ES2222183T3

ES2222183T3 - Microscopio de coherencia optica y procedimiento para la visualizacion rapida en tres dimensiones en vivo de funciones biologicas.

Info

Publication number: ES2222183T3
Application number: ES00911667T
Authority: ES
Inventors: June Iris Medford; Richard Campbell Haskell; Barbara Maria Hoeling; Daniel Carl Petersen; Ruye Wang; Mary Elizabeth Williams
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1999-01-29
Filing date: 2000-01-28
Publication date: 2005-02-01
Anticipated expiration: 2020-01-28
Also published as: AU779717B2; EP1147398A1; CA2361195A1; WO2000045153A1; WO2000045153A9; AU3352900A; ATE268901T1; EP1147398B1; DE60011389T2; US6608717B1; DE60011389D1

Abstract

Un sistema de microscopio de coherencia óptica de alta resolución para visualizar estructuras bajo una superficie de una muestra biológica, comprendiendo el sistema: - una fuente de luz; - un espejo de referencia; - una lente de focalización para focalizar la luz sobre la muestra biológica; - un fotodetector; - un dispositivo piezoeléctrico; - un camino óptico de muestra para recibir la luz de la fuente de luz y dirigir la luz a la lente de focalización, teniendo dicho camino de muestra una longitud de camino de muestra, en el que la luz dirigida a lo largo del camino de la muestra entra en la muestra biológica y se concentra en una abertura de un diámetro de haz dentro de la muestra; - un camino óptico de referencia para recibir la luz de la fuente de luz y dirigir la luz al espejo de referencia, teniendo dicho camino de referencia una longitud de camino de referencia; - en el que la longitud de al menos uno de los caminos ópticos está modulada por medio del dispositivo piezoeléctrico, y en el que un haz de luz proveniente del camino óptico de la muestra dispersado hacia atrás desde la muestra biológica se combina con un haz de luz proveniente del camino de referencia reflejado desde el espejo de referencia, en el que la combinación de haces de luz produce una señal de franjas de interferencia sobre el fotodetector cuando la longitud del camino de muestra y la longitud del camino de referencia son sustancialmente la misma dentro de la longitud de coherencia de la fuente de luz, en el que la amplitud de la modulación es igual o menor a 1, 5 longitudes de onda; y - un escáner dispuesto para explorar la abertura del haz a través de un primer plano sustancialmente normal a la dirección del haz de luz incidente, y para mover entonces la abertura del haz más profundo dentro de la muestra y para explorar otro plano mientras la posición del espejo de referencia es trasladada para conservar las longitudes de camino iguales de los caminos de muestra y de referencia coincidentes con laabertura del haz, y que la amplitud de franja es registrada en cada elemento de imagen volumétrica de elemento de volumen durante la exploración de la muestra resultante en un conjunto de datos tridimensionales que es representado en volumen para proporcionar una visualización en tres dimensiones de la muestra.

Description

Microscopio de coherencia óptica y procedimiento para la visualización rápida en tres dimensiones en vivo de funciones biológicas.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a un microscopio de coherencia óptica (OCM) para el estudio de problemas en biología experimental y en biotecnología. De manera más particular, la invención se usa para ver imágenes de células situadas hasta a cuatro milímetros o más por debajo de la superficie del tejido vivo.

Descripción de la técnica relacionada

La microscopía de coherencia óptica (OCM) es una técnica desarrollada recientemente para representar imágenes de objetos que se encuentran incorporados en un medio opaco (por ejemplo, carne) hasta una profundidad de 1 a 2 mm. Se ha aplicado de manera exitosa sobre una base de prototipo en oftalmología (Swanson y colaboradores, 1993) y en dermatología (Schmitt y colaboradores, 1995) para representar imágenes de estructuras e interfaces de tejidos. Por otra parte, el OCM se ha venido usando para medir las propiedades ópticas del tejido, y por lo tanto, para proporcionar información sobre el estado fisiológico de un tejido. El OCM se ha convertido recientemente en una cuestión de interés para el estudio de la biología experimental.

La comprensión de los mecanismos experimentales proviene de estudios de los patrones de expresión de los genes, de la geometría de los tejidos y/o de la morfología de las células, todos ellos realizados sobre tejido fijado. A partir de estas vistas "instantáneas", los investigadores deben inferir la dinámica de los acontecimientos celulares y moleculares subyacentes. Recientemente, se han introducido las tecnologías de imagen biológicas que permiten el análisis no destructivo de la migración celular, la diferenciación y la interconexión neuronal durante el desarrollo embrionario. Por ejemplo, se pueden usar los compuestos fluorescentes o absorbentes para etiquetar células que son después seguidas por medio de un microscopio de luz convencional equipado con una cámara de vídeo o con un microscopio cofocal. El microscopio cofocal añade una profunda resolución significativa, ofreciendo la posibilidad de obtener una imagen tridimensional por medio de la combinación de las secciones ópticas a través de la profundidad de un embrión. La velocidad de formación de la imagen del microscopio cofocal es lo suficientemente rápida para seguir los comportamientos dinámicos de las células cuando éstas migran o de los axones de las células de la retina cuando se extienden, sienten activamente y retiran proyecciones hacia las células en el téctum (O'Rourke y colaboradores, 1994). Sin embargo, la dispersión de luz en el tejido embrionario reduce la relación señal a ruido de un microscopio cofocal, limitando la profundidad de la muestra que se puede explorar a unas 200 \mum (Schmitt y colaboradores, 1994b). Una segunda tecnología de imagen es la imagen por resonancia magnética (MRI) recientemente extendida al dominio microscópico de forma que ahora puede resolver un cubo de 12 \mum en embriones vivos (Jacobs y Fraser, 1994). Aunque un microscopio MRI es indiferente a la opacidad óptica, es tanto caro como lento, requiriendo casi una hora para generar una imagen de alta resolución.

Merece la pena notar que otras técnicas en imagen desarrolladas recientemente también experimentan una degradación en la imagen con la profundidad dentro del tejido. Por ejemplo, la proteína de la fluorescencia verde (GFP) ha sido modificada y ha sido expresada en la planta Arabidopsis thaliana, dando como resultado preciosas imágenes de raíces de desarrollo. Sin embargo, las imágenes son obtenidas con un microscopio cofocal y están limitadas a profundidades de menos de 100 \mum en esta preparación. El desarrollo del meristemo primario en el embrión de la semilla ocurre a varios cientos de micras dentro del tejido, demasiado profundo para un microscopio cofocal. Limitaciones similares se aplican a la microscopía de doble fotón (Potter y colaboradores, 1996) y a la transferencia de energía de resonancia fluorescente (Helm y Tsien, 1996).

Microscopía de coherencia óptica. Un microscopio de coherencia óptica usa los principios de la microscopía cofocal, con una puerta de coherencia adicional que excluye la luz dispersada hacia atrás proveniente de los planos fuera del foco, dando como resultado una relación señal a ruido que se ve mejorada en 6 órdenes de magnitud (1zatt y colaboradores, 1994a, b). Se ha conseguido una resolución de 10 \mum tanto en la dirección lateral como en la dirección hacia abajo (Huang y colaboradores, 1991b). La fibra óptica y las fuentes y detectores de estado sólido se usan típicamente, de forma que el instrumento es típicamente robusto. La OCM salva esta limitación en la profundidad de la microscopía cofocal y es actualmente más rápida que la MRI. Y a un coste estimado de por debajo de 10000 dólares, el instrumento es dos órdenes de magnitud menos caro que el microscopio MRI.

La puerta de coherencia en OCM se consigue superponiendo un interferómetro de Michelson sobre el microscopio cofocal. La luz dispersada hacia atrás proveniente de la muestra interfiere de manera coherente con la luz que vuelve desde un brazo de referencia añadido solamente cuando los dos caminos ópticos sean iguales. La amplitud de las franjas de interferencia (su "visibilidad") se convierte en la señal; esta señal es apreciable solamente para la luz dispersada hacia atrás desde un estrecho intervalo de profundidades en la muestra. El intervalo de profundidad sobre el que ocurre la interferencia está relacionado con la longitud de coherencia de la fuente. Por ejemplo, el intervalo de profundidades, que también es la resolución de profundidad, es aproximadamente 10 \mum cuando la anchura espectral de la fuente es de 30 nm (\lambda = 830 nm, Swanson y colaboradores, 1992). A una profundidad particular, se puede formar una imagen lateral (sección óptica) trasladando el haz; el tamaño de punto del haz focalizado (fácilmente menor de 10 \mum) determina la resolución lateral.

Historia de la reflectometría. Cuando se introdujeron las fibras ópticas en la industria de las comunicaciones en la década de los setenta, surgió inmediatamente la necesidad de un procedimiento de prueba y de localización de defectos en el cable de fibra. Los primeros reflectómetros (Barnoski y Jensen, 1976), que funcionaban en el dominio del tiempo, simplemente medían el tiempo en vuelo del viaje de recorrido hasta un defecto en la fibra causante de reflejos. Las anchuras típicas de pulso eran de unos pocos nanosegundos, de forma que la resolución espacial era en torno a un metro.

En la década de los ochenta, aparecieron los reflectómetros de baja coherencia que funcionan en el dominio de la frecuencia (Danielson y Whittenburg, 1987; Takada y colaboradores, 1987; Youngquist y colaboradores, 1987). En esta técnica, se emplea una fuente de luz espectralmente ancha (30 nm) que funciona en el infrarrojo cercano (800 a 1300 nm) en un interferómetro Michelson, uno de cuyos circuitos es la fibra bajo prueba. La fuente de luz tiene un tiempo de coherencia de 70 femptosegundos, una mejora considerable sobre las anchuras de pulso en el dominio del tiempo. A medida que se varía la longitud del camino de referencia, se supervisa la salida del interferómetro en busca de franjas de interferencia que ocurren cuando la luz es reflejada o dispersada hacia atrás desde un punto una distancia a lo largo de la fibra probada igual a la longitud del camino de referencia. La resolución espacial a lo largo de la fibra probada es la mitad de la longitud de coherencia porque la fibra es atravesada dos veces en ese circuito del interferómetro. (Realmente, la resolución espacial geométrica es incluso más pequeña en un factor de n, donde n es el índice de refracción de la fibra). Para una anchura espectral de 30 nm, la longitud espacial geométrica a lo largo de la fibra es de 7 \mum.

Poco después los oftalmólogos adaptaron este reflectómetro de baja coherencia para medir la longitud del ojo (Farcher y colaboradores, 1998; Hitzenberger, 1991). Finalmente, se añadieron exploraciones laterales, y tanto los datos de los laterales como los de la profundidad fueron representados en términos de imágenes de la muestra, generalmente imágenes en dos dimensiones con una dimensión lateral y una dimensión de profundidad (Huang y colaboradores, 1991 a, b). La imagen representa presumiblemente la variación espacial de las propiedades ópticas de la muestra, principalmente el coeficiente de dispersión.

Un ejemplo de un sistema de reflector de baja coherencia que introduce variaciones de camino de la longitud óptica y desplazamientos de frecuencia utilizando una superficie dispersora o reflectora conectada a una etapa de traslación, se trata en la Solicitud de Patente Internacional WO 95/33970. Este sistema usa una leva óptica en su brazo de referencia. El radio de la leva varía y tiene una transición gradual en la cara periférica de la leva para insertar una variación de frecuencia inducida Doppler.

Efectos de la polarización. La interferencia ocurre a la salida del OCM solamente entre las componentes de los campos eléctricos de idéntica polarización que vuelven desde el espejo de referencia y la muestra, respectivamente. Los efectos de birrefringencia en las fibras ópticas o en la muestra pueden alterar la magnitud y la fase relativas de las dos componentes de polarización emitidas por la fuente y reducir así la amplitud de las franjas de interferencia en el fotodetector. Para eliminar problemas en las fibras, algunos trabajadores han usado fibras preservadoras de la polarización y luz polarizada linealmente para eliminar los efectos de dispersión de polarización que conducen a diferentes longitudes de camino óptico para diferentes estados de polarización (Clivaz y colaboradores, 1992). Kobayashi y colaboradores (1991) construyeron un reflectómetro insensible a la polarización separando los dos estados de polarización a la salida del interferómetro y midiendo sus franjas de interferencia con dos detectores independientes. La suma de las salidas del detector es independiente de los efectos de birrefringencia en las fibras o en la muestra. Por otra parte, Wang y colaboradores (1994) idearon un medio sencillo y barato de burlar los efectos de la birrefringencia. Juiciosamente, retorcieron la fibra de referencia introduciendo birrefringencia de tensión, hasta que los estados de polarización de los campos de referencia y de muestra coincidían y la amplitud de las franjas de interferencia se hacía máxima. Más que compensar y eliminar los efectos de birrefringencia, Hee y colaboradores (1992) han construido un reflectómetro de baja coherencia para explotar los cambios de polarización en la muestra. Con este dispositivo fueron capaces de medir las propiedades de birrefringencia de una arteria coronaria de un ternero.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un sistema de microscopio de coherencia óptica de alta resolución para visualizar estructuras que se encuentran por debajo de una superficie de una muestra biológica. El sistema incluye una fuente de luz que emite luz en una longitud de onda entre 700 y 1500 nm. estando la luz dirigida a lo largo de un camino de muestra y un camino de referencia. La longitud de al menos uno de los caminos es un camino modulado que tiene una amplitud seleccionada de modulación que es igual o menor que tres franjas de la longitud de onda. La modulación puede ocurrir a una frecuencia de al menos 50 kHz, 100 kHz, 300 kHz o a una frecuencia más alta. La luz dirigida a lo largo del camino de la muestra puede explorar la muestra biológica, resultando esta exploración en una imagen de una parte de la muestra biológica; la parte puede estar entre 100 \mum y 4000 \mum por debajo de la superficie de la muestra.

La imagen puede incluir una o más capas. Cada capa se puede derivar a partir de múltiples elementos de imagen volumétrica correspondientes todos ellos a sustancialmente la misma profundidad por debajo de la superficie de la muestra. La imagen puede incluir al menos unas 50 capas distintas, cada una de las cuales se deriva de un grupo distinto de elementos de imagen volumétrica, con todos los elementos de imagen volumétrica para capa distinta correspondientes a sustancialmente la misma profundidad distinta por debajo de la superficie de la muestra. Igualmente, la imagen puede incluir elementos de imagen volumétrica combinados de varias capas, de forma que la imagen puede ser una representación tridimensional de la parte de la muestra biológica. El sistema OCM de la invención puede incluir además un volumen de coherencia sobre un plano en el que la longitud de la muestra sea igual a la longitud del camino de referencia, de forma que el volumen de referencia exista por debajo de la superficie de la muestra biológica.

La luz proveniente del camino de la muestra puede entrar en la muestra y concentrarse en un diámetro de anchura de haz de no más de 20 \mum dentro de la muestra. La anchura del haz es coincidente con el volumen de coherencia, de forma que la resolución de las estructuras dentro de la muestra es una distancia menor o igual al diámetro de la anchura del haz.

La invención proporciona además un procedimiento para visualizar una estructura por debajo de una superficie de una muestra biológica, empleando el sistema OCM descrito en este documento. El sistema OCM permite también un procedimiento para analizar una función biológica basado en una visualización de los cambios en vivo en estructuras bajo una superficie de una muestra biológica. La función que vaya a ser analizada puede incluir, por ejemplo, la regulación de genes, desarrollo, respuesta de mensajero y tensión.

La invención proporciona también un procedimiento para visualizar una estructura bajo una superficie de una muestra biológica. El procedimiento puede incluir los pasos de: proporcionar luz que tenga una longitud de onda entre 700 y 1500 nm; dividir la luz en un camino de luz de muestra y un camino de luz de referencia; modular la longitud de al menos uno de los caminos de luz a una amplitud no mayor de 3 franjas de la longitud de onda; dirigir la luz desde el camino de muestra a la muestra biológica, de forma que la luz se concentre en una anchura de haz a una profundidad seleccionada por debajo de la superficie de la muestra, y de forma que la anchura del haz sea coincidente con un volumen de coherencia sobre un plano de igual longitud de camino del camino de la muestra y el camino de referencia; y detectar una imagen a una profundidad seleccionada por debajo de la superficie de la muestra para visualizar la estructura.

De acuerdo con este procedimiento, el paso de dirigir la luz se puede repetir al menos 100 veces, y tras cada paso de direccionamiento, el procedimiento puede incluir el paso adicional de translocalizar el camino de la luz de muestra en una posición diferente en la muestra biológica. La imagen así visualizada puede indicar una diferencia entre una muestra biológica mutante y una muestra biológica no mutante. La imagen puede incluir un patrón de dispersión de luz, en el que el patrón se correla con una característica de la muestra biológica, tal como, por ejemplo, la actividad de los genes, la diferenciación, la elongación de las células, la latencia de las células, la respuesta a tensión, y respuesta patógena.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa el esquema óptico de un microscopio de coherencia óptica de fibra óptica (OCM).

La figura 2 es una imagen de un rayado de Ronchi visualizada a través de 1,2 mm de una solución altamente dispersiva de esferas de látex de poliestireno.

La figura 3 es una gráfica típica de la amplitud de franja OCM frente a la profundidad, promediada sobre cortes horizontales en una preparación de planta.

La figura 4 es una gráfica típica de la amplitud de franja OCM frente a la profundidad, promediada sobre cortes horizontales en una preparación de rana.

La figura 5 ilustra la relación entre el ruido en el haz de referencia frente a la potencia del haz de referencia.

La figura 6 muestra la impedancia de elementos piezoeléctricos montados y desmontados como una función de la frecuencia de la tensión de control.

La figura 7 muestra el desplazamiento del elemento piezoeléctrico por voltio aplicado a cada una de las frecuencias de resonancia.

La figura 8 ilustra la dependencia de la fase de la señal de franja de salida.

La figura 9 muestra los valores experimentales para las potencias de la señal de salida del interferómetro en los primeros dos armónicos como una función de la tensión de control piezoeléctrica.

La figura 10 es un esquema óptico de un OCM modificado.

Descripción detallada de la realización preferida

La presente invención describe un microscopio de coherencia óptica capaz de abordar los problemas fundamentales en la biología experimental. Se presentan en este documento los resultados para dos sistemas experimentales ejemplo, la rana Xenopus laevis y la planta Arabidopsis thaliana. La invención es igualmente adecuada para su aplicación a otros numerosos taxos, incluyendo por ejemplo, Drosophila, pez cebra y virtualmente cualquier planta importante en agricultura o en ciencia. La presente invención también es ampliamente aplicable a otros sistemas biológicos en los que los eventos, estructuras, células y/o procesos que se vayan a visualizar no son accesibles por medio de la microscopía de luz. La invención es particularmente adecuada para los estudios de biología experimental de estructuras y eventos dentro de 4 mm, preferiblemente dentro de 3 mm, de manera más preferible dentro de 2 mm, y más preferiblemente dentro de 1 mm, de una superficie de tejido. Igualmente, la invención contempla el uso del OCM contemplado para otros propósitos, tales como, por ejemplo, diagnósticos y análisis genómico funcional. Siguiente a los procedimientos descritos en este documento, se pueden adquirir en menos de un minuto los datos para una imagen tridimensional formada mediante el apilamiento de imágenes laterales sucesivas provenientes de diferentes profundidades. De acuerdo con esto, la presente invención es particularmente adecuada para el análisis genómico funcional de alto rendimiento, teniendo cada OCM la capacidad de hacer un seguimiento del desarrollo y otros eventos regulados por genes en muchas plantas por día. En este aspecto de la invención, se pueden analizar 25, 50, 100, 250, 500 ó más plantas por día, dependiendo de la naturaleza del análisis.

Biología experimental-Xenopus laevis.La resolución del OCM lo hace idealmente adecuado para el siguiente desarrollo dentro de el embrión de anfibios, donde el tamaño de una sola célula es mayor de 10 \mum y tienen lugar eventos de desarrollo críticos dentro de los primeros pocos cientos de micras. La microscopía más convencional (microscopía cofocal, videomicroscopía) no es adecuada para el seguimiento de la mayoría del desarrollo embrionario debido a la naturaleza altamente dispersiva del citoplasma del embrión de la rana y las aberraciones ópticas inherentes en la profundidad de imagen cofocal dentro de los tejidos (Schmitt y colaboradores, 1994b). Recientemente, usando un microscopio MRI, Jacobs y Fraser (1994) fueron capaces de seguir los eventos en el interior de un embrión de rana durante la gastrulación y neurulación. Sorprendentemente, observaron que las células más profundas (mesodermo) y las células de la superficie (ectodermo) se extendían a velocidades diferentes. Los análisis previos realizados sobre fragmentos explantados de tejido embrionario han sugerido que los tejidos del ectodermo y del mesodermo se extendían por el eje embrionario casi conjuntamente (Keller, 1986). Es deseable examinar las relaciones exactas entre estos tejidos ya que se cree desde hace tiempo que las señales que circulan desde el mesodermo hasta el ectodermo juegan un papel fundamental en el establecimiento y configuración del sistema nervioso embrionario.

Biología experimental-Arabidopsis thaliana

El cuerpo de la planta es de una formación predominantemente postembrionaria a través de la actividad de tejidos especializados denominados meristemos (Steeves y Sussex, 1989). Los conocimientos actuales sobre los mecanismos moleculares que gobiernan la función y formación de los meristemos es muy limitada. Recientemente, sin embargo, se han producido avances en la comprensión de la formación de los meristemos a través del análisis genético del pequeño crucífero Arabidopsis thaliana (Mayer y colaboradores, 1991; Barton y Poethig, 1993). En la Arabidopsis se forman de forma embrionaria dos meristemos, los meristemos primarios de la raíz primaria y de apical de brote, mientras que los meristemos secundarios (laterales) de raíz y brote aparecen de manera postembrionaria. Se han usado aproximaciones moleculares y genéticas con el fin de identificar los genes requeridos para la formación de los meristemos de raíz (William y Sussex, 1995; Laskowski y colaboradores, 1995). Como resultado, es ahora posible asignar etapas al desarrollo de los meristemos laterales de raíz en base a sus características morfológicas.

El meristemo apical del brote de la Arabidopsis cae por debajo de la superficie, y un embrión de la Arabidopsis cae dentro de una capa de células pigmentadas. Como resultado, hasta ahora el desarrollo en el embrión de la raíz primaria y de los meristemos apical del brote podría ser visualizado solamente fijando y seccionando o diseccionando el embrión del tejido materno. Estos procedimientos obviamente evitan la observación continua del desarrollo dentro del mismo meristemo.

De manera postembrional, el meristemo apical del brote forma la vasta porción de tejidos y de órganos en una planta (por ejemplo, las hojas). Las hojas son iniciadas directamente sobre los costados del meristemo apical del brote a través de una expansión simétrica del meristemo, llevando a un abultamiento que tras una expansión unidireccional adicional pasa a estar claramente delimitado como el primordio de la hoja (Steeves y Sussex, 1989). Experimentos quirúrgicos han demostrado que los primordios de hoja previamente iniciados tienen un efecto inhibidor sobre el posicionamiento del primordio posterior, causando que éste último se forme sobre el punto más alejado de las dos hojas previamente iniciadas (Snow y Snow, 1962). Si este efecto inhibidor es debido a factores químicos o físicos aún no está claro (Smith y Hake, 1992; Hernández y Green, 1993; Green, 1994). Las aproximaciones tradicionales al estudio de filotaxia (el patrón de la iniciación de la hoja) han requerido alguna clase de disección para eliminar los tejidos superiores con el fin de ver el meristemo apical del brote. El uso de OCM para seguir de manera no invasora el patrón de la iniciación de la hoja en la Arabidopsis evita la alteración del entorno bioquímico y físico de la planta. Es posible ver procesos en el meristemo apical, vértice del brote y otros tejidos y órganos profundamente enterrados. Por ejemplo, el OCM permite la detección de la iniciación de órganos, dorsoventralidad y otros procesos profundamente enterrados en 1 a 2 milímetros de tejido a una resolución de al menos 10 \mum. Estas dimensiones caen dentro de los intervalos óptimos de OCM y no son adecuadas para su análisis por medio de otras técnicas. Como un ejemplo, OCM permite la observación de patrones alterados de filotaxia que surge a partir de mutaciones genéticas o de la aplicación exógena de hormonas. Además, una alta cantidad de luz dispersada hacia atrás detectada en células y tejidos por medio de OCM se correla fuertemente con las células y tejidos que se conocen que son activos en la transcripción y en la diferenciación. De esta forma, OCM proporciona una herramienta para hacer un seguimiento de procesos activos, naturales o inducidos en vivo. La presente invención contempla de esta forma de manera expresa el uso de realizaciones OCM de la invención en varias aproximaciones a los siguientes procesos biológicos activos incluyendo, por ejemplo, análisis genómico funcional, estudios experimentales, seguimiento de respuestas a señales biológicas tales como hormonas y elicitores patógenos y similares.

Microscopio de coherencia óptica. El microscopio de la invención es capaz de imágenes de células situadas por debajo de la superficie del tejido vivo, incluso aunque la dispersión de la luz en la muestra se mostrase opaca a un microscopio de luz convencional o un microscopio cofocal. La penetración de profundidad se consigue mediante el uso de una fuente de luz de diodo infrarrojo superluminiscente con una longitud de coherencia de 20 \mum junto con una puerta de coherencia basada en un interferómetro de Michelson. La combinación excluye la luz dispersada hacia atrás desde los planos fuera del foco, dando una resolución de profundidad de 10 \mum. La resolución lateral de 10 \mum o mejor se consigue mediante la focalización del haz iluminador en un punto pequeño. La exploración lateral de dos dimensiones del punto del haz produce una sección óptica a una profundidad fija en la muestra. Una imagen en tres dimensiones se obtiene mediante el apilamiento sucesivo de las secciones ópticas a diferentes profundidades. Dichas exploraciones en tres dimensiones típicamente duran menos de un minuto.

La figura 1 presenta el esquema óptico de un OCM de fibra óptica. El diodo superluminiscente (SLD) es un diodo láser con facetas terminales que han sido recubiertas antirreflexiones de manera que no ocurra el laseado, y de esta forma, la anchura espectral completa de la transición aparece a la salida. La longitud de onda central cae en el infrarrojo cercano (por ejemplo, 850 nm) donde el coeficiente de absorción del tejido biológico está casi en su mínimo. Asumiendo un perfil espectral gaussiano, una anchura espectral de anchura completa a medio máximo (FWHM) de 30 nm del SLD produce una resolución de profundidad final (FWHM de la función de visibilidad gaussiana) de 11 \mum/n, donde el índice de refracción n del tejido está cerca de 1,40 (Bolin y colaboradores, 1989). El haz láser de helio-neón (633 nm) sirve simplemente para visualizar el punto focalizado, y ambos haces son acoplados en fibras ópticas monomodo. Las dos fibras son combinadas en una región fusionada denominada "acoplador 2 x 1".

Cada haz fuente es dividido y enviado a lo largo de los dos caminos del interferómetro de Michelson por medio del acoplador 2 x 2, una región fusionada similar de las dos fibras que combina sus modos espaciales. La fibra de camino de la muestra está terminada con una lente colimada aesférica, y el haz es entonces focalizado por medio de una lente doble en un diámetro de punto de 9 \mum. El montaje de fibra de muestra/lente focalizadora se monta sobre una etapa de exploración de tres dimensiones que consiste en una etapa de traslación de una dimensión alimentada por medio de un motor de CC y un par de galvo-escáneres en un montaje x-y. Los galvo-escáneres de bucle cerrado exploran por líneas el plano horizontal mientras que el motor CC de bucle cerrado avanza gradualmente a lo largo de la dimensión de profundidad, de forma que la abertura del haz focalizado explore un volumen de muestra y se forme una imagen OCM. La fibra de camino de referencia está terminada también con una lente de colimación aesférica y es conducida a un espejo de referencia (retrorreflector) que está montado sobre otra etapa de traslación controlada por medio de un motor CC de bucle cerrado. A medida que el montaje de fibra de muestra/lente de focalización es movido gradualmente a lo largo de la dimensión de profundidad, el espejo de referencia es trasladado para conservar la apertura de haz coincidente con el volumen de coherencia (posición de iguales longitudes de camino en el interferómetro). Este último punto es importante porque el intervalo Raileigh del haz focalizado es aproximadamente de 60 \mum, de forma que el haz se expande rápidamente y la resolución lateral se degrada rápidamente a medida que el volumen de coherencia se desvía de la apertura de haz.

En una realización, el instrumento puede incluir también cilindros piezoeléctricos de ajuste alrededor de los cuales se envuelven la fibra de camino de referencia y la fibra de camino de muestra. En respuesta a una tensión aplicada, la circunferencia de cada cilindro cambia ligeramente, dando como resultado un cambio en la longitud del camino óptico de las fibras. Si los cilindros piezoeléctricos están controlados (desfasados 180º) por medio de una señal de tensión triangular con una frecuencia de, por ejemplo, 8,3 kHz, los cambios resultantes en las longitudes de fibra modulan la diferencia de longitud de camino óptico entre los dos brazos del interferómetro. Si la amplitud de la tensión piezoeléctrica de control se elige de manera que las variaciones de longitud de camino óptico sean de \pm 1,5 \lambda, el patrón de interferencia a la salida del interferómetro estará modulada a 100 kHz, una frecuencia que es fácilmente aislada por medio de un filtro paso banda eléctrico para incrementar la relación señal a ruido. Realizaciones alternativas pueden emplear una pila piezoeléctrica con un espejo unido a la misma como manera de conseguir cambios de longitud de alta frecuencia en un camino de luz. Esa realización está descrita con más detalle en el ejemplo 1 más
adelante.

Técnicas de exploración. Se pueden usar dos procedimientos generales diferentes para explorar una muestra y para crear una imagen OCM. Primero, uno puede realizar una exploración lateral en dos dimensiones a una profundidad fijada, después incrementar la profundidad, después realizar otra exploración lateral, etc. Se construye entonces una imagen en tres dimensiones de un volumen de muestra por medio del apilamiento sucesivo de secciones ópticas en dos dimensiones que son paralelas a la superficie de la muestra. En contraste con esto, la mayoría de los investigadores (véase por ejemplo, Huang y colaboradores, 1991 a) realizan una exploración longitudinal (profundidad) en un punto transversal fijado, después trasladan el haz lateralmente en una sola dirección y repiten la exploración longitudinal, etc. Típicamente, se forma entonces una sección óptica en dos dimensiones que es perpendicular a la superficie de la muestra, teniendo una dimensión de profundidad y una dimensión lateral. Cada exploración longitudinal es llevada a cabo por medio de la traslación del espejo de referencia a velocidades de hasta 160 mm/s (Hee y colaboradores, 1994). La luz reflejada del espejo móvil de referencia es entonces desplazada Doppler hasta 380 kHz, y el filtro eléctrico paso banda se puede fijar a esa frecuencia. En este caso no hay necesidad de modulación del patrón de interferencia proporcionado por los cristales piezoeléctricos incluidos en la figura 1. Sin embargo, con esta técnica de desplazamiento Doppler, es difícil conservar la apertura del haz coincidente con el volumen de coherencia, dando como resultado una resolución lateral degradada. Para las imágenes de embriones, es preferible explorar en ambas direcciones laterales para crear una sección óptica a una profundidad dada.

Focalización del haz. La resolución lateral de una imagen OCM es determinada por medio del tamaño del haz focalizado. De esta manera, para una buena resolución, es beneficioso usar un punto focalizado menor de 10 \mum de diámetro. En una realización del OCM (véase la figura 1), la fibra de muestra está terminada con una lente de colimación aesférica (f = 6,2 mm, Óptica OZ) de forma que el haz emergente tiene un diámetro I/e^{2} de 1,4 mm y un semiángulo de divergencia de 0,4 mrad. Las posteriores lentes dobles de focalización (f = 10 mm, Melles Griot, 06LAI001) está diseñada para minimizar la aberración esférica a 830 nm y produce un tamaño de punto de difracción casi limitada con un diámetro I/e^{2} de 8 \mum.

Se puede probar una disposición de focalización seleccionada por medio de la imagen de un rayado de Ronchi a través de 1,2 mm de una solución altamente dispersante de esferas de látex de poliestireno. El rayado de Ronchi consiste en tiras de anchura de 10 \mum de cromo depositadas sobre un calzo de cubierta de vidrio. Las tiras de cromo están separadas por tiras de 10 \mum de vidrio limpio. La solución altamente dispersante sirve como una trasparencia de tejido y consiste en esferas de látex de poliestireno de 0,523 \mum. La solución tiene un coeficiente de dispersión \mu_{s}' = (1 - g) \mu_{s} de 10/cm, donde el parámetro de asimetría g es igual al coseno medio del ángulo de dispersión. La solución de esfera representa casi 5 profundidades ópticas y aparece opaca al ojo desasistido o a través de un microscopio convencional. A partir de un análisis detallado de imágenes como las de la figura 2, se determinó que el diámetro I/e^{2} de la apertura del haz era de 8,8 \pm 0,2 \mum, justo ligeramente más grande que el tamaño de punto limitado por difracción de 8 \mum.

Tiempo de adquisición de la imagen. En el diseño y en la construcción de un OCM para la obtención de imágenes en biología experimental y biotecnología, un factor crítico es el tiempo necesario para adquirir una imagen. Ciertamente este tiempo debería ser más corto comparado con el tiempo medio entre divisiones celulares, y sería de ayuda si el tiempo de adquisición fuese lo suficientemente corto para eliminar el movimiento bruto del embrión. El fenómeno físico fundamental que pone un mínimo sobre el tiempo de adquisición es el ruido de fotón. Por ejemplo, para obtener un 3% de precisión en la señal recogida en cada elemento de imagen volumétrica en una imagen en tres dimensiones de un embrión, asumiendo las estadísticas de Poisson, debe haber unos 10^{3} fotones en la señal recogida para un elemento de imagen volumétrica promedio. De esta manera, para representar en imagen un cubo de 500 \mum a una resolución de 10 \mum en cada dirección, y un paso de exploración de 5 \mum en cada dirección, se deben recoger entonces los datos de 100 x 100 x 100 = 10^{6} elementos de imagen volumétrica. El número total de fotones requerido es por lo tanto de 10^{6} x 10^{3} = 10^{9} fotones.

La señal recogida es proporcional a la amplitud de las franjas de interferencia a la salida del interferómetro. El término de interferencia es proporcional al campo eléctrico dispersado hacia atrás desde un elemento de imagen volumétrica, de forma que la señal recogida es proporcional a la raíz cuadrada de la potencia dispersada hacia atrás (Izatt y colaboradores, 1994a). Si P_{0} es la potencia incidente sobre el interferómetro, y P(z) es la potencia que retorna desde un elemento de imagen volumétrica a profundidad z, entonces:

(1)Señal \varpropto \text{raíz cuadrada} \ P_{0} (P(z)) P_{0)}

Representación de imágenes OCM

Aunque se han reflejado en literatura varias imágenes OCM de tejido biológico vivo (Swanson y colaboradores, 1993; Hee y colaboradores, 1994; Schmitt y colaboradores, 1994c, d, Bouma y colaboradores, 1995), permanece por hacer una gran cantidad de trabajo en la identificación de las características ópticas precisas de la muestra que dan lugar a las características en la imagen OCM. Schmitt y colaboradores (1993, 1994a) han mostrado que en medios débilmente dispersivos, la potencia que retorna de un volumen de muestra a una profundidad z en un instrumento OCM viene dada por:

(2)P(z) = P_{0} \ exp(-2\mu_{t} z)\cdot \ \mu_{back}l_{coh}/2

donde P_{0} es la potencia incidente sobre el interferómetro, \mu_{t} = \mu_{s} + \mu_{a} el coeficiente de atenuación total igual a la suma de los coeficientes de dispersión y de absorción del medio (unidades de 1/m), \mu_{back} es el coeficiente de dispersión hacia atrás (1/m), y l_{coh} es la longitud de coherencia de la fuente. En la ecuación (2), P_{0} exp(-\mu_{t} z) es la potencia que alcanza una profundidad z en la muestra sin ser dispersada o absorbida, \mu_{back} l_{coh}/2 es la fracción de esa potencia que es dispersada hacia atrás y que puede interferir de manera coherente a la salida del interferómetro, y exp(-\mu_{t} z) es la fracción de la luz dispersada hacia atrás que alcanza la superficie del medio sin ser dispersada o absorbida. Como apuntó Schmitt y colaboradores (1993), los datos OCM se pueden usar junto con las ecuaciones (1) y (2) para deducir valores de \mu_{t} y de \mu_{back} en el tejido. De hecho, Clivaz y colaboradores (1992) han usado OCM para medir las propiedades de dispersión, índice de refracción y grosor de las paredes arteriales.

Schmitt y colaboradores (1994a) usaron simulaciones Monte Carlo para mostrar que el modelo de dispersión simple de la ecuación (2) es válido en un medio de hasta 4 ó 5 profundidades ópticas (4 ó 5/\mu_{t}). Usando OCM, Schmitt y colaboradores (1993) midieron \mu_{t} para que fuese de unos 5/mm (y \mu_{back} para que fuese de unos 1,5/mm) en la dermis del dedo y del antebrazo humano. A profundidades ópticas mayores de 4 ó 5, la dispersión múltiple comienza a ser importante, y la resolución se puede degradar. Por otra parte, Izatt y colaboradores (1994a) muestran que el OCM tiene su mayor ventaja sobre la microscopía cofocal entre 5 y 15 profundidades ópticas.

Schmitt y colaboradores (1994c) estudiaron las paredes de las arterias coronarias de la rata recién cortadas con OCM. Usando puntos de haz focalizados con diámetros que oscilan entre 8 y 17 \mum, midieron los coeficientes de atenuación total más altos con puntos de haz más grandes. Concluyeron que el incremento en la \mu_{t} medida era un resultado de la degradación de la coherencia espacial a través del haz con un diámetro de haz creciente. Especularon que esta degradación era debida a las fluctuaciones espaciales en el índice de refracción de las paredes arteriales, y sugirieron una estructura matemática basada en la función de coherencia mutua del haz que podría comenzar a describir de manera cuantitativa la pérdida observada en la coherencia espacial.

Una representación minuciosa de las imágenes OCM del tejido biológico requiere una elucidación del origen de la dispersión y de la absorción en el tejido. Por ejemplo, uno puede imaginar dos tipos de dispersión desde un grupo de células: (1) dispersión desde órganos de célula que deberían llevar a la dispersión sobre todos los ángulos de dispersión, quizá ligeramente ponderada hacia ángulos delanteros, y (2) reflexiones de Fresnel desde desajustes de índice de refracción tales como podría ocurrir en la interfaz extracelular/intracelular. La última dispersión debería ser altamente direccional y se hace referencia a la misma como la refracción "especular". Por supuesto, ambos tipos (1) y (2) surgen de inhomogeneidades en el índice de refracción, pero la dependencia angular es completamente distinta. Además, hay un cambio de fase de 180º en el tipo (2) de dispersión cuando el índice de refracción es desde un medio con un índice de refracción más alto.

Calibración del OCM. Es deseable idear numerosos procedimientos de calibración para el OCM. Un procedimiento de calibración importante es usar el OCM para examinar trasparencias de tejido con propiedades ópticas y dimensiones físicas cuidadosamente construidas. Por ejemplo, la exploración longitudinal de una OCM se puede comprobar examinando las trasparencias consistentes en capaz homogéneas de soluciones altamente dispersivas con profundidades definidas de manera precisa por calzos de cubierta de microscopio. Las soluciones pueden ser hechas de esferas de látex de poliestireno de intralípido, una emulsión de grasa usada para la alimentación intravenosa en hospitales. Las esferas están disponibles en diámetros precisos; la teoría de Mie se puede usar para calcular el coeficiente de dispersión de las soluciones de esfera así como el parámetro de asimetría g, el coseno medio del ángulo de dispersión. Los intralípidos contienen un amplio continuo de tamaños de partículas, pero sus propiedades ópticas han sido estudiadas de manera exhaustiva porque es menos caro que las esferas de látex (Driver y colaboradores, 1989; Flock y colaboradores, 1987, 1992; van Staveren yo colaboradores, 1991). Se pueden medir valores de \mu_{t} para soluciones de esferas e intralípidos con un espectrofotómetro usando una técnica de dilución sucesiva.

La resolución lateral y de profundidad se puede comprobar colocando un blanco de resolución o una retícula de calibración de microscopio en una interfaz entre capas en una trasparencia de tejido. (Véase la imagen de un rayado de Ronchi en la figura 2). Se pueden usar las pendientes, intercepciones y discontinuidades en los datos de una exploración longitudinal para deducir \mu_{t} y \mu_{back} para las distintas capas de una trasparencia (Schmitt y colaboradores, 1993). Las exploraciones de una solución de esferas de poliestireno (usadas también en la figura 2) mostradas que midieron la visibilidad de franja caen de manera exponencial con la profundidad como predice la ecuación (2), y un valor para \mu_{t} de 38,4 \pm 0,2/cm. Una serie de medidas de espectrofotómetro produjeron \mu_{t} de 40,0 \pm 0,1/cm. La discrepancia es probablemente debida a la pequeña contribución de fotones múltiplemente dispersados.

Imágenes del OCM. La adquisición de imagen puede ser controlada por medio de un sistema de ordenador que ejecute un software de visualización, tal como por ejemplo, LabView (de National Instruments). Como ejemplo, una imagen puede consistir en 500.000 elementos de imagen volumétrica y cubrir un volumen de 1 mm x 1 mm x 1 mm. Por supuesto, la invención se puede aplicar a imágenes de cualquier número de elementos de imagen volumétrica, ya sea de menos de 500.000n elementos de imagen volumétrica o mayor de varios millones de elementos de imagen volumétrica. El número deseado de elementos de imagen volumétrica será seleccionado en base al volumen que se vaya a representar y a la resolución deseada. Las secciones horizontales de imagen se pueden visualizar durante la adquisición de datos, y tras la recogida, una imagen en tres dimensiones puede ser visualizada rápidamente como una serie temporal de secciones horizontales visualizadas sobre la pantalla de un ordenador. Se puede llevar a cabo un examen más extensivo de una imagen en tres dimensiones mediante la transferencia de la imagen a una estación de trabajo Unix que esté ejecutando un paquete software avanzado, tal como por ejemplo, AVS 5.0 (Sistemas de Visualización Avanzada). Una manera particularmente útil de extraer información de una imagen es girar un volumen que represente la imagen, prestando atención al alineamiento de las características estructurales. En una imagen representada por volumen, la contribución de un elemento de imagen volumétrica en la parte trasera del volumen de la imagen está "combinada" con contribuciones provenientes de todos los elementos de imagen volumétrica a lo largo de la línea que se proyecta hacia adelante hacia al píxel final en la imagen en dos dimensiones. Varias de las figuras incluidas con este documento son simplemente imágenes representadas por volumen vistas desde una sola perspectiva, impresas después en una impresora láser en color. El contenido de información de estas imágenes de impresora en color es significativamente menor que las imágenes representadas por volumen giratorias en la pantalla del ordenador.

Propiedades ópticas del tejido de rana y de planta. A partir de las imágenes recogidas del tejido de rana y del tejido de planta, se han deducido valores medios para el coeficiente total de atenuación \mu_{total} = \mu_{s} + \mu_{a}, donde \mu_{s} y \mu_{a} son los coeficientes de dispersión y de absorción. Cuando el haz de 850 nm entra en la muestra, la potencia incidente es atenuada con la profundidad debido a la dispersión y a la absorción. Las figuras 3 y 4 son gráficas típicas de la amplitud de franja OCM frente a la profundidad, promediadas sobre secciones horizontales en las preparaciones de la planta y de la rana, respectivamente. La amplitud de franja es proporcional a la raíz cuadrada de la potencia dispersada hacia atrás desde la muestra, de forma que debería caer exponencialmente con la profundidad de acuerdo con
exp(-\mu_{total} \cdot profundidad). Valores ajustados para \mu_{total} son 15 y 10/mm para el tejido de la planta y para el tejido de la rana, correspondiente a profundidades ópticas (es decir, longitudes de atenuación) de 70 \mum y 100 \mum,

\hbox{respectivamente.}

Diseño de OCM modificada. El OCM modificado es más rápido que el instrumento original ya que las exploraciones x-y son realizadas por medio de espejos galvo-exploradores en lugar de traductores de motor CC. Además, un espejo de referencia montado piezoeléctricamente produce unas franjas de salida a 125 kHz en lugar de la frecuencia de 2 kHz conseguida por medio de la envoltura de la fibra óptica alrededor de un cilindro piezoeléctrico.

La invención contempla también otras modificaciones para OCM. Por ejemplo, se puede conseguir mediante el ensanchamiento de la banda de paso de estos filtros, un bajo tiempo de respuesta para los filtros eléctricos que selectivamente dejan pasar los primeros dos armónicos de la frecuencia de franja. Además, el circuito integrado rms que se puede usar para medir la amplitud de la señal de franja tiene un margen dinámico inherentemente bajo. El procesado digital de la señal (DSP) es por lo tanto una alternativa deseable para los circuitos analógicos. Una solución DSP puede permitir modificaciones en las características del filtro en el software, con la determinación del tiempo de respuesta por medio del número entero de periodos de franja que sean muestreados. El margen dinámico puede ser mejorado de esta manera sobre el circuito rms analógico porque las multiplicaciones son realizadas de manera digital.

Además, el ruido del fotodetector a 100 kHz es de 25 pW/sqrt(Hz), un factor de 8 mayor que la especificación del fabricante (New Focus, Modelo 1801). Sustituyendo un híbrido fotodiodo/amplificador de silicio similar de Advanced Photonix (Modelo SD 100-41-21-23 1), se consiguió un nivel de ruido de 1 pW/sqrt (Hz). El amplificador en el fotodetector Advanced Phoenix tenía un ancho de banda de 400 kHz comparado con los 125 kHz para el detector New Focus. También, el fotodiodo Advanced Photonix funciona con una polarización inversa de 15 voltios, mientras que el diodo New Focus no tiene polarización. Esta reducción en el ruido del fotodetector redujo los niveles de ruido globales hasta el punto del ruido de fotón fundamental. La figura 5 ilustra que la salida del interferómetro OCM típica de 25 \muW está acompañada por el ruido de fotón que es principalmente ruido Bose-Einstein. Esto último quiere decir que el OCM consigue su máxima relación señal a ruido cuando el haz de referencia se corta a 3 \muW.

Las modulaciones de longitud del camino de baja amplitud de la invención son importantes para conseguir una buena resolución axial de la imagen, consecuentes con la longitud de coherencia de la fuente de luz. Las amplitudes deseables en la longitud del camino son lo más significativamente expresadas como una función de la franja de la longitud de onda de la fuente de luz que se esté usando, donde una franja está definida como 1/2 \lambda. Se prefiere una amplitud de unas tres franjas, una amplitud de dos franjas es más preferida, y una amplitud de una franja o menos es lo más preferido. Por ejemplo, con una longitud de onda de 850 nm, 3 franjas - 1275 nm, 2 franjas - 850 nm y 1 franjas = 425 nm.

Ejemplos Ejemplo I Modificaciones al sistema OCM A. Obtención de modulación de alta frecuencia de la longitud de camino por medio de la conexión de un espejo de referencia ligero de peso a una pila piezoeléctrica

1. Modulación de fase rápida. La modulación de fase rápida se consiguió en el interferómetro Michelson del sistema OCM mediante la conexión de un espejo de referencia de peso ligero a una pila piezoeléctrica y controlando la pila a una frecuencia de resonancia de unos 125 kHz. Se examinaron el comportamiento eléctrico de la pila piezoeléctrica y las propiedades mecánicas del montaje del espejo piezoeléctrico. Se consiguió una amplitud de desplazamiento a la resonancia de 400 nm usando un generador de función estándar. Las fluctuaciones lentas en la diferencia de longitud de camino de los dos brazos del interferómetro causaban variaciones en la intensidad rms medida de la señal de franja de salida acoplada en CA. Controlando la pila piezoeléctrica a una amplitud óptima (un desplazamiento de 0,42 \lambda, o ligeramente menor de 1 franja) y sumando las potencias en los dos primeros armónicos de la frecuencia de control piezoeléctrica, se consiguieron las medidas sensibles a la fluctuación de la señal de franja de salida.

Los cristales piezoeléctricos son usados en una variedad de formas para la modulación de fase en interferometría. El espejo en el brazo de referencia de un interferómetro de Michelson es a menudo conectado a la pila piezoeléctrica que es controlada a frecuencias de hasta 10 kHz, muy por debajo de su frecuencia de resonancia. Con amplitudes de control de algunas decenas hasta unos cientos de voltios, se pueden conseguir modulaciones de longitud de camino del orden de unas pocas micras. En los interferómetros de fibra óptica, la fibra se puede arrollar en un gran número de vueltas alrededor de un cilindro piezoeléctrico hueco. Excitando el cilindro hasta frecuencias de unos pocos kHz se consigue expandirlo y contraerlo radialmente, estirando y relajando la fibra de acuerdo con esto, y proporcionando de esta manera la modulación de la longitud de camino óptico. Sin embargo, este procedimiento típicamente requiere decenas de metros de fibra, haciendo el interferómetro sensible a fluctuaciones térmicas que resultan en derivas de la fase de la señal de franja de salida. Otros problemas con esta aproximación pueden incluir desajustes de polarización estática y modulación de birrefringencia dinámica, que requiere un rotador de Faraday para compensación. Se han usado también fibras recubiertas con películas piezoeléctricas. Cuando se aplica una tensión a la chaqueta piezoeléctrica, la fibra se retuerce radialmente y de esta manera incrementa la longitud. De esta manera, se puede conseguir las modulaciones de fase rápida, pero la amplitud de la modulación es típicamente pequeña. Con el fin de producir un cambio en la longitud del camino óptico de 1 \mum a 100 kHz, una fibra recubierta una longitud de 20 cm requeriría más de 100 V de amplitud de excitación.

Con el fin de minimizar el tiempo requerido para recoger una imagen OCM, fue deseable desarrollar un procedimiento de modulación de fase con una frecuencia mayor de 100 kHz y una amplitud de desplazamiento del orden de 1 \mum. Este ejemplo describe el uso de una pila piezoeléctrica que es excitada a una frecuencia de resonancia de 125 kHz para producir una amplitud de desplazamiento de 400 nm con una tensión de excitación pico a pico de solamente 6,7 V.

2. Pruebas del comportamiento eléctrico de las pilas piezoeléctricas. Las pilas piezoeléctricas fabricadas por NEC Corporation de Japón (disponibles en Thorlabs Inc., Newton, NJ, tipo AE0203-D04) fueron probadas para su posible uso en el interferómetro de Michelson del OCM de la invención. Las dimensiones de estos elementos piezoeléctricos son de 2,5 mm x 5 mm x 5 mm, y las especificaciones del fabricante indican un desplazamiento de 3 \mum a 100 Vdc. Como la impedancia del elemento piezoeléctrico decrece inicialmente con el incremento de la frecuencia ( Z = 1/\omegaC, donde C \approx 100 nF), las corrientes más grandes necesarias para mantener esta tensión aplicada podrían llevar a sobrecalentar la pila a frecuencias más altas. En cualquier caso, un generador de funciones de alta potencia sería necesario para el funcionamiento a altas frecuencias. La excitación de los elementos piezoeléctricos a su frecuencia de resonancia, sin embargo, se ha probado que es un procedimiento para burlar estos problemas.

El comportamiento eléctrico del elemento piezoeléctrico desmontado fue probado mediante la medida de su impedancia como una función de la frecuencia (véase la figura 6). A frecuencias muy por debajo de la resonancia, los elementos piezoeléctricos se comportan como un condensador, con la impedancia inversamente proporcional a la frecuencia y la tensión está desfasada de la corriente aproximadamente 90º. A 255 kHz el elemento piezoeléctrico desmontado experimenta una impedancia mínima y la tensión y la corriente están en fase. Se hace referencia comúnmente a esta frecuencia como la frecuencia de resonancia eléctrica del elemento piezoeléctrico. A 330 kHz se produce un máximo en la impedancia, y de nuevo, la tensión y la corriente están en fase - la frecuencia de antirresonancia eléctrica del elemento piezoeléctrico. Entre la resonancia y la antirresonancia, la impedancia se incrementa con la frecuencia, mientras que la tensión se desfasa de la corriente en 90º. A frecuencias más altas de la antirresonancia, el elemento piezoeléctrico muestra de nuevo un comportamiento similar a un condensador.

Se probaron varios elementos piezoeléctricos desmontados del mismo modelo, y se encontró que sus características eléctricas eran consistentes dentro de un porcentaje pequeño. Estas medidas fueron repetidas para una marca diferente de pila piezoeléctrica con dimensiones ligeramente más grandes (3,5 mm x 3,5 mm x 9 mm, de Piezomechanik, Múnich, Alemania). Se observó el mismo tipo de comportamiento con el mínimo y el máximo de la impedancia ocurriendo a 153 kHz y a 191 kHz, respectivamente, por lo tanto a frecuencias más bajas que para los elementos piezoeléctricos NEC más pequeños.

Con el fin de usar la pila piezoeléctrica para la modulación de fase, se conectó un pequeño espejo ligero de peso (1,5 mm x 1,5 mm x 0,1 mm, de Edmund Scientific Co., Barrington, NJ) a su cara con cianoacrilato ("súper-glue"). La pila piezoeléctrica con el espejo conectado fue pegada directamente sobre un montaje de espejo ajustable estándar o pegada sobre un disco de aluminio de 25 mm de diámetro de 5 mm de grosor, que era entonces sostenido por medio de un montaje de espejo. Aunque el pegado del espejo ligero de peso al elemento piezoeléctrico no alteraba su comportamiento eléctrico, la conexión de la pila al disco de aluminio o al montaje de espejo cambiaba de manera significativa las características de resonancia eléctrica del elemento piezoeléctrico en lugar de la simple antirresonancia eléctrica del elemento piezoeléctrico desmontado, varias antirresonancias a frecuencias tanto inferiores como superiores a la frecuencia original aparecida. La figura 6 muestra también la impedancia del elemento piezoeléctrico montado como una función de la frecuencia de la tensión de excitación. Este elemento piezoeléctrico había sido pegado a un disco de aluminio con un epoxi destinado para los conectores de fibra óptica (F 120, de Thorlabs Inc., Newton, NJ).

3. Comportamiento mecánico del espejo piezoeléctrico en un interferómetro de Michelson. El comportamiento mecánico del espejo piezoeléctrico fue probado en un brazo del interferómetro de Michelson con un láser de helio-neón (633 nm) como fuente de luz. En las medidas con el elemento piezoeléctrico montado, se observó que las frecuencias de desplazamiento piezoeléctrico máximo eran aquéllas para la impedancia máxima. La resonancia mecánica del elemento piezoeléctrico es de esta forma coincidente con su antirresonancia eléctrica. A continuación, se hace referencia a estas frecuencias como las resonancias para las que el elemento piezoeléctrico experimenta un máximo en su desplazamiento. La figura 7 muestra el desplazamiento del elemento piezoeléctrico por voltio aplicado a cada una de las frecuencias de resonancia. Para una frecuencia de resonancia particular, se observó que el desplazamiento piezoeléctrico aumentaba de manera lineal con el aumento de la amplitud de la tensión de excitación. Sin embargo, el desplazamiento por voltio varía para las diferentes resonancias del mismo elemento piezoeléctrico y disminuye a las frecuencias más altas. Aunque el desplazamiento por voltio es más alto a la resonancia de 56 kHz en casi un factor de tres, el elemento piezoeléctrico en el interferómetro de Michelson era por el contrario excitado a la resonancia de 125 kHz debido a su frecuencia más alta (véase la sección 5).

Ambas posiciones de las resonancias y las correspondientes amplitudes de desplazamiento eran dependientes de los detalles de montaje del elemento piezoeléctrico de una manera que podría entenderse al menos de manera cuantitativa. La conexión de la pila con súper-glue daba como resultado frecuencias de resonancia más bajas y amplitudes de desplazamiento más grandes que las del caso en el que se usaba epoxi más suave. Este resultado se representa como que la capa muy delgada de súper-glue entre el elemento piezoeléctrico y el sustrato de montaje fuerza al elemento piezoeléctrico a expandirse solamente en la dirección libre. Esto da como resultado un desplazamiento mayor del espejo que cuando se usa una capa más gruesa de epoxi más elástica, presumiblemente porque la epoxi puede ser exprimida mediante la expansión del elemento piezoeléctrico. También, si el elemento piezoeléctrico montado con súper-glue se expande principalmente en la dirección libre, su centro de masa se traslada, en contraste con el elemento piezoeléctrico en la epoxi, que se puede expandir y contraer sobre su centro de masa. El elemento piezoeléctrico montado con súper-glue tiene entonces una masa efectiva más grande cuando resuena, produciendo frecuencias de resonancia más bajas.

De manera similar, el disco sobre el que el elemento piezoeléctrico está montado puede jugar un papel importante en la determinación de las posiciones de las frecuencias de resonancia. Se examinó la diferencia entre los elementos piezoeléctricos NEC pegados con epoxi sobre discos de aluminio de 5 y 10 mm de grosor, ambos de 25 mm de diámetro. Mostraban esencialmente las mismas frecuencias de resonancia entre 100 y 360 kHz, pero la resonancia más baja, que también tiene la amplitud de desplazamiento mayor, estaba desplazada desde 56,7 kHz para el disco de aluminio más delgado hasta 85,6 kHz para el disco de aluminio más grueso. La teoría de placas predice que la frecuencia de resonancia del modo más bajo (membrana) para un disco de aluminio de 25 mm de diámetro y 5 mm de grosor debería ser de 80 kHz y un factor de dos más alto para el disco de 10 mm de grosor. La fórmula usada es válida bajo las suposiciones de que el disco está sujetado rígidamente a su periferia y que el grosor del disco es pequeño comparado con su diámetro. Ninguna de estas suposiciones es bien satisfecha en el presente caso. Una investigación adicional usando un paquete software de análisis de elementos finitos (SAP 2000 No lineal V6.15) reveló que las frecuencias de resonancia son muy sensibles a las condiciones precisas de montaje, con las frecuencias observadas casi consistentes con la técnica de montaje de tres puntos empleada en estas pruebas. Las medidas con dos montajes de espejos de tres puntos de masas diferentes produjeron las mismas resonancias mecánicas y las mismas amplitudes piezoeléctricas. Estas medidas y estos cálculos apoyan la conclusión de que la resonancia de frecuencia más baja para el sistema de pila-epoxi-disco es probablemente una vibración fundamental del disco, mientras que las resonancias a frecuencias más altas pueden ser atribuidas a la parte "piezoeléctrica en epoxi" del sistema.

Los resultados para las frecuencias de resonancia y las amplitudes de desplazamiento para la misma marca de elemento piezoeléctrico y la misma técnica de montaje para el elemento piezoeléctrico no diferían en más de un tanto por ciento pequeño. El hacer funcionar el sistema de espejo piezoeléctrico en el interferómetro de Michelson OCM durante horas a una hora durante el transcurso de un año no ha provocado un desplazamiento en la frecuencia de resonancia o un cambio en el desplazamiento del elemento piezoeléctrico. Incluso tras horas de funcionamiento continuo, la pila no aumenta de temperatura de manera evidente, y el sistema mantiene un alto grado de estabilidad. Con una tensión de excitación de 6,7 V pico a pico, el elemento piezoeléctrico NEC descrito con espejo montado con súper-glue, montado con epoxi sobre un disco de aluminio de 5 mm de grosor, proporciona un desplazamiento de unos 400 nm a una frecuencia de resonancia de 125 kHz, haciéndolo idealmente adecuado para la modulación de fase en el OCM de la invención.

4. Cálculos que determinan la amplitud de modulación óptima. La fuente de luz del diodo superluminiscente (SLD) en el OCM probado tiene una longitud de onda de 850 nm. Por lo tanto, un desplazamiento piezoeléctrico de 400 nm produce una diferencia de longitud de camino total entre la muestra y los brazos de referencia en el OCM menor de una longitud de onda (\lambda), es decir, la modulación menor de una franja. Para dichas modulaciones de longitud de camino pequeñas, la señal de franja de salida del interferómetro tomará diferentes formas claramente dependiendo de la relación de fase inicial entre la muestra y los haces de referencia.

La figura 8 ilustra este punto para una modulación de media franja (desplazamiento piezoeléctrico de 0,25 \lambda). La gráfica (a) de la figura 8 muestra el desplazamiento piezoeléctrico que es simplemente de la forma d_{0} sen (\omegat), donde el desplazamiento pico a pico 2-D_{0} se toma para que sea de 0,25 \lambda. De manera teórica, el término interferencia en la correspondiente intensidad de salida del interferómetro viene dada por:

I_{salida} = I_{0} cos (\alpha sen (\omega t) + \phi)

donde \alpha está relacionado con la amplitud de desplazamiento piezoeléctrico por \alpha = 4\pi d_{0}/ \lambda, y I_{0} es igual a 2
(I_{ref}/I_{muestra})^{1/2}, donde I_{ref} y I_{muestra} son las intensidades devueltas desde los caminos de referencia y de muestra. El gráfico (b) de la figura 8 representa I_{salida} para una diferencia de fase inicial entre los haces de muestra y de referencia de \phi = 0; el gráfico (c) es una traza similar para \phi = \pi/2. Las dos señales son claramente diferentes en su forma y tienen diferentes componentes de Fourier, incluyendo diferentes componentes de CC. En el gráfico (b) la componente más fuerte es la que está a 2\omega, el segundo armónico de la frecuencia de modulación. En el gráfico (c) la componente de Fourier dominante de la señal es la que está en \omega, el fundamental de la frecuencia de excitación. Mediante inspección de las gráficas, también es claro que los valores rms para las señales acopladas CA son diferentes. (La salida del interferómetro debe estar acoplada en CA en el OCM para eliminar la enorme componente CC I_{ref}). Por lo tanto, las derivas aleatorias en la fase entre los haces de muestra y de referencia conducirán a derivas en el valor rms de la salida del interferómetro acopladas en CA.

\newpage

El cálculo de las componentes de Fourier de la señal (1), la potencia P_{1}, en la frecuencia fundamental \omega y la potencia P_{2} en el segundo armónico 2\omega se puede expresar como:

(2)P_{1} = 2 I_{0}{}^{2} J_{1}{}^{2} (\alpha) sen^{2} \phi

(3)P_{2} = 2 I/I_{0}{}^{2} J_{2}{}^{2} (\alpha) cos^{2} \phi

De esta forma, la suma de las potencias en los dos primeros armónicos P_{1} + P_{2} es independiente de \phi solamente para aquellas amplitudes piezoeléctricas para las que J_{1}^{2} (\alpha) = J_{2}^{2} (\alpha). El valor más bajo de \alpha para el que esto ocurre es \alpha = 2,63, lo que conduce a un desplazamiento piezoeléctrico 2-D_{0} de 0,419\lambda. A esta amplitud de modulación particular, la suma P_{1} + P_{2} es independiente de las derivas en la diferencia de longitudes de camino entre los dos brazos y por lo tanto es una medida útil de la intensidad de franja de salida del interferómetro acoplada en CA.

La figura 9 muestra los valores experimentales para las potencias de la señal de salida del interferómetro en los primeros dos armónicos como una función de la tensión de excitación piezoeléctrica. Para cada configuración de la tensión de excitación, se observaron las potencias a 122 kHz y a 244 kHz con un analizador de espectros cuando eran variadas con la fase fluctuante, y se trazaron sus valores máximos. Las líneas continuas y punteadas indican los mejores ajustes a las ecuaciones P_{1} = k_{1}J_{1}^{2} (r_{1}x) y P_{2} = k_{2}J_{2}^{2} (r_{2}x), donde k_{1}, k_{2}, r_{1} y r_{2} son los parámetros de ajuste. Como se esperaba, los valores ajustados de k_{1} y k_{2} eran los mismos dentro del 1%, y los valores de r_{1}x y r_{2}x a una tensión piezoeléctrica de x = 5,95 voltios pico a pico estaban dentro del 1% de 2,63. En este punto, se observó que la suma de potencias P_{1} + P_{2} era independiente de la deriva de la fase.

5. Discusión. Se ha conseguido una alta frecuencia de franja mediante la excitación de un elemento piezoeléctrico a esta misma frecuencia y usando una resonancia piezoeléctrica para obtener una amplitud de modulación de casi una franja. también es posible conseguir altas frecuencias de franja excitando un elemento piezoeléctrico a bajas frecuencias pero con grandes amplitudes de desplazamiento. Envolviendo 100 m de fibra alrededor de un tubo piezoeléctrico, Cruz y colaboradores alcanzaron frecuencias de franja de 1 GHz con una diferencia de longitud de camino pico a pico de 14 mm. En este caso, la deriva de la fase deja de ser un problema debido al largo tren de franjas antes de la ruptura de la fase asociada con la inversión piezoeléctrica. Sin embargo, las grandes diferencias de camino del interferómetro inherentes en esta aproximación son incompatibles con el funcionamiento del OCM de la invención.

El OCM de la invención recoge imágenes en tres dimensiones realizando una serie de exploraciones en dos dimensiones rápidas en planos normales al haz incidente y a intervalos de profundidad regulares en la muestra. Estas dos exploraciones "en cara" en dos dimensiones son realizadas a profundidades determinadas por la posición de longitud de camino igual del interferómetro en la muestra. Como el intervalo de profundidad típico para el OCM es de unas 5 \mum, se debe limitar la modulación en la diferencia de longitud de camino a 1 \mum durante una de las exploraciones en cara. Modulaciones más grandes degradarían la profundidad de resolución del OCM. De esta forma, una pila piezoeléctrica excitada a su frecuencia de resonancia proporciona tanto una alta frecuencia de franja para la adquisición rápida de imágenes OCM como una pequeña amplitud de modulación para una buena resolución de profundidad.

6. Conclusión. Una pila piezoeléctrica, cuando está pegada a un disco de aluminio, visualiza un número de resonancias mecánicas entre 50 y 350 kHz. El elemento piezoeléctrico está excitado a su resonancia de 125 kHz para una modulación rápida de fase en un interferómetro de Michelson. Con una amplitud de tensión de excitación de 6 voltios pico a pico, se consigue un desplazamiento piezoeléctrico de unos 360 nm (0,42 \lambda). El funcionamiento a largo plazo del elemento piezoeléctrico bajo estas condiciones es fiable; en particular, no se han observado calentamientos ni otros daños en la pila. El valor rms medido de la salida del interferómetro acoplada en CA experimenta grandes variaciones debido a la deriva de la fase entre los brazos de referencia y de muestra del interferómetro. Sin embargo, para un desplazamiento piezoeléctrico de 0,42\lambda, la suma de las potencias de los dos primeros armónicos de la frecuencia de excitación proporciona una medida de la salida del interferómetro que depende de las derivas de la
fase.

B. Modificaciones al diseño básico de OCM para mejorar la velocidad de captura de imagen

Se construyó un OCM modificado que es capaz de recoger una imagen de un millón de elementos de imagen volumétrica en menos de un minuto. En la figura 10 aparece un esquema óptico del instrumento. Los cambios clave en el diseño a partir del OCM original implican la introducción de espejos de galvo-exploración para las exploraciones x-y y el uso de un espejo piezoeléctrico montado para la producción de franjas de interferómetro.

1. Espejos de galvoexploración. Un par de galvo-escáneres ortogonales (Modelo 6800-XY, de Cambridge Technology, Inc.) desvían el haz colimado que sale de la fibra de muestra y varía su ángulo de incidencia sobre la lente de focalización, explorando de esta forma el diámetro de apertura del haz a través del plano x-y en la muestra. Se puede hacer funcionar a los galvo-escáneres hasta 1 kHz. El haz emplea 20 microsegundos sobre un elemento de imagen volumétrica, de forma que una exploración lineal a lo largo del eje x de 100 elementos de imagen volumétrica tarda 2 milisegundos. Se hace funcionar el galvo rápido del eje x ligeramente por debajo de 500 Hz. Por lo tanto, se puede tomar una imagen de un millón de elementos de imagen volumétrica en veinte segundos, aunque la sobrecarga en el procesado de cada exploración x-y y el movimiento de los actuadores del motor CC a lo largo del eje z incrementa el tiempo de recogida de 40 a 60 segundos. Los galvo-escáneres se calibraron por medio de la representación de imagen de un rayado de Ronchi con un periodo de 20 \mum.

2. Generación de una franja rápida de interferómetro. El brillo de un elemento de imagen volumétrica en una imagen OCM es proporcional a la amplitud de las franjas de interferómetro OCM. En cada elemento de imagen volumétrica, se debe determinar la amplitud de las franjas. El OCM modificado emplea 20 microsegundos sobre un elemento de imagen volumétrica, de forma que la frecuencia de las franjas debe ser de al menos 50 kHz. Para conseguir esta frecuencia, se pegó un pequeño espejo de referencia (1,5 mm x 1,5 mm x 0,1 mm, Edmund Scientific Co.) a una pila piezoeléctrica (AED203-D04, Thorlabs) con una frecuencia de resonancia de 250 kHz. Cuando el espejo y la pila eran pegados con epoxi a un disco de aluminio (diámetro = 25 mm, grosor = 5 mm), la frecuencia de resonancia se dividía en un número de resonancias, estando una resonancia fuerte a 120 kHz. A esta resonancia, una tensión de excitación de 6 voltios pico a pico es suficiente para desplazar el espejo 0,42 x 850 nm = 357 nm (pico a pico). Esta modificación se revisa con más detalle en el ejemplo IA más adelante.

El espejo/pila piezoeléctrica forma el extremo final del retrorreflector en el brazo de referencia del interferómetro OCM. Cuando se hace oscilar piezoeléctricamente el espejo a 120 kHz, la diferencia de longitud de camino en el interferómetro varía y aparecen 120 franjas a la salida. Las franjas son aisladas con un filtro eléctrico de ancho de banda estrecho, y la salida es enviada entonces a un circuito rms. Un circuito comercialmente disponible es el AD63 7 (Analog Devices) que mide la amplitud de las franjas mejores del 10% en aproximadamente dos periodos de la señal de franja. Dos periodos a 120 kHz equivalen a 17 microsegundos, de forma que el haz emplea 20 microsegundos sobre cada elemento de imagen volumétrica.

3. Eliminación del ruido de fase del interferómetro. Como todos los interferómetros Michelson, la diferencia de longitud de camino entre los brazos de muestra y de referencia del OCM fluctúa lentamente en casi media longitud de onda (una franja) debido a corrientes de aire, efectos de la temperatura, etc. Estas derivas en la fase causan que la señal de franja desplace potencia desde la frecuencia de excitación piezoeléctrica fundamental (120 kHz) a armónicos más altos y a un desplazamiento CC. Como resultado de esto, la salida del circuito rms puede variar de un 30a un 50% incluso cuando la potencia de dispersión del elemento de imagen volumétrica permanece constante. Este problema se soluciona mediante la construcción del filtro eléctrico para pasar las frecuencias fundamental y primer armónico. Además, usando una tensión de excitación sinusoidal para la pila piezoeléctrica, la amplitud de movimiento del espejo de referencia se ajusta a 0,42 x 850 nm = 357 nm (pico a pico). A esta amplitud, la salida del circuito rms es independiente de la deriva de la fase en el interferómetro OCM. Este es un resultado útil para reducir el ruido en una imagen OCM.

4. Eliminación de la deriva de birrefringencia. El diseño del OCM modificado tiene otra ventaja notable sobre el diseño del OCM original. En el OCM original, unos 10 metros de fibra óptica estaban envueltos bajo tensión sobre un cilindro piezoeléctrico. Se aplicaba una tensión de excitación al cilindro, expandiendo y contrayendo la fibra, y provocando la oscilación de la longitud de camino óptico de la fibra. Se insertó un sistema de fibra/cilindro dentro de cada uno de los brazos de muestra y de referencia del interferómetro OCM. Estos dos cilindros piezoeléctricos eran excitados con un desfase de 180º para producir franjas a la salida del interferómetro OCM. La expansión de estas largas longitudes de fibra conducían a una birrefringencia de tensión considerable, y se incorporaban "canales" para girar la fibra de forma sistemática hasta que las longitudes de camino óptico para los dos estados de polarización del haz fuesen iguales. Esta configuración de los canales estaba sometida a fluctuación, conduciendo a curvas de visibilidad deformadas de las franjas del interferómetro.

En el OCM modificado, las longitudes de la fibra óptica en los brazos de muestra y de referencia eran justo de un metro. No se producía el estiramiento de la fibra, y no se apreció distorsión de la curva de visibilidad gaussiana con el tiempo.

Ejemplo II Software para visualizar imágenes OCM en tres dimensiones

Se pueden generar imágenes OCM en tres dimensiones mediante la adaptación del software de visualización disponible, tal como por ejemplo, AVS (Advanced Visual Systems) versión 5.0 para visualizar imágenes OCM en tres dimensiones sobre estaciones de trabajo Unix. Por conveniencia mayor, VISUALIZATION EXPRESS, también de AVS, no requiere una estación de trabajo Unix. VISUALIZATION EXPRESS está escrito en OpenGL, lo que permite que las aplicaciones gráficas sean llevadas a muchas plataformas software/hardware. Este software se adaptó para crear una interfaz gráfica de usuario de cliente denominada "Red Intuitiva" dentro de Visualization Express y que consiguió una flexibilidad y una potencia mayores. A continuación se da una breve descripción de los principios fundamentales de este paquete software de visualización de imágenes.

Principios de representación de volumen

Durante la adquisición de la imagen, el OCM asigna un solo número a cada uno del casi millón de elementos de imagen volumétrica explorados en el volumen de muestra. Para una primera aproximación, este número es una medida de la potencia dispersada de luz del elemento de imagen volumétrica asociado. Para visualizar uno de estos volúmenes de datos en tres dimensiones, todos los elementos de imagen volumétrica deben ser proyectados sobre una pantalla de ordenador en dos dimensiones para su visualización. El procedimiento de proyección de elementos de imagen volumétrica, incluyendo la asignación de los pesos relativos de los elementos de imagen volumétrica profundos dentro del volumen frente a la cercanía a la superficie del volumen, es denominada representación del volumen.

El algoritmo básico para la representación de volumen es la traza del rayo. Cada píxel de la imagen en dos dimensiones que vaya a ser generada sobre la pantalla del ordenador determina un rayo que es conducido desde el píxel en la pantalla en dos dimensiones a través del volumen de datos en tres dimensiones. Se emplea una "proyección paralela", en la que los rayos proyectados son paralelos unos a los otros. Todos los elementos de imagen volumétrica del volumen a lo largo de un rayo contribuyen al valor del píxel correspondiente en la pantalla del ordenador de dos dimensiones. Como un rayo no siempre viaja a través de los centros de los elementos de imagen volumétrica que el propio rayo intersecta, hay diferentes maneras de calcular (o "combinar") las contribuciones de elementos de imagen volumétrica a lo largo del rayo. Por ejemplo, uno puede considerar todos los elementos de imagen volumétrica en la cercanía del rayo y calcular la suma de sus contenidos de elemento de imagen volumétrica ponderado inversamente por sus distancias al rayo. De manera alternativa, por simplicidad, y por lo tanto costes de cálculo reducidos, uno puede usar solamente aquellos elementos de imagen volumétrica penetrados por el rayo y sumar sus contenidos de elemento de imagen volumétrica (sin ponderar).

Otra característica implicada en la combinación de elementos de imagen volumétrica a lo largo de un rayo es el factor de "opacidad". El contenido de cada elemento de imagen volumétrica es multiplicado por el factor de opacidad mientras se forma la suma a lo largo de un rayo dado. Si el factor de opacidad para todos los elementos de imagen volumétrica es cero, ningún elemento de imagen volumétrica contribuye a un píxel, y el píxel es negro. Si el factor de opacidad para todos los elementos de imagen volumétrica es uno, se suman los contenidos de elemento de imagen volumétrica a lo largo del rayo y el píxel resultante puede contener un gran número, quizá un número que represente saturación. Los valores pequeños para el factor de opacidad tienden a evitar la saturación y permiten profundidad de elementos de imagen volumétrica en el volumen de la imagen para contribuir de manera significativa al píxel correspondiente. Esto es, los valores pequeños del factor de opacidad tienden a otorgar una apariencia más "transparente" al volumen de la imagen.

Uso de color falso. El OCM de la invención asigna un número bruto (nivel de gris) a un elemento de imagen volumétrica en base a su potencia de dispersión de luz medida. AVS VISUALIZATION EXPRESS usa color falso para ayudar a distinguir diferentes niveles de gris en los contenidos de elemento de imagen volumétrica brutos. Se usaron dos maneras diferentes para implementar color falso en los algoritmos de representación de volumen disponibles en AVS Express. La manera más sencilla, denominada "SFP", es aplicar el algoritmo de traza del rayo para la representación de volumen (descrito anteriormente) para los contenidos brutos de escala de gris de los elementos de imagen volumétrica. Los píxeles resultantes en dos dimensiones son entonces codificados en color, por ejemplo, se asigna a los píxeles débiles el color azul y a los píxeles intensos el color rojo. Sin embargo, en este procedimiento, una región particular del volumen tridimensional puede cambiar de color de manera drástica cuando el volumen es visualizado desde diferentes posiciones ventajosas. Por ejemplo, se pueden superponer dos elementos de imagen volumétrica verdes a lo largo de una línea particular de visión para producir un píxel rojo.

Más preferido es un segundo procedimiento de implementación de color falso en AVS Express. En el procedimiento de representación de volumen denominado "DC", los contenidos brutos de los elementos de imagen volumétrica se codifican en color, es decir, los valores para el rojo, verde y azul son asignados a cada elemento de imagen volumétrica en base a los niveles brutos de gris del elemento de imagen volumétrica. Entonces, el algoritmo de traza de rayo resultante para la representación de volumen se ejecuta de manera independiente para los tres colores para generar una imagen coloreada en dos dimensiones sobre la pantalla del ordenador. Este procedimiento DC superpone de hecho dos elementos de imagen volumétrica verdes para producir un píxel verde intenso. De esta manera, una región del volumen de la imagen con una intensidad particular de dispersión de luz retendrá su color, al menos aproximadamente, mientras el volumen es girado en la pantalla.

El software permite examinar los aspectos anatómicos, morfológicos e histológicos de plantas, ranas y otros organismos. Ejemplos de configuraciones del software AVS son de la siguiente forma:

Algoritmo de traza del rayo : compuesto directo

Interpolación: trilineal

Puntos de control:

\hskip1cm

Posición del punto de control 1: 2

\hskip1cm

Posición del punto de control 2: 23

Parámetros del intervalo 1:

Transparencia izquierda = 1,0

\hskip1cm Color = 0

\hskip1cm Saturación = 0

\hskip1cm Valor = 0

Transparencia derecha = 1,0

\hskip1cm Color = 0,66

\hskip1cm Saturación = 1,0

\hskip1cm Valor = 1,0

Parámetros del intervalo 2:

Transparencia izquierda = 0,91

\hskip1cm Color = 0,66

\hskip1cm Saturación = 1,0

\hskip1cm Valor = 1,0

Transparencia derecha = 0,95

\hskip1cm Color = 0

\hskip1cm Saturación = 1,0

\hskip1cm Valor = 1,0

Parámetros del intervalo 3:

Transparencia izquierda = 0,69

\hskip1cm Color = 0

\hskip1cm Saturación = 1,0

\hskip1cm Valor = 1,0

Transparencia derecha = 1,0

\hskip1cm Color = 0

\hskip1cm Saturación = 1,0

\hskip1cm Valor = 1,0

Ejemplo III Biología experimental de la planta Arabidopsis thaliana

Para estudiar la formación del meristemo en el embrión en desarrollo, se hicieron crecer las plantas en cuatro macetas de cuatro pulgadas en suelo en una cámara de crecimiento bajo duraciones del día de dieciséis horas, para acelerar la transición al crecimiento reproductivo. Durante la formación de la flor, los internodos de la Arabidopsis se alargan de manera importante. De esta manera se colocó fácilmente una sola silicua , con sus embriones en desarrollo dentro, entre dos láminas de cristal de microscopio sin interferir con el resto de la planta o eliminar la silicua de la planta. La silicua se montó poco después de la fertilización para seguir el desarrollo de los embriones en el transcurso de los pocos días (a partir de un embrión globular a un embrión completamente dilatado). Las imágenes OCM permitieron una observación precisa del desarrollo de un solo embrión con el tiempo. El patrón de desarrollo en embriones de tipo silvestre se comparó con aquellos patrones de embriones mutantes para ganar una mejor percepción dentro de los patrones embriogénicos alterados.

El OCM se usó también para estudiar los cambios temporales en el meristemo apical del brote y en el vértice del brote durante las sucesivas iniciaciones de la hoja. Para estas observaciones, se hicieron crecer las plantas en macetas de cuatro pulgadas en suelo bajo duraciones del día de ocho horas, para inhibir la transición desde el desarrollo vegetativo a reproductivo. Estas condiciones de crecimiento permitieron la observación de la actividad del meristemo sobre muchos eventos consecutivos de iniciación de la hoja. Como las variaciones de la humedad parecieron tener efectos significativos sobre las velocidades de crecimiento de las plantas, es preferible mantener las plantas en una cámara de crecimiento de humedad controlada. Además, para permitir una regulación precisa del entorno en el que crece la planta, dichas cámaras permiten el crecimiento de poblaciones de plantas bajo condiciones de día largo (para los estudios sobre la formación del embrión) y condiciones de día corto (para estudios sobre filotaxia) al mismo tiempo.

En este procedimiento, se observó el volumen y la forma del meristemo apical del brote y del vértice del brote en el transcurso de varios días. Se examinaron el meristemo y el vértice del brote desde arriba para asegurar que cada hoja, no importa donde se iniciase, era representada en imagen con la misma fidelidad. Por medio de esta aproximación, se ganaban percepciones dentro de los cambios en el meristemo vértice del brote y apical del brote mientras sufría cambios de desarrollo, tales como la formación de hojas sucesivas, y se pueden caracterizar los procedimientos de mutantes en comparación con las plantas de tipo silvestre.

C. Estudios de imágenes de plantas

Se obtuvo una imagen del brote de la planta (Arabidopsis thaliana) usando el OCM de la invención. El volumen de la imagen es de 600 \mum x 600 \mum x 400 \mum (ancho x ancho x profundidad) con un tamaño de elemento de imagen volumétrica de (10 \mum)^{3}. En una vista desde arriba directa a lo largo del haz y a lo largo del eje del brote, los pecíolos de los cotiledones y las hojas 1 y 2 eran visibles en su crecimiento desde el centro del brote de la planta. El meristemo apical del brote era evidente cuando la imagen era recortada como una región altamente dispersora en la base de las hojas. El mutante gl-1 (glabrous) de la Arabidopsis thaliana fue usado para evitar una alta dispersión de luz de los tricomas.

Se visualizó una imagen girada de la región de la hoja y el meristemo, teniendo un volumen de (200 \mum x 200 \mum x 120 \mum) (ancho x ancho x profundidad) con un tamaño de elemento de imagen volumétrica de (2 \mum)^{3}. Como una vista lateral, con el haz incidente desde la parte de arriba de la figura, se veían crecer las hojas hacia afuera desde el centro del brote. El meristemo y el vértice del brote eran evidentes en la base de las hojas.

Se tomaron varias imágenes en una serie en la para cada una de diez plantas de semillero de Arabidopsis durante los días 5 al 12 de desarrollo cuando se formaron los primordios de la hoja y surgió un patrón en espiral de hojas. En estas imágenes era posible identificar el meristemo apical del brote y/o los primordios de la hoja asociada, llegando a la conclusión de que el OCM puede seguir de manera no invasora el desarrollo morfológico de una planta. Las imágenes pueden indicar que las regiones de más alta dispersión de la luz corresponden a áreas de actividad celular más alta. Los primordios de la hoja y el presumido meristemo apical del brote dispersan altamente, y son sitios de rápida división celular. De acuerdo con esto, la alta actividad celular puede servir como una prueba intrínseca para OCM.

En una imagen OCM de una planta Arabidopsis de cinco días de edad, el parámetro de "opacidad" (véase el Ejemplo III del software de representación de la imagen) fue ajustado de forma que la opacidad fuese alta. Con esta configuración, los tejidos débilmente dispersantes (azul) que rodean fuertemente los tejidos dispersantes (rojo/amarillo) esconden las regiones fuertemente dispersantes de la vista. Los efectos globales fueron que el "exterior" de la planta era visible, como en un micrógrafo de exploración por electrones. Recortando o rebanando dentro del plano de la imagen del tejido fuertemente dispersante, se mostraba el rojo/amarillo.

En otra imagen OCM de la misma planta de cinco días, el parámetro de opacidad se ajustaba bajo de forma que los elementos de imagen volumétrica profundos en el tejido podían ser vistos. Usando estos procedimientos, era posible identificar de manera no ambigua muchos de los órganos más grandes (> 30 \mum) en el vértice del brote. La identificación de los primordios de hoja más pequeños era más difícil. Para identificar de manera no ambigua los órganos más pequeños, se hicieron observaciones frecuentes, por ejemplo, cada dos horas, para observar su incremento de tamaño durante el desarrollo. Todas las imágenes fueron adquiridas con el OCM original que requiere tres horas para una imagen de un millón de elementos de imagen volumétrica. Por lo tanto, se promedia una sola imagen sobre el crecimiento significativo, y este promediado es probablemente un factor en la resolución de la imagen. El OCM modificado tiene un tiempo de adquisición de imagen de cinco minutos o menos para imágenes similares. El uso de OCM modificado produciría una serie de imágenes más juntamente espaciadas en el tiempo, y permitió la identificación de los primordios de la hoja cuando surge del meristemo.

En una comparación lado a lado de una imagen OCM de una planta viva con una sección histológica de una planta diferente, la imagen OCM incluía hojas y una región pequeña altamente dispersante que consistía en un primordio de hoja. La sección histológica de una planta comparable apoyó esta representación. La imagen OCM fue recortada desde la parte superior y fue una imagen del "exterior" (opacidad alta), de forma que el meristemo que estaba debajo no era visible. A continuación, el desarrollo de una planta individual es útil para detectar un primordio de hoja emergente tan pronto como sea posible. Mientras que la resolución de la sección histológica era claramente superior, solamente las imágenes OCM eran capaces de seguir el posterior desarrollo del primordio emergente de la hoja.

En comparación directa de las secciones OCM y las secciones tradicionales, las plantas eran representadas en imagen con un OCM y eran fijadas para su análisis tradicional. La imagen OCM mostró los primordios de la hoja y los pecíolos de cotiledón. La cantidad de dispersión de luz era proporcional al color. Se configuró un solo espectro de forma que el rojo era la cantidad más alta de dispersor de luz, naranja-amarillo lo era menos, verde menos, y azul-negro el que menos. Las células y tejidos que estaban activos (por ejemplo, transcripción y diferenciación) produjeron la cantidad mayor de dispersor de luz.

En las secciones ópticas y las tradicionales secciones de plástico más profundas en una planta, se visualizó una imagen OCM de tejido profundamente enterrado. Se veían los primordios de la hoja y también se vio un estípulo recientemente formado. Los estípulos que se sabe que son muy activos desde el punto de vista de la transcripción, produjeron una gran cantidad de luz dispersada en OCM, y de esta forma, apareció como rojo en la imagen OCM.

En la sección OCM y la sección tradicional de desarrollo de órganos y el meristemo apical, se vio un primordio de hoja adoptando una simetría dorsoventral mientras que se vio que un primordio de hoja menos maduro no siendo dorsoventral, reteniendo aún características céntricas. De esta forma, OCM puede detectar estas diferencias. El primordio de hoja más avanzado apareció como una forma rectangular roja, y el primordio de hoja menos avanzado apareció como una forma redonda roja. El meristemo, detectable en una sección de plástico en un plano focal diferente también apareció como un objeto con forma rectangular rojo. De esta forma, OCM puede seguir y predecir los cambios del desarrollo que tienen lugar profundamente dentro de los tejidos en vivo de una manera no destructiva.

Se dirigió una comparación de OCM y micrografía de exploración por electrones de un mutante de la Arabidopsis, sin meristemos de brote. El mutante sin meristemos de brote es conocido por carecer de un meristemo apical del brote (Barton y Poething, 1993). En plantas de tipo silvestre, el meristemo apical apareció como una estructura de color rojo altamente dispersora de luz. Como se predijo, en el mutante sin meristemos de brote no existía dicha estructura. En su lugar, se detectó un hueco que indicaba una carencia de un meristemo apical del brote.

De esta forma, el OCM se puede usar, no solamente para visualizar estructuras de una muestra biológica, sino también para visualizar las etapas, procesos y eventos del desarrollo para contrastar mutantes con no mutantes o para clasificar series mutantes o alélicos y similares. El efecto de una variedad de factores en la dispersión de la luz se puede usar también para caracterizar las muestras biológicas con respecto a dichos factores, incluyendo por ejemplo, la actividad genética, diferenciación, elongación celular, latencia celular, respuesta a la tensión, respuesta patógena y similares. Los usos de las comparaciones de dispersión de luz empleando el OCM de la invención serán evidentes para aquéllos que se aborden dichas comparaciones, para la correlación de la dispersión de luz u otras características de imagen OCM con una variedad de condiciones, estructuras y eventos de interés.

Ejemplo IV Biología experimental de la rana Xenopus lavéis

A. Los embriones de Xenopus se montan sobre un pozo pequeño triangular cortado en una capa en el fondo de un disco de petri recubierto con goma de silicona. Se coloca una lámina de agarosa gelificada de 100 \mum de grosor sobre la parte superior del embrión y se fija en su lugar con espinas delgadas de cactus pinchadas en la goma de silicona. Este procedimiento de estabilización del embrión conserva el embrión en una posición y orientación definidas sin el peligro de desvirtuar los movimientos de la célula bajo estudio. Durante la gastrulación, se recogen un conjunto de imágenes en tres dimensiones a través del grosor del polo animal del embrión. Estos conjuntos de datos tridimensionales son procesados e representados en una película acelerada. Como la resolución del OCM es más pequeña que las células independientes, estas imágenes son adecuadas para seguir los movimientos de gastrulación del tejido. De manera alternativa, se pueden recoger imágenes bidimensionales en el plano que bisector embrión a lo largo de su línea media. Esto ofrece velocidades rápidas de trama, y por lo tanto un mejor detalle sobre el movimiento de las células dentro de este reducido campo de visión.

B. De manera adicional, el sistema OCM se usa para examinar la conformación morfológica del mesodermo tras el que se curva hacia dentro. Este procedimiento es crítico para las estructuras resultantes, tales como el notocordio y los segmentos del cuerpo de un articulado, así como para el sistema nervioso. Las interacciones entre el notocordio y la médula espinal afectan al patrón dorsoventral del sistema nervioso, y las interacciones con los segmentos del cuerpo de un articulado dan como resultado la segmentación del sistema nervioso sensorial y las raíces ventrales de los axones mononeuronales formados en la médula espinal. La disposición experimental descrita anteriormente se usa para estabilizar los embriones, y el OCM se usa para recoger las imágenes necesarias para las películas aceleradas bi y tridimensionales.

C. Estudios de imágenes de embrión de rana. Se tomó una imagen de un embrión de rana que estaba ligeramente fijado (2% paraformaldehído durante la noche a 4ºC en la etapa 41 del desarrollo). La región de la cabeza que se representó en imagen fue (1,6 mm x 1,6 mm x 1,3 mm) (ancho x ancho x profundidad). El tamaño de elemento de imagen volumétrica era de (20 \mum)^{3}. En la figura, el embrión (renacuajo) estaba sobre su lado derecho y era visualizado a lo largo de un eje del cuerpo desde la cola a la cabeza, de forma que el eje ventral-dorsal apuntaba de izquierda a derecha. El haz era incidente desde la parte superior de la imagen. El bombeo del ojo izquierdo era claramente evidente en la parte superior de la imagen. Las áreas rojas y amarillas denotaban regiones altamente dispersoras, y el azul y el negro, regiones más trasparentes.

Se tomó otra imagen del mismo embrión de rana, pero con un aumento ligeramente mayor. El volumen representado en la imagen era de (600 \mum x 600 \mum x 420 \mum) (ancho x ancho x profundidad), y el tamaño de elemento de imagen volumétrica era de (6 \mum)^{3}. El haz era aún incidente sobre el lado izquierdo del embrión desde la parte superior de la imagen. La vista era una vez más a lo largo del eje del cuerpo, pero mirando hacia la cola, de forma que el lado dorsal estaba sobre la izquierda y el lado ventral estaba a la derecha. El segmento de 600 \mum de longitud que era representado en imagen estaba además bajo el cuerpo desde la cabeza. El fondo de 420 \mum estaba orientado de arriba a abajo en la figura, y la anchura dorsal-ventral de 600 \mum caía de izquierda a derecha. La imagen en tres dimensiones estaba siendo girada cuidadosamente de forma que la vista era en línea recta bajo el eje de la médula espinal - un giro de un solo grado sobre el eje del haz (eje de arriba a abajo) oscurecería la estructura que era obvia en el ángulo de visión seleccionado.

Referencias citadas

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Claims

1. Un sistema de microscopio de coherencia óptica de alta resolución para visualizar estructuras bajo una superficie de una muestra biológica, comprendiendo el sistema:

- una fuente de luz;

- un espejo de referencia;

- una lente de focalización para focalizar la luz sobre la muestra biológica;

- un fotodetector;

- un dispositivo piezoeléctrico;

- un camino óptico de muestra para recibir la luz de la fuente de luz y dirigir la luz a la lente de focalización, teniendo dicho camino de muestra una longitud de camino de muestra, en el que la luz dirigida a lo largo del camino de la muestra entra en la muestra biológica y se concentra en una abertura de un diámetro de haz dentro de la muestra;

- un camino óptico de referencia para recibir la luz de la fuente de luz y dirigir la luz al espejo de referencia, teniendo dicho camino de referencia una longitud de camino de referencia;

- en el que la longitud de al menos uno de los caminos ópticos está modulada por medio del dispositivo piezoeléctrico, y en el que un haz de luz proveniente del camino óptico de la muestra dispersado hacia atrás desde la muestra biológica se combina con un haz de luz proveniente del camino de referencia reflejado desde el espejo de referencia, en el que la combinación de haces de luz produce una señal de franjas de interferencia sobre el fotodetector cuando la longitud del camino de muestra y la longitud del camino de referencia son sustancialmente la misma dentro de la longitud de coherencia de la fuente de luz, en el que la amplitud de la modulación es igual o menor a 1,5 longitudes de onda; y

- un escáner dispuesto para explorar la abertura del haz a través de un primer plano sustancialmente normal a la dirección del haz de luz incidente, y para mover entonces la abertura del haz más profundo dentro de la muestra y para explorar otro plano mientras la posición del espejo de referencia es trasladada para conservar las longitudes de camino iguales de los caminos de muestra y de referencia coincidentes con la abertura del haz, y que la amplitud de franja es registrada en cada elemento de imagen volumétrica de elemento de volumen durante la exploración de la muestra resultante en un conjunto de datos tridimensionales que es representado en volumen para proporcionar una visualización en tres dimensiones de la muestra.

2. El sistema de la reivindicación 1, en el que las potencias en una señal de franjas a una frecuencia fundamental, f, y un segundo armónico de la frecuencia fundamental, 2f, se suman para proporcionar una medida de la amplitud de las franjas.

3. El sistema de la reivindicación 1 ó 2, en el que la modulación ocurre a una frecuencia de al menos 50 kHz.

4. El sistema de la reivindicación 1 ó 2, en el que la modulación ocurre a una frecuencia de al menos 100 kHz.

5. El sistema de la reivindicación 1 ó 2, en el que la modulación ocurre a una frecuencia de al menos 300 kHz.

6. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 5, en el que la luz dirigida a lo largo del camino de la muestra explora la muestra biológica, y en el que la exploración da como resultado una imagen de una parte de la muestra biológica, en el que la parte está entre 100 \mum y 4000 \mum por debajo de la superficie de la muestra.

7. El sistema de la reivindicación 6, en el que la imagen comprende una primera capa, la primera capa derivada de una primera pluralidad de elementos de imagen volumétrica Correspondientes todos ellos a sustancialmente la misma primera profundidad bajo la superficie de la muestra.

8. El sistema de la reivindicación 7, en el que la imagen comprende adicionalmente una segunda capa, la segunda capa derivada de una segunda pluralidad de elementos de imagen volumétrica correspondientes todos ellos a una misma segunda profundidad bajo la superficie de la muestra.

9. El sistema de la reivindicación 8, en el que la imagen compre de al menos unas 50 capas distintas, incluyendo las mencionadas primera y segunda capas, en el que cada una de las capas se deriva de una pluralidad distinta de elementos de imagen volumétrica, y en el que todos los elementos de imagen volumétrica de cada capa distinta corresponden sustancialmente a una misma profundidad distinta bajo la superficie de la muestra.

10. El sistema de la reivindicación 8, en el que la imagen comprende elementos de imagen volumétrica mezclados de una pluralidad de capas que incluyen las mencionadas primera y segunda capas, y en el que la imagen es una representación en tres dimensiones de la parte de la muestra biológica.

11. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 10, comprendiendo además un volumen de coherencia sobre un plano en el que la longitud de la muestra es igual a la longitud del camino de referencia, en el que el volumen de coherencia existe bajo la superficie de la muestra biológica.

12. El sistema de la reivindicación 11, en el que la luz proveniente de la muestra entra en la muestra y concentra la mencionada abertura de diámetro del haz, en el que el diámetro de la apertura del haz no es mayor a 20 \mum dentro de la muestra, y en el que la abertura del haz es coincidente con el volumen de coherencia, de forma que la resolución lateral de las estructuras dentro de la muestra sea una distancia menor o igual al diámetro de la abertura del haz.

13. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 12, en el que el haz de luz dirigido a lo largo del camino de la muestra explora la muestra biológica, y en el que la exploración da como resultado una imagen de una parte de la muestra biológica, en el que la parte está entre 100 \mum y 4000 \mum por debajo de la superficie de la muestra.

14. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 13, en el que la amplitud de la modulación es igual a 0,42 longitudes de onda.

15. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 14, en el que la longitud de coherencia de la fuente de luz determina la resolución de profundidad del sistema de microscopio.

16. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, en el que el dispositivo piezoeléctrico es una pila piezoeléctrica que tiene el espejo de referencia montado sobre ella.

17. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 16, en el que la luz tiene una longitud de onda entre 700 y 1500 nm.

18. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 17, en el que la modulación de la longitud de camino ocurre a una frecuencia de al menos 50 Hz.

19. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 18, en el que la amplitud de modulación de la longitud del camino es menor a 0,50 longitudes de onda.

20. El sistema de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 18, en el que la amplitud de modulación de la longitud del camino es igual o menor a 1,0 longitudes de onda.

21. Un procedimiento para visualizar una estructura que se encuentra por debajo de una superficie de una muestra de planta, empleando el sistema de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 20.

22. Un procedimiento de análisis de una función biológica basado en la visualización en vivo de los cambios en las estructuras bajo la superficie de la muestra de la planta, empleando el sistema de cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 20.

23. El procedimiento de la reivindicación 22, en el que la función es seleccionada del grupo consistente en regulación de genes, desarrollo, respuesta a mensajero y tensión.

24. Un procedimiento para visualizar una estructura que se encuentra bajo una superficie de una muestra de una planta comprendiendo los pasos de:

- proporcionar luz;

- dividir la luz en un camino de luz de muestra y un camino de luz de referencia;

- modular la longitud de al menos uno de los caminos de luz con un dispositivo piezoeléctrico, en el que la modulación de la longitud del camino ocurre a una frecuencia f, y en el que la amplitud de la modulación es igual o menor a 1,5 longitudes de onda;

- dirigir la luz desde el camino de muestra a la muestra de la planta con una lente focalizadora, en la que la luz entra a la muestra de la planta y se concentra en una abertura de haz dentro de la muestra de planta;

- explorar la abertura de haz a través del primer plano sustancialmente normal a la dirección del haz de luz incidente;

- combinar un haz de luz desde el camino de luz de muestra dispersado hacia atrás desde la muestra de planta con un haz de luz proveniente del camino de luz de referencia reflejado por un espejo de referencia, en el que la combinación de haces de luz produce una señal de franjas de interferencia sobre un fotodetector cuando la longitud del camino de luz de muestra y la longitud del camino de luz de referencia son sustancialmente las mismas dentro de la longitud de coherencia de la fuente de luz;

- mover la abertura del haz a una profundidad diferente dentro de la muestra de la planta y explorar otro plano mientras la posición del espejo de referencia se traslada para conservar las longitudes de camino iguales de los caminos de luz de muestra y de referencia coincidentes con la abertura del haz; y

- registrar la amplitud de franja en cada elemento de volumen, elemento de imagen volumétrica, durante la exploración de la muestra de la planta dando como resultado un conjunto de datos tridimensionales que es representado en volumen para proporcionar una visualización en tres dimensiones de la muestra de planta.

25. El procedimiento de la reivindicación 24, en el que las potencias en una señal de franjas a una frecuencia fundamental, f, y un segundo armónico de la frecuencia fundamental, 2f, son sumadas para proporcionar una medida de la amplitud de las franjas.

26. El procedimiento de la reivindicación 24 o de la reivindicación 25, en el que los pasos de dirección se repiten al menos cien veces y en el que tras cada paso de dirección, el procedimiento comprende el paso adicional de tras-situar el camino de luz de muestra a una posición diferente en la muestra de planta.

27. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones de la 24 a la 26, en el que la imagen indica una diferencia entre una muestra de planta mutante y una muestra de planta no mutante.

28. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones de la 24 a la 26, en el que la imagen comprende un patrón de dispersión de luz, y en el que el patrón se correla con una característica de la muestra de planta.

29. El procedimiento de la reivindicación 28, en el que la característica se selecciona del grupo consistente en actividad genética, diferenciación, elongación celular, latencia celular, respuesta a la tensión y respuesta patógena.

30. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones de la 24 a la 29, en el que la amplitud de la modulación es igual a 0,42 longitudes de onda.

31. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones de la 24 a la 30, en el que la luz tiene una longitud de onda entre 700 y 1500 nm.

32. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones de la 24 a la 31, en el que la modulación de la longitud de camino ocurre a una frecuencia de al menos 50 kHz.

33. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones de la 24 a la 32, en el que la amplitud de modulación de la longitud de camino es menor de 0,5 longitudes de onda.

34. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones de la 24 a la 32, en el que la amplitud de modulación de la longitud de camino es igual o menor a 1,0 longitudes de onda.