ES2222894T3

ES2222894T3 - Molecula de acido nucleico cerrada de forma covalente para inmuno-estimulacion.

Info

Publication number: ES2222894T3
Application number: ES00912392T
Authority: ES
Inventors: Claas Junghans; Burghardt Wittig; Sven Konig Merediz; Matthias Schroff
Original assignee: Mologen AG
Current assignee: Mologen AG
Priority date: 1999-07-27
Filing date: 2000-02-24
Publication date: 2005-02-16
Anticipated expiration: 2020-02-24
Also published as: DK1196178T3; US20030125279A1; AU3418000A; EP1196178B1; WO2001007055A1; US6849725B2; EP1196178A1; PT1196178E; ATE268600T1; DE50006758D1; DE19935756A1; DE10082079D2

Abstract

Molécula de ácido desoxi-ribonucleico, que consiste en una cadena parcialmente monohebra, en forma de pesa, cerrada covalentemente, de residuos de desoxi-ribonucleósidos y contiene una o más secuencias con la serie de bases N1N2CGN3N4, donde N1N2 es un elemento del grupo GT, GG, GA, AT o AA, N3N4 es un elemento del grupo CT o TT, así como C desoxi-citosina, G desoxi-guanosina, A desoxi-adenosina y T desoxi- timidina, caracterizada porque la secuencia es a) GTTCCTGGAG ACGTTCTTAG GAACGTTCTC CTTGACGTTG GAGAGAAC o bien b) ACCTTCCTTG TACTAACGTT GCCTCAAGGA AGGTTGATCT TCATAACGTT GCCTAGATCA, o bien c) contiene una secuencia de ácido desoxi-ribonucleico con la serie de bases AACG TTCTTCGGGG CGTT, d) siendo la longitud de la molécula de ácido desoxi- ribonucleico de 40 a 200 nucleótidos.

Description

Molécula de ácido nucleico cerrada de forma covalente para inmuno-estimulación.

La invención se refiere a moléculas de ácido nucleico, especialmente aquellas moléculas de ácido nucleico que poseen componentes nucleósidos CpG no modificados, capaces de surtir un efecto inmuno-modificador para la modulación de la actividad del sistema inmunitario humano o animal.

Hace algunos años que se sabe que determinadas secuencias cortas de ácido nucleico pueden ejercer un efecto fisiológico considerable, estimulando de manera pronunciada las células efectoras del sistema inmunitario a través de mecanismos hasta ahora desconocidos. Estas secuencias de ácido nucleico inmuno-estimuladoras ("ISS") tienen una longitud de sólo unas pocas bases y no actúan a través de la expresión de proteínas codificadas por ellas. La mayoría de las secuencias cortas inmuno-modificadoras de oligo-desoxi-ribonucleótidos ("ODN") conocidas contienen un segmento citosina-guanosina no metilado (segmento CpG) (Krieg AM, Yi AK, Matson S, Waldschmidt TJ, Bishop GA, Teasdale R, Koretzky GA, Klinman DM; CpG motifs in bacterial DNA trigger direct B-cell activation; Nature 1995 Apr 6 374:6522 546-9). Se supone que la identificación de este segmento por medio de mecanismos de identificación hasta ahora desconocidos de las células eucariotas desencadena una especie de mecanismo de alarma que dispara una reacción dirigida contra agentes virales o bacterianos. Conforme a esta propuesta de explicación, la identificación de segmentos CpG, cuya presencia en el genoma de los eucariotas es mucho menor que en el genoma de los procariotas, funciona en los animales superiores como "señal de alarma". La existencia de segmentos CpG señala, según esta teoría, una infección por agentes patógenos procariotas, y su identificación permite un control independiente o anterior a la formación de una respuesta inmunitaria mediada por células T ayudadoras. Mediante este mecanismo, se posibilitaría la estimulación y proliferación de las células B de forma independiente de las células T ayudadoras, ya que las señales coestimuladoras necesarias para la activación de las células T y B, principalmente la secreción de citocinas de la denominada respuesta celular tipo 1 (citocinas Th-1 específicas, como el interferón gamma, IL-7, IL-12) ya estarían disponibles a través de las vías de señalización dependientes de CpG.

Además, las ISS incrementan la actividad de las células NK y de los macrófagos. En contraposición, la actividad de las denominadas citocinas tipo 2 (IL-4, IL-10) es suprimida, probablemente por un antagonismo entre la respuesta Th1 y Th2 (Seder RA y Paul WE, Acquisition of lymphokine-producing phenotype by CD4+ T cells; Annu Rev Immunol. 1994;12:635-73).

La estimulación pronunciada de la respuesta inmunitaria celular permite influenciar los círculos de regulación, los cuales sin intervención no inducen una actividad inmunológica satisfactoria para el paciente. Esto incluye la inducción de una respuesta contra antígenos "débiles", es decir no estimuladores por la presentación en el contexto del MHC-I, como por ejemplo péptidos de punto de ruptura de translocaciones cromosómicas u oncogenes mutados, como los que se encuentran con frecuencia en las enfermedades tumorales (Melief CJ, Kast WM; T-cell immunotherapy of cancer; Res Immunol 1991 Jun-Aug; 142(5-6):425-9; veasé también: Pasternak G, Hochhaus A, Schultheis B, Hehlmann R; Chronic myelogenous leukemia: molecular and cellular aspects; J Cancer Res Clin Oncol 1998;124(12):643-60). Asimismo podría ser un efecto deseable la eliminación de la tolerancia a autoantígenos, como por ejemplo los de la tirosinasa o tirosin-hidroxilasa expresados en las células tumorales del melanoma maligno y representados por el MHC-I (Weber LW, Bowne WB, Wolchok JD, Srinivasan R, Qin J, Moroi Y, Clynes R, Song P, Lewis JJ, Houghton AN; Tumor immunity and autoimmunity induced by immunization with homologous DNA; J Clin Invest 1998 Sep 15;102(6):1258-64; Surman DR, Irvine KR, Shulman EP, Allweis TM, Rosenberg SA, Restifo NJ; Generation of polyclonal rabbit antisera to mouse melanoma associated antigens using gene gun immunization; Immunol Methods; 1998 May 1;214(1-2):51-62). Otro aspecto sumamente importante es el efecto adyuvante de las ISS en las vacunas profilácticas, así como la posibilidad de convertir la reacción a una infección existente de una respuesta tipo 2 a una tipo 1, permitiendo así el control del agente patógeno (Kovarik J, y cols. CpG oligodeoxynucleotides can circumvent the Th2 polarization of neonatal responses to vaccines but may fail to fully redirect Th2 responses established by neonatal priming; J Immunol. 1999 Feb 1;162(3):1611-7). En las infecciones producidas por un elevado número de patógenos se ha podido demostrar que el tipo de respuesta inmunitaria influye de manera decisiva en la evolución de la infección o en la supervivencia del paciente. Considerando que las reacciones alérgicas representan una respuesta tipo 2 exagerada, también es de esperar un efecto terapéutico de las ISS en dichas afecciones.

Se ha observado que determinadas secuencias que contienen CpG poseen la propiedad de neutralizar la estimulación producida por ISS, es decir que tales secuencias son capaces de suprimir el efecto estimulador de las ISS al ser agregadas a éstas (Krieg AM, Wu T, Weeratna R, Efler SM, Love-Homan L, Yang L, Yi AK, Short D, Davis HL; Sequence motifs in adenoviral DNA block immune activation by stimulatory CpG motifs; Proc Natl Acad Sci U S A 1998 Oct 13;95(21):12631-6). Sin haber aclarado con precisión el mecanismo de acción subyacente de estos segmentos de secuencia descritos como CpG neutralizadores ("CpG-N"), los autores de la publicación citada especulan que este efecto está limitado a una inhibición de la estimulación por las ISS. Mientras no se haya aclarado el mecanismo de la inmunoinducción producida por las ISS, no puede excluirse sin embargo, que otros efectos inmuno-modificadores de estos segmentos CpG podrían asimismo ser terapéuticamente utilizables. Existe al menos una enfermedad humana, el lupus eritematoso sistémico, que se caracteriza por la presencia de anticuerpos anti-ADN en el suero de los pacientes y en la que se supone que existe una relación etiológica con una reacción contra ISS bacterianas (Krieg AM, CpG DNA: a pathogenic factor in systemic lupus erythematosus?, J Clin Immunol 1995 Nov;15(6):284-92). Para esta y otras indicaciones, la inhibición del mecanismo subyacente por medio de segmentos CpG-N sería provechosa. Independientemente de la aclaración del mecanismo subyacente, el potencial de las secuencias CpG para modificar la respuesta inmunitaria es considerable, lo que ha desencadenado un interés explosivo de la ciencia en el fenómeno y en las posibilidades de su aplicación en el tratamiento y la profilaxis de infecciones, enfermedades tumorales e inmunodeficiencias.

La bibliografía sobre las ISS afirma (véase p. ej. WO09818810A1, pág. 17, 11 29-30), y la presente invención lo confirma (véase más abajo), que las secuencias inmuno-estimuladoras que contienen CpG tienen un efecto más intenso cuando son monocatenarias. La administración de ISS de oligo-desoxi-nucleótidos cortos de cadena abierta y monohebra para la inmuno-modificación es, por lo tanto, aconsejable, y ha sido objeto de numerosos experimentos para el tratamiento de enfermedades infecciosas, tumorales y autoinmunitarias. Sin embargo, los oligo-desoxi-nucleótidos de cadena abierta y monohebra son degradados muy rápidamente por las exonucleasas extra e intracelulares, por lo que difícilmente pueden emplearse in vivo. Las mencionadas nucleasas poseen una actividad enzimática considerablemente reducida frente a uniones modificadas del éster fosfórico en el esqueleto de los polímeros de ácidos nucleicos; esto condujo al uso de tioésteres fosfóricos ("tioatos") o de compuestos fosfóricos reducidos (fosfonatos) en forma quiral o aquiral para las aplicaciones en las que deben administrarse al paciente moléculas de ácido nucleico monocatenario. Estos compuestos modificados pueden lograrse por síntesis en fase sólida, mediante procedimientos ciertamente mucho más complejos que los de la síntesis convencional de ADN mediante amidita.

Estos compuestos son conocidos por la investigación de cadenas no codificantes (antisense); sin embargo, en los estudios clínicos se puso de manifiesto que estas cadenas no codificantes poseen además efectos secundarios importantes, especialmente sobre el sistema de coagulación sanguínea y el sistema complemento (véase, p. ej., Sheehan y Lan, Blood 92, 1617-1625 (1998)). En lo que respecta al uso de derivados del ácido tiofosfórico para la protección de las ISS frente a la acción de las nucleasas, se ha demostrado, además, que las secuencias poseen menos actividad estimuladora si los residuos de citosina-guanosina propiamente activos están protegidos por las secuencias flanqueadoras necesarias para la actividad (véase al respecto WO 98/18810).

La información acerca del uso y de la fabricación de ISS inmuno-estimuladoras que contienen CpG está descrita detalladamente en WO 98/18810, así como en la bibliografía que ahí se cita. En WO 98/18810 se señala específicamente la necesidad de proteger los oligo-desoxi-nucleótidos de la actividad de las exonucleasas. Se señalan varias propuestas de solución al problema de la falta de estabilidad in vivo, las cuales, sin embargo, se limitan expresamente a ODN lineales monohebra; así es como se mencionan el éster tiofosfórico, el fosfodiéster o los fosfonatos. La posibilidad de estabilizar los ODN mediante la formación de estructuras secundarias, especialmente una horquilla (la llamada estructura en "tallo-bucle", "stem loop" en inglés) se menciona en WO 98/18810. La fabricación y el uso de fosfotioato-oligómeros en relación con secuencias inmuno-estimuladoras han sido descritos en US 5,663,153, US 5,723,335 así como en US 5,856,462.

Otra estrategia para la protección de secuencias monohebra se describe en US 5,750,669. En este caso, los extremos del oligómero son dotados de residuos de nucleósidos acoplados a través de enlaces 5'-5' y 3'-3' que inhiben la degradación por exonucleasas. La investigación sobre cadenas no codificantes ha permitido conocer oligo-desoxi-nucleótidos lineales, que presentan un estructura de horquilla en el extremo 3' (Hosono y col., Biochim Biophys. Acta 244, 339-344 (1995)). Experimentos destinados a estudiar la competición por los puntos de unión de proteínas fijadoras de ADN, como los factores de trascripción, han revelado la existencia de ODN con dos horquillas o covalentemente cerrados en forma de pesa (Lim y cols. 1997, Nuc. Acids Res. 25, 575-581; Blumenfeld y cols., Nuc. Acids Res. 1993, 21, 3405-3411).

Los autores del escrito de registro WO 98/18810, que se fundamenta en el conocimiento técnico global de las secuencias inmuno-estimuladoras, señalan en una publicación al respecto que en este momento el empleo de ISS aisladas no es practicable por sus problemas de estabilidad y toxicidad, debiendo ser incorporadas en secuencias vectoras (Weeratna R, Brazolot Millan CL, Krieg AM, Davis HL; Reduction of antigen expression from DNA vaccines by coadministered oligodeoxynucleotides. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 1998 Aug;8(4):351-6).

En resumen, es posible afirmar que las ISS-ODN poseen un potencial considerable como enfoques inmunológicos ventajosos desde el punto de vista terapéutico o profiláctico, si bien las moléculas monohebra eficaces requieren ser mejoradas, por su falta de estabilidad o por su toxicidad elevada para su aplicación en el ámbito de la medicina humana.

Partiendo de este estado de la técnica, la presente invención tiene como finalidad posibilitar la disponibilidad de estructuras moleculares adecuadas que contengan secuencias inmuno-estimuladoras o inmuno-modificadoras de desoxi-ribonucleótidos resistentes a exonucleasas, similares a los módulos de ácido desoxi-ribonucleico enlazados con diéster del ácido fosfórico que se conocen en la naturaleza. Los esfuerzos previos dirigidos a la fabricación de ISS-ODN resistentes a nucleasas se han centrado en primer lugar en la obtención de modificaciones nuevas de bases, mejor toleradas, en moléculas lineales monohebra. A fin de poder estimar mejor la importancia de la fracción monohebra de la ODN, se han llevado a cabo experimentos en los que se sintetizaron las secuencias a investigar en parte como monohebras, como dos hebras lineales hibridizantes y como molécula anular parcialmente bihebra cerrada covalentemente. Sorprendentemente, se encontró que las moléculas de dos hebras con la secuencia inmuno-estimuladora relevante en la región bihebra también tenían un efecto estimulador apreciable, aunque no era de suponer que esta secuencia podía encontrarse preponderantemente bajo la forma monohebra fuera de un medio ambiente de pronunciado efecto desnaturalizador. Además resultó sorprendente que las moléculas que tenían los segmentos de secuencia estimuladora dentro de un bucle monohebra presentaban, aparte de la actividad estimuladora esperada, una muy elevada estabilidad en suero, lo que facilitaría su utilización como ISS-ODN.

En la invención, la finalidad descrita se logra por la fabricación de moléculas cortas de ácido desoxi-ribonucleico, integradas por una secuencia de residuos de nucleósidos parcialmente monohebra, en forma de pesa y cerrada covalentemente, que contiene una o varias secuencias con el orden de bases N^{1}N^{2}CGN^{3}N^{4}, donde N^{1}N^{2} es un elemento del grupo GT, GG, GA, AT o AA, N^{3}N^{4} es un elemento del grupo CT o TT, así como C desoxi-citosina, G desoxi-guanosina, A desoxi-adenosina y T desoxi-timidina. Tales moléculas de ácido desoxi-ribonucleico cerradas covalentemente pueden ser obtenidas a partir de moléculas de ácido desoxi-ribonucleico de cadena abierta, que posean en partes una secuencia autocomplementaria y que puedan formar entre sí o con una segunda molécula un híbrido intermedio estable, con una zona de dos hebras cerrada, con un hueco en el esqueleto azúcar-fosfato, por medio de la unión de este hueco a una enzima adecuada, por ejemplo la DNA-ligasa del bacteriófago T4. Alternativamente, la molécula de la invención también puede obtenerse por unión intramolecular de una molécula que tenga al menos dos zonas autocomplementarias, separadas sólo por un hueco en el esqueleto de fosfatos.

Las moléculas obtenidas no poseen extremos 5' ó 3' libres, por lo que no son accesibles a las exonucleasas.

En este contexto, inmuno-estimulación significa que las células mediadoras y efectoras del sistema inmunitario, a saber los actualmente conocidos timocitos con función de ayuda y los timocitos citotóxicos, las células B y las células NK (natural killer cells), los macrófagos y monocitos, así como las células dendríticas y sus precursores, y las poblaciones celulares de función aún no aclarada del sistema inmunitario, son estimuladas por el uso de las moléculas de ácido nucleico obtenidas conforme a la invención, mostrando proliferación, migración, diferenciación o actividad.

Un aspecto esencial de la inmuno-estimulación es que, por ejemplo, las células B, que suelen requerir para su proliferación una señal coestimuladora de los timocitos ayudadores, son capaces de proliferar bajo el efecto de las secuencias inmuno-estimuladoras de ácido nucleico incluso sin que haya señales coestimuladoras.

Inmuno-modificación o inmuno-modulación significa en este contexto que, aparte de una estimulación generalizada en el sentido arriba definido, también se influye en el tipo o el carácter de una reacción inmunitaria, ya sea porque se actúa sobre una reacción inmunitaria a punto de iniciarse o desarrollarse, o porque una reacción ya establecida modifica su carácter.

Un ejemplo de esto es el efecto de los oligo-desoxi-nucleótidos que contienen CpG sobre el desarrollo de la reacción inmunitaria. Bajo la acción de estas sustancias, los macrófagos y los monocitos, entre otras células, secretan típicamente interleucina-12, que estimula a su vez la secreción de interferón gamma por parte de las células NK y de los timocitos ayudadores del tipo citotóxico. El interferón gamma actúa a su vez como estimulador de toda una serie de componentes de la respuesta inmunitaria citotóxica, mediada por células, entre los que se cuentan las células asesinas CD8-positivas, y también es un antagonista potente de la formación, mediada por la interleucina-4, de moléculas solubles de anticuerpos del subtipo IgG1.

El efecto global de tal inmuno-modulación mediada por las ISS sería la inducción de una respuesta inmunitaria citotóxica por agentes patógenos a los que, sin modulación, el paciente o el animal de experimentación reaccionarían mediante una respuesta mediada por anticuerpos. (Immunostimulatory oligodeoxynucleotides promote protective immunity and provide systemic therapy for leishmaniasis via IL-12- and IFN-gamma-dependent mechanisms. Walker y cols., Proc Natl Acad Sci USA 1999 Jun 8 96:12 6970-5)

Un ejemplo de inmuno-modulación en el contexto clínico es la aplicación de las ISS de la invención en cuadros clínicos de alergia o de reacción atópica. Determinadas formas de esta enfermedad se caracterizan porque los pacientes afectados presentan un nivel plasmático de inmunoglobulina E (IgE) muy superior al valor promedio. Este nivel incrementado de IgE no sólo es un síntoma de la enfermedad, sino que contribuye de manera decisiva, a través de las cadenas de señales de la fijación de la IgE a las células efectoras del sistema inmunitario y la secreción posterior de quimiocinas y sustancias mensajeras paracrinas, especialmente histamina, al cuadro clínico de la hipersensibilidad local o sistémica. La modulación de esta respuesta inmunitaria es el objetivo de numerosos proyectos de investigación. Un punto de partida prometedor es, a este respecto, el tratamiento de los pacientes con ODN inmuno-estimuladores.

En el sentido de la invención, se definen como moléculas cortas de ácido desoxi-ribonucleico aquéllas que poseen una longitud de cadena según los ejemplos de ejecución (preferiblemente 48 a 116 nucleótidos). Los ácidos nucleicos con tales longitudes "cortas" de cadena se ilustran en los dibujos correspondientes (véase la fig. 2: los constructos en forma de pesa ensayados in vivo NoSS30, ISS30, ISS30-ds, ISS30-sl, ISS13, AT-2L, AT-1L así como mini).

Las moléculas de ácido desoxi-ribonucleico probadas tienen la secuencia

a) (por ejemplo en la secuencia "mini" (fig. 2))

GTTCCTGGAG ACGTTCTTAG GAACGTTCTC CTTGACGTTG GAGAGAAC

o bien

b) (por ejemplo en la secuencia "AT-2L" (fig. 2))

ACCTTCCTTG TACTAACGTT GCCTCAAGGAA GGTTGATCTT

CATAACGTTG CCTAGATCA

o bien contienen una secuencia con la serie de bases

c) AACG TTCTTCGGGG CGTT

Preferiblemente, la secuencia c) está contenida en la secuencia "ISS30" (fig. 2)

CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG

TGGTAACC CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG

CGTTCTTAGG TGGTAACC

Las moléculas de ácido desoxi-ribonucleico, integradas por una cadena de residuos de desoxi-ribonucleósidos parcialmente monohebra, en forma de pesa y cerradas covalentemente, que contienen una o varias secuencias con la serie de bases N^{1}N^{2}CGN^{3}N^{4}, donde N^{1}N^{2} es un elemento del grupo GT, GG, GA, AT o AA, N^{3}N^{4} es un elemento del grupo CT o TT, así como C desoxi-citosina, G desoxi-guanosina, A desoxi-adenosina y T desoxi-timidina, se emplearán para la inmuno-estimulación en el hombre o en animales superiores.

Las moléculas de ácido desoxi-ribonucleico reivindicadas, con las secuencias o las gamas de secuencias específicas mencionadas, tienen preponderantemente una longitud de hasta 200 nucleótidos y especialmente de 48 a 116 nucleótidos (véase la secuencia ISS 30 (fig. 2)).

Las moléculas de ácido desoxi-ribonucleico conformes a la invención se emplearán en una forma en la que la secuencia de la serie de bases N^{1}N^{2}CGN^{3}N^{4} se halle preponderantemente en el fragmento monohebra.

Al emplear las moléculas de ácido desoxi-ribonucleico conforme a la invención, la estimulación puede efectuarse in vitro o in vivo.

Además, las moléculas de ácido desoxi-ribonucleico conforme a la invención se emplearán como adyuvante en la vacunación terapéutica o profiláctica. A este respecto también se prefiere el uso de las moléculas de ácido desoxi-ribonucleico para la "inversión" de una respuesta inmunológica tipo 2 a una respuesta tipo 1. Como tal se define el efecto adyuvante de las ISS en las vacunas profilácticas, es decir, la posibilidad de convertir la reacción a una infección existente de una respuesta tipo 2 a una respuesta tipo 1, utilizándolas de esta manera para el control del agente patógeno.

Otras medidas ventajosas se describen en las demás reivindicaciones; la invención se describe en mayor detalle en los siguientes ejemplos:

Ejemplo 1 Síntesis de las moléculas de ácido nucleico conforme a la invención

ODN 5'-fosforilizadas con la secuencia CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGT
TCTTAGG TGGTAACC (TIB-Molbiol, Berlín) fueron calentadas durante 5 minutos a 90ºC y luego refrigeradas sobre hielo para permitir la formación de la estructura de horquilla. Los sobrenadantes autocomplementarios fueron ligados a una concentración final de 1 \mug/\mul DNA en presencia de DNA ligasa de T4 (0,1 U/\mug ODN) durante 24 horas a 37ºC. Después de una extracción con fenol y una extracción subsiguiente con cloroformo y la precipitación con isopropanol en presencia de MgCl_{2} (c.f. 10 mM) y NaAc (c.f. 300 mM), se obtuvo el producto por centrifugación y recuperación en agua.

Para la depuración de las endotoxinas, el producto de la ligación fue sometido luego a una cromatografía de intercambio de aniones (material portador: LiChrospher DMAE, Merck Darmstadt; 0-1M NaCl en fosfato sódico 50 mM) y concentrado mediante precipitación con isopropanol. Para los ensayos in vivo, el procedimiento fue llevado a cabo bajo condiciones estériles, recuperándose el producto final en PBS estéril.

Ejemplo 2 Obtención de células de bazo y cultivo celular, ensayos de citocina

Se obtuvieron células del bazo recién extirpado de ratones BALB/c de 5 a 10 semanas de edad (Bomholtgard Breeding & Research Center, Dinamarca). Dos bazos recién extirpados se homogeneizaron con la ayuda de un filtro metálico de 40 \mum, y las células obtenidas se recogieron en 20 ml de RPMI 1640 (con 10% SFB, 100 U/ml de penicilina y 100 \mug/ml de estreptomicina, Biochrom, Berlín). Los eritrocitos y plaquetas fueron eliminados por centrifugación en gradientes (Ficoll 1.077; Biochrom, Berlín). Las células se incubaron a una concentración final de 10^{6} células/ml a 37ºC en una estufa con atmósfera de 5% CO_{2}.

10^{5} células esplénicas recién obtenidas se incubaron en placas de 96 pocillos durante 24 horas con los constructos preparados como se describió en el ejemplo 1. La concentración de los constructos fue en este caso de 2 \muM. La presencia de citocinas en el sobrenadante se determinó por ELISA (Biosource, Bélgica) siguiendo las instrucciones del fabricante del ELISA. Para todos los puntos se efectuaron al menos determinaciones por triplicado.

Los resultados de este experimento se muestran en la figura 2. Se compararon 6 constructos de arquitectura diferente, pero con ISS idénticas. La ISS está marcada en cada caso mediante un subrayado. La molécula más activa es la molécula lineal, protegida por fosfotioato (ISS30-lPS). La molécula no protegida (ISS30-l), por el contrario, prácticamente no revela estimulación alguna de la producción de IL-12. El segundo efecto, en cuanto a su intensidad, lo demostró en este ensayo la molécula que contiene la ISS en el bucle (ISS30). El constructo comparativo sin ISS (NoSS30) carece en cambio de efecto. Si la ISS se halla en el contexto de dos hebras (ISS30-ds, ISS30-sl), el efecto es claramente menor, si bien aún es más pronunciado que el del control o el de la molécula lineal no protegida. Se demostró que incluso los constructos pequeños de molaridad idéntica pueden tener efectos de la misma magnitud (véase AT-2L). En este caso, el efecto medido incluso es superior al de la molécula lineal protegida por fosfotioato. Un constructo con una sola ISS por molécula mostró, en cambio, un efecto reducido (AT-1L). Finalmente, la longitud de la molécula puede reducirse a un tamaño mínimo sin perder su efecto (véase mini).

Ejemplo 3 Estabilidad en el suero

5 \mug del desoxi-ribonucleótido WOT-11-P (fosfato-GAAGAACGTT TTCCAATGAT TTTTCATTGG AAAAC) (TIB Molbiol) fueron marcados con 75 \muCi de gamma-32P-ATP (6000 Ci/mmol) (NEN) en presencia de 10u de polinucleotidoquinasa de T4 (MBI-Fermentas, Leon-Rot) de acuerdo a las indicaciones del fabricante. La enzima fue inactivada por calentamiento a 75ºC durante 1 hora. El preparado se llevó a un volumen de 50 \mul con agua y se purificó en columna de tamaño ZG-50 (Pharmacia). La molécula marcada radiactivamente fue convertida con WOT-10-P 5'-fosforilado y no marcado (5'fosfato-GTTCTTCGGG GCGTTCTTTT TTAAGAACGCCCC) (TIB Molbiol) en presencia de 1 U de DNA ligasa de T4 (MBI-Fermentas, Leon-Rot) y 1 mM ATP durante 2 horas a 37ºC. La ODN no unida se eliminó por incubación con DNA-polimerasa de T7. La actividad del preparado obtenido se determinó en un contador de centelleo (Beckmann Instruments) a 78000 cpm/\mul, que corresponde a 7.800 cpm / ng.

Para la determinación de la estabilidad en suero de los constructos obtenidos, se agregaron 2,5 \mul de DNA (195.000 cpm equiv. a 25 ng DNA) con 20 \mul de suero fetal bovino no inactivado (Life Technologies), o con suero recién obtenido de voluntarios humanos a 180 \mul de medio RPMI (Life Technologies). Todas las determinaciones se efectuaron por triplicado. Las muestras se incubaron a 37ºC; se tomaron alícuotas de 20 \mul de las muestras a las 0, 1, 2, 7, 11 y 24 horas y se conservaron a -40ºC. 5 \mul de cada muestra fueron sometidos a digestión con 20 \mug/ml de proteinasa K (Life) durante 1 hora. Luego, las muestras fueron sometidas a electroforesis desnaturalizante en poliacril-amida, se digitalizaron los geles (Molecular Dynamics) y se comparó la intensidad de las bandas (IP Labgel). La evaluación se muestra en la fig. 3. Cada punto representa la media aritmética de tres determinaciones.

Ejemplo 4 Uso de los constructos en el ratón

Los constructos se ensayaron in vivo. Se inyectaron ratones BALB/C hembra de seis semanas de edad por vía intraperitoneal con 50 \mug de cada constructo correspondiente en 250 \mul de PBS estéril. Se tomaron muestras de 50 \mul de sangre después de 2, 6, 24 y 72 horas, se mezclaron con heparina, se centrifugaron y el suero se almacenó a -70ºC. Se determinó la presencia de IL-12 mediante ELISA (véase arriba) en todas las muestras simultáneamente. Se buscó la presencia de endotoxina en todas las preparaciones con el sistema de ensayo para endotoxina de limulus (LAL-Test, BioWhittaker). Todas las muestras tenían un contenido de endotoxina por debajo del límite de detección.

Ejemplo 5 Incubación de células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) con ISS-ODN circular

Las PBMC fueron aisladas de la sangre de donantes voluntarios con nivel elevado de IgE usando métodos conocidos y se incubaron a una concentración de 10^{6} células por ml en medio RPMI (suero fetal bovino (SFB) al 10%). A las muestras se le agregó

A:: nada (control);

B:: 1 \mug/ml de anticuerpos anti-CD-40 más 5 ng/ml de IL-4;

C:: 1 \mug/ml de anticuerpos anti-CD-40, 5 ng/ml de IL-4 más 2 \muM de ODN ISS30 conforme a la invención;

D:: 2 \muM de ODN ISS30 conforme a la invención;

y las células se incubaron durante 10 días a 37º en estufa bajo condiciones estándar de cultivo de células. Luego, las células se eliminaron por centrifugación, y se determinó el contenido de IgE mediante ELISA en el sobrenadante. Se obtuvieron los siguientes valores (todos los valores se expresan en ng de IgE por ml de sobrenadante)

	A	B	C	D
Voluntario 1	9,2	10,3	3,8	4,3
Voluntario 2	4,6	6,7	1,7	3,0
Voluntario 3	1,5	3,2	0,6	0,1

Ejemplo 6

Otro aspecto de la inmuno-estimulación es la mejor maduración de las células dendríticas bajo el efecto de ISS-ODN. Un ejemplo es la obtención de células CD14, CD8 y CD4 positivas

a) Obtención de células CD14, CD8 y CD4 positivas

Las células dendríticas (CD), CD14 positivas se aislaron mediante partículas magnéticas (Milteniy Biotec, Bergisch Gladbach, Alemania), como lo describe el fabricante. Para ello se aislaron células mononucleares de la sangre periférica de donantes sanos en un gradiente de densidad Ficoll (Pharmacia), separándolas primero con las partículas magnéticas específicas del marcador de superficie respectivo en las columnas de separación correspondientes.

b) Maduración de células dendríticas

Se cultivaron células CD14 positivas de la línea monocitaria en medio CellGro (Cell Genix, Freiburg) que contenía Glutamax I (Gibco Life, Karlsruhe), GM-CSF (800 U/ml, Leucomax 300; Novartis Pharma GmbH) e IL-4 (500 U/ml, R&D Systems GmbH). Los días tres y cinco se sustituyó cada vez la mitad del medio por medio fresco. El día siete, se cambió completamente, y se enriqueció con prostaglandina E2 (1 \mug/ml, Sigma), TNFa (20 ng/ml, Sigma), IL-6 (1000 U/ml, R&D Systems GmbH) y 2 \muM de ISS 30 conforme a la invención.

c) Ensayo ELISpot para IFN-gamma

Placas de microtitulación recubiertas de nitrocelulosa (de 96 pocillos) HA S45 (Milipore, Eschborn) se recubrieron a 4ºC durante toda la noche con anti-interferón (IFN) gamma (10 \mug/ml, Mabtech), y luego se bloquearon con albúmina sérica humana (ASH) al 5% (Baxter, UnterschleiBheim). Las placas se lavaron y luego se sembraron con 50 \mul de células dendríticas (CD) obtenidas de la forma descrita (2 x 10^{5}/ml) y con 50 \mul de células T CD4 positivas, obtenidas en la forma descrita, (2 x 10^{6}/ml) y se incubaron durante 72 horas a 37ºC y 7% CO_{2} con 100 \mul de los antígenos correspondientes. Como antígeno se usaron 10 Lf de toxoide tetánico (TT) (Chiron Behring GmbH & Co., Marburg). Después de un lavado extenso, las placas se incubaron con anticuerpos específicos anti-IFN gamma, biotinilados, obtenidos en ratón (5 \mug/ml, Mabtech, Alemania), y éstos se detectaron con fosfatasa alcalina marcada con avidina (Sigma-Aldrich, Steinheim) y reacción cromática con BCIP-NBT (Sigma-Aldrich). El análisis de las manchas se hizo mediante videoanálisis asistido por ordenador (KS400 imaging system software, Carl Zeiss, Eching) en un microscopio Carl Zeiss Vision Microskop Axioplan 2.

La presencia de ISS-ODN conforme a la invención produjo un aumento considerable del número de manchas en el IFN-gamma ELIspot. Además, la presencia de ISS-ODN durante la coincubación de las células dendríticas y las células ayudadoras T intensificó considerablemente la especificidad antigénica de la reacción; así es como el cociente entre manchas TT específicas (TT presente durante la coincubación en placa ELIspot) e inespecíficas (ningún TT) pasó de 8,9 (con ISS) a 2,8 (sin ISS).

Breve explicación de las ilustraciones

Fig. 1 muestra, a título de ejemplo, el esquema de un constructo conforme a la invención que contiene dos segmentos CpG. Las ISS están subrayadas.

Fig. 2 muestra los resultados de las determinaciones de IL-12 in vitro en pg de IL-12/ml. Al lado se representan en forma esquemática los constructos empleados.

Fig. 3 muestra el resultado de la medición de estabilidad en suero fetal bovino en función del tiempo.

<110> Mologen Forschungs-, Entwicklungs- und Vertriebs G

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<120> Molécula de ácido nucleico cerrada de forma covalente para inmuno-estimulación

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<130> Mologen-ImmunPCT

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<140>

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<141>

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<150> DE 199 35 756.0

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<151> 27-07-1999

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<160> 11

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 60

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: monohebra circular con estructura de tallo-bucle (pesa), fosfodiéster en todos los casos

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

cttccttgta ctaaccttgc ctcaaggaag gttgatcttc ataacgttgc ctagatcaac

\hfill

60

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<210> 2

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<211> 60

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 2

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accttccttg tactaacgtt gcctcaagga aggttgatct tcataacgtt gcctagatca

\hfill

60

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<210> 3

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: secuencia monohebra lineal, los primeros cinco y los tres últimos enlaces de éster fosfórico por tioato

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<400> 3

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gttgcctaga tcaacgttcc ttgtactaac

\hfill

30

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<210> 4

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de secuencia artificial: secuencia monohebra lineal, fosfodiéster en todos los casos

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<400> 4

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tcattggaaa acgttcttcg gggcgttctt

\hfill

30

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<210> 5

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<211> 30

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 5

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tcattggaaa acgttcttcg gggcgttctt

\hfill

30

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<210> 6

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<211> 82

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 6

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cctaggggtt accacctaac gttcttcggg aggtggtaac ccctaggggt taccacctaa

\hfill

60

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cgttcttcgg gaggtggtaa cc

\hfill

82

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<210> 7

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<211> 114

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 7

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tcttcggggc gttctttact aggtcctctc caggttacca cctaagaacg ccccgaagaa

\hfill

60

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cgttttccaa tgatactagg tcctctccag gttaccacct tcattggaaa acgt

\hfill

114

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<210> 8

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<211> 68

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 8

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tcttcggggc gttctttttt aagaacgccc cgaagaacgt tttccaatga tttttcattg

\hfill

60

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gaaaacgt

\hfill

68

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<210> 9

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<211> 116

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 9

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cctaggggtt accaccttca ttggaaaacg ttcttcgggg cgttcttagg tggtaacccc

\hfill

60

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taggggttac caccttcatt ggaaaacgtt cttcggggcg ttcttaggtg gtaacc

\hfill

116

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<210> 10

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<211> 48

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 10

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gttcctggag acgttcttag gaacgttctc cttgacgttg gagagaac

\hfill

48

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<210> 11

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<211> 60

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<212> DNA

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<400> 11

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cttccttgta ctaaccttgc ctcaaggaag gttgatcttc ataacgttgc ctagatcaac

\hfill

60

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Claims

1. Molécula de ácido desoxi-ribonucleico,

que consiste en una cadena parcialmente monohebra, en forma de pesa, cerrada covalentemente, de residuos de desoxi-ribonucleósidos y contiene una o más secuencias con la serie de bases N^{1}N^{2}CGN^{3}N^{4}, donde N^{1}N^{2} es un elemento del grupo GT, GG, GA, AT o AA, N^{3}N^{4} es un elemento del grupo CT o TT, así como C desoxi-citosina, G desoxi-guanosina, A desoxi-adenosina y T desoxi-timidina,

caracterizada porque la secuencia es

a): GTTCCTGGAG ACGTTCTTAG GAACGTTCTC CTTGACGTTG GAGAGAAC o bien

b): ACCTTCCTTG TACTAACGTT GCCTCAAGGA AGGTTGATCT TCATAACGTT GCCTAGATCA, o bien

c): contiene una secuencia de ácido desoxi-ribonucleico con la serie de bases AACG TTCTTCGGGG CGTT,

d): siendo la longitud de la molécula de ácido desoxi-ribonucleico de 40 a 200 nucleótidos.

2. Molécula de ácido desoxi-ribonucleico según la reivindicación 1, estando la serie de bases de la característica c) contenida en la secuencia

CCTAGGGGTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC CCTAGGG
GTT ACCACCTTCA TTGGAAAACG TTCTTCGGGG CGTTCTTAGG TGGTAACC.

3. Molécula de ácido desoxi-ribonucleico según la reivindicación 1 ó 2, preferiblemente con una longitud de 48 a 116 nucleótidos.

4. Molécula de ácido desoxi-ribonucleico según una o más de las reivindicaciones 1 a 3, hallándose la secuencia de la serie de bases N^{1}N^{2}CGN^{3}N^{4}en un contexto monohebra.

5. Utilización de moléculas de ácido desoxi-ribonucleico según las reivindicaciones 1 a 4 para la preparación de un medicamento o un componente de un medicamento para la inmuno-estimulación en seres humanos o animales superiores.

6. Utilización según la reivindicación 5, pudiendo practicarse la estimulación in vitro o in vivo.

7. Utilización según una de las reivindicaciones 5 ó 6 como adyuvante en la vacunación terapéutica o profiláctica.