ES2320639T3 - Deteccion del virus de la diarrea viral bobina en muestras de pelo. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para detectar si un animal diana es positivo o negativo frente al virus de la diarrea vírica bovino, que comprende a) suministrar una muestra de pelo procedente de dicho animal diana, en el que dicho suministro de una muestra de pelo comprende suspender una muestra de pelo, o un material absorbente utilizado para limpiar pelo, procedente de dicho animal diana en un disolvente bajo condiciones eficaces para solubilizar cualquier proteína gp48 del virus de la diarrea vírica bovino o fragmentos de esta proteína que conserven la especificidad antigénica; b) proporcionar un sistema de ensayo que comprende: (1) un anticuerpo de captura que es un anticuerpo específico de epitopo del virus de la diarrea vírica bovino, en el que dicho anticuerpo de captura se inmoviliza sobre un soporte sólido y es capaz de reconocer y unirse a la proteína gp48 del virus de la diarrea vírica bovino o a fragmentos de esta proteína que conserven la especificidad antigénica; (2) un anticuerpo detector que es un anticuerpo anti-virus de la diarrea vírica bovino, capaz de reconocer y unirse a dicha proteína gp48 del virus de la diarrea vírica bovino o a fragmentos de esta proteína que conserven la especificidad antigénica; y (3) un generador de señales para indicar la presencia de dicho anticuerpo detector asociado operativamente con un antígeno del virus de la diarrea vírica bovino; c) analizar la muestra con dicho sistema de ensayo para generar un cambio en la señal si un antígeno del virus de la diarrea vírica bovino está presente en la muestra; y d) comparar la señal con uno o más niveles de referencia para indicar si el animal diana es positivo o negativo frente al virus de la diarrea vírica bovino.
Description
Detección del virus de la diarrea viral bobina
en muestras de pelo.
La presente invención se refiere a la detección
de una infección por el virus de la diarrea vírica bovino en
muestras de pelo procedentes de animales.
En la actualidad, el virus de la diarrea vírica
bovino ("BVDV") representa una amenaza importante para la
industria ganadera. Se ha descubierto que este patógeno, que fue
descrito por primera vez hace más de cincuenta años, es muy
virulento y se propaga con facilidad. Considerado uno de los
patógenos principales de los sistemas entérico, respiratorio,
reproductor e inmunológico bovinos, el BVDV sigue provocando
importantes pérdidas económicas en la industria ganadera de todo el
mundo. Se han producido brotes recientes en Canadá, EEUU y a lo
largo del mundo.
Clasificado como un miembro del género
Pestivirus de la familia Flaviviridae, el BVDV está
estrechamente relacionado con el virus de la enfermedad de la
frontera ovino ("BDV") y el virus del cólera porcino
("HCV"), siendo ambos pestivirus serológicamente relacionados.
La secuenciación genómica entera o parcial de aislados de
pestivirus ha permitido determinar que entre los pestivirus está
presente un alto grado de conservación de la secuencia. En fechas
más recientes se han identificado variantes antigénicos de BVDV, y
las cepas de BVDV se han dividido en dos genotipos diferenciados,
el tipo 1 y el tipo 2, que a su vez se han subdividido basándose en
la citopatogenicidad. La clonación molecular y la tecnología de la
reacción en cadena de polimerasa (PCR) han determinado que la
estructura general del BVDV consiste en una proteína de la cápsida y
tres glicoproteínas de la envuelta. El genoma de BVDV es un ARN de
12,3 kb que consiste en un único marco de lectura abierto ("open
reading frame", ORF). El mismo virus de BVD es un virus de ARN
con envuelta, pequeño, con polaridad de cadena positiva. Este
aspecto de cadena positiva del genoma vírico permite que el ARN sea
infeccioso, incluso en ausencia de proteínas del virión.
El BVDV se propaga a través de un rebaño de una
manera fecal-oral, atacando los sistemas entérico,
respiratorio, reproductor e inmunológico. La carga vírica necesaria
para provocar una infección sintomática se correlaciona con el tipo
y la cepa de virus BVD. Además, el BVDV tiene la capacidad de
infectar a los fetos atravesando la placenta, lo cual a menudo da
como resultado el aborto espontáneo del feto y una menor fertilidad
resultante entre los animales infectados. Las estrategias para el
control del BVDV varían desde unas prácticas de gestión más
rigurosas para intentar simplemente reducir las pérdidas económicas,
a unos procedimientos de ensayo complicados para identificar a los
animales infectados que aunque son eficaces implican unos costes
inaceptables. El fracaso de las vacunaciones en el terreno para el
BVDV ha incrementado la necesidad de un protocolo de ensayo que
ayude a identificar y a eliminar a los animales infectados de manera
barata.
Debe advertirse que el BVDV, al igual que otros
agentes de enfermedades infecciosas, está asociado con una amplia
variedad de manifestaciones clínicas, creando un desafío muy difícil
para el diagnóstico. Las manifestaciones habituales de una
infección por BVDV pueden incluir un aumento súbito de abortos,
infertilidad, ciclos de celo irregulares, muertes embriónicas
tempranas, momificación fetal, inmunosupresión, disentería,
trombocitopenia e hipoplasia cerebral. Además, estudios serológicos
han demostrado que un alto porcentaje de ganado infectado por BVDV,
incluyendo los considerados como persistentemente infectados (PI),
se mantienen clínicamente asintomáticos. Estas condiciones hacen
que sea imprescindible desarrollar un ensayo fiable, barato y que
sea fácil de usar para ayudar a la detección de animales infectados
por BVDV en rebaños de ganado.
El virus BVD se mantiene en un rebaño, de forma
típica, debido a la presencia de animales portadores PI
inmunotolerantes. Este ganado PI se expone al virus en el útero
pero puede mantenerse clínicamente asintomático durante toda su
vida, con lo que está produciendo constantemente materia fecal y
fluidos corporales con una alta concentración de virus y, con ello,
representa un peligro de infección para otros animales mientras
permanecen en el rebaño. El virus puede estar presente en más de la
mitad del ganado antes de que aparezcan señales de un brote. Los
síntomas de la enfermedad normalmente van precedidos de leucopenia,
y los intentos de desarrollar ensayos hasta la fecha se han
centrado en identificar este efecto.
Los anteriores brotes de BVDV han provocado unas
pérdidas económicas muy graves en la industria ganadera. Por
ejemplo, en 1993 en Ontario, los casos de BVDV aumentaron 23% en
menos de un año. También debe advertirse que aunque la asignación
histórica del BVDV a los pestivirus se produjo por la primera
especie con la que se descubrió que estaba asociado (por ejemplo,
ganado), ahora se sabe que los pestivirus pueden atravesar las
barreras entre especies. Esto indica que, en áreas en que los
rumiantes salvajes que deambulan libremente (por ejemplo, alces
americanos, búfalos, etc.) están expuestos a rebaños de ganado
infectado, estos animales también son susceptibles a una infección
por BVDV o, como alternativa, pueden actuar como reservorios de
virus capaces de infectar un rebaño previamente "limpio".
Se han vendido más de 150 vacunas para el BVDV a
los ganaderos a lo largo de los últimos treinta años. Estas vacunas
han consistido en virus BVD vivos modificados o en partículas
víricas y virus atenuados inactivados. A pesar del uso y la
disponibilidad de estas vacunas se han producido brotes recientes de
BVDV. Las actuales estrategias de vacunación implican una
inoculación de vacuna anual repetida al ganado, y se están dando más
pasos para intentar asegurar que no nazcan terneros portadores PI.
Sin embargo, para que sea posible un control eficaz del virus BVD
resulta fundamental identificar los animales PI y retirarlos del
rebaño. Se han desarrollado varios procedimientos de ensayo
diferentes para la detección de BVDV y/o la detección de animales
infectados por BVDV. Estos procedimientos de ensayo incluyen la
transcripción inversa-reacción en cadena de
polimerasa, el inmunoensayo de enzimas ligados (ELISA), las
técnicas convencionales de aislamiento de virus, y la
inmunohistoquímica (Haines et al., "Monoclonal
Antibody-Based Immunohistochemical Detection of
Bovine Viral Diarrhea Virus in Formalin-Fixed,
Paraffin-Embedded Tisúes", Vet. Pathol.,
29:27-32 (1992)).
Ambas técnicas de PCR y de aislamiento de virus,
debido a su sensibilidad inherente, son capaces de detectar niveles
muy bajos de BVDV. Sin embargo, estos procedimientos también
consumen mucho tiempo, son relativamente complejos y caros. La
inmunohistoquímica de muestras de tejidos, tales como muestras de
biopsias de muescas de oreja, es un técnica eficaz para detectar
animales PI. Sin embargo, esta técnica consume mucho tiempo,
requiere mucho trabajo y técnicos muy cualificados. La tecnología de
ELISA, aunque es un poco menos sensible, es más adecuada como
herramienta de diagnóstico de amplia base para detectar una
infección por BVDV en animales, porque es barata, produce
resultados en poco tiempo, y no requiere técnicos muy cualificados
ni instalaciones de laboratorio muy especializadas. Sin embargo,
los ensayos ELISA de captura de antígenos para BVDV se han basado
históricamente en el uso de extractos de leucocitos del animal que
se va a ensayar. Los extractos de leucocitos son necesarios porque
las proteínas del BVDV se acumulan en concentraciones relativamente
altas dentro de los leucocitos de los animales infectados, y los
procedimientos ELISA previos carecen de selectividad para detectar
sus proteínas de BVDV diana en el suero sanguíneo (Horner et
al., "Comparison of an Antigen Capture
Enzyme-Linked Assay with Reverse
Transcription-Polymerase Chain Reaction and Cell
Culture Immunoperoxidase Tests for the Diagnosis of Ruminant
Pestivirus Infections", Vet. Microbiol.,
43:75-84 (1995)). La preparación misma de extractos
de leucocitos consume mucho tiempo y es relativamente cara, lo cual
provoca que cualquier ensayo ELISA basado en esta extracción sea
también caro.
Debido a que los procedimientos mencionados
anteriormente para detectar una infección por BVDV en animales no
sólo consumen mucho tiempo sino que a menudo requieren instalaciones
de laboratorio sofisticadas y técnicos muy cualificados para
realizarlos, su coste resulta prohibitivo para ser utilizados de
forma amplia, tal como resulta necesario para la industria ganadera
actual.
En fechas más recientes se ha desarrollado un
ensayo ELISA más rápido y barato que detecta el BVDV de muestras de
suero, plasma, leche, orina o fluido mucosal utilizando un
anticuerpo monoclonal específico de proteínas o de fragmentos de
proteínas víricas de BVDV. Véase la patente de EEUU nº 6.174.667 y
el documento WO 99/15900 de Huchzermeier et al. Aunque este
procedimiento representa un avance frente a los procedimientos
previamente disponibles, las muestras de suero o de otros fluidos
corporales pueden ser difíciles de recoger y/o de manipular.
Baszler et al., Vet. Pathol., 32 (1995),
pp. 609-618, describen el diagnóstico de una
infección por el virus de la diarrea vírica bovino en muestras de
tejidos de rumiantes utilizando una inmunohistoquímica basada en
anticuerpos monoclonales.
Njaa et al., J. Vet. Diagn. Invest.
AAVLD, col., MO, EEUU, 12 (2000), pp. 393-399,
presentan un diagnóstico de una infección por el virus de la
diarrea vírica bovino utilizando especímenes de biopsia de piel. Se
encontró una tinción positiva principalmente en el epitelio de
folículos capilares y en las células de la matriz capilar del bulbo
capilar. No se toma pelo como muestra, sino las células (matriz
capilar) que forman las principales estructuras de la fibra
capilar.
Boxman et al., J. Clin. Microb., julio
1997, 37(7), pp. 2270-2273 describen la
detección del virus del papiloma humano en muestras de pelo. No se
menciona el virus de la diarrea vírica bovino.
La presente invención se dirige a solucionar los
anteriores defectos en la técnica.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para detectar si un animal diana es positivo o
negativo frente al virus de la diarrea vírica bovino. Este
procedimiento implica suministrar una muestra de pelo procedente de
un animal diana, en el que dicho suministro de una muestra de pelo
comprende suspender una muestra de pelo, o un material absorbente
utilizado para limpiar pelo, procedente de dicho animal diana en un
disolvente bajo condiciones eficaces para solubilizar cualquier
proteína gp48 del virus de la diarrea vírica bovino o fragmentos de
esta proteína que conserven la especificidad antigénica.
Se proporciona un sistema de ensayo que incluye:
(1) un anticuerpo de captura que es un anticuerpo específico de
epitopo del virus de la diarrea vírica bovino, en el que el
anticuerpo de captura se inmoviliza sobre un soporte sólido y es
capaz de reconocer y unirse a la proteína gp48 del virus de la
diarrea vírica bovino o a fragmentos de esta proteína que conserven
la especificidad antigénica; (2) un anticuerpo detector que es un
anticuerpo anti-virus de la diarrea vírica bovino,
capaz de reconocer y unirse a la proteína gp48 del virus de la
diarrea vírica bovino o a fragmentos de esta proteína que conserven
la especificidad antigénica; y (3) un generador de señales para
indicar la presencia del anticuerpo detector asociado operativamente
con un antígeno del virus de la diarrea vírica bovino. La muestra
se analiza con el sistema de ensayo para generar un cambio en la
señal si un antígeno del virus de la diarrea vírica bovino está
presente en la muestra. La señal se compara con uno o más niveles
de referencia para indicar si el animal diana es positivo o negativo
frente al virus de la diarrea vírica bovino.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento para detectar una infección por el virus de la
diarrea vírica bovino en un bovino. Este procedimiento implica
suministrar una muestra de pelo del bovino (como se indicó
anteriormente), poner en contacto la muestra con un reactivo
específico de la proteína gp48 del virus de la diarrea vírica
bovino, y analizar si el reactivo específico de la proteína gp48 del
virus de la diarrea vírica bovino se une a la proteína gp48 del
virus de la diarrea vírica bovino o a fragmentos de esta proteína
que conserven la especificidad antigénica procedentes de la
muestra.
El procedimiento tradicional para detectar
animales infectados por BVDV, incluyendo los portadores
persistentemente infectados (PI), ha sido a través del uso de
procedimientos de aislamiento de virus. Sin embargo, los
inmunoensayos para detectar antígenos víricos de BVD representan un
medio alternativo y barato para detectar una infección por BVDV, y
son capaces de producir resultados en poco tiempo (minutos u horas,
por ejemplo), y no requieren técnicos muy cualificados ni
instalaciones de laboratorio muy especializadas.
Los inmunoensayos de captura de antígenos para
la detección de antígenos de BVDV han utilizando predominantemente
muestras de sangre, bien extractos de leucocitos que requieren, de
forma típica, un procedimiento de preparación de muestras que
consume tiempo y requiere mucho trabajo, o bien, en fechas más
recientes, suero. Los virus BVD y los antígenos de BVDV son ubicuos
en todo el cuerpo de un animal infectado, en particular en un animal
portador PI y, por tanto, también pueden aislarse a partir de una
diversidad de tejidos del animal. Los inmunoensayos de captura de
antígenos para la detección de antígenos de BVDV en muestras de
tejidos han utilizado el antígeno vírico P80 como diana, y han
empleado un procedimiento de preparación de muestras largo para
aislar y para solubilizar el antígeno vírico P80 de las muestras de
tejidos. El antígeno vírico P80 fue el antígeno diana elegido
porque se sabe que está presente a concentraciones suficientemente
altas para ser detectado mediante un inmunoensayo dentro de las
células de animales infectados por BVDV. Los procedimientos previos
con tejidos implicaban tratar la muestra con un tampón que contenía
un agente de lisis celular, de forma típica un detergente, tal como
NP-40, seguido de una incubación durante
aproximadamente 2 horas y después una o dos centrifugaciones para
aclarar el extracto.
Por contraste, la presente invención utiliza un
inmunoensayo de captura de antígenos específico para el antígeno
vírico gp48 para detectar BVDV en una muestra de pelo sin la
necesidad de un procedimiento largo de preparación de muestras.
Además, el pelo de un animal puede obtenerse de forma no invasiva,
sin riesgo para el animal que se va a ensayar. Por tanto, la
presente invención representa un medio rápido, sencillo, barato, no
invasivo y seguro para ensayar un animal para detectar BVDV y es el
primer medio documentado para ensayar muestras de pelo para la
detección de antígenos de BVDV para detectar animales infectados por
BVDV.
Los procedimientos de inmunoensayo previos que
utilizan sangre o suero no pueden utilizarse con fiabilidad para
ensayar animales jóvenes menores de 3 meses por la potencial
interferencia con anticuerpos maternos. Por contraste, la presente
invención puede utilizarse con muestras de pelo como un medio fiable
para ensayar animales jóvenes menores de 3 meses para detectar la
presencia de BVDV. Estas muestras contienen el antígeno de BVDV
pero no contienen niveles suficientes de anticuerpos maternos para
interferir con el ensayo.
El procedimiento de la presente invención tiene
una mayor fiabilidad comparado con los anteriores ensayos ELISA y
muestra una excelente concordancia cuando se compara con los
procedimientos de referencia establecidos y convencionales para la
detección de BVDV (aislamiento vírico e inmunohistoquímica). El
procedimiento de la presente invención es fácil de usar, fiable,
rápido y barato. Además, el procedimiento de la invención ayudará a
los veterinarios en sus intentos para identificar animales
infectados por BVDV, en especial animales PI, y retirarlos de un
rebaño concreto. Esto, a su vez, protege a la industria ganadera
frente a una importante pérdida económica debido al BVDV. Puesto
que el BVDV puede afectar a otros rumiantes, este procedimiento
puede utilizarse con poblaciones de animales salvajes (por ejemplo,
ciervos, alces americanos, alces europeos) para determinar si son
positivos frente al BVDV. Como resultado, las poblaciones de
animales salvajes pueden gestionarse para ayudar a la eliminación
de reservorios de virus BVDV fuera de la población de ganado
doméstico.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para detectar si un animal diana es positivo o
negativo frente al virus de la diarrea vírica bovino. Este
procedimiento implica suministar una muestra de pelo (como se
indicó anteriormente) del animal diana. Se proporciona un sistema de
ensayo que incluye: (1) un anticuerpo de captura que es un
anticuerpo específico de epitopo del virus de la diarrea vírica
bovino, en el que el anticuerpo de captura se inmoviliza sobre un
soporte sólido y es capaz de reconocer y unirse a la proteína gp48
del virus de la diarrea vírica bovino o a fragmentos de esta
proteína que conserven la especificidad antigénica; (2) un
anticuerpo detector que es un anticuerpo anti-virus
de la diarrea vírica bovino, capaz de reconocer y unirse a la
proteína gp48 del virus de la diarrea vírica bovino o a fragmentos
de esta proteína que conserven la especificidad antigénica; y (3)
un generador de señales para indicar la presencia del anticuerpo
detector asociado operativamente con un antígeno del virus de la
diarrea vírica bovino. La muestra se analiza con el sistema de
ensayo para generar un cambio en la señal si un antígeno del virus
de la diarrea vírica bovino está presente en la muestra. La señal
se compara con uno o más niveles de referencia para indicar si el
animal diana es positivo o negativo frente al virus de la diarrea
vírica bovino.
La presente invención también se refiere a un
procedimiento para detectar una infección por el virus de la
diarrea vírica bovino en un bovino. Este procedimiento implica
suministrar una muestra de pelo del bovino (como se indicó
anteriormente), poner en contacto la muestra con un reactivo
específico de la proteína gp48 del virus de la diarrea vírica
bovino, y analizar si el reactivo específico de la proteína gp48 del
virus de la diarrea vírica bovino se une a la proteína gp48 del
virus de la diarrea vírica bovino o a fragmentos de esta proteína
que conserven la especificidad antigénica procedentes de la
muestra.
La presente invención puede realizarse con un
anticuerpo policlonal o con un anticuerpo monoclonal.
La producción de anticuerpos monoclonales puede
realizarse mediante técnicas que son muy conocidas en la técnica.
Básicamente, el proceso implica obtener en primer lugar células
inmunológicas (linfocitos) procedentes del bazo de un mamífero (por
ejemplo, un ratón) que se ha inmunizado previamente con el antígeno
de interés in vivo o in vitro. Los linfocitos que
segregan anticuerpos entonces se fusionan con células de mieloma
(de ratón) o células transformadas, que son capaces de replicarse
indefinidamente en un cultivo celular, produciendo, con ello, una
línea celular inmortal secretora de inmunoglobulinas. Las células
fusionadas resultantes, o hibridomas, se cultivan y las colonias
resultantes se seleccionan para la producción de los anticuerpos
monoclonales deseados. Las colonias que producen estos anticuerpos
se clonan y se cultivan in vivo o in vitro para
producir grandes cantidades de anticuerpos. Una descripción de la
base teórica y de la metodología práctica de la fusión de estas
células se indica en Kohler y Milstein, Nature, 256:495
(1975).
Los linfocitos inmunológicos se producen
mediante la inmunización in vivo del animal (por ejemplo, un
ratón) con la proteína o el polipéptido de interés. Estas
inmunizaciones se repiten según sea necesario a intervalos de hasta
varias semanas para obtener una valoración suficiente de
anticuerpos. Tras la última inmunización de refuerzo los animales
se sacrifican y se retiran las células del bazo.
La fusión con células de mieloma de mamífero o
con otros compañeros de fusión capaces de replicarse indefinidamente
en un cultivo celular se realiza mediante técnicas convencionales y
muy conocidas, por ejemplo, utilizando polietilenglicol (PEG) u
otros agentes de fusión (véase Milstein y Kohler, Eur. J.
Immunol., 6:511 (1976). Esta línea celular inmortal, que es
preferiblemente murina, pero que también puede derivarse de células
de otra especie de mamífero incluyendo, pero sin limitarse a ratas
y seres humanos, se selecciona para que sea deficiente en las
enzimas necesarias para la utilización de ciertos nutrientes, para
que sean capaces de un crecimiento rápido y para que tengan una
buena capacidad de fusión. Muchas de estas líneas celulares son muy
conocidas por los expertos en la técnica y otras se describen con
regularidad.
Los procedimientos para generar anticuerpos
policlonales también son muy conocidos. De forma típica, estos
anticuerpos pueden generarse administrando la proteína o el
polipéptido de interés por vía subcutánea a conejos blancos de
Nueva Zelanda que primero se han sangrado para obtener suero
preinmunológico. Los antígenos pueden inyectarse a un volumen total
de 100 \mul por sitio en seis sitios diferentes. Cada material
inyectado contendrá polioles plurónicos adyuvantes tensioactivos
sintéticos o gel de acrilamida pulverizado que contenga la proteína
o el polipéptido después de una electroforesis en gel de
acrilamida-SDS. Entonces los conejos se sangran dos
semanas después de la primera inyección y se inmunizan
periódicamente con el mismo antígeno tres veces cada seis semanas.
Después se recoge una muestra de suero 10 días después de cada
inmunización. Entonces los anticuerpos policlonales se recuperan
del suero mediante una cromatografía de afinidad que utilice el
correspondiente antígeno para capturar el anticuerpo. Por último,
los conejos se sacrifican con pentobarbital 150 mg/kg por vía
intravenosa. Este y otros procedimientos para generar anticuerpos
policlonales se describen en Harlow et al. (eds.),
Antibodies: A Laboratory Manual
(1988).
(1988).
Después de preparar los anticuerpos se pueden
marcar con radiomarcadores, marcadores fluorescents como
fluoresceína y rodamina, marcadores activos por resonancia
magnética nuclear, quimioluminiscentes como luciferina, y marcadores
enzimáticos como peroxidasa o fosfatasa. El anticuerpo puede
marcarse con estos reactivos utilizando técnicas conocidas en la
técnica. Por ejemplo, véase Wensel y Meares, Radioimmunoimaging
and Radioimmunotherapy, Elsevier, Nueva York (1983), para
técnicas relacionadas con el radiomarcaje de anticuerpos. Véase
también Colcher et al., "Use of Monoclonal Antibodies as
Radiopharmaceuticals for the Localization of Human Carcinoma
Xenografts in Athymic Mice", Meth. Enzymol.,
121:802-816 (1986).
Los animales infectados por BVDV se han
identificado previamente ensayando muestras de su sangre utilizando
un procedimiento de aislamiento de virus, que sólo puede ser
realizado por técnicos muy cualificados en instalaciones de
laboratorio muy especializadas. En fechas recientes, como medio
alternativo para detectar antígenos de BVDV en animales infectados,
se han desarrollado inmunoensayos de captura de antígenos para suero
u otras muestras de fluidos corporales que utilizan el anticuerpo
monoclonal específico de antígenos de BVDV 15.c.5, según se
describe en la patente de EEUU nº 6.174.667 de Huchzermeier et
al. El anticuerpo monoclonal 15.c.5 reconoce un epitopo de la
glicoproteína gp48 (denominado también "EO" o "E^{ms}")
de BVDV (Corapi et al., "Monoclonal Antibody Analysis of
Cytopathic and Noncytopathic Viruses from Fatal Bovine Viral
Diarrhea Virus Infections", J. Virol.,
62(8):2823-2827 (1988)), y un hibridoma de
ratón conocido como BVD MAB 15.C.5 se ha depositado en The American
Type Culture Collection, que ahora se encuentra en 10801 University
Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, con el nº de
registro ATCC PTA-716.
\newpage
La presente invención utiliza preferiblemente un
inmunoensayo de captura de antígenos para muestras de pelo que
emplea el anticuerpo monoclonal 15.c.5 e implica un procedimiento de
preparación y de recogida de muestras más sencillo, rápido, seguro
y barato que las técnicas de detección de BVDV convencionales.
El pelo del animal diana puede obtenerse
arrancando o cortando pelo de cualquier parte del animal. Como
alternativa, el pelo del animal puede limpiarse con un material
absorbente, como algodón, para recoger el antígeno gp48 de BVDV del
limpiado del pelo sin que sea necesario quitarle pelo al animal. La
muestra de pelo puede proporcionarse suspendiendo el pelo o el
material de limpieza del pelo en un disolvente, como un tampón
diluyente, durante un corto periodo de tiempo, para solubilizar
cualquier proteína gp48 de BVDV o sus fragmentos. El sobrenadante
entonces se ensaya para detectar la presencia del antígeno vírico
gp48. El volumen de muestra requerido para los objetivos de este
sistema de ensayo es al menos 100 \mul por pocillo. El
procedimiento de la presente invención puede utilizarse con
terneros jóvenes, lo cual es una ventaja frente al ELISA con
suero.
El sistema de ensayo de la presente invención
emplea preferiblemente un anticuerpo monoclonal específico del
antígeno de BVDV como anticuerpo de captura, con un anticuerpo
anti-BVDV policlonal de cabra como anticuerpo
detector, y un anticuerpo anti-cabra conjugado con
peroxidasa de rábano como conjugado. Los resultados del ensayo
puede determinarse mediante el uso de un espectrofotómetro de
microplacas en el que la densidad óptica se lee a 450
nanómetros.
El inmunoensayo con pelo de BVDV puede ser un
inmunoensayo de tipo "sándwich", que emplea un anticuerpo
específico de gp48 (como anticuerpo de captura o detector) y otro
anticuerpo específico de gp48 (como anticuerpo detector o de
captura que se complementa con el primer anticuerpo específico de
gp48), o un inmunoensayo de tipo competitivo, que emplea un
anticuerpo específico de gp48 con un antígeno gp48 marcado o un
antígeno gp48 unido a una fase sólida.
Es posible una diversidad de configuraciones y
formatos para cada tipo de inmunoensayo. El anticuerpo de captura,
por ejemplo, puede unirse a una diversidad de diferentes fases
sólidas para permitir el lavado de los reactivos de ensayo sin
reaccionar durante el desarrollo del ensayo. Éstos incluyen
micropocillos, tubos de ensayo revestidos, partículas magnéticas
revestidas, varillas o bastoncillos, y membranas (de nitrocelulosa y
otros).
El anticuerpo de captura, también denominado
anticuerpo primario, puede unirse mediante adsorción pasiva,
acoplamiento covalente, o utilizando una fase sólida prerrevestida
con un ligante secundario, como proteína A, proteína G, un
anticuerpo secundario específico para el anticuerpo primario,
avidina, o un anticuerpo específico para un ligando particular (es
decir, biotina, dinitrofenol, fluoresceína y otros). En el caso de
la avidina o de cualquiera de los anticuerpos específicos de
ligandos, resulta necesario unir covalentemente el ligando al
anticuerpo de captura.
Para un ensayo de tipo competitivo, el antígeno
de gp48 puede unirse a una fase sólida para la adsorción pasiva, el
acoplamiento covalente, o mediante el uso de una fase sólida
prerrevestida con un ligante secundario, tal como avidina, o un
anticuerpo específico para un ligando particular, como dinitrofenol,
fluoresceína y otros. En el caso de la avidina o de cualquiera de
los anticuerpos específicos de ligandos, resulta necesario unir
covalentemente el ligando al antígeno gp48.
Puede emplearse una diversidad de marcadores
(generadores de señales) en los inmunoensayos de tipo
"sándwich" o competitivos, incluyendo enzimas como peroxidasa,
peroxidasa de rábano o fosfatasa alcalina; fluoróforos como
fluoresceína y rodamina; sondas quimioluminiscentes como éster de
acridinio o luciferina; una sonda de resolución en el tiempo como
un quelado de europio; especies radiactivas como ^{14}C, ^{3}H,
^{35}S, ^{125}I, ^{32}P o ^{131}I; o partículas como oro
coloidal, látex simple o látex secado.
Los procedimientos para marcar anticuerpos con
isótopos radiactivos son, por lo general, conocidos en la técnica.
Los procedimientos para marcar con tritio se describen en la patente
de EEUU nº 4.302.438, que se incorpora en la presente como
referencia en su totalidad. La yodación, el marcaje con tritio y los
procedimientos para marcar con ^{35}S especialmente adaptados
para anticuerpos monoclonales murinos se describen en Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.
124-124, N.Y. Academic Press (1983), y las
referencias citadas en él. Otros procedimientos para yodar
anticuerpos se describen en Hunter y Greenwood, Nature,
144:945 (1962); David et al., Biochemistry,
13:1014-1021 (1974), y en las patentes de EEUU nº
3.867.517 y 4.376.110.
Pueden prepararse anticuerpos marcados con
fluoróforos y cromóforos a partir de restos convencionales conocidos
en la técnica. Puesto que los anticuerpos y otras proteínas
absorben luz que tiene una longitud de onda de hasta
aproximadamente 310 nm, los restos fluorescentes deben seleccionarse
para que tengan una absorción sustancial a unas longitudes de onda
por encima de 310 nm y preferiblemente por encima de 400 nm. Se
describe una diversidad de fluorescentes y cromóforos adecuados en
Stryer, Science, 162:526 (1968), y Brand et al., Annual
Review of Biochemistry, 41:843-868 (1972), que
se incorporan en la presente como referencia en su totalidad. Los
anticuerpos pueden marcarse con grupos cromóforos fluorescentes
mediante procedimientos convencionales, tales como los descritos en
las patentes de EEUU nº 3.940.475, 4.289.747 y 4.376.110, que se
incorporan en la presente como referencia en su totalidad.
Un grupo de fluorescentes que tiene la serie de
propiedades deseables descritas anteriormente son los tintes de
xanteno, que incluyen las fluoresceínas derivadas de
3,6-dihidroxi-9-fenilxanthidrol
y las resaminas y rodaminas derivadas de
3,6-diamino-9-fenilxanthidrol
y la rodamina B lisamina. Los derivados de rodamina y fluoresceína
de 9-o-carboxifenilxanthidrol tienen un grupo
9-o-carboxifenilo. Los compuestos de fluoresceína que tienen
grupos de acoplamiento reactivos, tales como grupos amino e
isotiocianato, como el isotiocianato de fluoresceína y la
fluorescamina, pueden adquirirse con facilidad. Otro grupo de
compuestos fluorescentes son las naftilaminas, que tienen un grupo
amino en la posición \alpha o \beta.
Los anticuerpos pueden marcarse con fluorocromos
o con cromóforos mediante los procedimientos descritos en Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp.
208-249, N.Y. Academic Press (1983), que se
incorpora en la presente por referencia en su totalidad.
El anticuerpo monoclonal específico de gp48 o el
anticuerpo anti-BVDV puede marcarse directamente
mediante acoplamiento covalente o un anticuerpo secundario marcado
que sea específico para el correspondiente anticuerpo primario
puede utilizarse sin necesidad de modificar químicamente el
anticuerpo primario. También puede emplearse un ligante secundario
marcado, como avidina o un anticuerpo marcado específico para un
ligando concreto (es decir, dinitrofenol, fluoresceína y otros). En
el caso de la avidina o de cualquiera de los anticuerpos específicos
de ligandos, resulta necesario unir covalentemente el
correspondiente ligando al anticuerpo primario.
Para un ensayo de tipo competitivo, el antígeno
gp48 puede marcarse directamente mediante un acoplamiento covalente
o puede emplearse un ligante secundario marcado, como avidina o un
anticuerpo marcado específico para un ligando particular (es decir,
dinitrofenol, fluoresceína y otros). En el caso de la avidina o de
cualquiera de los anticuerpos específicos de ligandos, resulta
necesario unir covalentemente el correspondiente ligando al antígeno
gp48.
En otra realización de la presente invención, el
sistema de ensayo incluye una cantidad del anticuerpo de captura
suficiente para optimizar la detección de la proteína gp48 de BVDV o
un fragmento de la proteína procedente de la muestra tomada del
animal diana. Además, la concentración del anticuerpo detector, el
conjugado anti-cabra concreto y su concentración,
la formulación del tampón diluyente del reactivo, la formulación del
reactivo de unión no específica (NSB), y el tipo de micropocillo
pueden optimizarse para producir el menor efecto de fondo y la
mayor proporción de señal frente al ruido. Además, la configuración
del reactivo (es decir, concentrados 10 x del reactivo detector,
del reactivo de conjugado enzimático y del reactivo NSB, con un
tampón diluyente del reactivo distinto) pueden diseñarse para
maximizar la estabilidad y la caducidad del kit.
Puede añadirse una pequeña cantidad de
gamma-globulina bovina al tampón diluyente del
reactivo utilizado para preparar las disoluciones de trabajo del
anticuerpo detector y del conjugado enzimático. Como resultado, la
señal de fondo disminuye significativamente.
Además, resulta ventajoso utilizar un anticuerpo
monoclonal purificado en lugar de una preparación de ascitis bruta
para el revestimiento de los pocillos para asegurar la coherencia
entre los lotes de microplacas revestidas. El problema de la alta
señal de fondo cuando se revisten los pocillos con 15.c.5 purificado
puede aliviarse mediante la adición de albúmina bovina al 15.c.5
purificado antes del revestimiento de los pocillos.
El procedimiento ELISA se realiza a temperatura
ambiente y tarda aproximadamente 4 horas en completarse, aunque no
requiere unas instalaciones de laboratorio muy especializadas.
Con respecto a los componentes del kit de
ensayo, cada kit contiene un control negativo y un control positivo.
Estos controles se incluyen dentro de cada ensayo para asegurarse
de que cada ensayo sea válido, y para ser utilizados en los
cálculos de reducción de datos (para "normalizar" los
resultados de las muestras). Estos controles, así como todos los
demás reactivos utilizados en el ensayo, se conservan con la adición
de timerosal.
Para minimizar los volúmenes necesarios de los
recipientes y para maximizar la estabilidad del kit, el reactivo
detector, el reactivo del conjugado enzimático, el reactivo de
inhibición de la unión no específica (por ejemplo, el reactivo
"NSB") y el tampón de lavado de ELISA pueden suministrarse como
10 x concentrados. El tampón diluyente del reactivo, el control
negativo, el control positivo, el reactivo de sustrato de
tetrametilbenzidina (TMB), y una disolución que detenga la reacción
(disolución de detención) pueden suministrarse en el kit en una
forma lista para utilizar sin necesidad de dilución. Las muestras
se ensayan en una de las dos placas de 96 pocillos suministradas en
el kit.
Otros compuestos o recursos necesarios para
realizar el sistema de ensayo del antígeno de BVDV incluyen, entre
otras cosas, agua desionizada, un lector de microplacas capaz de
realizar una lectura de densidad óptica (DO) a 450 nm, pipetas
serológicas, y pipeteadores de precisión.
Se proporcionan los siguientes ejemplos para
ilustrar las realizaciones de la presente invención, pero de ningún
modo pretenden limitar su alcance.
Los compuestos que forman el tampón de lavado de
ELISA son Tris HCl 0,1 M (6,25 Normal) para el ajuste del pH;
timerosal al 0,001% (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO); y Tween
20 al 0,5%.
Los compuestos que forman el reactivo detector
10 x concentrado son etilenglicol al 25%; timerosal al 0,01%;
anticuerpo anti-BVD de cabra aproximadamente al 5%;
y colorante alimentario amarillo al 0,06% en PBS (pH 7,4).
Los compuestos que forman el reactivo NSB 10 x
concentrado son etilenglicol al 25%; timerosal al 0,01%; IgG de
ratón al 0,2%; y colorante alimentario rojo al 0,06% en PBS (pH
7,4).
Los compuestos que forman el tampón diluyente
del reactivo son albúmina de suero bovina al 2,5%; timerosal al
0,01%; Igepal CA-630 al 0,625% (Sigma Chemical
Company, St. Louis, MO); y gamma-globulina bovina 2
\mug/ml en PBS (pH 7,4).
El sustrato de tetrametilbenzidina (TMB) está
disponible en el mercado. Los suministradores de este sustrato
incluyen BioFX Laboratories (Owing Mills, MD), Pierce Chemical Co.
(Rockford, Illinois), y Kirkegaard & Perry Laboratories
(Gaithersburg, MD).
La disolución de detención consiste en una
formulación ácida. Puede obtenerse, de forma típica, como un
reactivo listo para usar en BioFX Laboratories (Owing Mills,
MD).
Cada placa de 96 pocillos se reviste durante la
noche con 0,1 ml por pocillo de una disolución que contiene el
anticuerpo anti-BVDV, tal como 15.c.5 purificado
(puede obtenerse en el Laboratorio de Diagnóstico del Colegio de
Medicina Veterinaria, Universidad de Cornell, Itaca, Nueva York) a 5
\mug/ml y albúmina de suero bovina a 10 \mug/ml en tampón
carbonato (pH 9,6). Después del revestimiento, cada placa se lava
tres veces con tampón de lavado de ELISA y se deja secar durante la
noche a 4ºC. Se utiliza una bolsa de papel de aluminio para
envolver cada placa después del secado, y se incluye un secante
dentro de cada bolsa para eliminar la humedad.
Los compuestos que forman el reactivo de
conjugado enzimático 10 x concentrado son etilenglicol al 25%;
timerosal al 0,01%; anticuerpo anticabra conjugado con un mecanismo
de detección, de forma típica peroxidasa de rábano (a una dilución
de aproximadamente 1 a 700); albúmina de conejo al 0,1%; y
gamma-globulina de conejo al 0,02% en PBS (pH
7,4).
Los compuestos que forman el control negativo
para el kit de ensayo son Igepal CA-630 al 1%; y
timerosal al 0,01% en PBS (pH 7,4).
Los compuestos que forman el control positivo
para el kit de ensayo son Igepal CA-650 al 1%;
timerosal al 0,01%; albúmina de suero bovina al 1%; cultivo de BVDV
(diluido de forma apropiada); y fluoruro de
fenilmetilsulfonilo
50 \muM en PBS (pH 7,4).
50 \muM en PBS (pH 7,4).
Para realizar el ELISA, el usuario debe emplear
el número necesario de micropocillos de una o más de las placas de
96 pocillos suministradas. Los mismos micropocillos pueden retirarse
de las placas suministradas, y cualquier pocillo que sobre debe
guardarse para futuros ensayos. Los pocillos primero se prehumedecen
pipeteando 0,2 ml de tampón de lavado de ELISA en cada pocillo;
este tampón después debe retirarse o verterse fuera de los pocillos
antes de la adición de la muestra. Al igual que en cada una de las
etapas de lavado, es importante que se retire todo el tampón de
lavado de ELISA que se ha añadido a los pocillos, aunque también hay
que asegurarse de que los pocillos no se sequen entre las etapas.
Después se pipetean 100 \mul de la muestra o el control en cada
pocillo.
Después de la adición de la muestra o el control
se cubren los pocillos con una película transparente autoadhesiva
cortada con un tamaño apropiado y se incuban los pocillos a
temperatura ambiente durante 1 a 1,5 horas. Entonces debe
prepararse el reactivo detector de trabajo mezclando 1 parte del
reactivo detector 10 x concentrado, 1 parte del reactivo NSB 10 x
concentrado, y 8 partes del tampón diluyente del reactivo. El
reactivo detector de trabajo debe prepararse aproximadamente en la
hora previa al uso previsto y almacenarse a 4ºC.
Después del periodo de incubación se retira el
líquido de los pocillos como se describió anteriormente y los
pocillos se lavan añadiendo 0,2 ml de tampón de lavado de ELISA a
cada pocillo y después eliminando o vertiendo fuera el tampón de
lavado de ELISA. Este proceso de lavado debe repetirse dos veces más
para producir un total de tres lavados. Después de esta etapa debe
pipetearse 0,1 ml del reactivo detector de trabajo en cada
micropocillo de muestra y de control. Los pocillos se cubren con la
película adhesiva y se incuban a temperatura ambiente durante 1 a
1,5 horas. Durante este tiempo debe prepararse el reactivo de
conjugado enzimático de trabajo mezclando 1 parte del reactivo de
conjugado enzimático 10 x concentrado, 1 parte del reactivo NSB 10 x
concentrado, y 8 partes del tampón diluyente del reactivo. El
reactivo de conjugado enzimático de trabajo debe prepararse
aproximadamente en la hora previa al uso previsto y almacenarse a
4ºC. Después del periodo de incubación se retira el líquido de los
pocillos como se describió anteriormente, y los pocillos se lavan un
total de tres veces como se describió anteriormente. Después se
pipetea 0,1 ml del reactivo de conjugado enzimático de trabajo en
cada micropocillo. Tras terminar esto, los pocillos se cubren con
película adhesiva y se incuban a temperatura ambiente durante 1 a
1,5 horas. Mientras se está produciendo esta incubación se recuperan
el reactivo de sustrato de TMB y la disolución de detención y se
deja que se equilibren a temperatura ambiente o que permanezcan a
temperatura ambiente.
Después del periodo de incubación se retira el
líquido de los pocillos y los pocillos se lavan un total de tres
veces como se describió anteriormente. Se pipetea 0,1 ml del
reactivo de sustrato de TMB en cada micropocillo. Para evitar la
contaminación del sustrato de TMB se recomienda que la cantidad de
TMB que se va a utilizar se vierta desde su botella a un recipiente
diferente para pipetear y que el TMB que sobre se rechace, en lugar
de devolverlo a su recipiente original. Después de introducir el
reactivo de sustrato de TMB en los pocillos, los pocillos se cubren
y se incuban a temperatura ambiente en la oscuridad durante 10 a 12
minutos. Después de este periodo de incubación se pipetea 0,1 ml de
disolución de detención en cada micropocillo y de nuevo se incuban
los pocillos a temperatura ambiente en la oscuridad durante 5 a 10
minutos. Cuando se termina esta incubación final se determina la
absorbancia de cada pocillo a 450 nm frente a un blanco de aire o de
agua en un lector de microplacas u otro espectrofotómetro
adecuado.
Con respecto al anterior protocolo, debe
advertirse que para asegurar la precisión y la calidad de los
resultados alcanzados deben incluirse los controles positivo y
negativo en cada ensayo de ELISA. El mismo kit de ensayo de
antígenos de BVDV debe almacenarse a 2-8ºC para
mantener su caducidad y su eficacia el mayor tiempo posible.
Los datos se reducen calculando en primer lugar
la media de la DO (densidad óptica) bruta para cada control y
muestra ensayados. El valor medio de DO obtenido para el control
negativo entonces se resta de cada uno de los otros valores medios
de DO brutos para obtener valores de DO corregidos para blanco para
las correspondientes muestras y controles positivos. Esta etapa
elimina el ruido de fondo (debido a la unión no específica del
conjugado enzimático) de la señal específica. Entonces se calcula
una DO "normalizada" para cada muestra dividiendo la DO
corregida para blanco de la muestra entre la DO "corregida para
blanco" del control positivo. Normalizando los resultados de
esta manera disminuye en gran medida la variación entre ensayos. Los
valores de DO normalizados así obtenidos se comparan con las
siguientes pautas (tabla 1) para determinar el estado de BVDV del
animal.
\vskip1.000000\baselineskip
Con respecto a la anterior comparación, si se
obtiene una DO "normalizada" que se encuentra dentro de la
"zona gris", la muestra debe volver a ensayarse utilizando los
reactivos de trabajo patrones como se utilizaron previamente, y
también debe ensayarse sin anticuerpo detector en el reactivo de
anticuerpo detector de trabajo.
La DO bruta obtenida sin detector debe restarse
de la DO bruta obtenida con detector; esta diferencia entonces debe
dividirse entre la DO corregida para blanco del control positivo del
kit (la DO del control negativo del kit debe utilizarse para
corregir para blanco el control positivo del kit como habitualmente
se hace). Un nuevo valor normalizado menor que 0,2 debe
considerarse BVDV negativo y un nuevo valor de DO normalizado de 0,2
o mayor debe considerarse BVDV positivo.
Para que los datos sean coherentemente fiables,
los valores de DO brutos (es decir, no corregidos para blanco)
obtenidos para el kit (con respecto a los controles positivo y
negativo) deben estar en los intervalos que aparecen en la tabla
2.
\vskip1.000000\baselineskip
Se ensayaron muestras de pelo procedentes de
ocho animales con el ELISA de captura de antígenos de BVDV (ACE) y
los resultados se compararon con los ensayos de referencia
realizados con los mismos animales (aislamiento de virus, PCR, o
inmunoensayo de captura de antígenos en sangre, o inmunohistoquímica
en una muesca de oreja fijada distinta). Seis de los animales
sujeto fueron BVDV-positivos y dos fueron
BVDV-negativos mediante un procedimiento de
referencia. La correlación entre los resultados de pelo/ACE y los
resultados de referencia fue excelente.
\vskip1.000000\baselineskip
Puesto que una infección aguda por BVDV puede
dar como resultado la producción de antígenos víricos en poco
tiempo, un resultado BVDV-positivo en el ELISA no
siempre es indicativo de un animal persistentemente infectado. El
diagnóstico definitivo de que ese animal concreto está
persistentemente infectado sólo debe realizarse después de tomar
una segunda muestra del animal sujeto al menos 3 semanas después de
la muestra inicial, y esta segunda muestra también debe resultar
BVDV-positivo.
Aunque la invención se ha descrito en detalle
como ilustración, debe entenderse que este detalle sólo tiene este
objetivo y que los expertos en la técnica puede realizar variaciones
sin apartarse del alcance de la invención que se define mediante
las siguientes reivindicaciones.
Claims (18)
1. Un procedimiento para detectar si un animal
diana es positivo o negativo frente al virus de la diarrea vírica
bovino, que comprende
a) suministrar una muestra de pelo procedente de
dicho animal diana, en el que dicho suministro de una muestra de
pelo comprende suspender una muestra de pelo, o un material
absorbente utilizado para limpiar pelo, procedente de dicho animal
diana en un disolvente bajo condiciones eficaces para solubilizar
cualquier proteína gp48 del virus de la diarrea vírica bovino o
fragmentos de esta proteína que conserven la especificidad
antigénica;
b) proporcionar un sistema de ensayo que
comprende:
- (1)
- un anticuerpo de captura que es un anticuerpo específico de epitopo del virus de la diarrea vírica bovino, en el que dicho anticuerpo de captura se inmoviliza sobre un soporte sólido y es capaz de reconocer y unirse a la proteína gp48 del virus de la diarrea vírica bovino o a fragmentos de esta proteína que conserven la especificidad antigénica;
- (2)
- un anticuerpo detector que es un anticuerpo anti-virus de la diarrea vírica bovino, capaz de reconocer y unirse a dicha proteína gp48 del virus de la diarrea vírica bovino o a fragmentos de esta proteína que conserven la especificidad antigénica; y
- (3)
- un generador de señales para indicar la presencia de dicho anticuerpo detector asociado operativamente con un antígeno del virus de la diarrea vírica bovino;
c) analizar la muestra con dicho sistema de
ensayo para generar un cambio en la señal si un antígeno del virus
de la diarrea vírica bovino está presente en la muestra; y
d) comparar la señal con uno o más niveles de
referencia para indicar si el animal diana es positivo o negativo
frente al virus de la diarrea vírica bovino.
2. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho sistema de ensayo incluye una cantidad suficiente de
dicho anticuerpo de captura para optimizar la detección de dicha
proteína gp48 del virus de la diarrea vírica bovino o de dicho
fragmento de la proteína que conserva la especificidad antigénica,
en dicha muestra obtenida de dicho animal diana.
3. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho anticuerpo específico de epitopo del virus de la
diarrea vírica bovino es el anticuerpo monoclonal denominado
15.c.5.
4. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho anticuerpo de captura es un anticuerpo policlonal.
5. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho anticuerpo de captura es un anticuerpo monoclonal.
6. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho anticuerpo detector anti-virus de la
diarrea vírica bovino es un anticuerpo policlonal.
7. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho anticuerpo detector anti-virus de la
diarrea vírica bovino es un anticuerpo monoclonal.
8. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que el generador de señales tiene un marcador directamente
conjugado a dicho anticuerpo detector.
9. El procedimiento de la reivindicación 1, en
el que dicho generador de señales se selecciona del grupo que
consiste en peroxidasa, fosfatasa alcalina, un fluoróforo, una sonda
quimioluminiscente, una sonda de resolución en el tiempo, una
especie radiactiva, partículas de oro coloidal, látex simple,
peroxidasa de rábano, y látex secado.
10. El procedimiento de la reivindicación 9, en
el que el generador de señales es un fluoróforo de fluoresceína.
11. El procedimiento de la reivindicación 9, en
el que el generador de señales es un sonda quimioluminiscente de
éster de acridinio.
12. El procedimiento de la reivindicación 9, en
el que el generador de señales es una sonda de resolución en el
tiempo de quelado de europio.
13. Un procedimiento para detectar una infección
por virus de la diarrea vírica bovino en un bovino, que
comprende:
\newpage
suministrar una muestra de pelo del bovino, en
el que dicho suministro de una muestra de pelo comprende suspender
una muestra de pelo, o un material absorbente utilizado para limpiar
pelo, procedente de dicho bovino en un disolvente bajo condiciones
eficaces para solubilizar cualquier proteína gp48 del virus de la
diarrea vírica bovino o fragmentos de esta proteína que conserven
la especificidad antigénica;
poner en contacto la muestra con un reactivo
específico de la proteína gp48 del virus de la diarrea vírica
bovino; y
analizar si el reactivo específico de la
proteína gp48 del virus de la diarrea vírica bovino se une a la
proteína gp48 del virus de la diarrea vírica bovino o a fragmentos
de esta proteína que conserven la especificidad antigénica
procedentes de la muestra.
14. Un procedimiento según la reivindicación 13,
en el que dicho análisis se realiza con un anticuerpo
policlonal.
15. Un procedimiento según la reivindicación 13,
en el que dicho análisis se realiza con un anticuerpo
monoclonal.
16. Un procedimiento según la reivindicación 15,
en el que el anticuerpo monoclonal es 15.c.5.
17. Un procedimiento según la reivindicación 15,
en el que dicho análisis se realiza con un inmunoensayo de
"sándwich".
18. Un procedimiento según la reivindicación 15,
en el que dicho análisis se realiza con un inmunoensayo
competitivo.
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