgicas, así como frente a autoantígenos que están implicados en enfermedades autoinmunitarias. Sin embargo, en otros casos, los componentes del MHC pueden ser alogénicos de manera que hagan tolerante al sujeto frente a un complejo MHC-péptido que es extraño. Estas circunstancias incluirían la tolerización de un tejido extraño antes o después de un trasplante de un órgano o tejido en el que el donante y el receptor no son idénticos con respecto a uno o más alelos del MHC de Clase II.

La expresión "cantidad efectiva", en relación con hacer tolerante a un individuo frente a un complejo MHC-péptido, se refiere a una cantidad suficiente para hacer que las células T, de otro modo específicas para el complejo antigénico, no den respuesta frente al complejo MHC-péptido. Las células T que no dan respuesta no pueden activarse cuando están presentes junto con el complejo antigénico para el que son específicas. La expresión "cantidad efectiva" en relación con inmunizar a un individuo contra a un antígeno, indica una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunitaria que produce células T específicas para el antígeno. Los intervalos de dosificaciones típicos son desde 1 nanogramo/kilogramo hasta 100 miligramos/kilogramo o incluso hasta 500 miligramos/kg. Las cantidades efectivas variarán dependiendo de factores tales como la edad, sexo y sensibilidad frente al antígeno.

Así, a modo sólo de ejemplo, considérense las utilidades diagnósticas y terapéuticas del presente invento con respecto a la MS. La contribución del MHC a la susceptibilidad a padecer MS ha sido analizada en un gran número de estudios (revisados en Spielman y Nathenson, 1982; Hillert y col., 1994). Estos estudios demostraron que la susceptibilidad está asociada con la región del MHC de Clase II y que haplotipos particulares del MHC de Clase II confieren un riesgo aumentado. La asociación más fuerte tiene lugar con el haplotipo HLA-DR2 (DRB1*1501); aproximadamente del 50% al 60% de los pacientes con MS y el 20% de los sujetos normales portan este haplotipo. El haplotipo DR2 es más común en pacientes con MS procedentes de Europa Occidental, de EE.UU. y de Canadá; el aplotipo está también aumentado entre los pacientes con MS de todo el mundo. Otros haplotipos del MHC de Clase II (DR4, DR6) se han asociado con la susceptibilidad a padecer MS en poblaciones particulares (italianos, árabes jordanos); sin embargo estas asociaciones no son tan fuertes como la asociación con DR2 (Marrosu y col., 1988; Kurdi y col., 1977).

El HLA-DR2 (codificado por los genes DRA, DRB1*1501) se ha visto que presenta al menos dos péptidos de la proteína básica de la mielina humana (residuos 85-99 y 148-162) a las células T. El péptido MBP (85-99) se unió con una alta afinidad a DR2 purificada, la afinidad del BMP (148-162) fue menor. Se encontró que los transfectantes DR2 (DRA, DRB1*1501, presentaban estos péptidos MBP a clones de células T que habían sido generados a partir de linfocitos sanguíneos de pacientes con MS (Chou y col 1989; Pette y col., 1990, Martin y col., 1990; Ota y con 1990; Wucherpfennig y col., 1990; Valli y col., 1993, Wucherpfennig y col 1994). Estos estudios apoyan la hipótesis de que las células T específicas para MBP y otros antígenos derivados de mielina están implicados en la respuesta inflamatoria en la MS. La identificación directa de esas células T en lesiones de MS, se requiere no obstante para probar esta hipótesis y esto requerirá complejos del MHC, solubles y estables, con péptidos individuales, tales como los proporcionados por el presente invento.

Una gran dificultad cuando se usan como sondas complejos MHC/péptido solubles es que la afinidad por el TCR es relativamente baja. Las células T compensan la afinidad relativamente baja de los TCR por los complejos MHC/péptido por medio de la interacción de múltiples moléculas de TCR con los complejos MHC/péptido presentados sobre la superficie de las células presentadoras de antígenos. Realmente, esa dimerización de las moléculas del MHC de Clase II puede ser importante en la activación de las células T debido a que HLA-DR1 se encontró en forma de dímero en la red cristalina (Brown y col., 1993). El presente invento se dirige a este problema proporcionando proteínas de fusión del MHC multivalentes. Los estudios clásicos realizados con anticuerpos y sus fragmentos F(ab) han demostrado que una unión bivalente/multivalente produce un aumento sorprendente de la "afinidad funcional" (también denominada "avidez"). Las moléculas de IgG y los fragmentos F(ab) se unen a antígenos monovalentes en disolución con igual afinidad; sin embargo, la unión a antígenos multivalentes (es decir, a antígenos de superficie celular) está enormemente reforzada por la naturaleza bivalente de la molécula de IgG (Crothers y Metzger, 1972; Dower y col., 1984; Hornick y Karush, 1972). La "afinidad funcional" de los anticuerpos IgG se encontró que era aproximadamente unas 100 veces mayor para la unión bivalente, que para la unión monovalente; este factor de aumento fue incluso mayor para la unión multivalente por los anticuerpos IgM (factor de 10^{3} hasta 10^{4}). Así, las proteínas de fusión multivalentes del MHC del presente invento se espera que presenten una avidez mucho mayor para sus TCR cognados que para las proteínas estándar y solubilizadas del MHC.

Por último, pero muy importante, las proteínas de fusión purificadas y solubles del MHC, cargadas con un péptido antigénico, pueden utilizarse en el proceso de tolerización. La tolerización puede utilizarse en el contexto del tratamiento de alergias estándar o en el contexto de las enfermedades autoinmunitarias tales como MS, RA, PV y SLE. Por ejemplo, estudios realizados en el modelo murino de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) han demostrado que una enfermedad autoinmunitaria puede tratarse mediante la administración de complejos MHC/péptido solubles, cargados con el péptido autoantigénico (Sharma y col., 1991). Así, el presente invento, que posibilita la preparación de proteínas de fusión del MHC, purificadas, solubles y vacías, que pueden estar cargados con péptidos individuales de unión al MHC, y que posibilita la producción de proteínas de fusión MHC-inmunoglobulina que incluyen regiones Fc que son capaces de fijar el complemento, proporciona varios métodos diagnósticos y terapéuticos nuevos.

III. Ejemplos

Construcciones de DNA. Los dominios extracelulares de DR\alpha (residuos 1-191 de DRA*0101) y DR\beta (residuos 1-198 de DRB1*1501) se expresaron en forma de fusiones con los dominios de dimerización de cremallera de leucina, de 40 aminoácidos, de Fos y Jun, respectivamente (van Straaten y col., 1983; Angel y col., 1988). Se utilizaron los dominios extracelulares completos, en lugar de los dominios C-terminales truncados, debido a que las interacciones carga-carga entre el residuo de Glu de la posición 191 de DR\alpha y el residuo de Lys de la posición 198 de DR\beta, se piensa que facilitan la asociación (Cosson y Bonifacino, 1992) de estas moléculas. Los dominios extracelulares de DR\alpha y DR\beta, así como los dominios de dimerización de Fos y Jun, se generaron por PCR con cebadores diseñados de manera que incluían un fragmento enlazador de siete aminoácidos (VDGGGGG, residuos 199-205 de SEQ ID NO: 2), con un sitio de restricción SalI en el extremo C-terminal de los dominios extracelulares del MHC y en el extremo N-terminal de los dominios de cremallera de leucina de Fos o Jun. Los segmentos del MHC se unieron luego con los segmentos de Fos o de Jun a través del sitio de restricción SalI. Este fragmento enlazador se incluyó entre los segmentos de DR y de la cremallera de leucina, tanto para facilitar la clonación (a través del sitio SalI) como para permitir una mayor libertad rotacional de las cadenas (a través de la secuencia de poli-Gly). Estas construcciones se volvieron a amplificar por PCR para permitir su clonación en los sitios XhoI-EcoRI de pPIC9 en forma de proteínas de fusión con la señal de secreción del factor sexual \alpha. La clonación en el marco de lectura en el interior de este vector, conservó la secuencia de reconocimiento Lys-Arg-Glu (escisión C-terminal con respecto a Arg) requerida para la escisión de la señal de secreción del factor sexual \alpha por parte del producto del gen KEX2 (Brake, 1990).

Los siguientes oligonucleótidos se utilizaron en la construcción: cebador directo de DR\alpha: 5' GTA TCT CTC GAG AAA AGA GAG ATC AAA GAA GAA CAT GTG ATC 3', sitio XhoI subrayado (SEQ ID NO: 5); cebador inverso de DR\alpha: 5' GTC ATA GAA TTC TCA ATG GGC GGC CAG GAT GAA CTC CAG 3', sitio EcoRI subrayado (codifica el extremo 3' del segmento Fos, el codón de terminación y el sitio de restricción EcoRI) (SEQ ID NO: 6); cebador directo de DR\beta: 5' GTA TCT CTC GAG AAA AGA GAG GGG GAC ACC CGA CCA CGT TTC 3', sitio XhoI subrayado (SEQ ID NO: 7); cebador inverso de DR\beta: 5' GTC ATA GAA TTC TCA ATG GTT CAT GAC TTT CTG TTT AAG 3', sitio EcoRI subrayado (codifica el extremo 3' del segmento Jun, el codón de terminación y el sitio de restricción EcoRI) (SEQ ID NO: 8). Los productos resultantes de la PCR están descritos como SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 3. Estos productos de PCR se clonaron en el interior de los sitios XhoI-EcoRI de pPIC9 y se verificaron mediante elaboración del mapa de restricción y secuenciación didesoxi.

Estas construcciones se ensayaron primero en células CHO (usando los péptidos señal naturales de las cadenas \alpha y \beta de DR). Se encontró que los transfectantes en células CHO se asociaban y secretaban heterodímeros \alpha\beta de DR, lo que indicaba que la cremallera de leucina de Fos/Jun promovía la asociación correcta de las moléculas de DR2 (datos no mostrados). No obstante, según se describe más adelante, se obtuvieron niveles de expresión más altos en un sistema de expresión en levaduras utilizando Pichia pastoris. Un trabajo reciente ha demostrado que células Schneider de Drosophila dan el nivel más alto de producción de proteína (1 mg/litro, comparado con 0,3 mg/litro en Pichia pastoris).

Transformación de Pichia pastoris con las construcciones de las cadenas DR\alpha y DR\beta. Para la producción de proteína, las construcciones DR\alpha-Fos y DR\beta-Jun se expresaron en Pichia pastoris bajo el control del promotor de la alcohol-oxidasa (AOX1). Se eligió Pichia pastoris porque los transformantes estables pueden ser generados y escrutados con rapidez; además, en este sistema se han producido algunas proteínas secretadas con niveles de producción muy altos (Cregg y col., 1993).

Para dirigir la expresión a la ruta de secreción, las cadenas DR\alpha y DR\beta se clonaron en el vector pPIC9 de expresión en Pichia pastoris en forma de fusiones en el marco de lectura con la señal de secreción del factor sexual \alpha (Brake, 1990). La señal de secreción del factor sexual \alpha es escindida por el producto del gen KEX2 en la secuencia Leu-Glu-Lys-Arg-Glu (residuos 3-7 de SEQ ID NO: 2 y SEQ ID NO: 4), estando la escisión C-terminal en el residuo de Arg. Aunque este diseño da como resultado la adición de un residuo de ácido glutámico en el extremo N-terminal de las cadenas DR\alpha y DR\beta maduras, los extremos N-terminales de estas cadenas se encuentran situados de manera tal que este residuo adicional no debe afectar a la asociación del heterodímero. Moléculas expresadas en forma de fusiones con la señal de secreción del factor sexual \alpha se secretaron de manera eficiente, mientras que el uso de la señal de secreción de PHO1 (vector pHIL-S1, Invitrogen) produjo una secreción escasa o nula. Para la transformación, la caja de expresión de pPIC9 puede ser escindida en forma de un fragmento BglII; esta caja porta secuencias 5' y 3' del gen AOX1 para permitir la integración en el locus AOX1, así como del gen HIS4 que permite la selección de los transformantes en medios deficientes en histidina. Los genes se integran en el locus AOX1 por recombinación homóloga; la integración en el gen AOX1 altera el gen y conduce a un crecimiento lento si el metanol es la única fuente de carbono (fenotipo deficiente en la utilización de metanol, Mut^{S}) (Cregg y col.,1987).

Así, el DNA del plásmido pPIC9 se purificó en gradientes de CsCl y se digirió con BglII para liberar la caja de expresión (extremo 5' de gen AOX1-construcción con la cadena DR\alpha o DR\beta-señal de poliadenilación-gen HIS4-extremo 3' del gen AOX1). Las transformaciones se realizaron mediante formación de esferoplastos de la cepa GS115 (siguiendo el procedimiento proporcionado por Invitrogen, San Diego, CA). Brevemente expuesto, se hicieron crecer células GS115 hasta alcanzar la fase semilogarítmica en medio YPD y se prepararon esferoplastos mediante una digestión limitada de la pared celular de la levadura con zimolasa (aproximadamente un 70% de formación de esferoplastos) (Cregg y col., 1987). Las células se transfectaron con 5 mg de DNA de los plásmidos que portan DR\alpha y DR\beta y los transfectantes que expresaron el gen HIS4 (presente en la caja de expresión de pPIC9) se seleccionaron en placas HIS^{-}. La integración de los plásmidos en el locus AOX1 se confirmó mediante siembras replicadas de las colonias en placas que contenían medio mínimo con metanol o con dextrosa como única fuente de carbono. Los transformantes que habían integrado el DNA plasmídico en el locus AOX1 mostraron un crecimiento escaso o nulo en las placas que contenían metanol debido a la alteración del gen de la alcohol-oxidasa.

Identificación de las colonias recombinantes. Una ventaja importante del sistema de Pichia pastoris es que los transformantes pueden ser identificados fácilmente. La integración en el locus AOX1 confiere un fenotipo (Mut^{S}) deficiente en la utilización de metanol, que puede determinarse comparando el crecimiento de colonias duplicadas en placas con metanol o en placas con dextrosa como única fuente de carbono. Las colonias Mut^{S}, obtenidas después de la cotransformación con los plásmidos que portaban las construcciones con las cadenas DR\alpha y DR\beta, se ensayaron con un análisis de PCR de DNA genómico con respecto a la integración de los genes de las cadenas DR\alpha y DR\beta. Veintisiete de las veintiocho colonias con el fenotipo Mut^{S}, portaron los genes de las cadenas DR\alpha y/o DR\beta; cuatro de estas colonias (14,2%) habían integrado ambos genes).

Así, brevemente expuesto, la integración de las construcciones con las cadenas DR\alpha y DR\beta, se estudió mediante análisis por PCR del DNA genómico aislado de colonias Mut^{S} individuales. Las colonias replicadas se transfirieron a 200 ml de tampón de lisis (LiCl 2,5 M, Tris 50 mM pH 8,0, Tritón X-100 al 4%, EDTA 62 mM) utilizando un palillo de dientes esterilizado. Se añadieron bolitas de vidrio lavadas en ácido y un volumen igual de fenol/cloroformo (1:1), y las muestras se agitaron fuertemente en vórtice. Después de la centrifugación, la fase superior se transfirió a un tubo limpio y el DNA genómico se precipitó mediante la adición de 2,5 volúmenes de EtOH frío. Después de una incubación a -20ºC durante 20 minutos, el sedimento se recogió por centrifugación, se lavó con EtOH frío al 70% y se secó al aire. El DNA se resuspendió en 40 ml de agua esterilizada y se desnaturalizó a 94ºC durante 10 minutos; en cada una de las reacciones de PCR se usaron 10 ml de DNA. Las cadenas DR\alpha y DR\beta se amplificaron por PCR durante 35 ciclos (94ºC 1 min, 55ºC 2 min, 72ºC 2 min) usando los oligonucleótidos que se habían utilizado para generar las construcciones de DNA; los productos de la PCR se redisolvieron en geles de agarosa al 1% teñidos con bromuro de etidio.

Expresión y purificación de heterodímeros de HLA-DR2. Los cuatro transformantes que portaban ambos genes de las cadenas DR\alpha y DR\beta se estudiaron con respecto a la expresión de heterodímeros de DR2. Las células se hicieron crecer durante dos días en un medio que contenía glicerol como única fuente de carbono y después se trasladaron a un medio que contenía metanol al 0,5%. Los sobrenadantes y los lisados celulares se estudiaron por medio de un análisis de ELISA en sándwich utilizando un mAb específico para el heterodímero \alpha\beta de DR (mAb L243) para la captura y un antisuero policlonal específico de DR (CHAMP) para la detección. El heterodímero \alpha\beta de DR se detectó en los lisados celulares y en los sobrenadantes de los transfectantes con DR\alpha\beta. Los transformantes que portaban los genes de la cadena DR\alpha o de la cadena DR\beta se utilizaron como controles; los lisados celulares y los sobrenadantes procedentes de estas células dieron un resultado negativo en este análisis (Figura 5). Estos experimentos demostraron que el heterodímero DR\alpha\beta se había asociado y se secretaba de manera eficiente. Los cuatro clones de Pichia mostraron niveles de expresión similares; esto no sorprende porque los cuatro transformantes habían integrado los genes en el locus AOX1.

Para una expresión a gran escala, las células se hicieron crecer en un fermentador a una densidad alta y las moléculas de DR2 se purificaron a partir de los sobrenadantes concentrados por cromatografía de afinidad con el mAb L243. El mAb utilizado en la purificación (L243) se une a la cadena DR\alpha pero solamente cuando ésta está correctamente asociada con la cadena DR\beta. La purificación por afinidad produjo aproximadamente 300-400 mg de HLA-DR2 por litro de cultivo. La SDS-PAGE reveló dos bandas, la identidad de estas bandas (DR\alpha en la banda superior, DR\beta en la banda inferior) y la escisión correcta del péptido señal del factor sexual \alpha se confirmó mediante análisis de la secuencia N-terminal después de la separación de las cadenas DR\alpha y DR\beta por SDS-PAGE y transferencia a una membrana de PVDF.

Un análisis de filtración en gel por HPLC (Bio-gel SEC 300 mm x 7,8 mm; velocidad de flujo 1 ml/min, PBS pH 6,8) de 10 \mug de HLA-DR2, demostró que la proteína recombinante eluía en forma de un pico simétrico único y solamente se detectaban cantidades muy pequeñas de agregados de pesos moleculares superiores. Por el contrario, el HLA-DR2 expresado en el sistema de Baculovirus, se encontró que formaba agregados a menos que estas moléculas estuvieran cargadas con un péptido de alta afinidad (Stern y Wiley, 1992). Estos datos demostraron que el heterodímero \alpha\beta de DR2 se asociaba y secretaba en el sistema de expresión de Pichia pastoris incluso en ausencia de un péptido de alta afinidad. Lo que es aún más importante, las moléculas purificadas no se agregaron incluso cuando no se encontraban cargadas con un péptido de alta afinidad.

De manera concreta, la inducción de cultivos de alta densidad se llevó a cabo utilizando un fermentador de serie LH, de Inceltech, equipado con monitores y controles para la determinación de pH, O_{2} disuelto, agitación, temperatura y flujo de aire. Un cultivo de 100 ml de toda la noche en YBN-glicerol se utilizó para inocular el fermentador que contenía 10 litros de un medio con sales basales para fermentación (sulfato cálcico\cdot2 H_{2}O 0,93 g/litro, sulfato potásico 18,2 g/litro, sulfato de magnesio\cdot7H_{2}O 14,9 g/l, e hidróxido potásico 6,5 g/litro) que contenía glicerol al 4% (p/v) más 43,5 ml de sales traza PTM1 (CuSO_{4} 24 mM, NaI 0,53 mM, MnSO_{4} 19,87 mM, Na_{2}MoO_{4} 0,83 mM, ácido bórico 0,32 mM CoCl_{2} 2,1 mM, ZnCl_{2} 0,15 mM, FeSO_{4} 0,23 mM y biotina 0,82 mM) a 30ºC. El O_{2} disuelto se mantuvo por encima del 20% ajustando la aireación y la agitación, y el pH se mantuvo a 6,0 mediante la adición de hidróxido amónico al 28% (v/v). El crecimiento se continuó hasta que el glicerol se agotó (20 horas). Una fase de alimentación en discontinuo con glicerol se inició mediante la adición limitada de glicerol al 50% (p/v) y 12 ml de sales PTM1 por litro de glicerol en un volumen de fermentación inicial de 18,15 ml/h/litro hasta que el cultivo alcanzó un peso celular húmedo de 200 g/litro (22 horas). Después de la fase de alimentación en discontinuo con glicerol, el cultivo se indujo sustituyendo la alimentación en discontinuo de glicerol con una alimentación en discontinuo con metanol (metanol al 100% que contiene 12 ml de sales traza de PTM_{1} por litro de metanol), a 1 ml/h/litro. La alimentación con metanol se fue aumentando gradualmente en incrementos del 10% cada 30 minutos a una velocidad de 3 ml/h/litro y la fermentación continuó durante 96 horas.

Los sobrenadantes se concentraron por ultrafiltración en una membrana YM30 (Amicon) y se pasaron por una columna de afinidad anti-DR (con mAb L243) a una velocidad de flujo de aproximadamente 10 ml/hora. Después de lavados prolongados con PBS, los heterodímeros se eluyeron con glicina 50 mM, pH 11,5. Los eluidos se neutralizaron de manera inmediata mediante la adición de Tris 2 M, pH 8,0, se dializaron frente a PBS y se concentraron por ultrafiltración. Las concentraciones de proteína se determinaron por medio del análisis "Coomassie Plus Protein Assay" (Pierce, Rockford, IL) usando albúmina de suero bovino como estándar.

Carga de moléculas solubles de HLA-DR2 con un péptido de alta afinidad. Una proteína básica de la mielina humana (residuos 85-99) que es reconocida por clones de células T restringidos a RD2, procedentes de pacientes con MS, se había demostrado en trabajos previos que se unía con una afinidad alta (IC_{50} de 4,2 nM) a DR2 soluble en detergente, purificada a partir de transfectantes de células L (Wucherpfenning y col., 1994 y 1995a). Un péptido biotinilado, con un fragmento enlazador SGSG entre el resto de biotina y la secuencia del MBP (es decir, biotina-SGSG-MBP(85-99)), se utilizó para estudiar la especificidad de la unión del péptido a DR2 recombinante. La unión del péptido se determinó incubando moléculas de DR2 (50-400 nM) con el péptido biotinilado (2 \muM) a 37ºC durante períodos de tiempo diferentes; como competidor se utilizó péptido no biotinilado para demostrar la especificidad de unión (Figura 6). Los complejos DR2/péptido fueron luego capturados en un placa para ELISA utilizando el mAb L243 y la cantidad de péptido biotinilado unido se cuantificó utilizando estreptavidina marcada con peroxidasa y ABTS como sustrato de la peroxidasa (detección a 405 nm).

La unión de un péptido a DR2 fue fuertemente dependiente del pH, observándose un máximo a de pH 7 a pH 8; una unión relativamente baja se observó a pH 5. Un pH óptimo similar se había observado en trabajos previos para la unión del péptido MBP a DR2 soluble en detergente (Wucherpfenning y col., 1994). La unión del péptido fue dependiente de la relación en moles relativa de DR frente a péptido, obteniéndose un máximo de unión con un exceso en moles del péptido de 10 veces sobre el número de moles de DR2 (Figura 6). La unión fue específica porque pudo bloquearse con un exceso de péptido MBP(85-99) no biotinilado, pero no con un péptido análogo Val89\rightarrowAsp en el que el residuo (Val 89) del anclaje P1 de MBP(85-99) había sido sustituido por ácido aspártico (Figura 6).

Para determinar qué fracción de moléculas recombinantes podía cargarse con un péptido individual, los complejos de DR2 y el péptido MBP biotinilado se precipitaron con bolitas de estreptavidina. Después de la precipitación, las cadenas DR\alpha y DR\beta se resolvieron por SDS-PAGE y se detectaron por transferencia Western utilizando un antisuero policlonal específico de DR. Aproximadamente el 50% de las moléculas precipitaron con las bolitas de estreptavidina y el 50% permaneció en el sobrenadante. Los experimentos de control demostraron que la precipitación de los complejos DR2/péptido era específica debido a que las moléculas no precipitaron cuando se utilizaron bolitas de agarosa como control, un péptido MBP no marcado o un exceso de péptido no marcado sobre péptido biotinilado; en vez de ello, las moléculas DR2 permanecieron en la fracción no unida.

En los experimentos de inmunoprecipitación, DR2 (400 nM) se incubó con péptido biotinilado (2 \muM) en un volumen de 50 ml de PBS, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM, pH 7,2 durante 24 horas a 37ºC. Los complejos DR2-péptido se precipitaron con bolitas de estreptavidina-agarosa. Las bolitas primero se bloquearon con albúmina de suero bovino al 3% en PBS, NP40 al 0,1% durante 1 hora a 4ºC; las bolitas después se sedimentaron y se añadieron las muestras que contenían DR2/péptido. Después de una incubación de 1 hora, las bolitas se lavaron tres veces con el tampón de bloqueo. Los complejos DR2-péptido se eluyeron de las bolitas de estreptavidina calentándolas en tampón de PAGE-SDS 1X a 94ºC durante 3 minutos. Las muestras se resolvieron en una PAGE-SDS al 12,5% y se transfirieron a una membrana de Immobilon (Millipore). Las transferencias se bloquearon durante la noche con leche en polvo desnatada al 5% en Tris 50 mM, pH 8,0, NaCl 150 mM, Tween 20 al 0,2% (tampón de TBST). Las cadenas DR\alpha y DR\beta precipitadas se detectaron con un antisuero policlonal específico de DR (CHAMP, 1:50.000 en tampón de bloqueo durante 90 min). Las transferencias se lavaron en tampón de TBST y se incubaron durante 30 min con un anticuerpo anti-IgG de conejo, conjugado con peroxidasa (1:10.000 en el tampón de bloqueo). Después de lavados prolongados en TBST, las bandas se detectaron por quimioluminiscencia intensificada (Amersham, Arlington Heights, IL).

En una serie aparte de experimentos, la unión del péptido a DR2 recombinante se cuantificó capturando las moléculas DR2 en placas para análisis de ELISA con un anticuerpo específico de DR inmovilizado. Las condiciones estándar para la unión fueron: 37ºC durante 24 horas en PBS, pH 7,2, EDTA 1 mM, PMSF 1 mM. Después de la unión del péptido, el péptido unido se cuantificó por ELISA. Las placas se recubrieron con 200 ng/pocillo de L234 purificado en bicarbonato 0,1 M, pH 9,6 durante la noche a 4ºC. Los sitios de unión inespecíficos se bloquearon con BSA al 3% en PBS, Tween 20 al 0,05% durante 2 horas. Las muestras se diluyeron en tampón de bloqueo y se añadieron a los pocillos (1 hora). El péptido biotinilado unido a HLA-DR2 se cuantificó con estreptavidina-peroxidasa usando ABTS como sustrato de la peroxidasa; la absorbancia se leyó a 405 nm.

Cinéticas de las uniones de péptidos a moléculas HLA-DR2 solubles. Se compararon (Figura 7) las cinéticas de las uniones a péptidos por moléculas DR2 solubles en detergente, purificadas a partir de una línea de células B transformadas con EBV (Gorga y col., 1987), y por moléculas DR2 recombinantes. Cantidades equimolares de ambas preparaciones de DR2 (200 nM) se incubaron con el péptido MBP biotinilado (2 \muM) a 37ºC durante diferentes períodos de tiempo; la cantidad de péptido unido a DR se investigó mediante un análisis de ELISA utilizando el anticuerpo mAb L243, específico para DR, para la captura, y estreptavidina-peroxidasa para la detección del péptido unido a DR. Las cinéticas de las uniones del péptido fueron sorprendentemente diferentes: Cuando se utilizaron moléculas recombinantes, las cinéticas de unión fueron mucho más rápidas y se cargó una fracción de las moléculas mucho mayor (50% de la unión máxima pasadas sólo 3 horas, alcanzándose una meseta pasadas 18 horas). Por el contrario, las cinéticas de las uniones del péptido a DR2 procedente de células B fueron lentas; la fracción de moléculas cargadas con péptidos aumentó lentamente a lo largo de un período de 48 horas, sin alcanzar una meseta (Figura 7). Estos resultados se explican por el hecho de que la mayor parte de las moléculas DR purificadas a partir de células B, están ya ocupadas con péptidos de alta afinidad, como se demuestra mediante estudios de elución de péptidos y la cristalización de HLA-DR1 (Chicz y col., 1993; Brown y col., 1993). Por el contrario, el sitio de unión al péptido de una fracción grande de las moléculas de DR2 recombinantes se encuentra vacía y fácilmente disponible para la unión por un péptido de alta afinidad.

Expresión de la proteína de fusión DR2-IgG. Las proteínas de fusión DR2-IgG se expresaron en el sistema de células Schneider de Drosophila. El diseño de DR2-IgG se eligió tanto para aumentar la afinidad por el receptor de células T, como para anexionarse a un dominio efector, la región Fc de IgG2a. La fijación del complemento puede dar como resultado la lisis de las células T diana después de la unión de las moléculas DR2-IgG al receptor de células T. Las moléculas DR2-IgG pueden por lo tanto ser útiles para el agotamiento selectivo de células T autoagresivas. Estudios que han comparado la afinidad de anticuerpos IgG bivalentes y de sus fragmentos F(ab) monovalentes han mostrado que la naturaleza bivalente de IgG aumenta enormemente la afinidad funcional por el antígeno (Crothers y Metzger, 1972); Dower y col., 1984; Hornick y Karush, 1972).

Construcciones de cDNA correspondientes a moléculas de fusión DR2-IgG. Se expresaron proteínas de fusión DR2 bivalentes fusionando la parte del Fc de IgG2a con el extremo 3' de la construcción de cDNA correspondiente a DR\alpha-Fos, anteriormente descrita. En este diseño, la cadena DR\alpha-Fc corresponde a la cadena pesada del anticuerpo y la construcción DR\beta-Jun corresponde a la cadena ligera del anticuerpo.

La parte Fc de IgG2a se amplificó por RT-PCR, procedente de un hibridoma (L243) de ratón que secreta un mAb de IgG2a. El producto de la PCR se fusionó en el marco de lectura con la construcción DR\alpha-Fos mediante una PCR con cebadores solapantes. La PCR con cebadores solapantes se realizó con un cebador para la parte Fc que solapaba en 20 pb con el extremo 3' de la construcción DR\alpha-Fos. DR\alpha-Fos y Fc se amplificaron por separado, se purificaron en gel, se mezclaron y amplificaron utilizando oligos que representan el extremo 5' de DR\alpha y el extremo 3' de IgG2a. La construcción se clonó en los sitios EcoRI-BamHI del vector de expresión pRmHa-3 bajo el control del promotor de la metalotioneína. El inserto se verificó mediante elaboración del mapa de restricción y secuenciación didesoxi.

Producción de moléculas de fusión DR2-IgG

El sistema de células Schneider de Drosophila se eligió para la expresión de la proteína de fusión DR2-IgG por los siguientes motivos: (1) Anticuerpos recombinantes se han expresado en células de insectos en trabajos previos (Gauthier y col., presentado para publicación), (2) En el vector de expresión pRmHa-3, los genes están bajo el control del promotor de la metalotioneína fuertemente inducible, (3) Las células Schneider son capaces de crecer hasta alcanzar una densidad celular elevada en medios libres de suero, y (4) La producción a gran escala de la proteína es más sencilla que en otro sistema de células de insectos (el sistema de Baculovirus) debido a que se generan transfectantes estables.

Se generaron transfectantes estables cotransfectando células de Schneider con los vectores que portan las cadenas DR\alpha-IgG y DR\beta así como con el plásmido pH8CO. Este vector confiere resistencia a la selección con metotrexato. Los transfectantes se seleccionaron con metotrexato 0,1 \muM en medio de Schneider, suero de ternera fetal al 10%. Los transfectantes se clonaron mediante el método de la dilución límite, y la secreción de moléculas DR2-IgG se determinó mediante el análisis de ELISA utilizando anticuerpos específicos para el fragmento Fc de IgG así como el mAb L243 específico para el heterodímero DR\alpha\beta.

Los transfectantes se hicieron crecer hasta alcanzar una densidad de \sim10x10^{6}/ml y la expresión se indujo añadiendo CuSO_{4} hasta alcanzar una concentración final 1 mM. Los sobrenadantes se recogieron cinco días después de la inducción y se concentraron por ultrafiltración. Las moléculas DR2-IgG se purificaron por cromatografía de afinidad utilizando el mAb L243. La pureza se determinó por SDS-PAGE; como comparación, una IgG de ratón purificada se desarrolló también sobre el gel. Los análisis de transferencia Western con un antisuero policlonal confirmaron la identidad de las dos bandas. Experimentos de unión del péptido mostraron que las moléculas DR2-IgG estaban correctamente plegadas y eran funcionales.

Expresión de moléculas de fusión DR2-secuencia marcadora para la generación de tetrámeros de DR2. La biotina-ligasa biotinila de manera específica un residuo de lisina en el interior de una secuencia de reconocimiento de 14 aminoácidos (LGGIFEAMKMELRD, SEQ ID NO: 9) (Shatz, 1993) y, por ello, una secuencia de DNA que codifica esta "secuencia marcadora" se añadió en la construcción DR\alpha-Fos. Esta construcción "DR\alpha-Fos-secuencia marcadora" se clonó en los sitios EcoRI y SalI del vector pRmHa-3 de expresión en Drosophila bajo el control del promotor inducible de la metalotioneína. Células Schenider de Drosophila cotransfectadas de manera estable con las construcciones DR\alpha-Fos-secuencia marcadora y DR\beta-Jun, se generaron según se ha descrito anteriormente para DR2-IgG. Las moléculas de fusión "DR2-secuencia marcadora" resultantes difieren de las proteínas de fusión DR2-Fos/Jun solamente por la adición de la secuencia marcadora de biotinilación en el extremo C-terminal de la construcción DR\alpha-Fos, y las moléculas DR2-secuencia marcadora se purificaron por afinidad a partir de los sobrenadantes utilizando el mAb L243 según se ha descrito anteriormente.

La biotinilación de sitios específicos de estas moléculas DR2-secuencia marcadora permite la asociación de tetrámeros de DR2-secuencia marcadora-biotina sobre la estreptavidina debido a que la estreptavidina tiene cuatro sitios de unión a biotina. Así, los tetrámeros se preparan mezclando las moléculas de DR2-secuencia marcadora-biotina con estreptavidina en una relación 4:1 en moles. El tetrámero DR2-secuencia marcadora-biotina/estreptavidina no porta un dominio efector pero puede estar conjugado con una toxina.

Expresión de biotina-ligasa para la biotinilación de las moléculas DR2-secuencia marcadora. Se sobreexpresó biotina-ligasa en E. coli; el cDNA de la biotina-ligasa (proporcionado por S. Lesley, Promega Corporation) se clonó en forma de un fragmento NdeI-XhoI en el interior del vector pET22b de expresión en procariotas bajo el control del promotor de T7. Esta construcción se usó para transfectar la cepa BL21/DE3 de E. coli que es lisogénica para el gen de la RNA-polimerasa de T7 bajo el control del promotor lacZ. La expresión de la proteína se indujo mediante adición de IPTG en concentración 1 mM durante 4 horas. Las células se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en Tris 20 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM. Las células se sonicaron y el material insoluble se separó por centrifugación, produciendo 5 ml de una fracción soluble de proteínas citoplásmicas a partir de 100 ml de cultivo.

La biotinilación se llevó a cabo a 37ºC en un volumen de 100 \mul, con de 0,1 \mul a 10 \mul de enzima, ATP 1 mM y biotina 1 \muM o 10 \muM. Después de la reacción, las moléculas DR2 recombinante-secuencia marcadora-biotina se capturaron en placas de 96 pocillos revestidas con el mAb L243 y el grado de biotinilación se cuantificó utilizando estreptavidina conjugada con peroxidasa.

Análisis de transferencia Western de la cadena \alpha biotinilada de DR2-secuencia marcadora. Las moléculas de DR2-marcador se biotilinaron con biotina-ligasa en presencia de ATP y biotina. Una transferencia Western se ensayó consecutivamente con un antisuero policlonal específico de DR y con estreptavidina-peroxidasa. Este experimento demostró la biotinilación específica de la cadena DR\alpha (que porta la secuencia de reconocimiento de 14 aminoácidos para la biotina-ligasa) por acción de la biotina-ligasa.

Generación de tetrámeros-DR2. Se utilizó estreptavidina marcada con fluoresceína para estudiar la formación de tetrámeros de DR2-secuencia marcadora-biotina. La fluoresceína absorbe a 492 nm, lo que permite su detección durante una cromatografía de filtración en gel por HPLC (Bio-Gel SEC 300 mm x 7,8 mm; velocidad de flujo 1 ml/min, PBS pH 6,8). La estreptavidina (MW 60 kDa) eluyó en forma de un pico único a los 8,3 minutos en la columna de filtración en gel de HPLC. El complejo estreptavidina-DR2-secuencia marcadora-biotina eluyó a los 5,8 minutos. Se observaron intermediarios que llevaban una, dos o tres moléculas de fusión con DR2 unidas a estreptavidina, cuando se utilizaron cantidades más pequeñas de DR2-secuencia marcadora-biotina para la formación del complejo. Los estándar de MW confirmaron el peso molecular previsto de la estreptavidina y del complejo estreptavidina-DR.

Generación de complejos DR2/péptido cargados con un péptido individual. Un péptido MBP(85-99) marcado con (His)_{6} se utilizó para purificar proteínas de fusión con DR2 cargadas con un péptido individual mediante cromatografía de afinidad con metal. Moléculas DR2-secuencia marcadora se incubaron con el péptido MBP marcado con (His)_{6} y se precipitaron con la resina de afinidad a metal (Talon Metal Affinity Resin, Clontech). Los complejos DR2/péptido eluyeron en condiciones suaves (EDTA 1 mM). Las moléculas DR2 eluidas se analizaron por análisis de transferencia Western, utilizando para la detección un antisuero policlonal específico de DR. Estos experimentos demostraron que complejos DR2/péptido definidos pueden generarse con un rendimiento de \sim50%.

Unión de células T a complejos DR2/péptido. Se estudió la unión de receptores de células T dispuestos sobre la superficie de clones de células T humanas, a complejos DR2 recombinante/péptido. Moléculas de DR2-secuencia marcadora, biotiniladas, se cargaron con el péptido MBP(85-99) y se capturaron sobre una placa revestida con estreptavidina; se cuantificó la unión de células T marcadas por fluorescencia a los complejos DR2/péptido inmovilizados. Como control positivo, se revistieron pocillos con un mAb anti-CD3.

La unión se estudió utilizando un clon (Ob.1A12) de células T humanas, restringido al DR2 y específico para MBP(85-99) y un clon de control (Go.P3.1) restringido a DR4 y específico para los residuos 190-204 de la proteína desmogleína 3 humana. La unión específica a los complejos DR2/MBP(85-99) sólo se observó con el clon de células T específico para MPB(85-99). Además, se observó unión sólo con los complejos DR2/MBP(85-99), y no con moléculas DR2 vacías.

La unión se estudió capturando moléculas DR2-secuencia marcadora biotiniladas sobre una placa revestida con estreptavidina. Los sitios de unión inespecífica se bloquearon con BSA al 0,1% en PBS. Las células T se marcaron con BCEFC-AM, una sonda fluorescente para membranas, durante 30 minutos a 37ºC, se lavaron y añadieron a la placa durante 20 minutos a 37ºC. Después de tres lavados, la fracción de célula T que se había unido a los complejos DR2/péptido o al mAb anti-CD3 se determinó en un lector de placas fluorescentes.

Producción de moléculas de fusión DR2-IgM. Las moléculas DR2-IgM portan diez brazos de DR2/péptido (hay cinco monómeros de IgM en el pentámero; cada monómero de IgM tiene dos brazos, como la IgG). Ya que las moléculas DR2-IgG tienen dos brazos de DR2/péptido, se espera que la afinidad funcional de las moléculas DR2-IgM para el receptor de células T sea mucho más alta. Un aumento significativo de la afinidad mejoraría la sensibilidad de la tinción inmunohistoquímica de lesiones de MS así como la eficacia terapéutica de estas moléculas. Las células de insectos expresan anticuerpos IgG a niveles altos (Potter y col., 1993; Gauthier y col., presentado para publicación). Los anticuerpos IgM se expresan en células de mamíferos (células CHO), pero aún no se ha informado sobre la expresión de anticuerpos IgM en células de insectos. Las moléculas DR2-IgM pueden ser particularmente útiles en inmunoterapia por las siguientes razones: (1) Alta afinidad por el receptor de células T dispuesto sobre las células diana, (2) Fijación del Complemento por acción del segmento Fc de IgM, y (3) Semivida en suero más prolongada.

El segmento Fc de la IgM murina se fusiona en el marco de lectura con el extremo 3' del segmento DR\alpha-Fos, de la manera anteriormente descrita para la construcción DR\alpha-IgG. La construcción DR\alpha-IgM se clona, por ejemplo, en el interior de los sitios EcoRI-BamHI del vector de expresión pRmHa-3, bajo el control del promotor inducible de metalotioneína (Bunch y col., 1988). Las construcciones de fusión de la cadena DR\alpha-IgM y de la cadena DR\beta se cotransfectan con un gen que codifica la cadena J murina. La cadena J facilita la asociación y secreción de moléculas de IgM en células de mamífero (Matsuuchi y col., 1986). La cadena J-murina puede clonarse, por ejemplo, en el vector de expresión pUC-hygMT que confiere resistencia a la higromicina. Los transfectantes estables pueden después seleccionarse utilizando higromicina en una concentración de 100 \mug/ml en un medio para células de Schneider (Sigma) complementado con suero de ternera fetal al 10%, ensayado en células de insectos. Los transfectantes se clonan por dilución límite y se ensayan con respecto a la expresión de moléculas DR2-IgM después de una inducción con CuSO_{4}.

La secreción de las moléculas DR2-IgM puede determinarse por inmunoprecipitación con el mAb L243, seguida de análisis de transferencia Western con anticuerpos específicos para el segmento Fc de la IgM murina. Para la producción de proteína, los transfectantes pueden adaptarse a medios libre de suero (ExCell400, JRH Biosciences).

Estas construcciones también se pueden utilizar para transfectar células CHO o líneas de células B murinas (M12.C3). En trabajos previos se había observado que las células CHO secretan anticuerpos IgM recombinantes a niveles altos y se han utilizado para la expresión de una proteína de fusión CD2-IgM (Wood y col., 1990; Arulanandam y col., 1993). Para la expresión en estas líneas celulares, las construcciones correspondientes a la cadena DR\alpha-IgM y a la cadena DR\beta pueden clonarse en vectores de expresión en eucariotas. La construcción DR\alpha-IgM puede clonarse, por ejemplo, en pcDNA3, que porta el gen de resistencia a neomicina, la construcción correspondiente a DR\beta-Jun puede clonarse en el vector pcDNAI (Invitrogen). Las células pueden transfectarse por electroporación y los transfectantes estables pueden seleccionarse con G418. La secreción de moléculas DR2-IgM puede determinarse por inmunoprecipitación con el mAb L243 y por análisis de transferencia Western.

Uso de proteínas de fusión DR2-Ig para el agotamiento selectivo de células T. Las proteínas de fusión DR2-Ig pueden ser útiles para el agotamiento selectivo de células T que reconocen péptidos propios unidos a DR2. La unión de proteínas de fusión DR2-Ig por el receptor de las células T puede conducir a la fijación del complemento y a la lisis de las células T diana. Las moléculas DR2 multivalentes pueden también conjugarse con genisteína, un inhibidor de tirosina-quinasa que produce la apoptosis después de su incorporación en las células diana.

Afinidad de los complejos multivalentes DR2/péptido por el receptor de células T. La unión de complejos multivalentes DR2/péptido a los TCR se estudiará utilizando clones humanos de células T restringidas a DR2. Las moléculas DR2 se cargarán con el péptido MBP(85-99) y se marcarán con [^{125}I] utilizando cloramina T inmovilizada (Iodobeads, Pierce). En el ensayo de unión, un número fijo de células T (1 x 10^{6} células, 1 ml) se incubarán con 6-10 concentraciones diferentes de complejos DR2/péptido marcados radiactivamente en PBS, BSA al 1,0%, NaN_{3} al 0,02%. Las moléculas marcadas radiactivamente se utilizarán en concentraciones a las que solamente una pequeña fracción (menor que el 10%) de los TCR de las células diana estarán ocupados.

En primer lugar, se determinará el tiempo de incubación requerido para alcanzar el equilibrio; los complejos DR2/péptido unidos a células y los no unidos a células se separarán mediante una centrifugación rápida (10-15 s) a través de una capa de silicona (d=1,050) al 84%, aceite de parafina (d=0,838) al 16%. La radiactividad unida a las células se cuantificará en un contador gamma y los datos se analizarán en representaciones de Scatchard para determinar K (constante de disociación) y n (número de moléculas de TCR presentes en las células diana). Se incluirán varios controles para demostrar la especificidad de la unión: (1) Clones de células T con especificidad para un complejo MHC/péptido no relacionado, (2) Complejos DR2/péptido cargados con péptidos de control, y (3) Competición de la unión producida con un exceso de complejos DR2/péptido no marcados radiactivamente.

Será de especial interés determinar las cinéticas de unión de las moléculas monovalentes (DR2), bivalentes (DR2-IgG) y multivalentes (DR2-IgM, DR2-tetrámeros) al TCR. Las tasas de "on" se determinarán incubando las células diana con ligandos marcados radiactivamente durante diferentes períodos de tiempo, a 37ºC (en presencia de azida sódica al 0,02% para prevenir la internalización de los TCR), seguida de una rápida separación de los reaccionantes. Las tasas de "off" se determinarán incubando las células T con ligandos marcados radiactivamente hasta que se alcanza el equilibrio. Las células después se lavarán, se incubarán durante períodos de tiempo diferentes y se determinará la cantidad de radiactividad unida a las células. Se espera que las tasas de off sean significativamente diferentes para los ligandos monovalentes, bivalentes y multivalentes. Estudios clásicos realizados con anticuerpos IgM han mostrado que la anexión multivalente enlentece notablemente la disociación del anticuerpo unido (Crothers y Metzger, 1972; Hornick y Karush, 1972).

Lisis de células T específicas para proteínas de fusión DR2-Ig, mediada por el complemento. El segmento Fc de la IgG1a se eligió para la proteína de fusión DR2-IgG porque la IgG2a fija el complemento. La IgM también fija el complemento, permitiendo que pueda determinarse la lisis de células T diana mediada por el complemento y producida por las proteínas de fusión. Las células T se incubarán con DR2-IgG o DR2-IgM; las células después se lavarán y se incubarán con complemento de suero de conejo diluido en el medio (dilución de 1:5 a 1:20). El complemento de suero de conejo se obtendrá procedente de Cedarlane Laboratories y se someterá a un pre-ensayo para asegurar que el lote no contiene ninguna citotoxicidad inespecífica contra células T humanas; el complemento se separará en partes alícuotas y se almacenará a -70ºC. La citotoxicidad se determinará pasados 30 y 60 minutos de incubación a 37ºC mediante tinción con azul tripán (% de citotoxicidad = [número de células muertas/número de células vivas + células muertas] x 100). Un mAb específico para CD3 humano (OKT3, IgG2a), que fija el complemento, se utilizará como control positivo. La especificidad de la lisis se determinará utilizando clones de células T de control así como moléculas DR2 cargadas con péptidos de control.

Acoplamiento de complejos DR2/péptido a toxinas que inducen apoptosis. Moléculas DR2 multivalentes de los tres diseños, DR2-IgG, DR2-IgM y tetrámeros DR2, se conjugarán con restos de toxina como otro de los medios de mediar en la muerte selectiva de células T. La genisteína, un inhibidor de tirosina-quinasa, puede ser particularmente efectiva para este fin. En un estudio reciente, se ha encontrado que la genisteína acoplada al mAb CD19 es sumamente efectiva para erradicar una leucemia de células B humanas en ratones SCID (Uckun y col., 1995). Una dosis única de 25 \mug de un conjugado genisteína-mAb proporcionó una protección completa frente a una sensibilización inmunológica letal con la leucemia de células B. CD19 es una molécula de superficie específica para el linaje de las células B; se observó que el conjugado que portaba el anticuerpo inducía la apoptosis después de su internalización mediante endocitosis mediada por el receptor. Los receptores de células T experimentan endocitosis después del reconocimiento de complejos DR2/péptido (Valitutti y col., 1995); es por lo tanto probable que los complejos DR2/péptido sean incorporados a las células T diana después de su unión al receptor de células T.

La genisteína se conjugará en complejos multivalentes DR2/péptido mediante formación de enlaces cruzados por fotoafinidad utilizando un agente favorecedor de la formación de enlaces cruzados (Sulpho-SANPAH), fotosensible, de 18,2 \ring{A} de longitud, no escindible y heterofuncional, de la manera descrita por Uckun y col., (1995). Los conjugados de DR2-toxina se ensayarán utilizando los clones de células T restringidos de DR2 humano. Las células T se incubarán con conjugados de DR2-toxina y la inducción de la apoptosis se determinará mediante electroforesis en gel de agarosa de DNA genómico. La fragmentación nucleosomal del DNA se estudiará mediante tinción con bromuro de etidio. Moléculas DR2 cargadas con péptidos de control así como clones de células T de control se utilizarán para demostrar la especificidad de la inducción de la apoptosis.

La inducción de la apoptosis producida por los conjugados DR2-toxina se cuantificará por citometría de flujo después de un marcaje terminal de los extremos del DNA fragmentado (procedimiento de TUNEL). Los extremos libres de los fragmentos del DNA nuclear se marcarán con nucleótidos conjugados con dioxigenina, utilizando la enzima desoxinucleotidil-transferasa terminal (TdT). Las células se fijarán y permeabilizarán mediante tratamiento con EtOH al 70%. Los extremos 3'-OH de los fragmentos de DNA nuclear se marcarán con dioxigenín-dUTP, dioxigenín-dATP y TdT, seguido de la detección de los extremos de DNA marcados con un anticuerpo anti-dioxigenina marcado con fluoresceína (kit para la detección de la apoptosis in situ, ApopTag, Oncor). El análisis FACS se utilizará para determinar la fracción de células que han experimentado apoptosis. Células cultivadas durante 12 horas a una concentración baja de suero (suero al 1%) se utilizarán como control positivo. La especificidad de la inducción de la apoptosis se demostrará utilizando clones de células T de control y moléculas DR2 cargadas con péptidos de control.

Unión de células T a complejos DR2/péptido inmovilizados

Estudios previos habían demostrado que las moléculas DR2 solubles y recombinantes se unen a péptidos de manera específica. Para estudiar si los complejos DR2 recombinante/péptido son reconocidos por receptores de las células T, se realizaron ensayos de adhesión a células T utilizando complejos DR2/péptido biotinilados que se capturaron en placas de microtitulación revestidas con estreptavidina. Clones de células T, específicos para MPB(85-99), y clones de células T de control se marcaron con BCEFC-AM, una sonda fluorescente para membranas, se lavaron y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC con complejos DR2/péptido inmovilizados. Después de los lavados, la fracción de células T unidas se determinó en un fluorómetro. La unión de células T restringidas a DR2 y específicas para MBP(85-99) se observó solamente cuando se utilizaron los complejos DR2/MBP(85-99) pero no cuando las moléculas DR2 estaban cargadas con un péptido de control. Asimismo, la sustitución de un solo aminoácido en un residuo de contacto principal del TCR suprimió la unión de las células T. La unión a los complejos DR2/MBP(85-99) no se observó con los clones de células T de control.

Proteínas de fusión DR2-Ig: Expresión de DR2 con un péptido MBP unido covalentemente

Se generaron proteínas de fusión DR2-Ig para permitir la unión multivalente a TCR dispuestos sobre células T diana (2 brazos DR2/péptido en la proteína de fusión DR2/IgG, 10 brazos DR2/péptido en la proteína de fusión DR2-IgM). Con el fin de asegurar que todos los sitios de unión presentes en estas moléculas estarán cargados con el mismo péptido, las moléculas DR2 se expresaron con un péptido MBP unido covalentemente. La secuencia de MBP(85-99) se anexionó al extremo N-terminal de la cadena \beta madura de DR a través de un fragmento enlazador de 16 aminoácidos (secuencia enlazadora: SGGGSLVPRGSGGGGS, SEQ ID NO: 10). Esta construcción de DNA se utilizó para expresar moléculas DR2 y moléculas DR2-Ig con un péptido MBP unido, en células Schneider de Drosophila.

Proteínas de fusión DR2-Ig: Expresión de una proteína de fusión DR2-IgM

La proteína de fusión DR2-IgM puede ser de la mayor utilidad para el agotamiento de células T específicas de antígeno en pacientes con MS debido a que estos presentan la valencia más alta. Las proteínas de fusión DR2-IgM no se secretaron en células Schneider de Drosophila; por lo tanto se realizó su expresión en células COS. Las moléculas de fusión DR2-IgM se secretaron cuando las células COS se transfectaban con las construcciones de cDNA.

Moléculas DR2 con biotinilación específica de sitio

La secuencia de reconocimiento para la biotina-ligasa, de 14 aminoácidos, se anexionó al extremo C-terminal de la cadena \alpha de DR; la biotina-ligasa biotinila de manera específica un residuo de lisina del interior de esta secuencia de reconocimiento de 14 aminoácidos. (LGGIFEAMKMELRD, SEQ ID NO: 9) (Schatz, 1993). Esta construcción se cotransfectó junto con la construcción del cDNA de la cadena \beta de DR en células Schneider de Drosophila y se generaron transfectantes estables. Las moléculas DR2-marcador biotina se purificaron por afinidad y se llevó a cabo una biotinilación específica de sitio, con biotina-ligasa expresada en E. coli. La biotinilación específica de sitio se comprobó por análisis de transferencia Western, que se ensayó con un antisuero específico para DR que marcó las dos cadenas DR\alpha y DR\beta, mientras que cuando se ensayó con estreptavidina únicamente marcó la cadena DR\alpha biotinilada.

Tinción de células T con complejos DR2/péptido inmovilizados en microbolitas fluorescentes

Las moléculas DR2-marcador biotina se utilizaron para generar sondas altamente multivalentes para la tinción específica de células T específicas de antígeno. Las moléculas DR2-marcador biotina se unieron a microesferas pequeñas (40 nm de diámetro) y muy fluorescentes a las que se había conjugado estreptavidina. La tinción de células T específicas de antígeno se estudió por FACS. Solamente se observó tinción con los clones de células T específicos para MBP(85-99), pero no con los clones de control; la intensidad de la tinción fue similar a la observada con un anticuerpo CD4. La tinción fue altamente específica ya que la sustitución de un único aminoácido en el péptido MBP en un residuo de contacto con el TCR suprimió la tinción de los clones de células T específicos de MBP.

Expresión de moléculas DQ8 asociadas con la diabetes dependiente de insulina

Los dominios de dimerización de cremallera de leucina de Fos y Jun también se utilizaron para expresar moléculas DQ solubles (DQ1 y DQ8) que están asociadas con la susceptibilidad a padecer pénfigo vulgar y diabetes dependiente de insulina, respectivamente. El mismo diseño se utilizó de la manera anteriormente descrita para DR2 recombinante (incluyendo los puntos de procesamiento). Se generaron transfectantes estables utilizando células Schneider de Drosophila y las moléculas DQ solubles se purificaron por afinidad. Los estudios de unión de los péptidos usando péptidos que en trabajos previos se había observado que se unían a DQ1 o DQ8, demostraron que las moléculas eran funcionales.

Secuencia de ácido nucleico que codifica la fusión DR2-IgG

1

Secuencia de ácido nucleico que codifica la fusión DR2-IgM

2

Referencias

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Wucherpfenning et al. (1995) Proc. Natl. Acad. Csi. (USA). 92:8896-8900.

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): SOLICITANTE: WUCHERPFENNING, Kai W.

\hskip4cm

STROMINGER, Jack L.

\hskip4cm

Presidente y Miembros del Harvard College

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DEL INVENTO: PROTEÍNAS DE FUSIÓN DE CLASE II DEL MHC, SOLUBLES, MONOVALENTES Y MULTIVALENTES, Y SUS USOS.

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 10

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): DIRECCIÓN PARA CORRESPONDENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): DESTINATARIO: TESTA, HURWITZ Y THIBEAULT, LLP.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): CALLE: 125 HIGH STREET

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: BOSTON

\vskip0.500000\baselineskip

(D): ESTADO: MA

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: EE.UU.

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CÓDIGO POSTAL: 02110

\vskip0.800000\baselineskip

(v): FORMA DE LECTURA POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE MEDIO: Disco flexible

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): SOPORTE LÓGICO: PatentIn Release n.º 1.0,

\hskip6cm

Versión n.º 1.30

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): DATOS GENERALES DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CLASIFICACIÓN:

\vskip0.800000\baselineskip

(vii): DATOS PREVIOS DE LA SOLICITUD:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NÚMERO DE LA SOLICITUD: US 60/024.077

\vskip0.500000\baselineskip

(B): FECHA DE PRESENTACIÓN: 16 de agosto de 1996

\vskip0.800000\baselineskip

(viii): INFORMACIÓN SOBRE EL APODERADO/AGENTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: Twomey, Michael J.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): NÚMERO DE REGISTRO: 38.349

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: HAR-002PR

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): INFORMACIÓN PARA TELECOMUNICACIONES:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TELÉFONO: (617) 248 7000

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TELEFAX: (617) 248 7100

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 750 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

: (ix) CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1...735

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1...21

\vskip0.500000\baselineskip

(C): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= "extremo 3' de la señal de secreción"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 22...594

\vskip0.500000\baselineskip

(C): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= "dominio extracelular de DRA*0101"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 595...615

\vskip0.500000\baselineskip

(C): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= "Secuencia enlazadora"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 616...735

\vskip0.500000\baselineskip

(C): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= "Dominio de cremallera de leucina de Fos"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:1:

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 245 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:2:

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 771 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1...756

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1...21

\vskip0.500000\baselineskip

(C): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= "extremo 3' de la señal de secreción"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 22...615

\vskip0.500000\baselineskip

(C): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= "dominio extracelular de DRB1*1501"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 616...636

\vskip0.500000\baselineskip

(C): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= "Secuencia enlazadora"

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 637...756

\vskip0.500000\baselineskip

(C): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= "Dominio de cremallera de leucina de Jun"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:3:

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 252 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: proteína.

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:4:

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1...42

\vskip0.500000\baselineskip

(C): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= "cebador de PCR sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATCTCTCG AGAAAAGAGA GATCAAAGAA GAACATGTGA TC

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1...39

\vskip0.500000\baselineskip

(C): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= "cebador de PCR sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCATAGAAT TCTCAATGGG CGGCCAGGAT GAACTCCAG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 42 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1...42

\vskip0.500000\baselineskip

(C): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= "cebador de PCR sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTATCTCTCG AGAAAAGAGA GGGGACACC CGACCACGTT TC

\hfill

42

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 39 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1...39

\vskip0.500000\baselineskip

(C): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= "cebador de PCR sintético"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:8:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCATAGAAT TCTCAATGGT TCATGACTTT CTGTTTAAG

\hfill

39

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 14 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1...14

\vskip0.500000\baselineskip

(C): INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= "secuencia sintética de reconocimiento para biotina-ligasa"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Leu Gly Gly Ile Phe Glu Ala Met Lys Met Glu Leu Arg Asp}

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN SOBRE LA SECUENCIA SEQ ID NO:10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 16 aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácidos

\vskip0.500000\baselineskip

(C): TIPO DE CADENA: sencilla

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERIZACIÓN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: misc_feature

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1...16

\vskip0.500000\baselineskip

: (C) INFORMACIÓN ADICIONAL: /nota= "secuencia enlazadora sintética"

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO:10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

\sa{Ser Gly Gly Gly Ser Leu Val Pro Arg Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser}

Claims

1. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II, que comprende:

en la que dichos polipéptidos primero y segundo se asocian en condiciones fisiológicas para formar una molécula heterodimérica del MHC de Clase II, que es capaz de unir selectivamente un péptido de unión al MHC para formar un complejo MHC/péptido.

2. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 1, en la que dicho dominio de unión del MHC de Clase II comprende un dominio extracelular de una cadena alfa del MHC de Clase II.

3. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 2, en la que dicho dominio extracelular comprende los residuos 5-180 de una cadena alfa del MHC de Clase II.

4. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 2, en la que dicho dominio extracelular comprende los residuos 5-200 de una cadena alfa del MHC de Clase II.

5. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 2, en la que dicho dominio extracelular comprende los residuos 5-190 de una cadena alfa del MHC de Clase II.

6. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 1, en la que dicha cadena alfa del MHC de Clase II se selecciona entre el grupo constituido por las cadenas alfa de HLA-DR1, HLA-DR2, HLA-DR4, HLA-DQ1, HLA-DQ2 y HLA-DQ8.

7. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 1, en la que dicha cadena alfa del MHC de Clase II está codificada por un alelo HLA seleccionado entre el grupo constituido por los alelos DRA*0101, DRA*0102, DQA1*0301 y DQA1*0501.

8. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 1, que comprende además un péptido de unión al MHC de Clase II, en la que dicha proteína de fusión y dicho péptido de unión al MHC de Clase II forman un complejo heterodimérico MHC/péptido.

9. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 1, en la que dicho dominio de unión del MHC de Clase II comprende un dominio extracelular de una cadena beta del MHC de Clase II.

10. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 9, en la que dicho dominio extracelular comprende los residuos 5-185 de una cadena beta del MHC de Clase II.

11. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 9, en la que dicho dominio extracelular comprende los residuos 5-205 de una cadena beta del MHC de Clase II.

12. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 9, en la que dicho dominio extracelular comprende los residuos 5-195 de una cadena beta del MHC de Clase II.

13. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 1, en la que dicha cadena beta del MHC de Clase II se selecciona entre el grupo constituido por las cadenas beta de HLA-DR1, HLA-DR2, HLA-DR4, HLA-DQ1, HLA-DQ2 y HLA-DQ8.

14. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 13, en la que dicha cadena beta del MHC de Clase II está codificada por un alelo seleccionado entre el grupo constituido por los alelos DRB1*01, DRB1*15, DRB1*16, DRB5*01, DQB1*03 y DQB1*02.

15. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en la que dicho dominio de dimerización es un dominio de cremallera de leucina.

16. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 15, en la que dicho dominio de cremallera de leucina comprende al menos cuatro héptadas de leucina.

17. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 15, en la que dicho dominio de cremallera de leucina se selecciona entre el grupo constituido por un dominio de cremallera de leucina de Fos y un dominio de cremallera de leucina de Jun.

18. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, que comprende además un primer fragmento enlazador molecular flexible interpuesto entre, y que une covalentemente, dicha cadena \alpha del MHC de Clase II y dicho primer dominio de dimerización, y un segundo fragmento enlazador molecular flexible interpuesto entre, y que une covalentemente, dicha cadena \beta del MHC de Clase II y dicho segundo dominio de dimerización.

19. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 18, en la que dicho primer o segundo fragmento enlazador molecular flexible comprende una secuencia peptídica de 1-15 residuos de aminoácidos.

20. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 19, en la que dicho primer o segundo fragmento enlazador molecular flexible comprende una secuencia peptídica de 5-7 residuos de aminoácidos.

21. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 19, en la que una parte mayoritaria de dichos residuos de aminoácidos se selecciona entre el grupo constituido por los residuos de alanina, glicina, serina, leucina, isoleucina y valina.

22. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, que comprende además un péptido de unión al MHC de Clase II, unido covalentemente al extremo N-terminal de dicha cadena \alpha del MHC de Clase II, en la que dicho péptido de unión es capaz de unirse selectivamente a la molécula del MHC de Clase II que incluye dicha cadena \alpha del MHC de Clase II y dicha cadena \beta del MHC de Clase II para formar un complejo MHC/péptido.

23. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, que comprende además un péptido de unión al MHC de Clase II, unido covalentemente al extremo N-terminal de dicha cadena \beta del MHC de Clase II, en la que dicho péptido de unión es capaz de unirse selectivamente a la molécula del MHC de Clase II que incluye dicha cadena \alpha del MHC de Clase II y dicha cadena \beta del MHC de Clase II para formar un complejo MHC/péptido.

24. Un complejo MHC/péptido según se ha definido en las reivindicaciones 8, 22 ó 23, en el que dicha molécula del MHC de Clase II es una molécula HLA-DR2, y dicho péptido de unión se selecciona entre el grupo constituido por los residuos 85-99, 84-102 y 148-162 de la proteína básica de la mielina humana.

25. Un complejo MHC/péptido según se ha definido en las reivindicaciones 8, 22 ó 23, en el que dicha molécula del MHC de Clase II es una molécula HLA-DR4, y dicho péptido de unión se selecciona entre el grupo constituido por los residuos 78-93, 97-111, 190-204, 206-220, 251-265, 512-526 y 762-786 de la proteína desmogleína 3 humana.

26. Un complejo MHC/péptido según se ha definido en las reivindicaciones 8, 22 ó 23, en el que dicha molécula del MHC de Clase II es una molécula HLA-DQ1, y dicho péptido de unión se selecciona entre el grupo constituido por los residuos 78-93, 97-111, 190-204, 206-220, 251-265, 512-526 y 762-786 de la proteína desmogleína 3 humana.

27. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según una cualquiera de las reivindicaciones 22-26, que comprende además un fragmento enlazador molecular flexible interpuesto entre, y unir covalentemente, dicha cadena del MHC de Clase II y dicho péptido de unión al MHC.

28. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 27, en la que dicho fragmento enlazador molecular flexible comprende una secuencia peptídica de 10-20 residuos de aminoácidos.

29. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 28, en la que dicho fragmento enlazador molecular flexible comprende una secuencia peptídica de 12-18 residuos de aminoácidos.

30. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 28 ó 29, en la que una parte mayoritaria de dichos residuos de aminoácidos se selecciona entre el grupo constituido por los residuos de alanina, glicina, serina, leucina, isoleucina y valina.

31. Una proteína de fusión multimérica del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II, que comprende al menos dos de las proteínas de fusión de una cualquiera de las reivindicaciones 1-30.

32. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según una cualquiera de las reivindicaciones 1-30, que comprende además una secuencia señal de secreción N-terminal unida covalentemente al extremo N-terminal de dicha proteína de fusión.

33. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 32, en la que dicha secuencia señal de secreción comprende una señal de secreción del factor sexual \alpha de levaduras.

34. Una proteína de fusión soluble del Complejo Principal de Histocompatibilidad de Clase II según la reivindicación 32, en la que dicha secuencia señal de secreción comprende una señal de secreción de una proteína del MHC humano de Clase II.

35. Un método para detectar células T que tienen una especificidad definida para un complejo MHC/péptido, que comprende:

proporcionar complejos MHC/péptido, monovalentes o multivalentes, de una cualquiera de las reivindicaciones 8, 22 ó 23, que comprenden dicho complejo MHC/péptido definido; y

poner en contacto una población de células T con dicho complejo MHC/péptido; y

detectar la presencia a ausencia de unión de dicho complejo MHC/péptido y las células T en dicha población.

36. Un método según la reivindicación 35, que comprende además aislar las células T reactivas con dicho complejo MHC/péptido definido, de entre dicha población de células T.

37. Un método según la reivindicación 36, en el que dicho aislamiento tiene lugar por medio de una clasificación de células activadas por fluorescencia.

38. Un método in vitro para estimular o activar células T reactivas frente a un complejo MHC/péptido definido, que comprende:

proporcionar un complejo MHC/péptido, monovalente o multivalente, de una cualquiera de las reivindicaciones 8, 22 ó 23; y

poner en contacto una población de células T con una cantidad inmunogénica de dicho complejo MHC/péptido.

39. Un método in vitro para destruir selectivamente células T reactivas frente a un complejo MHC/péptido definido, que comprende:

poner en contacto una población de células T con dicho complejo MHC/péptido, en el que dicho complejo MHC de Clase II/péptido comprende una sustancia citotóxica unida covalentemente a la proteína de fusión y capaz de destruir las células T a las que dicho complejo MHC/péptido se une selectivamente.

40. Un complejo MHC/péptido soluble, monovalente o multivalente, según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8, 22 ó 23, para utilizar en un método terapéutico.

41. Un complejo MHC/péptido soluble, monovalente o multivalente, según la reivindicación 40, para conferir a un sujeto inmunidad adoptiva frente a una proteína diana que comprende dicho péptido de unión al MHC.

42. Un complejo MHC/péptido soluble, monovalente o multivalente, según la reivindicación 40, para estimular o activar células T reactivas frente a un complejo MHC/péptido definido.

43. Un complejo MHC/péptido soluble, monovalente o multivalente, según la reivindicación 42, en el que dicho complejo MHC/péptido es singeneico en relación con dicho sujeto.

44. Un complejo MHC/péptido soluble, monovalente o multivalente, según la reivindicación 40, para destruir selectivamente células T reactivas frente a un complejo MHC/péptido definido, en el que dicho complejo MHC/péptido comprende además una sustancia citotóxica unida covalentemente.

45. Un complejo MHC/péptido soluble, monovalente o multivalente, según la reivindicación 40, para hacer tolerante a un sujeto humano frente a un péptido definido de unión al MHC de Clase II.

46. Un complejo MHC/péptido soluble, monovalente o multivalente, según la reivindicación 45, en el que dicha proteína de fusión soluble del MHC de Clase II comprende un dominio de unión al MHC de Clase II que es singeneico en relación con dicho sujeto.

47. Un complejo MHC/péptido soluble, monovalente o multivalente, según la reivindicación 45, en el que dicha proteína de fusión soluble del MHC de Clase II comprende un dominio de unión al MHC de Clase II que es alogénico en relación con dicho sujeto.

48. Un ácido nucleico aislado que codifica una proteína de fusión soluble del MHC de Clase II de una cualquiera de las reivindicaciones 1-34.

49. Un ácido nucleico aislado que codifica un complejo MHC/péptido de una cualquiera de las reivindicaciones 8, 22 ó 23.

50. Un complejo MHC/péptido según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8, 22 ó 23, en el que dicha molécula del MHC de Clase II es una molécula HLA-DR2 y dicho péptido de unión seleccionado entre el grupo constituido por los residuos 85-99, 84-102 y 148-162 de la proteína básica de la mielina humana, está unido a dicho heterodímero de la proteína de fusión del MHC de Clase II.

51. Un complejo MHC/péptido según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8, 22 ó 23, en el que dicha molécula del MHC de Clase II es una molécula HLA-DR4; y dicho péptido de unión seleccionado entre el grupo constituido por los residuos 78-93, 97-111, 190-204, 206-220, 251-265, 512-526 y 762-786 de la proteína desmogleína 3 humana, está unido a dicho heterodímero de la proteína de fusión del MHC de Clase II.

52. Un complejo MHC/péptido según se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 8, 22 ó 23, en el que dicha molécula del MHC de Clase II es una molécula HLA-DQ1; y dicho péptido de unión seleccionado entre el grupo constituido por los residuos 78-93, 97-111, 190-204, 206-220, 251-265, 512-526 y 762-786 de la proteína desmogleína 3 humana, está unido a dicho heterodímero de la proteína de fusión del MHC de Clase II.