ES2221865T3 - Vectores y procedimiento de produccion de proteinas recombinantes en hongos. - Google Patents
Vectores y procedimiento de produccion de proteinas recombinantes en hongos.Info
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Abstract
Vector de integración para la expresión de al menos una proteína en un organismo hospedador, en particular en un hongo, que comprende: a) al menos una secuencia de ADNr de levadura, b) al menos un gen marcador de la selección no-deficiente, y c) al menos una casete de expresión, donde la casete de expresión comprende un elemento promotor capaz de funcionar en el organismo hospedador, una zona de un gen heterólogo o genuino codificado para una proteína deseada, y un elemento terminador capaz de funcionar en el organismo hospedador, caracterizado porque al menos una secuencia de ADNr procede de una zona del ADNr de una levadura metilotrófica que comprende un fragmento de 400 bp de longitud de la zona 3'' del gen 25S-ADNr y un fragmento de 600 bp de longitud de la zona 5'' del gen 18S-ADNr, así como las secuencias situadas entre medias, incluida la secuencia 5S-ADNr.
Description
Vectores y procedimiento de producción de
proteínas recombinantes en hongos.
La presente invención se refiere a vectores de
integración para la integración selectiva y estable de ADN
heterólogo en el genoma de un organismo hospedador, en particular
de un hongo, así como a su aplicación. La invención se refiere
además a un procedimiento para la preparación de una o varias
proteínas recombinantes, utilizando para ello los vectores objeto
de la invención.
Los hongos y en particular las levaduras
representan sistemas atractivos para la producción de proteínas
recombinantes. Un representante destacado es la levadura
facultativamente metilotrófica Hansenula polymorpha que se
utiliza para la producción de sustancias farmacéuticas y de enzimas
industriales. La generación de cepas recombinantes de H.
polymorpha se realiza de forma rutinaria mediante vectores que
se integran en el genoma de la levadura. Debido a la localización
genómica del ADN heterólogo, las cepas recombinantes de H.
polymorpha se caracterizan por su elevada estabilidad mitótica.
Sin embargo, cada preparación de transformación da lugar a cepas
recombinantes diferentes, que se distinguen en cuanto al locus de
integración y el número de copias del ADN heterólogo integrado,
pudiendo variar el número de copias de 1 a 80. Dado que el locus de
integración es aleatorio, se supone, para la integración, una
recombinación no-homóloga en loci genéticos no
caracterizados con mayor precisión.
La integración selectiva de ADN heterólogo en el
genoma de H. polymorpha en cambio ha resultado ser muy
difícil. Muy recientemente se han descrito unas primeras
posibilidades para una integración homóloga selectiva en loci
genéticos definidos. Estos pocos ejemplos se limitan a una
preparación de integración-disrupción, en la que el
ADN recombinante se integró selectivamente en el locus MOX (Metanol
oxidasa) (Agaphonov y cols. 1995) o en secuencias HARS
asociadas en telómeros de H. polymorpha (Sohn vectores de
y cols. 1999).
Sería ventajosa una integración homóloga
selectiva en un locus genético que ofrezca buenas condiciones para
la expresibilidad. Esto es aplicable por lo general a aquellas
zonas de un cromosoma que contengan un gen muy expresivo, como por
ejemplo, el antes citado gen MOX. Para una integración
selectiva de secuencias ajenas se consideró además una zona del
genoma altamente expresiva que contiene los genes para los ARNs
ribosomales (los denominados ADNr).
Esta preparación se ensayó para dos clases de
levaduras, la levadura de cerveza Saccharomyces cerevisiae
(Lopes et al 1989, Lopes y cols. (1991) y la levadura
de la leche Kluyveromyces lactis (Bergkam y cols.
(1992). La integración se efectuó en estos casos mediante la
recombinación homóloga sirviéndose de fragmentos de ADNr del
huésped correspondiente. Las cepas recombinantes generadas de esta
manera contenían múltiples copias del ADN heterólogo, integradas en
el locus ADNr de los transformados. Se indicó como factor
importante, ineluddible, para la integración de vector en gran
número de copias, la presencia de un gen de complementación con un
promotor deficiente (es decir Leu2-d o
Ura3-d), con un alto efecto selectivo. La
combinación de un promotor deficiente y de un segmento de ADNr
definido resultó irrenunciable.
La generación de cepas recombinantes con
diferentes genes extraños en un número de copias deseado sólo se
podía hacer hasta ahora mediante fases de transformación sucesivas.
Para ello es preciso que los plásmidos utilizados presenten
diferentes genes marcadores de la selección. Ejemplos de esto son
las cepas para la co-expresión de los genes para el
antígeno HbsAg-L y HbsAg-S
(Janowicz y cols. 1991) para el desarrollo de una vacuna
contra la hepatitis B, o la co-expresión de dos
genes enzimáticos para el desarrollo de un biocatalizador
(Gellissen y cols. 1996). Existe por tanto la necesidad de
vectores que permitan la integración simultánea de diferentes
secuencias de ADN heterólogas en el genoma de un organismo
hospedador.
El objetivo de la invención es por lo tanto
facilitar otros vectores de integración que permitan integrar de
forma estable el ADN ajeno en gran número de copias en el genoma de
un organismo hospedador, y en caso de necesidad expresar diferentes
genes para la co-producción simultánea de diferentes
proteínas. Otro objetivo de la invención es el de facilitar unas
cepas de producción estables y un procedimiento para la preparación
de proteínas heterólogas.
Este objetivo se resuelve mediante un vector de
integración que comprende
a) al menos una secuencia de ADNr de
levadura,
b) al menos un gen marcador de la selección no
deficiente, y
c) al menos una casete de expresión,
donde la casete de expresión
comprende un elemento promotor capaz de funcionar en el organismo
hospedador, una zona de un gen heterólogo o genuino, codificada
para una proteína deseada y un elemento terminador capaz de
funcionar en el organismo hospedador, caracterizado porque al menos
una secuencia de ADNr procede de una zona del ADNr de una levadura
metilotrófica, que comprende un fragmento de 400 bp de longitud de
la zona 3' del gen 25S-ADNr y un fragmento de 600
bp de longitud de la zona 5' del gen 18S-ADNr, así
como las secuencias situadas entre medias, incluida la secuencia
5S-ADNr.
Sorprendentemente se ha comprobado que se puede
conseguir una integración Multi-Copy estable de un
vector de integración con al menos una secuencia de ADNr de
levadura, tal como se ha descrito anteriormente, renunciando a un
gen marcador de la selección deficiente, y que se pueden integrar
simultáneamente diversos vectores de integración con genes
marcadores idénticos no deficientes. Al efectuar la integración
simultánea de varios vectores se mantiene estable la estequiometría
mitótica. El establecimiento de un vector de levadura
"universal" basado en los nuevos elementos identificados
permite una amplia aplicación de la invención.
En el sentido de la invención se entiende por
"secuencia de ADNr de levadura" una secuencia derivada de un
tramo del genoma de una levadura que contiene los genes para los
ARNs ribosomales. Las secuencias de ADNr que se consideran para
realizar la invención proceden entre otras de las levaduras de las
especies Hansenula, Pichia, Saccharomyces, Kluyveromyces,
Candida, Schwanniomyces, Yarrowia, Arxula o Trichosporon
y en particular de las levaduras metilotróficas Hansenula
polymorpha y Pichia pastoris.
Un "gen marcador de la selección no
deficiente", tal como se utiliza aquí, se refiere a un gen cuyo
producto de proteína le confiere al organismo hospedador
determinadas características seleccionables que no poseía antes de
la transformación e integración del vector objeto de la invención o
de los vectores objeto de la invención (por ejemplo, resistencia
frente a un antibiótico, complementación de una auxotrofia), siendo
suficiente para un crecimiento normal del organismo hospedador la
actividad del producto codificado por una única copia del gen
marcador de la selección. Ejemplos de genes marcadores de la
selección no deficientes que se pueden considerar para realizar la
invención son entre otros los genes URA3, HIS3, ADE2, LYS2,
ARO7 y TRP1 de S. cerevisiae, así como el gen
LEU2 de H. polymorpha. Alternativamente se puede utilizar un
gen marcador de la selección dominante, como por ejemplo, el gen
bacteriano resistente a kanamicina.
"Casete de expresión", tal como aquí se
utiliza se refiere a un fragmento de ADN que se transcribe al menos
en un ARNm, que a continuación se traslada a un producto genético.
De acuerdo con la invención, la casete de expresión comprende un
elemento promotor que puede funcionar en el organismo hospedador,
una zona de un gen heterólogo codificada para una proteína deseada,
y un elemento terminador que puede funcionar en el organismo
hospedador. La casete de expresión puede contener además una
secuencia para un péptido de señalización y/o una secuencia
multienlace. Los anteriores componentes de una casete de expresión
pueden proceder de un solo gen o de diferentes genes.
Un "elemento promotor capaz de funcionar en el
organismo hospedador", tal como aquí se emplea, designa un
fragmento de ADN mediante el cual se establecen el punto de
iniciación y la frecuencia de iniciación de la transcripción
(síntesis de ARN) de un gen situado bajo control del elemento
promotor en el organismo hospedador. Los elementos promotores que
se pueden considerar para la realización de la invención incluyen
entre otros los promotores FMD, MOX, TPS1, PMA1 y DAS
de Hansenula polymorpha, los promotores MOX,
AOX1 y GAP1 de Pichia pastoris y los promotores
ADH1, PDC1, GAP1 y GUP1, de S. cerevisiae.
Un "gen heterólogo" tal como aquí se emplea
se refiere a un gen que procede de un organismo distinto al
organismo hospedador en el que se trata de ser expresado. Ejemplos
de genes heterólogos expresables son entre otros los genes de
insulina, fitasa, HGH, hirudina, lactorrefina o
G-CSF. Se designa como "gen genuino" en el
sentido de la invención un gen que procede de un organismo de la
misma especie que el organismo hospedador en el que se trata de
expresar el gen.
Un "elemento terminador capaz de funcionar en
el organismo hospedador" tal como aquí se emplea, designa un
fragmento de ADN que contiene estructuras de señalización para la
polimerasa ARN, que dan lugar a la terminación de la transcripción.
Ejemplos de elementos terminadores utilizables son el terminador
MOX o el PHO1 de H. polymorpha.
Como organismos hospedadores para la realización
de la presente invención se consideran en particular hongos, por
ejemplo, hongos filamentosos tales como por ejemplo, Aspergillus,
Neurospora, Mucor, Trichoderma, Acremonium, Sordaria y
Penicillium, o levaduras tales como Saccharomyces,
Hansenula, Pichia, Kluyveromyces, Schwanniomyces, Yarrowia, Arxula,
Trichosporon y Candida. El organismo hospedador en el
que tiene lugar la expresión de los genes heterólogos para la
preparación de una o varias proteínas para ayuda de los vectores de
integración conformes a la invención es preferentemente una
levadura, en particular una levadura metilotrófica. En la forma de
realización preferida de la invención se emplean los vectores de
integración objeto de la invención para la preparación de proteínas
en una levadura de la especie Hansenula, preferentemente
Hansenula polymorpha.
La secuencia de ADNr contenida en el vector
objeto de la invención está derivada de un tramo del genoma de una
levadura que contiene los genes para los ARNs ribosomales. Una
secuencia de ADNr de este tipo puede comprender por ejemplo un
tramo de aproximadamente 1 Kb de longitud de la zona 3' del gen
25S-ADNr y un tramo de aproximadamente 1 Kb de
longitud de la zona 5' del gen 18 S-ADNr, así como
las secuencias situadas entre medias, incluida la secuencia
5S-ADNr. Tal como aquí se emplean, las indicaciones
"tramo de la zona 3' del gen 25S-ADNr" y
"tramo de la zona 5' del gen 18S-ADNr" se
refieren a zonas codificadas del gen 25S-ADNr ó
18S-ADNr respectivamente. Un fragmento de ADNr que
se amplifica mediante PCR con el ADN genómico de una levadura, por
ejemplo, de una levadura metilotrófica tal como Hansenula
polymorpha, como matriz, y los cebadores A
(5'-ACG GGA TCC GGG TTT AGA CCG TCG TGA GAC
AGG-3'; SEQ ID NO. 2) y B (5'-CCT
GGA TCC TAC CAT CGA AAG TTG ATA GGG-3'; SEQ ID N0
3), y que se pueda obtener mediante digestión con la enzima de
restricción BamHI, también es adecuado como secuencia de
ADNr en el sentido de esta invención.
De acuerdo con la invención han resultado
especialmente ventajosos los vectores de integración en los que al
menos una secuencia de ADNr procede de la zona del ADNr de una
levadura metilotrófica, que comprende un fragmento de 400 pp de
longitud de la zona 3' del gen 25S-ADNr y un
fragmento de 600 bp de la zona 5' del gen 18S-ADNr,
así como las secuencias situadas entre medias, incluida la
secuencia 5S-ADNr. Tal como aquí se emplean, las
indicaciones "fragmento de la zona 3' del gen
25S-ADNr" y "fragmento de la zona 5' del gen
18S-ADNr" se refieren a zonas codificadas del
gen 25S-ADNr ó 18S-ADNr
respectivamente. Si se parte de una estructura de ADNr semejante a
la de Saccharomyces cerevisiae, entonces esta zona de
aproximadamente 3 Kb de longitud contiene una secuencia TOP, una o
varias secuencias HOT1 así como secuencias NTS1 y NTS2. Los vectores
objeto de la invención que contienen una secuencia de ADNr de este
tipo se integran de forma estable y en gran número de copias. Estas
secuencias de ADNr proceden preferentemente de Hansenula
polymorpha. Alternativamente se pueden utilizar secuencias de
ADNr procedentes de otras levaduras metilotróficas tales como
Pichia pastoris, Pichia methanolica o Candida
boidinii.
En una forma de realización preferida de la
invención, los vectores de integración objeto de la invención
comprenden al menos una secuencia de ADNr elegida de entre las
secuencias siguientes:
- a)
- una secuencia según la SEQ ID Nº 1;
- b)
- un fragmento de la secuencia según a), que sea adecuada para la integración estable de secuencias del vector en gran número de copias en el genoma de un organismo hospedador, en particular de una levadura;
- c)
- una secuencia que sea al menos un 70% idéntica con una secuencia según a) o b);
- d)
- una secuencia que sea al menos un 70% idéntica a una secuencia según a) o b) en la zona codificada del gen 5S (posiciones 956-1074 en la SEQ ID Nº 1) y/o en el tramo de la zona codificada del gen 25S (posiciones 1977-2420 en la SEQ ID Nº 1), contenido en la SEQ ID Nº 1;
- e)
- una secuencia que hibridiza con el contra-ramal de una secuencia según a) o b);
- f)
- un derivado de una secuencia según uno de los grupos a) a d) obtenido por sustitución, adición, inversión y/o supresión de una o varias bases, que sea adecuado para la integración estable de secuencias del vector en gran número de copias en el genoma de un organismo hospedador, en particular de una levadura, y
- g)
- una secuencia complementaria a una secuencia según uno de los grupos a) a f).
La secuencia de ADNr según la SEQ ID Nº 1 de 2,4
Kb de longitud, aislable como fragmento BamHI/EcoRI comprende
400 bp de la zona 3 del gen 25S-ADNr así como
secuencias TOP, HOT1, NTS1 y NTS2 que acompañan al gen
5S-ADNr. Para la realización de la invención se
pueden emplear también fragmentos de esta secuencia que son
adecuados para la integración estable de secuencias del vector en
gran número de copias en el genoma de un organismo hospedador, en
particular de una levadura, por ejemplo, un fragmento que no
contenga secuencias del gen 25S-ADNr, o un
fragmento que comprenda las secuencias TOP, HO1, NTS y 5S situadas
entre el extremo 3' del gen 25S y el extremo 5' del gen 5S. Para la
realización de la invención también se pueden tomar en consideración
fragmentos en los que falten una o varias de las secuencias HOT y/o
NTS, así como fragmentos en los que falte la secuencia TOP y/o la
secuencia 5S-ADNr. Pero como se supone que las
secuencias TOP y HOT son componentes importantes de la secuencia de
ADNr contenida en los vectores de integración objeto de la
invención, se prefieren fragmentos de la SEQ ID Nº 1 que contengan
al menos una secuencia TOP y al menos una secuencia HOT.
La expresión "integración estable", tal como
aquí se emplea, se refiere a una integración en la que el modelo de
restricción y el número de copias se mantiene esencialmente
inalterado después de al menos 100 generaciones de cultivo
permanente en un medio no selectivo.
La secuencia según el grupo d) es preferentemente
al menos un 80% idéntica, más preferentemente al menos un 90%
idéntica, con una secuencia según el grupo a) o b) en la zona
codificada del gen 5S (posiciones 956-1074 en la SEQ
ID Nº 1) y/o en el tramo de la zona codificada del gen 25S
(posiciones 1977-2420 en la SEQ ID Nº 1) contenido
en la SEQ ID Nº 1.
En el sentido de la invención las expresiones
"al menos un 70% idéntica", "al menos un 80% idéntica" y
"al menos un 90% idéntica" se refieren a identidad a nivel de
ADN, que se puede determinar aplicando procedimientos conocidos, por
ejemplo, la comparación de secuencias asistida por ordenador (Basic
local alignment search tool, S.F. Altschul y cols. J. Mol.
Biol. 215 (1990), 403-410).
La expresión "identidad" conocida para el
especialista se refiere al grado de parentesco entre dos o más
moléculas de ADN, que se determina por la coincidencia entre las
secuencias. El porcentaje de "identidad" viene dado por el
porcentaje de zonas idénticas en dos o más secuencias, teniendo en
cuenta los huecos u otras peculiaridades de la secuencia.
La identidad entre sí de moléculas de ADN
emparentadas se puede determinar sirviéndose de procedimientos
conocidos. Por lo general se utilizarán programas informáticos
especiales con algoritmos que tengan en cuenta los requisitos
especiales. Los procedimientos preferidos para determinar la
identidad generan primeramente la mayor coincidencia entre las
secuencias investigadas. Los programas informáticos para determinar
la identidad entre dos secuencias comprenden, pero no se limitan a
ello, el paquete de programas GCG, incluyendo GAP (Devereux, J.
y cols., Nucleic Acids Research 12(12): 387 (1984);
Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (WI));
BLASTP, BLASTN y FASTA (Altschul, S. y cols., J. Molec.
Biol. 215:403/410 (1990)). El programa BLAST X se puede obtener del
National Centre for Biotechnology Information (NCBI) y de otras
fuentes (Manual BLAST, Altschul S., y cols., NCB NLM NIH
Bethesda MD 20884; Altschul, S. y cols., J. Mol. 215:403/410
(1990)). Para determinar la identidad también se puede emplear el
conocido algoritm Smith Waterman.
Los parámetros preferidos para la comparación de
secuencias comprenden los siguientes:
| Algoritmo: | Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970) |
| Matriz de comparación: | Coincidencia (matches) = +10 |
| No coincidencia (mismatch) = 0 | |
| Valor de huecos (Gap Penalty): | 15 |
| Valor de longitud de huecos | |
| (Gap Length Penalty): | 1 |
El programa GAP también es adecuado para ser
utilizado con los parámetros anteriores. Los parámetros anteriores
son los parámetros estándar (parámetros por defecto) para las
comparaciones de la secuencia de ácido nucleico.
Pueden utilizarse a título de ejemplo otros
algoritmos, valores de apertura de huecos (gap opening penalties),
valores de extensión de huecos (gap extensión penalties), matrices
de comparación incluidas las citadas en el manual de programas,
paquete Wisconsin, Versión 9, Septiembre 1997. La elección dependerá
de la comparación que se vaya a realizar, y además, si la
comparación se realiza entre parejas de secuencias, para lo cual se
prefiere GAP o Best Fit, o entre una secuencia y una base de datos
de secuencias voluminosa, en cuyo caso se prefieren FASTA o
BLAST.
La característica "secuencia que hibridiza con
la cadena inversa de una secuencia según a) o d)" se refiere a
una secuencia que hibridiza en condiciones rigurosas con la cadena
inversa de una secuencia que tenga las características indicadas
bajo a) o b). Por ejemplo, las hibridizaciones se pueden realizar a
68ºC en 2 x SSC o según el protocolo del
Dioxygenin-Labelling-Kits de la
Firma Boehringer (Mannheim).
En una forma de realización de la invención, los
vectores de integración objeto de la invención comprenden un gen
marcador de la selección adicional para E. coli, por ejemplo
un gen resistente a la ampicilina, un gen resistente a la
tetraciclina o un gen resistente a kanamicina. Como gen marcador de
la selección para E. coli se puede considerar también el gen
URA-3 de S. cerevisiae, que permite
una selección de transformandos de la cepa E. coli
Uracil-auxotrófica MC1066.
Los vectores objeto de la invención tienen
preferentemente una longitud de 7 a 12 Kb. Estos vectores se pueden
manejar bien en E. coli y permiten una transformación sin
problemas de la levadura.
Los vectores de integración objeto de la
invención pueden contener secuencias que codifiquen uno o varios
polipéptidos, que permiten una mejor segregación de una proteína
secretora recombinante co-integrada de un organismo
hospedador. Tales secuencias son por ejemplo, secuencias que
codifican un polipéptido con la actividad biológica de una
proteinacinasa dependiente de Ca^{2+}/calmodulina y/o un
polipéptido con la actividad biológica de un factor de iniciación de
traslación 4E (elF4E), y en particular, secuencias que comprenden
la zona codificada del gen CMK2 y/o la zona codificada del
gen CDC33 de Saccharomyces cerevisiae, y que
codifican la proteína CMK2 y/o elF4E íntegra. Las secuencias que
codifican los polipéptidos que contribuyen a superar los cuellos de
botella que surgen durante la segregación de una proteína de una
célula eucarióntica se pueden identificar por el procedimiento
descrito en la patente DE 199 20 712 A1.
La invención también facilita un organismo
hospedador que comprende al menos un vector de integración conforme
a la invención, integrado de forma estable en el genoma. El
organismo hospedador puede ser un hongo filamentoso, por ejemplo un
hongo de las especies Aspergillus, Neurospora, Mucor,
Trichoderma, Acremonium, Sordaria o Penicillium. El
organismo hospedador es preferentemente una levadura,
preferentemente una levadura de las especies Hansenula, Pichia,
Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Schwanniomyces, Yarrowia,
Arxula o Trichosporon. En una forma de realización de la
invención, el organismo hospedador es una levadura metilotrófica,
preferentemente una levadura de la especie Hansenula; se
prefiere especialmente como organismo hospedador la levadura
metilotrófica Hansenula polymorpha.
La invención facilita además un organismo
hospedador que se puede obtener por integración estable de uno o
varios vectores de integración conforme a la invención, en el
genoma de un hongo. El organismo hospedador puede ser un hongo
filamentoso, preferentemente un hongo de la especie Aspergillus,
Neurospora, Mucor, Trichoderma, Acremonium, Sordaria o
Penicillium, o una levadura. La levadura pertenece
preferentemente a la especie Hansenula, Pichia, Saccharomyuces,
Kluyveromyces, Candida, Schwanniomyces, Yarrovia, Arxula o
Trichosporon. En una forma especialmente preferida de la
invención, la levadura es una levadura metilotrófica; se prefiere
especialmente la levadura metilotrófica Hansenula
polymorpha. En una forma de realización especial de la
invención, el organismo hospedador se puede obtener mediante la
integración estable de varios factores, que comprenden casetes de
expresión diferentes entre sí.
La invención facilita además un procedimiento
para la preparación de una o varias proteínas en un microorganismo
eucarióntico. De acuerdo con la invención se cultiva para ello de
forma conocida un organismo hospedador objeto de la invención, y se
obtiene la proteína generada.
La invención comprende también la utilización de
los factores de integración y organismos hospedadores objeto de la
invención para la preparación de una o varias proteínas.
Las siguientes figuras y ejemplos describen la
invención.
La figura 1 muestra la organización de una unidad
ADNr de S. cerevisiae (A) y Hansenula polymorpha (B)
así como una posición derivada de éstas de la secuencia clonada de
ADNr (SEQ ID Nº 1) en una unidad ADNr de Hansenula
polymorpha. Las flechas grises señalan el sentido de
transcripción de los genes ADNr. Los recuadros de trazos
identifican el amplificado primario y la secuencia de integración
utilizada en los vectores de integración, estando la representación
fuera de escala. NTS = Non transcribed spacer; 5S = 5S- ADNr; HOT =
Hot spot of recombination; TOP = Punto de enlace de topoisomerasa.
(A) la unidad ADNr de S. cerevisiae según Lopes et.
al. (1996). (B) Posición del amplificado primario. Los
cebadores homólogos a S. cerevisiae enlazan con el
25S-ADNr (cebador A) altamente conservado y con el
extremo 5' de 18S-ADNr (cebador B), dentro de la
unidad ADNr de H. polymorpha. Las flechas negras marcan el
amplificado PCR primario. (C) Posición de la secuencia de
integración (SEQ ID Nº 1) de 2,4 Kb de longitud en la unidad ADNr de
H. polymorpha. Esta secuencia incluye el gen 5S, la secuencia
NTS1 y zonas parciales de la secuencia NTS2 y de la secuencia
25S.
La figura 2 representa la secuencia de ADNr de
2,4 Kb de longitud de un elemento de integración (SEQ ID Nº 1) de un
vector de integración ADNr conforme a la invención. La zona de
5S-ADNr está sombreada de gris.
La figura 3 representa el vector de integración
ADNr pM2.
La figura 4 representa el vector de integración
ADNr pM2\Delta.
La figura 5 representa pM2ZT (lacZ,
Promotor TPS1), un vector de integración ADNr para la
expresión de lacZ en H. polymorpha,
La figura 6 representa pM2GT (GFP3,
Promotor TPS1), un vector de integración ADNr para la
expresión GFP en H. polymorpha.
La figura 7 muestra el resultado de un análisis
Southern Blot para demostrar la integración de pB14 en el
ADNr de H. Polymorpha.
La figura 8 muestra un modelo para la integración
de un vector de integración ADNr (pB14) en el ADN. La figura muestra
la correspondencia de los fragmentos del análisis
Southern-Blot en la figura 7. A partir del punto de
restricción para Bg/II y de las longitudes conocidas de los
fragmentos de fusión procedentes de ADN y ADNr heterólogos se
deduce la correspondencia de las longitudes de fragmentos del
análisis Southern Blot.
La figura 9 muestra el resultado del análisis
Southern Blot para una selección de cepas recombinantes
después de la transformación de RB11 con tres vectores
diferentes.
La figura 10 muestra el resultado de un análisis
Southern Blot para la determinación del número de copias de
los vectores co-integrados en la cepa recombinante
RB3T-19.
La figura 11 muestra el resultado de un análisis
Southern Blot para la demostración de la estabilidad mitótica
de la cepa recombinante RB3T-19. Las cifras indican
la fecha de la toma de muestras.
La figura 12 muestra un análisis Southern
Blot de cuatro cepas recombinantes que se generaron por
transformación simultánea con cinco vectores. Tres de estas cepas
contienen secuencias de al menos un vector de integración ADNr.
La figura 13 muestra la expresión de lacZ
controlada por el promotor TPS1 en cepas recombinantes de
H. polymorpha. Las colonias van numeradas consecutivamente
desde arriba a la izquierda hasta abajo a la derecha.
La figura 14 muestra la identificación de cepas
recombinantes segregadoras de insulina de H. polymorpha en un
ensayo de filtro inmunológico. Las cifras que figuran en los
filtros corresponden a los números de las cepas recombinantes. El
filtro A muestra las cepas RB4T 1-66.
El control positivo se encuentra en la posición
67. El filtro B muestra las cepas RB4T 67-132. El
control positivo se encuentra en la posición 133.
| amp | Ampicilina |
| amp^{(R)} | Resistencia a la ampicilina |
| ARS | Autonomously Replicating Sequence |
| BSA | Albúmina de suero bovino (Bovine Serum Albumin) |
| Bp | Pares de bases |
| ADN | Ácido desoxirribonucleico |
| DTT | Ditiotreitol |
| EDTA | Ácido etilendiamintetraacético |
| ELISA | Enzyme Linked Immuno Assay |
| FMD | Gen para la formiato-deshidrogenasa |
| HARS | H. polymorpha Autonomously Replicating Sequences |
| HOT | Hot spot of recombination |
| Kb | Kilopares de bases |
| LB | Luria-Broth-Medium |
| MOX | Gen para la metanol-oxidasa de Hansenula polymorpha |
| NTS | Non-transcribed spacer |
| ORI | Origen de replicación de un plásmido (origin of replication) |
| OD_{x} | Densidad óptica para una longitud de onda _{x}nm |
| PCR | Polymerase Chain Reaction |
| pH | potentia Hydrogenii |
| ADNr | ADN ribosomal |
| ARNr | ARN ribosomal |
| rpm | Revoluciones por minuto (rounds per minute) |
| SDS | Dodecilsulfato sódico (Sodium Dodecyl Sulphate) |
| TOP | Punto de enlace de topoisomerasa |
| TPS1 | Gen para trehalosis-6-fosfato-sintasa |
| Tris | Tris-(hydroximetil)-metilamina |
| ÜK | Cultivo durante la noche |
| X-Gal | 5-bromo-4-cloro-3-indolil-\beta-D-galactopiranosida |
| YNB | Yeast Nitrogen Base (Medio de selección sin Uracil) |
| YPD | Medio completo |
A menos que se mencione especialmente, los
productos químicos se obtuvieron de los siguientes fabricantes:
Acros Organix (New Jersey); Amersham International plc.
(Buckinghamshire, Inglaterra); Baker (Deventer, Países Bajos),
Biorad (Richmond, EEUU); Biozym (Hess. Oldendorf); Caesar &
Loretz GmbH (Hilden); Difco-Laboratories (Detroit,
EEUU); Fluka AG (Basilea, Suiza), Gibco (Paisly, Escocia); Janssen
(Beerse, Bélgica); Merck (Darmstadt); Oxoid Ltd. (Basingstone,
Inglaterra); Pharmacia (Friburgo); Reidel de Haen (Suiza); Roth
(Karlsruhe); Serva (Heidelberg); Sigma (St. Louis, EEUU); las
enzimas de restricción fueron obtenidas de los fabricantes
Boehringer (Mannheim), Gibco BRL (Paisly, Escocia) y New England
Biolabs (Schwalmbach). Se trabajó con los tampones respectivos
suministrados. La enzima Zymoliasa fue obtenida de Seikaguko Corp.
Las preparaciones de ADN se realizaron mediante diversos kits de
aislamiento de ADN de la Firma Quiagen (Hilden), siguiendo las
instrucciones del fabricante.
| 3.1 | E. coli | |
| DH5\alphaF' | F'end-A1hsd-R17r_{k}m_{k}+supE44thi-1recA1gyra relA(lacZYA-argF) | |
| U169(\phi80\Delta(lacZ)M15) (Gibco BRL, (Gaithersburg MD, EEUU) | ||
| MC 1066: | \Delta(lacl POZYA) \Delta74, galU, galK, strA^{-} usdR^{-}, tripC 9830, leu B6, pyr | |
| F74::Tn5 (Km^{r}) (Casadaban y cols.) | ||
| 3.2 | H. polymorpha | RB11 odc1 Orotidin-5-fosfato-decarboxilasa-deficiente (Uracil-auxotrófica) cepa |
| H. polymorpha (Weydermann y cols. 1995). |
Medio completo: 2% glucosa o glicerina, 1%
extracto de levadura, 2% bacto-peptona.
Medio de selección: 0,17% Yeast Nitrogen Base,
0,5% sulfato de amonio, 2% glucosa o glicerol, 38,4 mg/l arginina,
57,6 g/l isoleucina, 48 mg/l fenilalanina, 57,6 mg/l valina, 6
mg/ml trilonina, 50 mg/l inoxitol, 40 mg/l triptofano, 15 mg/l
tiroxina, 60 mg/l leucina, 4 mg/l histidina. En el medio de
selección falta el Uracil.
Luria Broth-Medium (LB): 10 g/l
hidrolisado de caseina (peptona Nº 140, Gibco), 5 g/l extracto de
levadura, 5 g/l NaCl. Como antibiótico se añadió ampicilina (Roth)
en una concentración de 500 mg/l, después del tratamiento en
autoclave.
Medio M9: 2% glucosa, 30 g/l Na_{2}HPO_{4},
15 g/l KH_{2}PO_{4}, 5 g/l NH_{4}Cl, 2,5 g/l NaCl, 0,015 g/l
CaCl_{2}, 2,28 g/l MgSO_{4}, 0,05% vitamina B1 (no tratada en
autoclave), 38,4 mg/l arginina, 57,6 mg/l isoleucina, 48 mg/l
fenilalanina, 57,6 mg/l valina, 6 mg/ml treonina, 50 mg/l inositol,
40 mg/l triptofano, 15 mg/l tirosina, 60 mg/l leucina, 4 mg/l
histidina.
Los fondos de cultivo sólidos se prepararon
añadiendo 1,6% agar a los medios líquidos.
En un Personal Cycler (Biometra, Göttingen) se
efectuaron reacciones PCR con el
PC-Long-Expand-Kit o
el
PCR-High-Fidelity-Kit
de la Firma Boehringer (Mannheim) en preparaciones de 50 \mul. La
depuración de los productos se realizó mediante el
PCR-Purification-Kit de la Firma
Qiagen (Hilden), siguiendo las instrucciones del fabricante.
400 ml de LB-Medium se inocularon
diluidos 1:100 desde un ÜK y se cultivaron a 37ºC hasta una
OD_{600} de 0,5-1. Después de 30 minutos de
incubación sobre hielo se centrifugó el cultivo a 4ºC y 3000 rpm
durante 15 minutos. Las células se lavaron dos veces con agua
helada (1 Vol./1/4 Vol.) y una vez con 1/50 Vol de glicerina al
10%. A continuación se recogió el pellet de células en 1,5 ml de
glicerina al 10% y se conservaron partes alícuotas de 40 \mul a
-70ºC. Para la transformación se descongeló sobre hielo una parte
alicuota y se transformó con 0,01-1 \mug de
Plasmid-ADN con un pulsador de genes (Bio Rad) a 1,6
kV, 25 \muF y 200 ohmios en una cubeta de 1 mm. A continuación se
incubaron las células para su recuperación durante
30-45 minutos a 37ºC en 1 ml de
LB-Medium, y a continuación se extendieron sobre
placas LB-amp. Las placas se incubaron a 37ºC.
La transformación de las células RbCl_{2} se
efectuó de acuerdo con el protocolo de Hanahan (1985). Por cada
transformación se mezclaron 20-500 ng de ADN con
200 \mul de células competentes descongeladas sobre hielo. Después
de 20 minutos de incubación sobre hielo, 45 segundos de choque
térmico (42ºC) y nueva incubación durante 2 minutos sobre hielo se
combinaron las células para su recuperación con 1 ml de
LB-Medium y se incubaron durante
30-45 minutos a 37ºC. A continuación se extendieron
las células sobre placas LB-amp que luego se
incubaron durante la noche a 37ºC.
100 ml YPD se inocularon con 5 ml de un ÜK de
crecimiento denso. El cultivo se agitó a 37ºC hasta obtener una
OD_{600} de 0,8-1,2 (aprox. 3 horas). Las células
se cosecharon mediante centrifugado a 3000 rpm y se volvieron a
suspender en 20 ml de tampón KP_{i} (50 mM/pH 7,5). Después de
añadir 0,5 ml de DTT y de agitar durante 15 minutos a 37ºC se
separaron las células por centrifugado a 2500 rpm y se lavaron dos
veces con tampón STM (270 mM sacarosa, 10 mM TrisCl, 1 mM
MgCl_{2}, pH 7,5). A continuación se recogieron las células en
0,25 ml de tampón STM y se almacenaron partes alicuotas de 60 \mul
a -70ºC. Para la transformación con vectores de integración ADNr se
linealizó en primer lugar el plásmido-ADN mediante
Xhol o Sacl. Se mezclaron 0,1-1 \mug
del ADN plásmido linealizado con células frescas competentes
descongeladas sobre hielo y se echaron a continuación estas
preparaciones en 2 ml en una cubeta. La transformación se efectuó
en un Gene-Pulser (Bio-Rad, Munich)
a 2,0 kV, 25 \muF y 200 ohmios. A continuación se incubaron las
células para su recuperación en 1 ml YPD durante 37ºC y luego se
extendieron sobre el medio de selección. Después de
2-4 días de incubación a 37ºC aparecieron visibles
colonias macroscópicas.
Para la integración de vectores en la levadura
H. polymorpha se transfirieron los clones protótrofos de
Uracil procedentes de la transformación, tres veces sucesivas sobre
placas del medio de selección, una vez sobre placas de medio
completo y después nuevamente sobre placas del medio de selección
(respectivamente al cabo de 24 horas de crecimiento a 37ºC).
Para los estudios de estabilidad se agitaron
cultivos líquidos de 50 ml (YPD, 2% glucosa) durante 27 días a 37ºC,
inoculándolos de nuevo cada día. En el momento de la
sobreinoculación y de la toma de muestras, los cultivos de H.
polymorpha presentaban una OD_{600} entre 3 y 4, es decir que
las células se encontraban por lo tanto todavía antes de pasar a la
fase estacionaria. Cada segundo día se prepararon cultivos de 2 ml
de glicerina (27%) que se conservaron a -70ºC.
La preparación de ADN a partir de geles de
agarosa de bajo punto de fusión se efectuó mediante la extracción de
fenol/cloroformo. Bloques de gel recortados bajo la luz UV con
fragmentos de ADN se combinaron con 130 \mul de agua y se
calentaron hasta fundir la agarosa a 70ºC. Después de añadir 150
\mul de fenol y de agitar 50 veces, se centrifugó la muestra (2
minutos a 13.000 rpm) y se desechó la fase de fenol inferior. A
continuación se vertieron sobre la fase acuosa 150 \mul de
fenol/cloroformo (mezcla 1:1), se mezcló y se centrifugó de nuevo.
De nuevo se desechó la fase inferior y se lavó la fase acuosa dos
veces con cloroformo/alcohol isoamílico (1:24) (150 \mul cada
vez). A continuación se añadió 1/10 volumen NaAc (3 M, pH 8) y 1 ml
de etanol al 96%, y se precipitó el ADN mediante incubación durante
15 minutos a -70ºC. Después de separar por centrifugación el ADN,
de lavar una vez con etanol al 70% y el subsiguiente secado se
recogió el ADN en 15-30 \mul de agua.
El aislamiento de fragmentos a partir de
preparaciones de PCR y geles de bajo punto de fusión se efectuó
mediante el kit de purificación PCR (Quiagen, Hilden), siguiendo
las instrucciones del fabricante.
La preparación de plásmido-ADN a
partir de E. coli se efectuó siguiendo el método descrito por
Maniatis y cols. (1982), de lisis alcalina. Se separaron 1,5
ml de un ÜK por centrifugación a 13.000 rpm (2 minutos). El pellet
de células se volvió a suspender en 100 \mul P1 (50 mM Tris/HCl,
10 mM EDTA). La lisis se realizó añadiendo 100 \mul P2 (200 mM
NaOH, 1% SDS). A continuación se precipitaron las proteínas y demás
componentes celulares, mediante la adición de 100 \mul P3 (2,55 M
KOAc, pH 4,8). Después de centrifugar durante 10 minutos a 13.000
rpm se precipitó el ADN del residuo con doble volumen de etanol al
96%. Después de lavar y secar se recogió el pellet en 20 \mul de
agua. El grado de pureza de este ADN era suficiente para análisis
de restricción.
Para preparaciones de ADN de mayor grado de
pureza y mayores cantidades se utilizó el
Plasmid-Midi-Kit de la Firma
Quiagen, siguiendo las instrucciones del fabricante.
La concentración de ADN con bajo peso molecular
(oligonucleótidos) se efectuó mediante determinación de la absorción
a 260 nm. La concentración del ADN de alto peso molecular se estimó
por comparación con un patrón de cantidades calibrado (escala KB,
Pharmacia) en gel de agarosa.
Células procedentes de 2 ml de ÜK se cosecharon a
13.000 y se resuspendieron en 0,5 ml de tampón STEHp (0,5 M
Sorbitol; 0,1 M Tris/HCl; pH 8; 0,1 M EDTA). La pared celular se
eliminó añadiendo 10 \mul de cimoliasa (2,5 mg/ml) y 1 \mul de
\beta-mercaptoetanol e incubando durante 1 hora a
37ºC. Bajo el microscopio se controló si las células estaban
presentes en forma de protoplastos. A continuación se separaron los
protoplastos cuidadosamente por centrifugación (5 minutos a 3000
rpm), ser resuspendieron en tampón TEHp (50 mM Tris/HCl, pH 8, 20
mM EDTA) y se combinaron con 25 \mul de SDS (20%). La lisis se
efectuó mediante incubación durante 20 minutos a 65ºC. Añadiendo 200
\mul de KOAc e incubando sobre hielo (30 minutos) se precipitaron
las proteínas y los residuos de las células. Después de centrifugar
a 13.000 rpm durante 10 minutos se filtró el sobrenadante a través
de algodón, y se precipitó el ADN disuelto en el filtrado mediante
isopropanol de 0,7 volúmenes. Después de lavar con etanol al 70% se
recogió el pellet de ADN seco en 20-30 \mul de
agua.
Para la obtención de ADN genómico de mejor
calidad se modificó el protocolo estándar descrito en 9.6. Las
células de H. polymorpha se cosecharon a partir de 50 \mul
ÜK a 3.000 rpm. Las células se resuspendieron en 30 ml de tampón
STEHp, se separaron por centrifugación y a continuación se
recogieron en 1,5 ml de STEHp. Para disolver la pared celular se
añadieron 30 \mul de cimoliasa. Los protoplastos se mezclaron con
2 ml de KOAc 5 M, el lisado se separó por centrifugación durante 30
minutos a 13.000 rpm (4ºC). A continuación se combinó el
sobrenadante con 2 ml de NH_{4}OAc 5 M y se precipitó el ADN
disuelto mediante 10 ml de etanol frío al 96%. Después de 5 minutos
de incubación sobre hielo se separó por centrifugación el ADN a
3.000 rpm durante 5 minutos, se lavó con etanol al 50% y se recogió
en 2 ml TE (10 mM Tris/HCl, 0,1 mM EDTA, pH 7,5). Todo este
procedimiento se repitió varias veces en volúmenes cada vez
menores. Por último se recogió el ADN en un volumen de 200 \mul
TE.
5 \mug de ADN cromosomal (H. polymorpha)
o 0,5 \mul de ADN plásmido se trataron durante la noche con 1
U/\mug de la correspondiente endonucleasa de restricción. La
separación de los ADN se efectuó en geles de agarosa al
0,6-0,8%. Mediante unos tiempos de separación
largos (2-12 horas a 200 mA) se pudieron distinguir
también fragmentos de ADN relativamente grandes 5-12
Kb).
Después de fotografiar el gel se procedió a la
transferencia de ADN sobre una membrana de nylon (Hybound M.
Amersham) en un aparato Vakuum-Blot (LKB 2016
Vacugene, Pharmacia). Para ello se transfirió primeramente durante
15 minutos con una solución de depurinificación (0,25 M HCl). Este
paso adicional permite efectuar la transferencia incluso de
fragmentos muy grandes. El gel se recubrió con solución de
desnaturalización (1,5 M NaCl, 0,5 N NaOH) y tampón de
neutralización (3 M NaAc, pH 5,5), respectivamente, durante 20
minutos. Por último se recubrió durante 20 minutos con 20 x SSC
tampón de transferencia (3 M NaCl, 0,3 M NaCitrat, pH 7).
Irradiando la membrana durante 2 minutos con luz UV (254 nm)
seguido de 30 minutos de incubación a 80ºC se fijó el ADN a la
membrana de nylon.
La preparación de la sonda, la hibridización y la
demostración del híbrido se efectuaron con ayuda de una reacción
enzimática, de acuerdo con el protocolo del kit de
Dioxygenin-Labeling de la Firma Boehringer
(Mannheim). En algunos casos se hibridizaron y desarrollaron los
Southern-Blots con una segunda sonda. Para ello se
retiró la primera sonda de la membrana mediante una secuencia de
fases de lavado (1 hora en dimetilformamida a 60ºC, después lavado
en solución 1 (0,2 M NaOH, 0,1% SDS) y solución 2 (0,3 M NaCl, 0,03
M Citrat), respectivamente, durante 10 minutos).
La demostración de la actividad de
\beta-galactosidasa se efectuó según Suckow y
Hollenberg (1998). Las cepas a ensayar se cultivaron durante
4-5 horas en medio de selección a 37ºC. Una gota de
4 \mul de cada uno de los cultivos se puso sobre una placa de
selección y se incubó durante la noche a 37ºC. La placa se recubrió
a 70ºC con agar de recubrimiento fresco (0,5% agarosa, 0,5 M
Na_{2}HPO_{4}/NaH_{2}PO_{4} (pH 7); 0,2% SDS; 2% DMF
(dimetilformamida) 2 mg/ml X-gal
(o-nitrofenil-\beta-D-galactopiranosida)
a 70ºC. Al cabo de pocos minutos, los clones con expresión
lacZ mostraron coloración azul.
A partir de 3 ml de un ÜK se cosecharon las
células H. polymorpha y se recogieron en 200 \mul de medio
YNB y 1 ml de glicerina al 5%. Después de 1-2 días
de crecimiento se determinó en primer lugar la OD_{600}. A
continuación se separaron las células por centrifugación y se
siguieron empleando 25 \mul del sobrenadante. A esta parte
alicuota se añadieron 25 \mul de NaAc 5 M y 50 \mul de
4-nitrofenilfosfato. La preparación se incubó
durante 30 minutos a 37ºC. La conversión enzimática del substrato se
detuvo añadiendo 100 \mul de ácido tricloroacético al 15%.
Después de añadir 100 \mul de NaOH 1 M aparecieron muestras de
sobrenadante del cultivo con una coloración amarilla intensa. La
coloración amarilla se cuantificó en el fotómetro mediante la
medición OD_{405}.
Las células se cultivaron durante
1-2 días a 37ºC en 2 ml del medio de selección
(glicerina al 2%). Partes alicuotas de 4 \mul de estos cultivos se
gotearon sobre una placa de selección y se incubaron durante la
noche a 37ºC. A continuación se colocó sobre la placa una membrana
de nitrocelulosa (Amersham Int., Inglaterra), y se efectuó a
continuación una nueva incubación durante la noche a 37ºC. La
membrana se retiró con precaución y todas las células adheridas a
la membrana se lavaron cuidadosamente con agua. Después de secar la
membrana se pudo demostrar inmunológicamente el producto de gen
segregado sobre los filtros con anticuerpos de insulina. La
demostración se realizó siguiendo métodos estándar sirviéndose del
kit NOVEX-Anti-Maus. Los clones
segregadores de insulina se pudieron demostrar unívocamente con
este método.
Para este estudio se empleó un mutante del
wt-GFP, la yeast enhanced
green fluorescent protein3 (yEGFP), optimizado
especialmente para la traslación en la levadura S.
cerevisiae. Esta proteína presenta en S. cerevisiae una
fluorescencia más intensa que wt-GFP (Cormack
y cols. 1997). En el plásmido pM2GT se encuentra el gen para
yEGFP bajo control del promotor TPS1 de H.
polymorpha. Se pudo demostrar que yEGFP da lugar en H.
polymorpha a una fluorescencia comparable con S.
cerevisiae. En este estudio se efectuó un análisis cualitativo
de la expresión GFP. Para ello se utilizaron las cepas en
muestras dobles durante 12 horas a 37ºC en medio YNV (cultivos de 2
ml) y se investigó la luminiscencia verde bajo el microscopio
fluorescente.
Para la integración de un vector en el ADNr de
H. polymorpha es condición necesaria la presencia de una
secuencia que sea homóloga a esta zona. Para ello se fijó un
fragmento de ADNr de 2,4 Kb de longitud de la zona ADNr de H.
polymorpha. En adelante, esta secuencia de 2,5 Kb de longitud
(SEQ ID Nº 1) (figura 2) se designará como secuencia de
integración. Para la clonación de este fragmento del ADN ribosomal
de H. polymorpha se amplificó primeramente un fragmento de 3
kB de longitud del ADN cromosomal de H. polymorpha,
sirviéndose de una reacción PCR mediante los cebadores A
(5'-ACG GGA TCC GGG TTT AGA CCG TCG TGA GAC
AGG-3') y B (5'-CCT GGA TCC TAC CAT
CGA AAG TTG ATA GGG-3'). La determinación de los
cebadores se realizó según secuencias de 18S-ADNr y
25S ADNr de S. cerevisiae flanqueadas de secuencias de
identificación BamHI. El amplificado se acortó después a 2,5
Kb mediante restricción EcoRI/BamHI (el fragmento contiene
una secuencia de identificación EcoRI interna. El fragmento
de 2,4 Kb de longitud se clonó en el vector pM1 y se secuenció
totalmente. Se formó el vector base pM2 (figura 3), del que han
procedido todos los plásmidos descritos en esta solicitud.
Mediante comparación con secuencias conocidas de
la unidad ADNr de S. cerevisiae se pudo demostrar en la
secuencia clonada la presencia del gen 5S-ADNr. El
5S-ADN de H. polymorpha presenta un 96% de
homología con el correspondiente gen de S. cerevisiae. El
gen 5S se encuentra en la posición 958-1079 de la
secuencia de integración, contando desde el interfaz EcoRI
blanqueante. Con esta situación y a partir del conocimiento relativo
al aislamiento de la secuencia de integración se pudo establecer la
posición del fragmento de ADNr clonado en una repetición ADNr de
H. polymorpha, y suponer una organización de la misma clase
de las secuencias de ADNr como en S. cerevisiae. En los
acortamientos se pierden zonas parciales del ITS2 y de la secuencia
18S. La posición del fragmento clonado en la unidad ADNr de H.
polymorpha está representada en la figura 1 (C). Su secuencia
completa está documentada en la siguiente figura 2. La secuencia
sombreada de gris muestra el emplazamiento del
5S-ADNr de 121 bp de longitud.
El fragmento de 2,4 Kb
EcoRI/BamHI-ADNr descrito en el ejemplo
anterior se introdujo en un Shuttle-Vector pM1 de
E. coli y H. polymorpha, que contiene los siguientes
elementos: HARS1 y terminador MOX de H.
polymorpha; ori and amp^{(R)} de E. coli.
Entre HARS1 y el terminador MOX está situado un punto
de policlonización para recibir fusiones heterólogas de
promotor/gen. En los ejemplos 3 y 4 se reproducen algunos ejemplos
de los vectores de integración/expresión resultantes. El ADNr
integrado contiene una BrsGI, SacI, SnaI y una
secuencia de reconocimiento Xhol para la linealización del
vector M2 resultante. El vector está representado en la figura
2.
Para generar el vector base pM2\Delta se ha
digerido el vector pM2 con DraI/AatII, y el fragmento de 8,7
Kb resultante se religó con T4-polimerasa después
de retirar el sobrante 3' del extremo cohesivo AatII. Se
forma un sub-vector acortado sin amp^{R}.
La propagación de este vector y de sus derivados se efectuó en la
cepa de E. coli MC1066, que es auxotrófica al Uracil, y por
lo tanto se pudo seleccionar a través del gen Ura3 sobre
prototropía de Uracil. El vector básico M2\Delta está representado
en la figura 4.
El vector pM2Zt representado en la figura 5 se
generó mediante la integración de una casete de expresión para el
gen lacZ bacteriano en el punto de policlonización de pM2.
Como elemento promotor se utilizó el promotor TPS1 de H.
polymorpha (pM2ZT) y en el ejemplo 4 se generó una casete de
expresión para GFP mediante integración de un fragmento
adecuado en pM2. Como elemento promotor se empleó el promotor
TPS1 de H. polymorpha.
El vector pM2GT representado en la figura 6 se
generó en el punto de policlonización de pM2 mediante integración de
una casete de expresión para GFP. Como elemento promotor se
empleó el promotor TPS1 de H. polymorpha.
En el ejemplo siguiente se describen otros
vectores de expresión. Son derivados de pM2 y pM\Delta, y se
generaron mediante la integración de un fragmento adecuado en el
punto de policlonización de los dos vectores básicos, tal como se
ha mostrado en los ejemplos 3 y 4. Contienen casetes de expresión
para la síntesis de insulina y fitasa. Además del TPS1 se
empleó el promotor FMD como elemento de control para la
expresión heteróloga del gen. Se generaron los siguientes
vectores:
- pB11
- Derivado de pM2 con casete de expresión heteróloga para insulina (Promotor FMD ante un gen de insulina), secuencia de integración de ADNr de H. polymorpha, HARS1, URA3 (S. cerevisiae), terminador MOX, ori, amp^{R}.
- pB14
- Como pB11, pero con un gen sintético de fitasa en lugar del gen de insulina.
- pB14X
- Derivado M2\Delta con casete de expresión heteróloga. Como pB14 pero sin amp^{R}
La transformación de RB11 mediante vectores de
integración de ADNr transcurrió de acuerdo con un principio general
que es válido para todas las transformaciones que aquí se
describen. Mediante la restricción por medio de una enzima, para la
cual solamente hay un interfaz singular dentro de la secuencia de
integración (por ejemplo, SacI o ShoI), se dividió la
secuencia de integración o en dos secuencias parciales extremas,
que pueden recombinar homólogamente con las correspondientes
secuencias en la unidad ADNr. Para plásmidos
no-linealizados no se pudo demostrar hasta ahora
ninguna integración en el ADNr. Los vectores de integración ADNr
contenían como gen marcador de la selección el gen URA3
intacto de S. cerevisiae. La utilización de un gen intacto
de este tipo da lugar, tal como se muestra en los ejemplos
siguientes, a cepas mitóticamente estables, en las que el ADN
integrado recombinante puede estar presente en
40-50 copias.
La transformación se realizó mediante
electroporación (véase Material y Métodos). La integración en el
genoma se efectúa mediante crecimiento bajo presión de selección a
lo largo de 30 generaciones (placas YNB o medios que no contengan
Uracil). En el método convencional para la generación de cepas
recombinantes de H. polymorpha mediante plásmidos circulares
se necesitan al menos 80 generaciones de crecimiento sobre medios
selectivos (Gatzke y cols. 1995). De este modo, con la
utilización de vectores de integración ADNr se dispone de un método
más rápido y sencillo, con respecto a los protocolos acreditados,
para la generación de cepas recombinantes de H.
polymorpha.
El ADNr en H. polymorpha consta de unas 40
unidades consecutivas, de estructura idéntica (ejemplo 1). La
longitud de una unidad es de aprox. 8 Kb. Esta longitud se puede
determinar mediante experimentos de hibridización con sondas ADNr,
si en las restricciones se utilizan enzimas que cortan una sola vez
en una repetición de ADNr. Una de estas enzimas es BglII.
Cabe la integración en una o varias de estas unidades de ADNr.
La cepa Uracil-auxotrófica RB11
se transformó mediante pB14 de acuerdo con el método antes descrito.
La linealización se efectuó mediante SacI. De esta manera se
distribuyó el fragmento ADNr del vector entre dos secuencias
marginales de aproximadamente la misma longitud. De las cepas
recombinantes generadas se documenta a continuación un ejemplo
representativo. La demostración de la estructura del ADN heterólogo
integrado en el ADNr se basa en las siguientes consideraciones
previas: si se utiliza una enzima que corta en el vector pero no en
el ADNr (BamHI) y se utiliza éste junto con BglII
(corta en la unidad ADNr pero no en el vector) entonces se deben
poder identificar tamaños de fragmentos que indiquen la transición
de una unidad de repetición ADNr a una copia vectorial. Para el caso
de que haya varias copias del vector integradas en diferentes
posiciones se tendrían que demostrar también fragmentos de puenteo
muy largos, ya que BamHI solamente corta en el vector y
BglII sólo en el ADNr. La figura 7 muestra este análisis.
El ADN cortado con las enzimas de restricción
indicadas hibridiza con la sonda procedente de la reacción de
marcación de la secuencia de integración (véase Material y
Métodos). En la traza del ADN tratado con BamHI se reconoce
una intensa señal en 7,4 Kb. Esto corresponde al fragmento de
vector. En esta traza queda también visible una señal débilmente
reconocible por encima de 21 Kb. Este fragmento se interpreta como
fragmento puente. En la traza de ADN tratado con BglII se
reconoce una señal intensa en 8 Kb, lo que corresponde a la
longitud de una unidad ADNr. En la traza con la doble digestión se
reconocen tanto las señales ADNr como las señales de vector. En 8,8
Kb y en 6,7 Kb se ven señales débiles que representan fragmentos de
transición de ADNr en plásmido ADN. En la primera traza se aplicó
como patrón de longitud de ADN la escala de kilobases, y en la
segunda traza \lambda ADN digerido con
EcoRI/HindIII.
De ahí se deduce el siguiente estado: El ADN
heterólogo está presente al menos en dos clusters. El número de
copias de plásmido por cluster ha de ser considerablemente superior
a 2. Entre los cluster de plásmido hay al menos una unidad ADNr
intacta. La figura 8 muestra la estructura deducida del
análisis.
Se trataba de investigar la posibilidad de
integrar simultáneamente en diferentes clusters en el ADNr diversos
factores con idéntico diseño base. De esta manera se tiene la
opción de preparar, con un gasto pequeño, cepas recombinantes para
la co-producción de dos o más proteínas. Por este
motivo se transformó RB11 con los tres vectores pM2, pB11 y pB14
(véanse los ejemplos 2 y 5), y se investigaron las 40 cepas
recombinantes resultantes en cuanto a la presencia de vectores
integrados. Los vectores pB11 y pB14 se linealizaron mediante
restricción Sacl, pM2 mediante restricción Xhol dentro
de la secuencia de integración, y se emplearon en una preparación de
transformación en cantidades equimolares. Los tres vectores poseen
coincidentes la secuencia de integración de 2,4 Kb de longitud para
la recombinación homóloga en la zona ADNr del genoma de H.
polymorpha y el gen URA3 de S. cerevisiae (véase
el ejemplo 1).
El ADN cromosomal de las cepas recombinantes
resultantes de la preparación se cortó con AatII (corta una
sola vez en cada uno de los tres vectores), se separan los
fragmentos en un gel de agarosa y se someten a un análisis
Southern-Blot. Como sonda se utilizó la secuencia de
integración marcada con digoxigenina. Mediante la restricción del
ADN heterólogo con un "single cutter" se garantizó que para
los vectores se forman fragmentos que se pueden asociar claramente,
y que hibridizan con la sonda. La figura 9 muestra una selección de
las cepas analizadas.
Las cifras impresas en negrita caracterizan las
cepas que llevan integrados simultáneamente dos o tres vectores
diferentes. En las cepas RB3T-13,
RB3T-17 y RB3T-37 se reconocen
señales a la altura de pM2 y pB14, y llevan ambos vectores
integrados genómicamente. RB3T-19 muestra una señal
para los tres vectores. Debido a la restricción mediante
AatII aparece en el control RB11 una señal en 6,5 Kb,
que representa la unidad ADNr, y que también aparece en las cepas
recombinantes.
La cepa RB3T-34 muestra una banda
intensa para pB14 y una más débil para pM2. En esta cepa
recombinante se produjo otra combinación de
co-integración. En la última traza aparece el patrón
de longitud de ADN (KBL).
El vector pM2 se pudo demostrar en 20 cepas (Nº
1-13, 17, 19, 22, 33-40), el pB14 en
siete cepas (Nº 4, 6, 11, 19, 21, 22, 34) y el pB11 en siete cepas
(Nº 4, 6, 11, 19, 21, 22, 34). Se pudieron identificar cuatro cepas
recombinantes, en las que estaban integrados dos vectores diferentes
(Nº 17, 13 y 37 con pM2 y pB11; Nº 34 con pM2 y pB14). Una cepa (Nº
19) contiene los tres vectores. Las cepas recombinantes se
designaron de acuerdo con la siguiente nomenclatura: RB para
la cepa RB11 de H. polymorpha; 3T para la
Transformación de RB11 con 3 vectores diferentes.
Para todas las cepas recombinantes generadas de
la preparación de la transformación descrita en el ejemplo 8 se
demostraron números de copias entre 40 y 50. Por lo tanto se
corresponde aproximadamente con el número total de unidades de
repetición ADNr en el ADNr de H. polymorpha en la
co-integración de vectores diferentes,
repartiéndose este número total entre el número de copias de los
distintos vectores. Como ejemplo para la determinación del número
de copias se eligió la cepa RB3T-19, con tres
vectores distintos integrados. Para la hibridización se utilizó una
sonda de terminador MOX. La secuencia para el terminador
MOX aparece una sola vez en el genoma de H.
polymorpha, y se encuentra en los tres vectores. Por lo tanto se
generó una sonda que hibridiza tanto con los fragmentos de vectores
como también con la secuencia de terminador MOX "single
copy" genuino del huésped. El ADN cromosomal de
RB3T-19 se cortó con AatII y se analizó. El
ADN cortado se aplicó en unos niveles de dilución definidos. La
intensidad de la señal de hibridización de la secuencia heteróloga
en las diluciones se puede comparar con la del gen genuino. Las
tres señales para los vectores integrados se reconocen en las
respectivas diluciones, con una intensidad en disminución. La señal
para el fragmento genuino de terminador MOX sólo se reconoce
débilmente. Las señales para pB11 y pM2 en la dilución 1/20 se
corresponden aproximadamente con la señal del terminador
MOX. Para pB14 aparece en la dilución 1/5 una señal
relativamente intensa. De ahí resulta el número de copias citado en
el texto de 20 en cada caso para los vectores pM2 y pB11 y de cinco
copias para pB14. Para los vectores co-integrados
pB11 y pM2 se pudo determinar en cada caso un número de copias de
20. Para pB14 resultó un número de copias de 5. Por lo tanto se
alcanza un número total de copias de 45 para los tres vectores
co-integrados.
La estabilidad mitótica de las cepas
recombinantes que se habían generado por transformación de H.
polymorpha mediante tres vectores de integración ADNr se
investigó a título de ejemplo en las cepas RB3T-13,
RB3T-17, RB3T-19 y
RB3T-37. Para ello se cultivaron las cepas durante
27 días en un cultivo líquido de 50 ml en un medio no selectivo
(YPD). A intervalos periódicos se tomaron muestras y se reunieron.
El ADN genómico de las muestras reunidas se preparó y después de la
restricción mediante AatII se sometió a un análisis
Southern Blot. Como sonda se empleó el fragmento de
terminador MOX AatII/BglII del vector pM2.
Para las cuatro cepas recombinantes se pudo demostrar la
estabilidad mitótica en análisis Southern Blot. La figura 11
muestra a título de ejemplo el resultado del análisis Southern
Blot para la cepa RB3T-19. La intensidad
variable de todas las señales para los fragmentos de vectores a lo
largo de todo el período de tiempo muestra la estabilidad mitótica
de la cepa analizada.
El objetivo de este experimento era el de
aumentar el número de vectores utilizados simultáneamente en una
transformación, determinando de este modo un límite superior para la
co-integración. RB11 se
co-transformó con los vectores pB11 (10,7 Kb), pB14
(9,7 Kb), pB14X (8,7 Kb), pM2 (8,2 Kb) y pM2X (6,7 Kb). Las cepas
recombinantes se comprobaron en el análisis Southern Blot. Se
analizaron 80 cepas recombinantes. El ADN genómico de las cepas
recombinantes se cortó con NcoI, para el que también existe
igualmente en todos los vectores un único punto de restricción.
Como sonda se empleó la secuencia de terminador MOX marcado
con digoxigenina. En 66 casos estaba integrada una sola especie de
vector, en siete casos estaban dos, en seis casos tres y en un caso
cuatro del total de cinco vectores. Entre las 80 cepas
recombinantes analizadas no se pudo descubrir ninguna cepa que
tuviera integrados genómicamente los cinco vectores. La figura 12
muestra el análisis Southern Blot para cuatro cepas
seleccionadas, donde tres de estas cepas contienen secuencias de al
menos un vector de integración. El ADN cromosomal se cortó con
XhoI. El análisis del ADN se cortó como en la figura 11. La
cepa RB5T-31 contiene cuatro especies diferentes de
vectores (pM2, pM2X, pB14X y pB11). La señal para pB14 en 9,7 Kb
resulta especialmente intensa. Esto indica un número de copias
considerablemente superior en comparación con los otros
vectores.
Ejemplos 12-15
Una vez que en los ejemplos anteriores se ha
mostrado que la co-integración de varios vectores
diferentes en el ADNr de H. polymorpha da lugar a unas cepas
recombinantes mitóticamente estables, en los ejemplos siguientes se
demuestra la posibilidad de expresar cuatro genes indicadores
diferentes. Como genes indicadores se eligieron GFP,
lacZ, un gen para una variante de insulina y un gen de
fitasa, porque la detección de los productos genéticos
resulta fácil de realizar. Los genes indicadores están contenidos
en los vectores pM2GT, (GFP) pM2TZ (lacZ), pB11
(Insulina) y pB14 (fitasa). Los cuatro vectores se linealizaron
respectivamente mediante restricción SacI dentro de la
secuencia de integración y se añadieron en cantidades equimolares a
una preparación de co-transformación. Se analizaron
132 cepas recombinantes resultantes para determinar la presencia de
los productos genéticos.
En el vector pM2Zt que aquí se utiliza, el gen
lacZ está detrás del promotor TPS1 de H.
polymorpha. Este promotor se activa mediante temperaturas de
cultivo superiores. En el caso de crecimiento a 40ºC sobre placas de
YNB, utilizando glucosa como única fuente de hidratos de carbono,
se activa suficientemente el promotor. Las células se cultivaron
durante seis horas a 40ºC en medio de selección y a continuación se
gotearon respectivamente 5 \mul de los cultivos sobre placas de
selección. Después de 24 horas de crecimiento se investigaron las
colonias para determinar la actividad de
\beta-galactosidasa, sirviéndose de un
X-Gal Overlay-Assay (véase Material
y Métodos). Después de una incubación de 5 horas se documentó el
resultado (figura 13). El ennegrecimiento de la colonia corresponde
a una intensa actividad de \beta-galactosidasa.
Las colonias grises muestran una actividad media o débil. 61 de las
132 cepas recombinantes mostraron actividad de
\beta-galactosidasa. Este resultado se confirmó
en un experimento
repetitivo.
repetitivo.
El vector pB14 utilizado lleva una casete de
expresión con el gen para una variante de insulina bajo control del
promotor FMD. Para ello se incubaron las células en un
cultivo previo (YNB, 5% glicerina) durante 6 horas a 37ºC y se
gotearon respectivamente 5 \mul de éste sobre placas YNB
(2% glicerina). Como fuente de hidratos de carbono se utilizó en
este caso glicerina, ya que el gen de la insulina está bajo control
del promotor FMD. Este promotor es reprimido por la glucosa
y desreprimido por la glicerina. Para la identificación de las
cepas productoras de insulina se utilizó un ensayo de filtro
inmunológico (véase Material y Métodos). Después de revelar el
filtro se observaron decoloraciones en las posiciones de las
colonias positivas de insulina (véase la figura 14). La coloración
del filtro es proporcional a la cantidad de insulina segregada. En
17 de las 132 cepas recombinantes se pudo observar secreción de
insulina. En el filtro A de la figura 14, cuatro cepas muestran una
señal moderadamente intensa. La cepa Nº 51 y la cepa Nº 56 muestran
una coloración débil. La cepa Nº 126 muestra una señal
relativamente intensa con el control positivo. Las cepas Nº 80, 94
y 114 muestran coloraciones débiles.
El vector pB11 lleva el gen para la
con-fitasa bajo control del promotor FMD. En
el caso de esta fitasa se trata de una muteína (Hoffman La Roche,
Basilea). Para determinar la actividad de la fitasa se recurrió a
las cepas en cultivos de noche de 3 ml (YPD, 37ºC), y en el
sobrenadante del cultivo se determinó a continuación la actividad
de la fitasa por procedimiento fotométrico (véase Material y
Métodos). 20 cepas mostraron actividad de fitasa.
El vector pM2G soporta el gen yEGFP bajo
control del promotor TPS1 de H. polymorpha. Si la
proteína indicadora está acumulada en la célula recombinante en
cantidades suficientes, entonces después de efectuar la excitación
mediante una luz de longitud de onda de 395 nm se produce una
fluorescencia que tiene su máximo de emisión en 510 nm (Morise y
cols. 1974); las células presentan una luminosidad verde
intensa (véase Material y Métodos). Las cepas se incubaron durante
24 horas en medio YNB a 37ºC. A continuación se identificaron bajo
microscopio fluorescente cepas con señal GFP. El experimento se
repitió un total de tres veces y se determinaron como positivas
aquellas cepas que presentaban una señal en los tres análisis. En 36
de las 132 cepas se demostró la presencia de
GFP.
GFP.
Mediante la co-transformación con
cuatro vectores diferentes se generaron las 132 cepas recombinantes
que están documentadas en los ejemplos 12 a 15. Todas las cepas se
investigaron para determinar la expresión de los genes indicadores
antes descritos. 28 de ellos no mostraron ninguna expresión. En las
restantes cepas de H. polymorpha parece haber tenido lugar
una distribución aleatoria de los vectores. 52 cepas muestran una
expresión de IacZ, situada detrás del promotor TPS1
que es muy intenso en H. polymorpha. En 36 casos se expresó
el gen GFP. En el vector utilizado, el gen GFP también
está situado detrás del promotor TPS1. En 20 cepas se
observó una expresión del gen de fitasa, y en 17 una expresión del
gen de insulina. 24 cepas muestran una co-expresión
de dos genes indicadores. En estos casos se observó la aparición de
todas las combinaciones de los cuatro genes indicadores. Se
descubrieron dos cepas recombinantes que muestran una
co-expresión de tres genes indicadores: En la cepa
RB4T-75 se pudo demostrar una combinación de GFP,
lacZ e insulina y en la cepa RB4T-81 se
observó lacZ, fitasa e
insulina.
insulina.
La Tabla 1 muestra un resumen de la expresión de
cuatro genes indicadores en cepas recombinantes de H.
polymorpha. Se analizaron 132 cepas recombinantes. Las cepas
que muestran una co-expresión de varios genes
indicadores tienen fondo gris, las cepas con la
co-expresión de tres genes están destacadas mediante
un enmarcado (+ = expresión fuerte, 0 = expresión media,- =
expresión débil).
Una cepa recombinante que había sido producida
por transformación mediante el vector pB14 (producción de fitasa
controlada por el promotor FMD), contenía aproximadamente 40 copias
del ADN recombinante. La estabilidad mitótica se comprobó a lo largo
de un crecimiento de 100 generaciones. Unas alicuotas de cultivo al
comienzo de las investigaciones de estabilidad y después de 100
generaciones sirvieron para inocular 3 ml del medio que contenía un
2% de glicerina como fuente de hidratos de carbono. La fitasa
segregada se cuantificó después de un cultivo de 30 horas. En ambos
casos se determinó una concentración de aprox. 60 mg/l.
Agaphonov MO, Beburov MY,
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Claims (37)
1. Vector de integración para la expresión de al
menos una proteína en un organismo hospedador, en particular en un
hongo, que comprende
- a)
- al menos una secuencia de ADNr de levadura,
- b)
- al menos un gen marcador de la selección no-deficiente, y
- c)
- al menos una casete de expresión,
donde la casete de expresión
comprende un elemento promotor capaz de funcionar en el organismo
hospedador, una zona de un gen heterólogo o genuino codificado para
una proteína deseada, y un elemento terminador capaz de funcionar en
el organismo hospedador, caracterizado porque al menos una
secuencia de ADNr procede de una zona del ADNr de una levadura
metilotrófica que comprende un fragmento de 400 bp de longitud de la
zona 3' del gen 25S-ADNr y un fragmento de 600 bp
de longitud de la zona 5' del gen 18S-ADNr, así como
las secuencias situadas entre medias, incluida la secuencia
5S-ADNr.
2. Vector de integración según la reivindicación
1, caracterizado porque el organismo hospedador es un hongo
filamentoso.
3. Vector de integración según la reivindicación
2, caracterizado porque el hongo filamentoso pertenece a la
especie Aspergillus, Neurospora, Mucor, Trichoderma, Acremonium,
Sordaria o Penicillium.
4. Vector de integración según la reivindicación
1, caracterizado porque el organismo hospedador es una
levadura.
5. Vector de integración según la reivindicación
4, caracterizado porque la levadura es una levadura
metilotrófica.
6. Vector de integración según las
reivindicaciones 4 ó 5, caracterizado porque la levadura
pertenece a la especie Saccharomyces, Hansenula, Pichia,
Kluyveromyces, Schwanniomyces, Yarrowia, Arxula, Trichosporon o
Candida.
7. Vector de integración según la reivindicación
6, caracterizado porque la levadura metilotrófica es
Hansenula polymorpha.
8. Vector de integración según una de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la secuencia de
ADNr es un fragmento ADNr que amplifica mediante PCR con ADN
genómico de una levadura como matriz y los cebadores A
5'-ACG GGA TCC GGG TTT AGA CCG
TCG TGA GAC AGG-3' (SEQ ID Nº 2)
y B
5'-CCT GGA TCC TAC CAT CGA AAG
TTG ATA GGG-3' (SEQ ID Nº 3)
y que puede obtenerse mediante digestión con la
enzima de restricción BamHI.
9. Vector de integración según una de las
reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la secuencia de
ADNr procede de una levadura de la especie Hansenula, Pichia,
Saccharomyces, Kluyveromyces, Candida, Schwanniomyces, Yarrowia,
Arxula o Trichosporon.
10. Vector de integración según la reivindicación
9, caracterizado porque la secuencia de ADNr procede de
Hansenula polymorpha.
11. Vector de integración según la reivindicación
10, caracterizado porque la secuencia de ADNr procede de
Pichia pastoris, Pichia methanolica o Candida
boiidinii.
12. Vector de integración según una de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la secuencia de
ADNr se elige de entre las secuencias siguientes:
- a)
- una secuencia según SEQ ID Nº 1;
- b)
- un fragmento de la secuencia según a), que es adecuado para la integración estable de secuencias del vector en gran número de copias en el genoma de un organismo hospedador, en particular de una levadura;
- c)
- una secuencia idéntica al menos en un 70% con una secuencia según a) o b);
- d)
- una secuencia que en la zona codificada del gen 5S (posiciones 956-1074 en la SEQ ID Nº 1) y/o en el tramo contenido en la SEQ ID Nº 1 de la zona codificada del gen 25S (posiciones 1977-2420 en la SEQ ID Nº 1) es idéntica al menos en un 70% con una secuencia según a) o b);
- e)
- una secuencia que hibridiza con el contra-ramal de una secuencia según a) o b);
- f)
- un derivado de una secuencia según uno de los grupos a) a b) obtenido por sustitución, adición, inversión y/o supresión de una o varias bases, que es adecuado para la integración estable de secuencias del vector en gran número de copias en el genoma de un organismo hospedador, en particular de una levadura, y
- g)
- una secuencia complementaria a una secuencia según uno de los grupos a) a f).
13. Vector de integración según la reivindicación
12, caracterizado porque la secuencia según el grupo d) es
idéntica al menos en un 80% con una secuencia según el grupo a) o
b).
14. Vector de integración según la reivindicación
13, caracterizado porque la secuencia según el grupo d) es
idéntica al menos en un 90% con una secuencia según el grupo a) o
b).
15. Vector de integración según una de las
reivindicaciones 1 a 14, caracterizado porque comprende un
gen marcador de la selección adicional para E. coli.
16. Vector de integración según una de las
reivindicaciones 1 a 15, con una longitud entre 7 y 12 Kb.
17. Vector de integración según una de las
reivindicaciones 1 a 16, caracterizado por contener
secuencias que codifican uno o varios polipéptidos, que permiten
una segregación mejorada del organismo hospedador, de una proteína
secretora recombinante co-integrada.
18. Vector de integración según la reivindicación
17, caracterizado porque las secuencias codifican un
polipéptido con la actividad biológica de una proteinacinasa
dependiente de Ca^{2+}/calmodulina y/o un polipéptido con
actividad biológica de un factor de iniciación de traslación 4E
(elF4E).
19. Vector de integración según la reivindicación
18, caracterizado porque las secuencias comprenden la zona
codificada del gen CMK2 y/o la zona codificada del gen
CDC33 de Saccharomyces cerevisiae.
20. Organismo hospedador que comprende al menos
un vector de integración integrado de forma estable en el genoma
según una de las reivindicaciones 1 a 19.
21. Organismo hospedador según la reivindicación
20, caracterizado porque se trata de un hongo
filamentoso.
22. Organismo hospedador según la reivindicación
21, caracterizado por pertenecer a la especie
Aspergillus, Neurospora, Mucor, Trichoderma, Acremonium,
Sordaria o Penicillium.
23. Organismo hospedador según la reivindicación
22, caracterizado por ser una levadura.
24. Organismo hospedador según la reivindicación
23, caracterizado porque la levadura es una levadura
metilotrófica.
25. Organismo hospedador según la reivindicación
23 ó 24, caracterizado por pertenecer a la especie
Hansenula, Pichia, Kluyveromyces, Schwanniomyces, Yarrowia,
Arxula, Trichosporon o Candida.
26. Organismo hospedador según la reivindicación
25, caracterizado porque la levadura es Hansenula
polymor-pha.
27. Organismo hospedador que puede obtenerse por
integración estable de uno o varios vectores de integración en el
genoma de un hongo según una de las reivindicaciones 1 a 15.
28. Organismo hospedador según la reivindicación
27, caracterizado porque el hongo es un hongo
filamentoso.
29. Organismo hospedador según la reivindicación
28, caracterizado porque el hongo filamentoso pertenece a la
especie Aspergillus, Neurospora, Mucor, Trichoderma, Acremonium,
Sordaria o Penicillium.
30. Organismo hospedador según la reivindicación
29, caracterizado porque el hongo es una levadura.
31. Organismo hospedador según la reivindicación
30, caracterizado porque la levadura es una levadura
metilotrófica.
32. Organismo hospedador según la reivindicación
30 ó 31, caracterizado porque la levadura pertenece a la
especie Saccharomyces, Hansenula, Pichia, Kluyveromyces,
Schwanniomyces, Yarrowia, Arxula, Trichosporon o
Candida.
\newpage
33. Organismo hospedador según la reivindicación
32, caracterizado porque la levadura es Hansenula
polymor-pha.
34. Organismo hospedador según una de las
reivindicaciones 27 a 31, caracterizado porque puede
obtenerse por integración de varios factores que comprenden casetes
de expresión diferentes entre sí.
35. Procedimiento para la preparación de una o
varias proteínas, caracterizado porque se cultiva un
organismo hospedador según una de las reivindicaciones 20 a 34 en
una forma de por sí conocida y se obtiene la proteína generada.
36. Utilización de un vector de integración según
una de las reivindicaciones 1 a 20 para la preparación de una o
varias proteínas en un organismo hospedador según una de las
reivindicaciones 20 a 34.
37. Utilización de un organismo hospedador según
una de las reivindicaciones 20 a 34 para la preparación de una o
varias proteínas.
Applications Claiming Priority (6)
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|---|---|---|---|
| DE19956297 | 1999-11-23 | ||
| DE19956297 | 1999-11-23 | ||
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