ES2221206T3

ES2221206T3 - Inmunoanalisis de captura del antigeno en suero del virus de la diarrea virica bovina.

Info

Publication number: ES2221206T3
Application number: ES98949426T
Authority: ES
Inventors: Roy Huchzermeier; Edward Joseph Dubovi
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc; Syracuse Bioanalytical Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc; Syracuse Bioanalytical Inc
Priority date: 1997-09-23
Filing date: 1998-09-23
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2018-09-23
Also published as: US20010051332A1; EP1387172A3; CA2304546A1; EP1018017B1; AU738964B2; CA2304546C; WO1999015900A1; DE69823531D1; AU738964C; DE69823531T2; PT1018017E; EP1018017A1; EP1387172A2; US6174667B1; DK1018017T3; AU9575298A; ATE265682T1

Abstract

Un método para detectar si un animal objetivo es positivo o negativo al virus de la diarrea vírica bovina, que comprende: a) proporcionar al menos una muestra de dicho animal objetivo, donde dicha muestra se elige del grupo formado por el suero sanguíneo, los mocos, la leche, el plasma sanguíneo y la orina; b) proporcionar un sistema de valoración que comprenda: 1) un anticuerpo de captura que es anticuerpo específico del epítopo del virus de la diarrea vírica bovina, estando dicho anticuerpo de captura inmovilizado sobre un soporte sólido y capaz de reconocer y enlazar una proteína o un fragmento proteínico de la misma del virus de la diarrea vírico bovino gp48 que retiene una especificidad antigénica; 2) un anticuerpo detector que es un anticuerpo del virus de la diarrea vírica anti-bovina, capaz de reconocer y enlazar dicha proteína o fragmento proteínico de la misma del virus de la diarrea vírico bovino gp48 que retiene una especificidad antigénica; 3) un sistema generador de señales para indicar la presencia de dicho anticuerpo detector asociado operativamente con el antígeno del virus de la diarrea vírica bovina, elegido de un anticuerpo primario, que está marcado directamente por un acoplamiento covalente, o bien un anticuerpo secundario marcado, específico para el anticuerpo primario, o un aglutinante secundario marcado, específico para el anticuerpo primario. c) analizar la muestra con dicho sistema de valoración para generar un cambio de señal si el antígeno del virus de la diarrea vírico está presente en la muestra; y d) comparar la señal con unos niveles de referencia para indicar si el animal objetivo es positivo o negativo al virus de la diarrea vírico bovino.

Description

Inmunoanálisis de captura del antígeno en suero del virus de la diarrea vírica bovina.

Campo de la invención

La invención hace referencia al campo de los immunoanálisis para la infección vírica. En particular, la invención se refiere al desarrollo de un immunoanálisis para la captura del antígeno que puede emplear muestras de suero, plasma, leche, moco o bien orina para identificar animales infectados por el virus de la diarrea vírica bovina.

Fundamento de la invención

El virus de la diarrea vírica bovina (VDVB) representa frecuentemente una amenaza importante para la industria del ganado. Descrito por primera vez hace cincuenta años, este patógeno ha resultado ser altamente virulento y de fácil extensión. Considerado un patógeno primario de los sistemas entérico, respiratorio, reproductor e inmunitario en los bovinos, el VDVB continúa causando pérdidas económicas significativas en la industria del ganado en el mundo entero. En Canadá, Estados Unidos y en todo el mundo se han producido brotes recientes. Para combatirlos se necesita un método de detección del VDVB más simple, más eficaz en cuanto al coste, capaz de aportar resultados en un tiempo oportuno que controle mejor la dispersión del virus VDVB en el ganado. Dicha herramienta es especialmente importante a la luz de la ineficacia de las vacunas de VDVB disponibles en la actualidad.

Clasificado como un miembro del género Pestivirus y de la familia Flaviviridae, el VDVB está íntimamente relacionado con el virus de la enfermedad de la frontera en ovinos (EFV) y el virus de la peste porcina (PPV), tratándose ambos de pestivirus relacionados serológicamente. La secuencia completa o parcial de genomas de los pestivirus aislados ha permitido observar que un grado elevado de conservación de la secuencia se encuentra presente entre los pestivirus. Más recientemente, se han identificado variantes antígenas del VDVB y las cepas del VDVB se han dividido en dos genotipos distintos, tipo 1 y tipo 2, que posteriormente se han subdividido, en base a su citopatogenicidad. La clonación molecular, y la tecnología de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (RCP) han determinado que la estructura general del VDVB consiste en una proteína cápside y tres glucoproteínas que la envuelven. El genoma del VDVB es un ARN de 12,3 kb, que consta de una estructura de lectura abierta única (ELA). El virus VDB es propiamente un virus pequeño de ARN envuelto con una polaridad del filamento positiva. Este aspecto del filamento positivo del genoma vírico permite que el ARN sea infeccioso, incluso en ausencia de proteínas víricas.

El VDVB se extiende entre el ganado por vía fecal-oral, atacando los sistemas entérico, respiratorio, reproductor e inmunitario. La carga vírica necesaria para provocar una infección sintomática se correlaciona con el tipo y la cepa del virus DVB. Además, el VDVB es capaz de infectar el feto al cruzar la placenta, lo que a menudo da lugar a un aborto espontáneo del feto, y a una fertilidad reducida entre los animales infectados. Las estrategias para el control de la gama de VDVB a partir de unas prácticas de tratamiento más estrictas, en un esfuerzo por reducir de forma simple la pérdida económica supondrían un nivel inaceptable de costes. El fracaso de las vacunaciones sobre el terreno para el VDVB ha aumentado la necesidad de un protocolo de ensayos que permitirá identificar y eliminar los animales infectados de forma eficaz en cuanto al coste.

También debería observarse que el VDVB, como otros agentes de la enfermedad infecciosa, se asocia a una amplia variedad de manifestaciones clínicas, creando un reto diagnóstico muy difícil. Las manifestaciones frecuentes de la infección por el VDVB pueden ser: fuertes abortos, infertilidad, ciclos de calor irregulares, muertes prematuras de embriones, momificación fetal, inmunosupresión, disentería, trombocitopenia, e hipoplasia cerebral. Además, los estudios serológicos han demostrado que un elevado porcentaje del ganado infectado con el VDVB, que incluye aquellos animales permanentemente infectados (PI), se mantiene clínicamente asintomático. Dichas condiciones han impulsado al desarrollo de un ensayo fiable, económico y fácil de utilizar, para ayudar a la detección de animales infectados por el VDVB en el ganado vacuno.

El virus VDB se mantiene típicamente en el ganado debido a la presencia de animales portadores infectados permanentemente e inmunotolerantes. Este ganado PI está expuesto al virus en el útero, pero puede mantenerse clínicamente asintomático en el transcurso de su vida, vertiendo continuamente heces, y eliminando líquidos corporales, con una concentración alta de virus, y con ello representa una amenaza de infección para los demás animales que se encuentran en el rebaño. El virus puede estar presente en más de la mitad del ganado en un rebaño antes de que los síntomas de una epidemia se manifiesten por sí solos. Los síntomas de la enfermedad van precedidos generalmente por leucocitopenia, y los esfuerzos llevados a cabo hasta la fecha se han centrado en identificar este efecto.

Las principales epidemias han dado lugar a serias pérdidas económicas en la industria de la ganadería; por ejemplo, en Ontario en 1993, los casos de VDVB aumentaron un 23% en menos de un año. También se debería resaltar que aunque la atribución histórica del VDVB como un pestivirus se halló entre el ganado, se desconoce el hecho de que los pestivirus puedan cruzar barreras de especies. Esto indica que en áreas en las cuales los animales rumiantes salvajes, libres (alces, búfalos, etc..) están expuestos a rebaños de ganado infectado, estos animales también son susceptibles a la infección por el VDVB, o bien pueden actuar alternativamente como una reserva de virus capaces de infectar un rebaño anteriormente "limpio".

Más de ciento cincuenta vacunas para el VDVB se han comercializado en granjas de ganado en los últimos treinta años. Estas vacunas han consistido en virus modificados vivos VDB o virus atenuados inactivados y partículas de virus. Sin embargo, las epidemias recientes del VDVB se han producido debido a la disponibilidad y al uso de estas vacunas. Los métodos actuales de vacunación implican la inoculación reiterada anual con vacunas para el ganado, y en general los pasos adicionales se toman con el objetivo de garantizar que no nacen terneros portadores PI. Sin embargo, para que sea posible el control eficaz del virus VDB, es esencial identificar los animales PI y retirarlos del rebaño. Se han desarrollado varios métodos de análisis diferentes para la detección del VDVB, y /o la detección de animales infectados por el VDVB. Estos métodos de análisis incluyen: una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de transcripción reversa, el enzimoinmunoanálisis (ELISA), y técnicas estándar de aislamiento de virus.

Tanto la técnica del PCR como la de aislamiento del virus, debido a su propia sensibilidad, son capaces de detectar niveles muy bajos del virus VDVB. No obstante, estos métodos también requieren tiempo, son relativamente complejos y caros. La tecnología ELISA, aunque algo menos sensible, se adapta mejor como una herramienta de diagnóstico muy amplia. Sin embargo, hasta este descubrimiento, los análisis ELISA que revelan el antígeno para el VDVB se han continuado basando en el uso de extractos de los glóbulos blancos de los animales que se investigaban. Los extractos de glóbulos blancos han sido necesarios porque las proteínas del VDVB se acumulan en concentraciones relativamente altas dentro de los leucocitos de los animales infectados, y a los anteriores métodos ELISA les faltaba la sensibilidad necesaria para detectar las proteínas del VDVB en el suero sanguíneo. (Horner y cols., 1995).

La preparación de extractos de glóbulos blancos requiere tiempo y es relativamente cara, lo que hace que cualquier análisis o ensayo ELISA resulte costoso. Así pues, con respecto a los métodos previamente indicados en su totalidad, no solamente requieren mucho tiempo, sino que además a menudo precisan de unas instalaciones de laboratorio sofisticadas y de unos técnicos muy especializados. Por este motivo, resulta económicamente prohibitivo utilizarlos en la industria actual de la ganadería.

Los estudios de radioinmunoprecipitación (RIP) del ganado infectado por el VDVB han indicado una fuerte respuesta inmunitaria a varias glucoproteínas del VDVB (Donis y Dubovi 1987), que incluyen la gp53^{E2}, gp48, gp25. La fuerte respuesta a éstas, y otras glucoproteínas, ha hecho que sean el objetivo o la diana de ulteriores estudios de la expresión genética del VDVB y de su citopaticidad. En el transcurso de este estudio, Corapi y cols., (1988) generaron el 15.c.5 mAb. Se descubrió que el objetivo de este mAb era un epítopo del VDVB gp48 (conocido también como "EO" ó E^{ms} en la literatura). Después, Kwang y cols., (1992) sugirieron que este mAb podía ser importante en el desarrollo de un análisis de detección ELISA para un anticuerpo para el VDVB, utilizando probablemente suero como muestra. Debe destacarse sin embargo que Kwang no sugirió el uso potencial de este anticuerpo (por ejemplo, mAb 15.c.5) en un ELISA de captura de antígeno.

La generación de anticuerpos monoclonales 15.c.5 (Corapi y cols., 1988) y el posterior descubrimiento de que niveles relativamente altos de una proteína del VDVB en particular (gp48) podían ser detectados en el suero de animales infectados por el VDVB utilizando el 15.c.5 como un anticuerpo de captura (Huchzermeier y cols., 1996) condujo a la invención anteriormente descrita. El mAb 15.c.5 se encuentra disponible actualmente en el Laboratorio de Diagnóstico de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Cornell, Ithaca New York.

Resumen de la invención

Se ha desarrollado un ensayo o análisis ELISA, tal como se ha definido en las reivindicaciones adjuntas, que utiliza un anticuerpo monoclonal (mAb), específico para la proteína del VDVB o fragmentos de proteína, para reconocer su presencia en el suero, plasma, leche, orina o moco bovino. El aspecto importante de este análisis ELISA es que permite la detección de proteínas víricas objetivo en suero, leche, plasma u otro líquido corporal. Típicamente, los leucocitos deben ser recogidos y extraídos, lo que requiere tiempo y un procedimiento laborioso de preparación de la muestra. Mediante el uso del mAb 15.c.5, que permite el desarrollo de una valoración para el VDVB a partir de suero, plasma, leche, orina o moco, los solicitantes descubrieron que eran capaces de construir un estuche claramente mejorado para las pruebas de inmunoanálisis. Este inmunoanálisis es preciso, tiene un tiempo de espera más breve para una muestra de análisis determinada, y es una opción económicamente más apropiada para la industria bovina. El epítopo principal de este mAb se encuentra localizado en el gp48, conocido también como "E^{ms}" y "E0".

Los solicitantes han optimizado su prueba ELISA de tal forma que ha aumentado su credibilidad, y muestra una armonía excelente cuando se compara con el método convencional, más sensible, de detección del VDVB-aislamiento vírico. Los solicitantes han desarrollado un estuche para ELISA en bovinos, fácil de utilizar, rápido y económico, que ayudará a los veterinarios a identificar animales infectados por el VDVB, especialmente aquellos animales PI, y a retirarlos de un rebaño determinado. Esto protege a la industria bovina de significativas pérdidas económicas debidas al VDVB. Puesto que el VDVB puede afectar a otros rumiantes, este análisis se puede emplear en poblaciones de animales salvajes (por ejemplo, ciervos, alces, antas) para determinar si son VDVB positivos. Este uso podría facilitar el tratamiento de poblaciones de animales salvajes y ayudar a retirar las reservas de virus VDVB fuera de la población bovina doméstica.

Descripción del modelo preferido Prueba del antígeno del virus de la diarrea bovino (VDVB)

Como se ha indicado, el VDVB vive entre la población bovina debido a la existencia de animales permanentemente infectados(PI). Este tipo de animal procede de una infección fetal del virus VDB. Si el feto sobrevive, el ternero resultante será incapaz de desarrollar una respuesta inmunitaria contra el virus y estará permanentemente infectado con el virus para el resto de su vida. Un animal PI puede vivir años; durante este tiempo, excretará gran cantidad de virus al ambiente y será potencialmente infeccioso respecto a otros animales.

Arquitecturas de la valoración

El inmunoanálisis del suero del VDVB puede ser un inmunoanálisis tipo sándwich, que emplea el anticuerpo específico GP-48 (como anticuerpo detector o de captura) y otro anticuerpo anti-VDVB (como un anticuerpo detector o de captura para complementar el monoclonal específico GP-48), o bien un inmunoanálisis tipo competitivo, que emplea el anticuerpo monoclonal específico GP-48 con un antígeno GP-48 marcado o un antígeno GP-48 acoplado a una fase sólida.

Para cada tipo de inmunoanálisis son posibles una diversidad de configuraciones y formatos. El anticuerpo de captura, por ejemplo, puede acoplarse a una variedad de diferentes fases sólidas, que permitirá la eliminación de los reactivos que no han reaccionado durante el transcurso del análisis. Estos incluirán: micro pocillos, tubos de ensayo recubiertos, partículas magnéticas recubiertas, varillas y membranas (nitrocelulosa y otras).

El anticuerpo de captura, al que se hace referencia como anticuerpo primario, puede obtenerse por absorción pasiva, acoplamiento covalente, o bien utilizando una fase sólida pre-lacada con un aglutinante secundario como la proteína A, proteína G, un anticuerpo secundario específico para el anticuerpo primario, la avidina, o un anticuerpo específico para un ligando en particular (por ejemplo.: biotina, dinitrofenol, fluoresceína y otros). En el caso de la avidina o de cualquier anticuerpo específico del ligando, es necesario acoplar de forma covalente el ligando al anticuerpo de captura).

Para una valoración de tipo competitivo, el antígeno GP-48 puede acoplarse a una fase sólida mediante absorción pasiva, acoplamiento covalente, o bien utilizando una fase sólida pre-lacada con un aglutinante secundario como la avidina, o un anticuerpo específico para un ligando en particular como el dinitrofenol, la fluoresceína y otros. (En el caso de la avidina o de cualquier anticuerpo específico del ligando, es necesario pegar el ligando al antígeno GP-48 de un modo covalente).

En los inmunoanálisis tipo competitivo o sándwich pueden emplearse una variedad de marcadores. Las posibilidades incluyen: un enzima como la peroxidasa o la fosfatasa alcalina, un fluoróforo como la fluoresceína, una muestra quimioluminiscente como un éster de acridinio, una muestra fluorescente de resolución en el tiempo como un quelato de europio, una especie radiactiva, o bien partículas como el oro coloidal, látex plano ó látex seco.

El anticuerpo monoclonal específico GP-48 o el anticuerpo anti-VDVB pueden ser marcados directamente mediante el acoplamiento covalente o bien un anticuerpo secundario marcado, específico para el correspondiente anticuerpo primario y pueden ser utilizados sin la necesidad de modificar químicamente el anticuerpo primario. También se puede emplear un aglutinante secundario marcado como la avidina o bien un anticuerpo etiquetado específico para un ligando en particular (por ejemplo: dinitrofenol, fluoresceína y otros). En el caso de la avidina o de cualquiera de los anticuerpos específicos del ligando, es necesario acoplar de forma covalente el ligando correspondiente con el anticuerpo primario.

Para una valoración competitiva, el antígeno GP-48 puede ser marcado directamente mediante un acoplamiento covalente o bien puede emplearse un aglutinante secundario marcado como la avidina o un anticuerpo marcado específico para un ligando en particular (por ejemplo: dinitrofenol, fluoresceína y otros). En el caso de la avidina o de alguno de los anticuerpos específicos del ligando, es necesario unir mediante un enlace covalente el ligando correspondiente con el antígeno GP-48.

El equipo de reactivos de análisis

Desde un punto de vista histórico, los animales permanentemente infectados (PI) se identifican analizando las muestras de sangre de estos animales usando un método de aislamiento del virus. Mientras que esta metodología de análisis puede detectar animales infectados, la prueba de aislamiento del virus únicamente puede ser realizada por técnicos experimentados en un laboratorio altamente especializado. La prueba del antígeno del VDVB para el suero, revelada aquí por los solicitantes, representa un medio más sencillo, rápido y menos caro de detección del antígeno del VDVB en muestras de suero, plasma, leche, orina o moco de animales infectados. Este equipo que aquí se menciona se basa en la metodología ELISA, y emplea un anticuerpo monoclonal específico del antígeno VDVB como anticuerpo de captura, con un anticuerpo anti-VDVB policlonal de cabra como el detector, y una peroxidasa de rábano picante - anticuerpo anti-cabra como el conjugado. Los resultados de la prueba pueden determinarse mediante el uso de un espectrofotómetro de microplaca donde se lee una densidad óptica a 450 nanómetros.

Para crear la tecnología ELISA que aquí se menciona, la concentración del anticuerpo detector, el conjugado anti-cabra en particular y su concentración, la formulación del tampón diluyente del reactivo, la formulación del reactivo NSB (ligante no específico); y el tipo de micropocillo se optimizaban para dar el fondo mínimo y el cociente señal-ruido máximo. Además, la configuración reactiva (es decir, 10 veces los concentrados de reactivo detector, reactivo de conjugado enzimático y reactivo NSB, con un tampón diluyente reactivo aparte) se diseñaba para maximizar la estabilidad del equipo y su periodo de caducidad.

Además de este trabajo, existían dos avances o descubrimientos que hacían que esta valoración del suero fuera posible. En primer lugar, se descubría que una pequeña cantidad de gammaglobulina bovina era un aditivo clave en el tampón diluyente reactivo (este tampón diluyente reactivo se emplea para preparar soluciones de trabajo de anticuerpo detector y de conjugado enzimático); este aditivo reducía de forma significativa la señal de fondo.

El segundo descubrimiento equivalía a un revestimiento del pocillo. Resulta una ventaja utilizar un anticuerpo monoclonal purificado antes que una preparación de ascitis cruda para un revestimiento del pocillo con el fin de garantizar consistencia entre lotes de microplacas revestidas. Sin embargo, cuando se revestían los pocillos de 15.c.5 purificado la señal de fondo era inaceptablemente alta. Se descubría que este problema podía aliviarse añadiendo albúmina bovina al 15.c.5 purificado, antes de revestir el pocillo.

El procedimiento ELISA se lleva a cabo a temperatura ambiente, y tarda aproximadamente 4 horas, pero no requiere unas instalaciones de laboratorio altamente especializadas.

Requisitos de la muestra

El volumen de muestra (suero, plasma, leche, orina o moco) requerido para los fines de este procedimiento es de cómo mínimo 100 \mul por pocillo. Solamente las muestras de terneros o becerros recién nacidos previas al calostro o bien de terneros de más de tres 3 meses de edad son adecuadas para los análisis en el equipo de análisis ELISA. Los anticuerpos maternales anti-VDVB, que pueden pasar a los terneros recién nacidos en las 24 horas de la toma del calostro, pueden interferir con este ELISA y producir resultados negativos falsos en los terneros PI. Debido a que el nivel de anticuerpo maternal disminuye a medida que envejece el ternero, esta interferencia se podrá evitar especificando los requisitos de edad para los animales analizados mediante este ELISA (Palfi y cols., 1993).

Componentes del equipo de análisis de antígeno del VDVB

Con respecto a los componentes del equipo de análisis, cada equipo o estuche contiene un control negativo y un control positivo. Estos controles se incluirán en cada serie para garantizar que cada serie es válida y se utilizarán en el cálculo de la reducción de datos (para "normalizar" los resultados de las muestras). Estos controles, así como todos los demás reactivos empleados en la valoración presentada en esta solicitud, se conservan añadiendo tiomersal.

Para minimizar los volúmenes necesarios y maximizar la estabilidad del equipo, el reactivo detector, el reactivo conjugado enzimático, el reactivo inhibidor de enlaces no específicos (por ejemplo, el reactivo "NSB") y el tampón de lavado ELISA se suministran como concentrados 10 veces. El Tampón Diluyente Reactivo, el control positivo y el control negativo, el reactivo sustrato TMB, y una solución que interrumpirá la reacción (por ejemplo "Solución paro") se suministran en el equipo en una forma ya preparada sin necesidad de dilución. Las muestras se dispondrán en una de las dos placas de 96 pocillos proporcionadas en el equipo.

Otros compuestos o recursos necesarios para realizar la prueba ELISA con el equipo de análisis del antígeno del VDVB incluyen entre otras cosas: agua desionizada, un lector de microplacas capaz de realizar una lectura de la densidad óptica (DO) a 450 nm, pipetas serológicas y pipetas de precisión. En la documentación que se incluye en el estuche se encuentran las directrices para la preparación de los reactivos y los procedimientos apropiados para el uso de los reactivos.

Composición de los reactivos

Debería destacarse que las soluciones de trabajo del reactivo detector y de los reactivos de conjugados enzimáticos deberían preparase aproximadamente 1 hora antes de su uso y luego almacenarse a 4ºC.

Tampón de lavado ELISA - concentrado 10 veces - Los compuestos que comprenden el tampón de lavado ELISA son: 1M Tris;HCl (6,25 normal) para el ajuste del pH; 0,01% de tiomersal, y 5% Tween 20.

Reactivo detector - concentrado 10 veces - Los compuestos que comprenden el reactivo detector son: 25% etilenglicol, 0,01% tiomersal, aproximadamente 5% anticuerpo anti-VDB de cabra, y 0,06% de alimento amarillo colorante en PBS(pH 7,4).

Reactivo NSB - concentrado 10 veces - Los compuestos que comprenden el reactivo NSB son: 25% etilenglicol, 0,01% tiomersal, 0,2% IgG de ratón, 0,06% alimento rojo colorante en PBS(pH 7,4).

Tampón diluyente reactivo - Los compuestos que comprenden el tampón diluyente reactivo son: 2,5% albúmina sérica bovina, 0,01% tiomersal y 1,0% de gammaglobulina bovina en PBS(pH 7,4).

Reactivo sustrato TMB - Se utiliza un sustrato TMB disponible en el comercio. Los proveedores de este sustrato son: Boehringer Mannheim Corp., Pierce Chemical Co., y Kirkegaard & Perry Laboratories.

Solución Paro - La solución paro consiste en un 1% de ácido clorhídrico (HCl). Se compra normalmente como un reactivo ya preparado en Kirkegaard and Perry Laboratories.

Pocillos revestidos de anticuerpos anti-VDVB - Cada bandeja de 96 pocillos se reviste por la noche con 0,1 ml por pocillo de una solución que contiene 1,5.c.5 a 5 \mug/ml y de albúmina sérica bovina a 10 \mug/ml en tampón de carbonato (pH 9,6). Tras el revestimiento, cada bandeja se lava tres veces con tampón de lavado ELISA y se deja secar durante la noche a 4ºC. Se usa una bolsa para recubrir cada bandeja después del secado, y se incluye un desecante dentro de cada bolsa para eliminar la humedad.

Reactivo de conjugados enzimáticos - concentrado 10 veces - Los compuestos que comprenden el reactivo conjugado enzimático son: 25% de etilenglicol, 0,01% de tiomersal, anticuerpo anti-cabra conjugado al mecanismo de detección, peroxidasa típicamente rábano picante (dilución aproximadamente 1 a 700), 0,1% albúmina de conejo, y 0,02% de gammaglobulina de conejo en PBS(pH 7,4).

Control negativo - Los compuestos que comprenden el control negativo para el equipo de valoración son un 1% de Igepal y un 0,01% de tiomersal en PBS(pH 7,4).

Control positivo - Los compuestos que comprenden el control positivo para el equipo de valoración son: 1% Igepal, 0,01% tiomersal, 1% albúmina de suero bovino, cultivo de VDB (dilución aproximadamente 1:20) y fluoruro de fenilmetilsulfonilo 50 \muM en PBS (pH 7,4).

Protocolo ELISA

Para realizar el ELISA el usuario debería emplear el número necesario de micropocillos de una o más de las placas suministradas de 96 pocillos. Los micropocillos de por sí pueden ser retirados de las placas suministradas, y los pocillos en exceso se deberían guardar para futuros ensayos. Los pocillos se humedecen previamente pipeteando 0,2 ml de tampón de lavado ELISA en cada pocillo; este tampón se debería retirar de los pocillos antes de añadir la muestra. Como con cada etapa de lavado, es importante retirar todo el tampón de lavado ELISA que se añade a los pocillos, asegurándose de que los pocillos no se secan entre etapas. Después pipetear 100 \mul de muestra o de control en cada pocillo.

Después de la adición de la muestra o del control, tapar los pocillos con la película transparente auto-adhesiva cortada al tamaño apropiado, e incubar los pocillos a temperatura ambiente durante 1 a 1,5 horas. Se debería preparar luego el reactivo detector de trabajo mezclando 1 parte del reactivo detector - concentrado 10 veces, 1 parte de reactivo NSB concentrado 10 veces, y 8 partes de tampón diluyente reactivo. El tampón diluyente reactivo se debería preparar en aproximadamente 1 hora de uso anticipado.

Después del periodo de incubación, retirar el líquido de los pocillos tal como se ha descrito antes y lavarlos añadiendo 0,2 ml de tampón de lavado ELISA a cada pocillo y luego desecharlos. Este proceso de lavado se debería repetir dos veces más hasta un total de tres lavados. Después de esta etapa, se deberían pipetear 0,1 ml de reactivo detector de trabajo en cada micropocillo de muestra y de control. Tapar los pocillos con la película adhesiva e incubar a temperatura ambiente durante 1 a 1,5 horas. Durante este tiempo, se debería preparar el reactivo conjugado enzimático de trabajo, mezclando 1 parte de reactivo conjugado enzimático - concentrado 10 veces, 1 parte de reactivo NSB- concentrado 10 veces, y 8 partes de tampón diluyente reactivo. El tampón diluyente reactivo se debería preparar aproximadamente 1 hora antes de su utilización. Después del periodo de incubación, retirar el líquido de los pocillos tal como se ha descrito antes, y lavar los pocillos un total de tres veces tal como se ha descrito. Después pipetear 0,1 ml de reactivo conjugado enzimático en cada micropocillo. Después de esto, se cubrirán los pocillos con la película adhesiva y se incubará a temperatura ambiente durante 1 a 1,5 horas. Mientras se realiza esta incubación recuperar el reactivo sustrato TMB y la solución de paro y dejar que se equilibren a temperatura ambiente o bien dejarlos a temperatura ambiente.

Después del periodo de incubación, retirar el líquido de los pocillos y lavar los pocillos un total de tres veces, tal como se ha descrito antes. Pipetear 0,1 ml de reactivo sustrato TMB en cada micropocillo. Para evitar la contaminación del sustrato TMB, se recomienda que la cantidad de TMB que se va a utilizar se vierta en un recipiente aparte para que pueda ser pipeteado y que cualquier TMB residual sea desechado antes que devuelto a su recipiente original. Una vez colocado el reactivo sustrato TMB en los pocillos, taparlos e incubar a temperatura ambiente (TA) en la oscuridad de 10 a 12 minutos. Después de este periodo de incubación, pipetear 0,1 ml de solución de paro en cada micropocillo, e incubar de nuevo a temperatura ambiente en la oscuridad de 5 a 10 minutos. Una vez completada esta incubación final, el estado del VDVB de las muestras está listo para ser leído a 450 nm, frente a un blanco de aire o agua en un lector de microplaca, u otro espectrofotómetro adecuado.

Con respecto al protocolo anterior, debería destacarse que para garantizar la exactitud y calidad de los resultados conseguidos, se deberían incluir ambos controles positivo y negativo en todo análisis ELISA. El equipo de análisis del antígeno del VDVB se debería almacenar a 2-8ºC para mantener su caducidad y eficacia el mayor tiempo
posible.

Reducción de datos ELISA

Los datos se reducen calculando primero la DO (densidad óptica) bruta media para cada muestra y control analizados. El valor medio de la DO obtenido para el Control Negativo se restará entonces de cada uno de los otros valores brutos hasta obtener unos valores blanco corregidos de DO para los correspondientes control positivo y muestra. Esta etapa elimina el ruido de fondo (debido a un enlace no específico del conjugado enzimático) de la señal específica. Una DO "normalizada" se calculará luego para cada muestra dividiendo la DO corregida por el blanco de dicha muestra por la DO "corregida por el blanco" del Control positivo. Normalizando los resultados de esta forma disminuye enormemente la variación. Los valores DO normalizados así obtenidos se comparan con las correspondientes directrices para determinar el estado del VDVB del animal, ver tabla 1, a continuación.

TABLA 1 Carta de densidades ópticas para la determinación del estado del VDVB

Valores DO "normalizados"	Estado VDVB
Menores a 0,20	VDVB negativo
0,20 a 0,39	"Zona gris"
Mayores a 0,39	VDVB POSITIVO

Con respecto a la comparación anterior, si se obtiene una DO "normalizada", es decir en la "zona gris", la muestra se debería volver a analizar usando los reactivos de trabajo estándar tal como se utilizaron con anterioridad y se debería analizar sin anticuerpo detector en el reactivo del anticuerpo detector de trabajo.

Esta DO bruta obtenida sin detector se debería restar de la DO bruta obtenida con detector; Luego esta diferencia se dividiría por la DO de la muestra en blanco del control positivo (la DO del control negativo se debería utilizar para comparar con el control positivo como siempre). Un valor nuevo normalizado inferior a 0,2 se consideraría el VDVB negativo, un valor DO normalizado nuevo de 0,2 o mayor se consideraría el VDVB positivo.

Control de calidad

Para mantener unos datos permanentemente fiables, los valores de DO bruta (por ejemplo, no comparados con el valor en blanco)obtenidos para el equipo con respecto a los controles negativo y positivo, se deberían mantener dentro de los márgenes que se indican en la tabla 2.

TABLA 2 Valores estándar de la densidad óptica no comparados con el valor blanco en cuanto a su fiabilidad

Valores de DO bruta
Control negativo	<0,5
Control positivo	>0,8

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TABLA 3 Resultados de ELISA en muestras de suero bovino usando la preparación 15.c.5 purificada como anticuerpo de captura en los micropocillos (se analizaba un total de 129 animales; Los resultados del aislamiento vírico se utilizaban como una determinación de referencia correcta)

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Resultados esperados

Para determinar la exactitud de la metodología ELISA se analizaron un total de 129 vacas domésticas en un estudio para la comparación de métodos. Este grupo incluía 104 muestras de VDVB negativo conocido y 25 muestras de VDVB positivo conocido, según se ha definido por el procedimiento de referencia de aislamiento del virus.

Usando los cortes de ELISA de la zona gris, positivo y negativo, descritos con anterioridad en la sección de Reducción de Datos, todos los animales con VDVB negativo daban resultados de ELISA negativos, como puede verse en la tabla 3. Un valor medio normalizado de la DO de 0,06 se obtenía con una desviación estándar de 0,03 para estas muestras de VDVB negativo. Los valores de la DO normalizados para estas muestras oscilaban entre 0,02 y 0,14, dando todas las muestras unos valores normalizados de DO inferiores a 0,20.

Veinticinco de las 25 muestras de VDVB positivo (según se ha definido en el Aislamiento del Virus de Referencia) eran positivas en el ELISA. Los valores de DO normalizados para estas 25 muestras positivas oscilaban entre 0,56 y 1,16, con un valor medio de 0,85 y una desviación estándar de 0,15.

Puesto que una infección aguda de VDVB puede dar lugar a la producción de antígenos víricos durante un breve periodo de tiempo, un resultado del VDVB positivo en la ELISA quizás no siempre será indicativo de un animal permanentemente infectado. Un diagnóstico definitivo de que un animal en particular está permanentemente infectado solamente se debería realizar después de tomar una segunda muestra del animal, al menos 3 semanas después de la muestra inicial y que la segunda muestra resulte ser también VDVB positiva.

De acuerdo con todo ello, se entiende que los modelos de invención que aquí se han descrito sean meramente ilustrativos de la aplicación de los principios de la invención. La referencia que aquí se hace a los detalles de los modelos ilustrados no pretenden limitar la finalidad de las reivindicaciones, que por sí solas mencionan aquellas características consideradas como esenciales para la invención.

Claims

1. Un método para detectar si un animal objetivo es positivo o negativo al virus de la diarrea vírica bovina, que comprende:

a): proporcionar al menos una muestra de dicho animal objetivo, donde dicha muestra se elige del grupo formado por el suero sanguíneo, los mocos, la leche, el plasma sanguíneo y la orina;

b): proporcionar un sistema de valoración que comprenda:

1): un anticuerpo de captura que es anticuerpo específico del epítopo del virus de la diarrea vírica bovina, estando dicho anticuerpo de captura inmovilizado sobre un soporte sólido y capaz de reconocer y enlazar una proteína o un fragmento proteínico de la misma del virus de la diarrea vírico bovino gp48 que retiene una especificidad antigénica;

2): un anticuerpo detector que es un anticuerpo del virus de la diarrea vírica anti-bovina, capaz de reconocer y enlazar dicha proteína o fragmento proteínico de la misma del virus de la diarrea vírico bovino gp48 que retiene una especificidad antigénica;

3): un sistema generador de señales para indicar la presencia de dicho anticuerpo detector asociado operativamente con el antígeno del virus de la diarrea vírica bovina, elegido de un anticuerpo primario, que está marcado directamente por un acoplamiento covalente, o bien un anticuerpo secundario marcado, específico para el anticuerpo primario, o un aglutinante secundario marcado, específico para el anticuerpo primario.

c): analizar la muestra con dicho sistema de valoración para generar un cambio de señal si el antígeno del virus de la diarrea vírico está presente en la muestra; y

d): comparar la señal con unos niveles de referencia para indicar si el animal objetivo es positivo o negativo al virus de la diarrea vírico bovino.

2. El método de la reivindicación 1, donde dicho sistema de valoración incluye una cantidad de dicho anticuerpo de captura, suficiente como para optimizar la detección de dicha proteína o fragmento proteínico del virus de la diarrea vírica bovina gp48 a partir de cómo mínimo una muestra tomada de dicho animal.

3. El método de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo específico del epítopo del virus de la diarrea vírica bovina es el anticuerpo monoclonal designado como 15.c.5.

4. El método de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo de captura es un anticuerpo policlonal o monoclonal.

5. El método de la reivindicación 1, donde el generador de señales tiene un marcador directamente conjugado a dicho anticuerpo detector.

6. El método de la reivindicación 1, donde dicho anticuerpo detector del virus de la diarrea vírica anti-bovino es un anticuerpo policlonal o monoclonal.

7. El método de la reivindicación 1, donde dicho generador de señales se elige del grupo formado por:

a): peroxidasa;

b): fosfatasa alcalina;

c): un fluoróforo;

d): una muestra quimioluminiscente

e): una muestra fluorescente de resolución en el tiempo;

f): una especie radiactiva;

g): partículas de oro coloidal;

h): látex plano;

i): peroxidasa de rábano picante; y

j): látex secado

8. El método de la reivindicación 7, donde el fluoróforo es la fluoresceína.

9. El método de la reivindicación 7, donde la muestra quimioluminiscente es un éster de acridinio.

10. El método de la reivindicación 7, donde la muestra fluorescente de resolución en el tiempo es un quelato de europio.

11. Un método de acuerdo con alguna de las anteriores reivindicaciones, donde el animal objetivo es el bovino.

12. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, donde dicho análisis se realiza con un anticuerpo policlonal.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, donde dicho análisis se realiza con un anticuerpo monoclonal.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 13, donde el anticuerpo monoclonal es el 15.c.5.

15. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, donde dicho análisis se realiza con un inmunoanálisis sándwich.

16. Un método para detectar si un animal objetivo es positivo o negativo al virus de la diarrea vírica bovina, mediante un ensayo competitivo que comprende

a): proporcionar al menos una muestra tomada de dicho animal objetivo, donde dicha muestra se selecciona del grupo formado por el suero sanguíneo, el moco, la leche, el plasma sanguíneo y la orina,

b): proporcionar un sistema de valoración que comprenda

(1): un anticuerpo monoclonal específico para el VDVB gp48, y

(2): un antígeno gp48 como agente detector o como agente de captura acoplado a una fase sólida,

(3): un sistema generador de señales para indicar la presencia del agente detector, asociado operativamente con el agente de captura, seleccionado a partir del agente detector, que está marcado directamente por un acoplamiento covalente, o bien un anticuerpo secundario marcado, específico para el agente detector, o bien un aglutinante secundario marcado, específico para el agente detector,

(4): analizar la muestra con dicho sistema de valoración para generar un cambio en la señal si el antígeno del virus de la diarrea vírico bovino está presente en la muestra.

17. El método de la reivindicación 16, donde dicho anticuerpo específico del epítopo del virus de la diarrea vírica bovina es el anticuerpo monoclonal designado como 15.c.5.

18. El método de la reivindicación 16, donde el generador de señales tiene un marcador directamente conjugado a dicho anticuerpo detector.

19. El método de la reivindicación 16, donde dicho generador de señales se selecciona a partir del grupo formado por:

a): peroxidasa;

b): fosfatasa alcalina;

c): un fluoróforo;

d): una muestra quimioluminiscente

e): una muestra fluorescente de resolución en el tiempo;

f): una especie radiactiva;

g): partículas de oro coloidal;

h): látex plano;

i): peroxidasa de rábano picante; y

j): látex secado.

20. El método de la reivindicación 19, donde el fluoróforo es la fluoresceína.

21. El método de la reivindicación 19, donde la muestra quimioluminiscente es un éster de acridinio.

22. El método de la reivindicación 19, donde la muestra fluorescente de resolución en el tiempo es un quelato de europio.

23. Un método de acuerdo con alguna de las reivindicaciones 16 a 22, donde el animal objetivo es bovino.