ES2223105T3 - Fragmento peptido del factor anti-lps de limulo (lalf) que tiene accion antivirica. - Google Patents

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN NUEVO EFECTO INMUNOLOGICO DE UN PEPTIDO PROCEDENTE DE LA PROTEINA DEL FACTOR ANTI-LPS DE LIMULUS. LOS EFECTOS INMUNOLOGICOS SON: (1) INDUCIR UN ESTADO ANTIVIRAL TANTO EN LAS LINEAS CELULARES HEP-2 COMO MDBK; (2) EL SOBRENADANTE PROCEDENTE DE CELULAS MONONUCLEARES HUMANAS ESTIMULADAS CON EL PEPTIDO DEL FACTOR ANTI-LPS DE LIMULUS (LALF) ES SUSCEPTIBLE DE INDUCIR UN EFECTO ANTIVIRAL EN LA LINEA CELULAR HEP-2, MEDIANTE IFN- GA ; (3) EL PEPTIDO LALF ES CAPAZ DE MODULAR LA RESPUESTA INMUNE IN VIVO E IN VITRO. LA PRESENTE INVENCION SE PUEDE UTILIZAR EN REGIMENES DE TRATAMIENTO TERAPEUTICO Y/O PROFILACTICO DE HUMANOS Y ANIMALES, PARA MEJORAR SUS RESPUESTAS INMUNES, SIN ESTIMULAR LA PRODUCCION DE CIERTOS MEDIADORES QUIMICOS (P.EJ. TNF- AL ), QUE PUEDEN PRODUCIR EFECTOS NOCIVOS, COMO FIEBRE E INFLAMACION.

Description

Fragmento péptido del factor anti-LPS de límulo (LALF) que tiene acción antivírica.

A pesar de tratamiento agresivo, el choque séptico que se produce por la sepsis Gram-negativa continúa siendo una causa principal de muerte en pacientes quirúrgicos y médicos. La muerte de dichos pacientes es usualmente resultado de colapso cardiovascular y/o múltiple fallo de sistemas de órganos. Uno de los componentes principales de las bacterias Gram-negativas que se cree que juega un papel integral en el choque séptico es un componente de la pared externa, la endotoxina (LPS).

Las endotoxinas son complejos de alto peso molecular, asociados con la membrana externa de bacterias Gram-negativas que producen reacciones pirogénicas en la administración intravenosa. La endotoxina es proporcionada por bacterias vivientes y también se libera en el entorno cuando las bacterias mueren y se descomponen.

La endotoxina bacteriana es un complejo que consiste en lípidos, carbohidratos y proteínas. Se caracteriza por una carga general negativa, estabilidad térmica y elevado peso molecular. Las endotoxinas altamente purificadas no contienen proteínas, y son un lipopolisacárido (LPS).

Las endotoxinas bacterianas se sabe que tienen efectos biológicos profundos en animales y en humanos, y que provocan graves problemas médicos cuando se encuentran presentes. Los síntomas comprenden la inducción de fiebre alta, activación de cascada complementaria y de citoquina e hipotensión. Es crítico el evitar la contaminación por endotoxina en cualquier producto farmacéutico o dispositivo médico, que establece contacto con fluidos corporales. Los altos niveles de endotoxinas en sueros debido a enfermedades bacterianas, tales como septicemia, no se pueden tratar fácilmente. El tratamiento antibiótico de la infección solamente extermina las bacterias, dejando la endotoxina de sus paredes celulares libre provocando fiebre.

El LPS es un importante mediador en la patogénesis del choque séptico y es una de las causas principales de muerte en las unidades de cuidados intensivos de Estados Unidos. Se ha observado que la exposición a LPS durante la sepsis estimula una respuesta inmune en monocitos y macrófagos que tiene como resultado una cascada tóxica que resulta en la producción de TNF-\alpha y otras citoquinas proinflamatorias (Morrison y Ulevitch, Am. J. Pathol. 93: 527, 1978). Los daños del endotelio en la sepsis resultan probablemente de descargas inflamatorias repetitivas y persistentes. Bone, Annals Int. Med. 115: 457 (1991).

Se han investigados varias proteínas en cuanto a su capacidad de unirse y neutralizar LPS y la utilización potencial en el tratamiento del choque séptico. Entre las proteínas más extensamente estudiadas de la unión de LPS, se encuentran la proteína bactericida / de incremento de permeabilidad (BPI), una proteína básica que se encuentra en los gránulos azurofílicos de leucocitos polimorfonucleares. La proteína BPI procedente de PMN humano tiene una potente actividad bactericida contra un amplio espectro de bacterias Gram-negativas. Esta actividad antibacteriana parece estar asociada con la región aminoterminal (residuos de amino ácidos 1-199) de la proteína humana aislada BPI. Recientemente, se ha demostrado que el fragmento N-terminal de BPI (rBPI_{25}) neutraliza las actividades de las endotoxinas e inhibe los eventos inducidos por LPS en neutrófilos y macrófagos. Helene y otros, Infection and Immunity, 62: 1185 (1994). Además de sus efectos bactericidas, se ha demostrado que la BPI neutraliza los efectos tóxicos e inductores de citoquinas de LPS a la que se une. Xoma Corporation está construyendo una cartera de productos terapéuticos basados en la proteína BPI. El producto principal de la empresa derivado de BPI, Neuprex, se encuentra en pruebas de eficacia clínica para cuatro tratamientos: [1] Meningococcemia, [2] Trauma hemorrágico, [3] Hepatectomía parcial, [4] Infecciones introabdominales graves. XOMA Corporation, 30 de julio de 1996.

La proteína de unión a lipopolisacáridos (LBP) es una glicoproteína de 60 kD sintetizada en el hígado, que muestra homología estructural significativa con la BPI. Schumann y otros dan a conocer las secuencias de aminoácidos y los cDNA de humano y conejo que codifican. Igual que la BPI, la LBP tiene un lugar de unión para el lípido A y se une a la LPS procedentes de bacterias de forma basta y lisa. A diferencia de la BPI, la LBP no posee actividad bactericida significativa, y favorece (en vez de inhibir) la producción de TNF inducida por LPS. Schumann y otros, Science, 249: 1429 (1990).

Uno de los mecanismos efectores normales de hospedante para eliminación de bacterias comporta la unión a neutrófilos y monocitos y subsiguiente fagocitosis. Como parte de este proceso, las bacterias quedan expuestas a factores bactericidas y bacteriostáticos, incluyendo radicales de oxígeno, enzimas lisosómicas, lactoferrina y varias proteínas catiónicas. La LPB opsoniza las partículas portadoras de LPS y las bacterias Gram-negativas intactas, mediando la fijación de estas partículas con recubrimiento de LPB a macrófagos. Wright y otros, J. Exp. Med. 170: 1231 (1989). La fijación parece que tiene lugar a través del receptor de monocitos CD14, que une complejos de LPS y LBP. Wright y otros, Science 249: 1431 (1990). La interacción de CD14, que se encuentra presente en la superficie de leucocitos polimorfonucleares al igual que en monocitos, con LPS en presencia de LBP se ha demostrado que incrementa la actividad adhesiva de neutrófilos. Wright y otros, J. Exp. Med. 173: 1281 (1991), Worthen y otros, J. Clin Invest. 90: 2526 (1992). Por lo tanto, si bien se ha demostrado que la BPI es citotóxica con respecto a bacterias y que inhibe la producción de citoquina proinflamatoria estimulada por bacterias, la LBP favorece la unión bacteriana a los monocitos y la activación de los mismos con intermedio de un mecanismo dependiente de CD14. Nuevos derivados de la proteína de unión de lipopolisacárido (LBP) biológicamente activos incluyendo proteínas híbridas derivadas de LBP se caracterizan por la capacidad de unión a LPS y neutralización del mismo y carecen de las propiedades inmunoestimulatorias mediadas por CD14 de holo-LBP. Gazzano-Santoro, WO 95/00641. Además, péptidos correspondientes a los residuos 91-108 de la proteína LBP fueron identificados que se unen específicamente al lípido A con gran afinidad. Los péptidos que inhiben la unión de LPS a LBP, inhibían la reacción de lisado de amebocito de límulo cromogénico, y bloqueaban la liberación de TNF después de la acción de LPS tanto in vitro como in vivo, Taylor^{24} y otros, J. of Biol. Chem. 270: 17934, [1995].

Otras proteínas de unión a LPS capaces de unir y neutralizar la endotoxina han sido aisladas a partir de cangrejos de herradura ("horseshoe crab") tales como Limulus polyphemus y factor antilipopolisacárido Tachypleus (TALF) aislado de Tachypleus tridentatus, Kloczewiak^{29} y otros, J. Infect. Dis. 170: 1490-7 (1994). Las celdas de su hemolinfa (amebocitos) sufren una serie de compleja de reacciones bioquímicas que tienen como resultado la formación de coágulos, análogos a la coagulación de la sangre de mamíferos. Este fenómeno ha sido explotado en forma de bioensayos sensibles a niveles muy bajos de endotoxinas.

En la actualidad, un bioensayo de este tipo es el método escogido para controlar fabricación farmacéutica y se designa Lisado Amebocito de Límulo (LAL).

Wainwright y otros, WO 92/20715 han dado a conocer la utilidad farmacéutica de la proteína de unión / neutralización de endotoxina y dan a conocer la utilización de la proteína de unión / neutralización de endotoxina para un ensayo de endotoxina. Un objetivo consiste en proporcionar compuestos farmacéuticos capaces de unión y neutralización de endotoxina in vivo y que contienen una proteína de unión / neutralización de endotoxina correspondiente como mínimo a una parte del dominio de unión y neutralización de la endotoxina de la proteína de unión / neutralización de endotoxina aislada a partir de cangrejo de herradura, de acuerdo con la invención.

El factor limulus anti-LPS (LALF) ha sido investigado en cuanto a su utilización en sepsis. Warren y otros, Infect. Immun. 60: 2506-2513 (1992) y García^{25} y otros, Crit. Care. Med. 22: 1211 (1994). Es casi cierto que esta proteína sufre las desventajas asociadas con otras proteínas extrañas o ajenas para terapia humana, es inmunogénica y tiene solamente una media vida corta en circulación. Estos factores reducirán su potencial clínico. Ninguna de estas sustancias se ha demostrado eficaz para el tratamiento de estados graves asociados con infecciones Gram-negativas en humanos.

La solución al problema técnico anterior se consiguió al conseguir sustancias, que se relacionan con los péptidos, que se unen íntimamente a LPS, y por lo tanto tienen utilidad en el diagnóstico y tratamiento de estados Gram-negativos y otros estados sépticos. Battafaraono y otros, sintetizaron tres péptidos a partir de BPI, LALF, LBP (cada uno de ellos con una longitud de 27 aminoácidos) del motivo propuesto de unión a LPS para estas proteínas. Todos los péptidos pequeños derivados de BPI, LALF y LBP conservaron actividad significativa neutralizante de endotoxina y bactericida contra muchas bacterias distintas gram-negativas in vitro Battafaraono^{26} y otros, Surgery 118: 318-24 [1995]. Más frecuentemente, Fletcher y otros, han diseñado un nuevo conjugado péptido-IgG, CAP-18 (106-138)-IgG, éste se une y neutraliza la endotoxina y extermina las bacterias gram-negativas. Fletcher^{27} y otros, J. Infect. Dis. 175: 621-32 [1997].

Hoess y otros, WO 95/05393 se refiere a sustancias que se unen con alta afinidad a la endotoxina (lipopolisacárido [LPS]), y que son útiles para la prevención de tratamiento como, por ejemplo, de sepsis de bacterias Gram-negativas y Gran-positivas, y para el tratamiento de infecciones por bacterias y por hongos, y también para neutralizar efectos asociados con la heparina. Las sustancias son péptidos de unión a LPS comprendiendo un dominio de unión a LPS. Se dio a conocer un péptido que comprendía los aminoácidos_{31-52} de factor limulus anti-LPS (LALF).

La estructura cristalina de LALF revela un pliegue terciario simple, que tiene forma y anfifaticidad especiales. Un bucle extendido superficialmente en la estructura LALF (bucle de LALF o bucle LALF) tiene características similares a la polimixina B al estar cargado positivamente y ser anfifático y teniendo varios residuos hidrofóbico y aromático expuestos. Además, el bucle de LALF se distingue por una serie alternada de residuos hidrofóbicos / aromáticos cargados positivamente que, en virtud de la conformación \beta extendida, apuntan en dirección opuesta, y un solo par de cargas positivas, lo cual, a causa de la conformación giro \beta ("\beta-turn"), apuntan en la misma dirección y mantienen la anfifaticidad. El bucle no contiene aminoácidos cargados negativamente. Hoess ha descrito las exigencias mínimas de rLALF para endotoxina y lípido A con péptidos lineales 10-mer. No obstante, los péptidos cíclicos unen el lípido A y la endotoxina con alta afinidad, presumiblemente al imitar las características tridimensionales del bucle expuesto, Ried^{28} y otros, J. Biol. Chem. 271: 28120-7 [1996]. El péptido cíclico LALF_{36-47} es capaz de bloquear la inducción de TNF después de la acción de endotoxina en los ratones. Más recientemente, se ha descrito que el factor antilipopolisacárido de Límulo (LALF) neutraliza la endotoxina bacteriana y protege los ratones contra la letalidad de LPS incluso cuando LALF se administra mucho después del inicio de la endotoxemia continua, Roth^{31} Rl. Su DH, Child AH, Wainwright NR y Levin J. Journal of Infectious Diseases, 177 (2): 388-394,1998.

Un bucle anfifático similar existe en otras tres proteínas que se unen a LPS: proteína de unión a lipopolisacáridos de conejo y humanos (LBP) y proteína humana bactericida / incrementadora de impermeabilidad (BPI). La inspección de las secuencias de LBP y BPI revela un modelo similar de residuos alternados que pueden producir un bucle anfifático.

No obstante, estos documentos no indican nada acerca del efecto antivírico y/o activación de monocitos de la proteína de unión neutralización de endotoxina procedente de Limulus polyphemus o el péptido que comprende los aminoácidos_{31-52} de la proteína. La utilización o efectividad terapéutica en la sepsis y en enfermedades infecciosas se relacionan con la unión a LPS. Además, ninguna de las referencias da a conocer la utilización de los péptidos_{31-52} del factor limulus anti-LPS para tratamiento antivírico o para aumentar la respuesta inmune.

Es conocido que los virus son agentes infecciosos más pequeños que contienen solamente un tipo de ácido nucleico en su genoma (RNA o DNA), en general como molécula única. Los virus replican solamente en células vivas y en el hombre pueden producir diferentes enfermedades.

A.

Enfermedades generalizadas en las que el virus se disemina en todo el cuerpo tal como en viruela, fiebre amarilla, dengue, etc.

B.

Enfermedades del sistema nervioso tal como poliomielitis, meningitis aséptica provocada por virus intestinales (polio, coxsackie), rabia, encefalitis transmitida por artrópodos, etc.

C.

Enfermedades de la piel o mucosas: Herpes simplex, tipo (usualmente de la boca) y tipo 11 (usualmente genital).

D.

Enfermedades oculares: Conjuntivitis debida a adenovirus, conjuntivitis debida a virus de Newcastle, conjuntivitis hemorrágica epidérmica.

E.

Enfermedades del hígado: Hepatitis tipo A (hepatitis infecciosa), hepatitis tipo B (hepatitis a través del suero), etc.

Dado que los virus son necesariamente parásitos intracelulares, los agentes antivíricos deben ser capaces de inhibir selectivamente las funciones víricas sin perjudicar al hospedante. Hay varios compuestos que inhiben un virus en una forma específica sin afectar al metabolismo celular, por ejemplo, la amantadina, una amina sintética que inhibe el virus A de la gripe; metisazona, un inhibidor de muchos virus de la viruela; trifluorotimidina que se ha utilizado con éxito en el tratamiento de lesiones de la córnea debido a virus de herpes simplex. Muchos de estos agentes que actúan como antimetabolitos tienen la desventaja de que son tóxicos para los humanos.

También se han probado por su capacidad antivírica y capacidad estimuladora del sistema inmune en animales y en humanos compuestos tales como Levamisol e Isoprinosina; estos agentes no son antimetabolitos sino estimuladores de la inmunidad celular.

Los interferones, un tipo de proteína descubierta en 1957, capaz de inhibir la replicación vírica, son producidos por animales y por el hombre, y también por células cultivadas, como respuesta a infección vírica o algún otro inductor. El interferón es más eficaz como sustancia antivírica en las células de la misma especie. Como contraste, la actividad del interferón no es específica para ciertos virus. El interferón producido como respuesta a un virus o a otro inductor inhibe de manera efectiva la replicación de una amplia variedad de virus. Cuando el interferón se añade a las células antes de que tenga lugar la infección, existe una notable inhibición de la replicación vírica, mientras que la función celular permanece normal.

Las infecciones víricas en el hombre pueden también ser asociadas a complicaciones durante operaciones quirúrgicas graves, tal como cirugía gastrointestinal, o en pacientes que tienen un elevado riesgo de infección en el lugar de la operación, tal como en cirugía cardiovascular.

En operaciones de cirugía aséptica tales como cirugía abdominal o cardiovascular, la reacción llamada fase aguda post-operativa se caracteriza por un deterioro de la función fagocítica, reducción de la respuesta de los linfocitos a activadores policlonales y una función alterada de las células B (D. Berger, Journal of Endotoxin Research, vol. 4 No. 1 (1997)). Esta fase se caracteriza por una disfunción inmunológica del paciente. La neumonía producida por cytomegalovirus (CMV) es más importante en personas que tienen deficiencia inmune, tales como pacientes tratados con inmunosupresores como resultado de un transplante de órganos o un proceso maligno, así como personas con deficiencias inmunológicas naturales tales como hipogamaglobulinemia y con procesos crónicos de debilitamiento, por cuya razón una neumonía producida por CMV puede ser una complicación en cualquier paciente con capacidad inmunológica disminuida. Las neumonías de origen vírico no responden a tratamiento antimicrobiano. La neumonía producida por el virus de la gripe afecta en general a personas mayores que presentan reducción inmunológica debido a enfermedades subyacentes no infecciosas tales como, por ejemplo, enfermedades del pulmón, cardiovasculares o del riñón. En todos estos casos, sería muy útil disponer de un agente con propiedades estimulantes del sistema antivírico y/o inmune.

La importancia de esta invención tiene lugar en el campo médico. La eficacia del péptido que se da a conocer se refiere a los efectos antivírico y antibacteriano, además de activar el sistema inmune y proteger al hospedante contra bacterias o infecciones víricas. Por lo tanto, el péptido _{31-52} del factor limulus anti-LPS es útil en el tratamiento y/o profilaxis de enfermedades infecciosas víricas y bacterianas, pacientes que se encuentren bajo un riesgo incrementado de infección debido a cirugía inminente, heridas, enfermedad u otros estados que afectan de manera perjudicial al sistema inmune. Este péptido es también útil para el tratamiento de pacientes afectados de inmunosupresión. En su conjunto, el péptido de esta invención se puede considerar como un nuevo agente inmunomodulador del sistema inmune con un amplio espectro para el tratamiento de enfermedades infecciosas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a la materia de las reivindicaciones adjuntas. El compuesto utilizado en esta invención comprende un péptido o proteína que comprende los aminoácidos _{31-52} de la proteína de factor anti-LPS aislado del cangrejo de herradura de caballo Limulus polyphemus y aumenta el mecanismo de las defensas inmunes del hospedante contra la infección pero no induce respuesta inflamatoria.

El péptido antes mencionado se ha demostrado que tiene un efecto antivírico capaz de proteger a las células contra infección vírica en un ensayo in vitro. Además, el sobrenadante de las células mononucleares humanas incubadas con el péptido contiene ciertos mediadores solubles tales como IFN-\gamma, capaces de proporcionar protección a células Hep-2 contra futuras infecciones víricas. Además, este péptido protege contra una infección directa in vivo. Estas características ventajosas hacen que este péptido sea útil en la prevención y tratamiento de infecciones porque activan selectivamente solo los componentes del sistema inmune que son responsables de la respuesta inicial a la infección, sin estimular la liberación de ciertos mediadores bioquímicos que pueden provocar efectos secundarios adversos. El péptido carece también de la toxicidad habitual de muchos inmunomoduladores.

El péptido se sintetiza utilizando un proceso de fase sólida. Se extrajo péptido en crudo con una solución de ácido acético al 30% en agua, liofilizada y a continuación purificada mediante RP-HPLC. Se verificó la masa molecular del péptido purificado utilizando un espectrómetro de masa de dos sectores JEOL JMS-HX110HF dotado de un cañón FAB. El preparado resultante no es antígeno, no es pirogénico y es farmacéuticamente aceptable para administración a animales y humanos.

Un péptido que comprende los aminoácidos _{31-52} procedentes de la proteína del factor limulus anti-LPS puede ser utilizado como agentes seguro, eficaz, terapéutico y/o profiláctico, solo o como coadyuvante, para aumentar la respuesta inmune en humanos y en animales. El péptido que comprende las secuencias de aminoácidos que se dan a conocer activa selectivamente solo los componentes que son responsables de la respuesta inicial a la infección provocada por patógenos bacterianos o víricos, sin estimular o favorecer que el sistema inmune libere ciertos mediadores bioquímicos (por ejemplo, TNF, IL-1) que producen efectos secundarios adversos. Como tal, el péptido puede ser utilizado para prevenir o tratar enfermedades infecciosas provocadas por bacterias o patógenos víricos en pacientes malnutridos, pacientes sometidos a cirugía y a transplantes de tuétano de hueso, pacientes sometidos a quimioterapia o radioterapia, pacientes nuetropénicos, pacientes con infección HIV, pacientes de trauma, pacientes con quemaduras, pacientes con infecciones crónicas o resistentes, todos los cuales pueden tener sistemas inmunes debilitados. Un individuo con un sistema inmunitario deficiente ("inmunocomprometido") se define en general como una persona que muestra una capacidad reducida o atenuada para montar una defensa celular y/o humoral normal a acciones producidas por agentes infecciosos, por ejemplo, virus, bacterias, hongos y protozoos. Un individuo con nutrición defectuosa de proteínas se define en general como persona que tiene un nivel de suero albúmina menor de aproximadamente 3,2 gramos por decilitro (gr/dl) y / o pérdida de peso no intencionada superior a 10% del peso corporal usual.

Más particularmente, la invención puede se utilizada para tratar terapéuticamente o profilácticamente animales o humanos que se encuentran sometidos a un riesgo incrementado de infección debido a cirugía inminente, heridas, enfermedad, radiación o quimioterapia, u otros estados que pueden ser perjudiciales para el sistema inmune. La invención es útil para tratar pacientes que tienen una enfermedad o desorden que provoca la reducción de la respuesta inmune metabólica normal tal como infección por HIV (SIDA).

El tratamiento con el péptido ha demostrado que es particularmente eficaz en la movilización de las defensas inmunes normales del hospedante, produciendo un incremento en la protección del mismo contra la infección.

En otra realización de la invención, el péptido puede ser administrado a pacientes que sufren "inmunoparálisis" (Randow y otros, J. Exp. Med. 1995, Vol. 181: 1887-1892.), definida como la reducción del MHC clase II monocítico, actividad monocítica reducida que presenta antígenos y su capacidad disminuida para producir citoquinas inflamatorias. Este fenómeno se llama Síndrome de Respuestas Antiinflamatorias Compensatorias (CARS). Durante la fase hipoinflamatoria tardía en simulación monocítica de sepsis es útil porque restablece el fenotipo deficiente y la función de monocitos en pacientes con "inmunoparálisis".

El péptido se administra en general a un animal o a un humano en cantidad suficiente para producir la mejora del sistema inmune. La forma de administración del péptido puede ser oral, entérica, parenteral, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal o intramuscular. La forma en la que el compuesto será administrado (por ejemplo, tabletas, cápsulas, solución, emulsión) dependerá de la ruta por la que se administra. La cantidad de compuesto a administrar se determinará en base individual, y se basará como mínimo en parte en consideración de la gravedad de la infección o heridas en el paciente, estado del paciente o salud en general, peso del paciente y tiempo disponible antes de la cirugía, quimioterapia u otros tratamientos de alto riesgo. En general, una dosis única contendrá preferentemente y de forma aproximada de 5 mg a 10 mg de péptido por quilo de peso corporal. En general, el compuesto utilizado en la presente invención puede ser administrado a un individuo periódicamente de la forma necesaria para estimular la respuesta inmune del mismo.

Las personas expertas en las técnicas médicas serán capaces de determinar la duración del tiempo durante el que se administra el compuesto y la dosis del mismo, dependiendo del estado físico del paciente y de la enfermedad o desorden sometido al tratamiento. Tal como se ha indicado anteriormente, el compuesto puede también ser utilizado como tratamiento preventivo para preiniciar las defensas metabólicas normales, que el cuerpo moviliza contra las infecciones.

El péptido puede ser utilizado para la prevención y tratamiento de infecciones provocadas por un amplio espectro de bacterias, hongos y patógenos víricos. La administración profiláctica de péptido a una persona sometida a cirugía, de modo preoperativo, intraoperativo y/o postoperativo, reducirá la incidencia y gravedad de infecciones postoperatorias en pacientes normales y de alto riesgo. Por ejemplo, en pacientes sometidos a procesos quirúrgicos clasificados como contaminados o potencialmente contaminados (por ejemplo, cirugía gastrointestinal, histerectomía, sección cesárea, prostatectomía transuretral) y en pacientes en los que la infección en lugar de la operación presenta un riesgo grave (por ejemplo, artroplastia protésica, cirugía cardiovascular), terapia inicial concurrente con agente antibacteriano apropiado y en el presente preparado de péptido reducirá la incidencia y gravedad de las complicaciones infecciosas.

En pacientes con reducción del sistema inmune ("inmunosuprimidos"), no solamente por enfermedad (por ejemplo, cáncer, SIDA) sino tratamientos de quimioterapia y/o radioterapia, la administración profiláctica del preparado péptido reducirá la incidencia de infecciones provocadas por un amplio espectro de patógenos oportunistas incluyendo muchas bacterias poco habituales, hongos y virus.

En pacientes de alto riesgo (por ejemplo, edad superior a 65 años, diabéticos, pacientes de cáncer, malnutrición, enfermedades renales, enfisema, deshidratación, movilidad reducida, etc.), la hospitalización es frecuentemente asociada con una alta incidencia de infección grave de la propia instalación. El tratamiento con este preparado péptido puede ser iniciado empíricamente antes de caracterización, utilización de respiradores, tubos de drenaje, unidades de cuidado intensivo, hospitalización prolongadas, etc. para ayudar a prevenir las infecciones que se asocian habitualmente a estos procedimientos. La terapia concurrente con agentes antimicrobianos y el preparado péptido está indicada para el tratamiento de infecciones crónicas, graves, refractarias, complejas y difíciles de tratar.

Los compuestos administrados en la presente invención pueden incluir opcionalmente otros componentes, además del péptido. Los otros componentes que se pueden incluir en un compuesto particular se determinan principalmente por el modo en el que el compuesto tiene que ser administrado. Por ejemplo, un compuesto que se debe administrar oralmente en forma de tabletas puede incluir, además del péptido, un componente de carga (por ejemplo, lactosa), un aglomerante (por ejemplo, carboximetil celulosa, goma arábiga, gelatina), un coadyuvante, un agente de sabor, un agente de color y un material de recubrimiento (por ejemplo, cera o plastificante). Un compuesto ha administrar en forma líquida puede incluir un péptido y, opcionalmente, un agente emulsionante, un agente de sabor y/o un agente colorante. Un compuesto para administración parenteral puede ser mezclado, disuelto o emulsionado en agua, solución salina estéril, PBS, dextrosa u otro portador biológicamente aceptable. Un compuesto para administración tópica se puede formular en un gel, ungüento, loción, crema u otra forma en la que el compuesto es capaz de recubrir la cara a tratar, por ejemplo, la cara en la que se encuentra la herida.

Se pueden administrar compuestos que comprenden el péptido de manera tópica al lugar de una herida para estimular y favorecer la curación y reparación de heridas. Las heridas debidas a úlceras, acné, infecciones víricas, infecciones por hongos o enfermedades periodontales, entre otras, pueden ser tratadas de acuerdo con la invención, para acelerar el proceso de curación. De manera alternativa, el preparado de péptido puede ser inyectado en la herida o área afectada. Además de la reparación de heridas, el compuesto puede ser utilizado para tratar infecciones asociadas con las mismas o los agentes causantes que resultan en la herida. Un compuesto para administración tópica puede ser formulado en forma de gel, ungüento, loción, crema u otra forma en la que el compuesto es capaz de recubrir el lugar a tratar, por ejemplo, el lugar de una herida. Una dosificación típica para heridas será de unos 5 mg a unos 10 mg.

En otra realización esta invención utiliza polipéptidos híbridos que contienen la secuencia de péptido mencionada en la que la secuencia de péptido constituye el término N o el término C de cadenas de polipéptido más larga de manera que mantiene su capacidad para incrementar la respuesta inmune y confiere esta capacidad al polipéptido híbrido. Un polipéptido híbrido preferente comprende una fusión del péptido y zonas de cadena larga de IgG.

La invención se refiere también a la utilización de proteínas armazón que exponen de manera apropiada la secuencia de péptido mencionada de manera que mantiene o aumenta su capacidad para incrementar la respuesta inmune y confiere esta capacidad al polipéptido híbrido. El término "proteínas armazón" se utiliza haciendo referencia a polipéptidos híbridos que incluyen dentro de su cadena de polipéptido la secuencia seleccionada LALF de manera tal que el segmento insertado forma un bucle expuesto en la estructura de la proteína fusionada, o polipéptido.

La vida media del péptido in vivo y otros parámetros farmacológicos se pueden mejorar con polipéptidos híbridos y de armazón y proteínas que comprenden la secuencia de péptido.

También las secuencias de DNA que codifican los péptidos, o la codificación de proteínas híbridas o de armazón que contienen la secuencia de péptido se podrían insertar en vectores apropiados a expresar in vivo para objetivos terapéuticos junto con cortadores apropiados, diluyentes, coadyuvantes o soluciones o productos químicos estabilizantes.

La nueva actividad inmunológica del péptido factor limulus anti-LPS que se da a conocer en esta invención aumenta las defensas no específicas de células mononucleares de mamíferos e incrementa significativamente su capacidad de responder a un ataque infeccioso. Además, no tiene como resultado aumento de temperatura corporal (por ejemplo, fiebre) tal como se ha indicado con muchos estimulantes no específicos de dichas defensas. Esta ventaja crítica del preparado péptido puede consistir en el perfil natural de respuestas cuya mediación efectúa en las células blancas de la sangre. Se ha demostrado que el efecto de la presente invención activa selectivamente las respuestas inmunes pero no estimula directamente o favorece la liberación de citoquina (por ejemplo, TNF) de células mononucleares, distinguiéndolos por lo tanto de otros inmunoestimulantes.

La invención se muestra a continuación mediante ejemplos específicos que se presentan con objetivo ilustrativo, pero que no limitan el alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Efecto antivírico del péptido en la línea celular Hep-2

Se estimó la determinación de la actividad antivírica por la inhibición del efecto citopático producido por un virus en la línea celular Hep-2, procedimiento habitual para determinar la actividad antivírica de los interferones (Famillietti y otros, 1981, Methods in Enzymology. Vol.78: 387-396). Para este objetivo se utilizaron platillos de cultivo de plástico de 96 pocillos (Nunc, Dinamarca). Se cultivaron en una formación monocapa (24 horas) 1\times10^{5} células/pocillo en medio MEM suplementado con 10% de suero fetal de vaca. Al día siguiente se incubaron con las células durante 24 horas 100 \mul de soluciones en serie de las muestras que contenían cantidades de 14 y 28 \mug / ml de diferentes péptidos a partir de proteínas de unión con LPS: factor limulus anti - LPS _{31-52}(LALF), Proteína de Unión a Lipopolisacárido _{86-99}(BPI). A continuación, las células fueron lavadas con solución salina e infectadas con 10^{-7} pfu de virus Mengo, proporcionado por el Institute of Molecular Biology, Universidad de Zurich que se multiplica en la línea celular de fibroblastos murinos L929. 18 horas más tarde, se midió el grado de destrucción celular por fijación y manchado, en general con cristal violeta, para leer el efecto citopático se utilizó un fotómetro Ultramicroanalytical System (SUMA). Se desarrolló un programa de ordenador en lenguaje Pascal UCSD para el sistema microordenador para todos los cálculos y correcciones (Ferrero y otros, 1994, Biotecnología Aplicada. Vol.1:). En este caso se utilizaron diluciones en serie de \gamma-IFN 70 000 IU/ml humano (MRI, Freeze-dried Reference Human Recombinant Gamma Interferon) como norma o estándar para definir unidades de actividad antivírica. Por esta razón, la protección antivírica mostrada por el péptido se relaciona con unidades internacionales de \gamma-IFN (UI/ml). Como control negativo se utilizaron diferentes péptidos a partir de proteínas que se unen a endotoxina. Se utilizó LPS a 10 ng/ml como control positivo porque es bien conocido que induce a la producción de los IFN (Manthey y otros, 1994, J. Immunology. Vol.153: 2653-2663). Una unidad de actividad antivírica se define como la cantidad de IFN capaz de producir una inhibición al 50% de la replicación vírica.

Los resultados se muestran en la Tabla 1.

TABLA 1

1

La Tabla 1 muestra que solamente el péptido LALF es capaz de inducir estado antivírico en las células Hep-2 definidas como Unidades Internacionales / ml de \gamma-IFN. No se presentó efecto alguno para los otros péptidos derivados de la proteína de unión LPS.

Ejemplo 2 Efecto antivírico del péptido en la línea celular MDBK

Se estimó la determinación de la actividad antivírica por medio de la inhibición del efecto citopático producido por un virus en la línea celular MDBK, esencialmente tal como se ha descrito en el Ejemplo 1. Las células utilizadas en este caso fueron MDBK, una línea celular de riñón bovino normal [ATCC Nº 6071], que son infectadas con 10^{-7} pfu de enterovirus bovino. Se utilizaron cantidades crecientes de péptido LALF a efectos de inducir protección en las células: 10 \muM, 20 \muM y 40 \muM. En este caso, diluciones en serie de \alpha-IFN 70 000 IU / ml humano (MRI, Interferon Alfa Recombinante Humano de Referencia Liocilizado) se utilizaron como norma o estándar a efectos de definir unidades de actividad antivírica. Una unidad de actividad antivírica se define como la cantidad de IFN capaz de producir una inhibición a 50% de la replicación vírica. La figura 5 muestra que el péptido LALF es capaz de inducir protección en la línea celular MDBK de modo dependiente de la dosis.

Ejemplo 3 Sobrenadante de células mononucleares humanas estimulado con péptido limulus anti-LPS factor_{31-52}(LALF) induce efecto antivírico en la línea celular Hep-2

Se obtuvo sangre venosa de voluntarios sanos y se utilizó centrifugación de gradiente Ficoll-Hypaque para fraccionar células mononucleares. Las células mononucleares fueron lavadas y resuspendidas en RPMI - 1640 medio de cultivo suplementado con 10% de suero fetal de vaca libre de endotoxina. En una concentración de 2 \times 10^{6} células/ml, se dividieron las células en partes alícuotas en placas de microtitulación de 24 pocillos (Nunc, Dinamarca). Las células fueron incubadas a continuación con 14 y 28 \mug / ml de diferentes péptidos: limulus anti - LPS factor_{31-52} (LALF), Proteína_{86-99} (LBP) de unión a Lipopolisacárido y 18 kDa de Proteína Antimicrobiana Catiónica_{108-128} (CAP - 18), a 37ºC durante 18 horas en 5% de CO_{2}. Las células fueron centrifugadas a 3000 rpm durante 5 minutos y a continuación se ensayaron diluciones en serie de sobrenadantes en cuanto a actividad antivírica utilizando los procedimientos descritos en el ejemplo 2.

Los resultados se resumen en la Tabla 2. Solamente el péptido LALF utilizado como estimulante de células mononucleares de sangre periférica humana indujeron a la liberación de ciertos mediadores capaces de conferir protección a las células Hep-2 contra infecciones víricas.

TABLA 2

2

Ejemplo 4 Falta de estimulación in vitro de TNT\alpha procedentes de células mononucleares humanas incubadas con péptido

Se obtuvo sangre venosa de voluntarios sanos y se utilizó centrifugación con gradiente Ficoll-Hypaque para fraccionar las células mononucleares. Las células mononucleares fueron lavadas y resuspendidas en medio RPMI 1640 libre de endotoxinas suplementado con 10% de suero fetal de vaca. Se dividieron en partes alícuotas 30 \times 10^{6} células en placas p-60 (Nunc, Dinamarca). Las células fueron incubadas con 14 ó 28 \mug/ml LALF a 37ºC durante 18 horas en 5% de CO_{2} y a continuación se centrifugaron a 3000 rpm durante 5 minutos. Se determinó la síntesis de TNF\alpha en el sobrenadante por ensayo inmunoabsorbente enlazado con enzimas específicas (ELISA), que procedía de Dr. W. Buurman (University Hospital Maastricht, Holanda).

Los resultados se resumen en la Tabla 3. El péptido LALF utilizado como estimulante en dosis de 14-28 \mug/ml sólo no indujo niveles de TNF-\alpha con respecto a las células tratadas con tampón de control.

TABLA 3

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3

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Ejemplo 5 Protección in vivo contra infección en ratones

Se desarrolló un modelo de sepsis peritoneal fulminante de Gram negativa en ratones BalB/c para caracterizar la eficacia del péptido LALF en la protección de un hospedante inmunológicamente intacto contra infecciones graves. Grupos de ratones recibieron el péptido LALF (14 \mug/0,1 ml) o solución salina (0,1 ml) intraperitonealmente 20 horas antes del ataque infeccioso. Se utilizó una dosis de Pseudomona aeruginosa (2 \times 10^{8} bacterias / ratones) que producía una mortalidad total de aproximadamente 90% (Browder y otros, 1987, Surgery. Vol. 102: 206 - 214), a efectos de inducir peritonitis experimental. Los ratones sobrevivientes fueron contados cada 24 horas durante 120 horas después del ataque bacteriano. Los datos de supervivencia fueron analizados por prueba estadística de Kaplan-Meyer, determinándose el análisis de significación utilizando una prueba de rango largo, Tabla 5. Se recogió sangre para cuantificación TNF-\alpha a partir del seno retroorbital en los 0, 20, 40, 60, 90, 120, 180, 240 minutos en el grupo de control y ratones tratados con péptido. Se determinó la concentración de TNF-\alpha en suero de ratones utilizando un ensayo ELISA específico amablemente proporcionado por Dr. W. Buurman (University Hospital Maastricht, Holanda). Figura 4.

TABLA 5

4

El péptido protege a los ratones contra el ataque de bacterias letales cuando se administra profilácticamente. La protección observada se atribuye a una actividad reguladora del péptido sobre la respuesta inmune del hospedante. Este efecto induce a una disminución de la citoquina proinflamatoria TNF, figura 4. Esta capacidad puede atenuar el efecto letal observado durante la sepsis como consecuencia de las liberaciones de mediador proinflamatorio sistémico.

Ejemplo 6 El péptido LALF no es tóxico y no afecta a los niveles de TNF-\alpha in vivo

Este enfoque fue desarrollado en ratones BalB/c con edad comprendida entre 6 y 8 semanas. Los ratones fueron inyectados por vía intravenosa con 50 \mug de péptido en 0,1 ml [2,5 mg/kg de peso corporal] o solución salina como control. Se observó el comportamiento de animales cada 4 horas durante 24 h. La supervivencia fue controlada durante una semana. Se recogió sangre para cuantificación de TNF-\alpha del seno retroorbital a las 0h, 6h, 24h y 48h en el grupo de control y ratones tratados con péptido. La concentración de TNF-\alpha en el suero de ratones fue determinado utilizando un ensayo ELISA específico proporcionado amablemente por el Dr. W. Buurman (University Hospital Maastricht. Holanda). Todos los ratones [10 animales / grupo] sobrevivieron más de una semana. El péptido LALF no es tóxico in vivo y no estimula la producción de TNF-\alpha, figura 3.

Ejemplo 7 Efecto de regulación del péptido derivado de LALF en la respuesta inmune en macrófagos peritoneales activados

Se obtuvieron células elicitadas peritoneales de ratones Balb/c (CENPALAB, Havana, Cuba). Se recogieron macrófagos de ratón primarios de la cavidad peritoneal 4 días después de la inyección intraperitoneal de 1 ml de caldo de tioglicolato de Brewer al 4%. Las células se mantuvieron en RPMI 1640 suplementadas con suero bovino fetal inactivado térmicamente al 10%, 2 mM de L-glutamina, 200 unidades/ml de penicilina, y 200 \mug/ml de estreptomicina a 37ºC en 5% de CO_{2}/96% aire.

Ensayo de secreción de NO_{2} - (Jin, F^{29}, Nathan, C, Radzioch, D, y Ding, A. Cell, 1997, 88: 417-426). Las células fueron aplicadas en placas de 96 pocillos a 2\times10^{6} células/ml en 200 \mul de medio y se incubaron a 37ºC durante 2 horas, y a continuación las células no adherentes fueron retiradas por lavado repetido con PBS. Los macrófagos fueron preincubados con 5 \muM de péptido LALF durante 18 horas, y se lavaron posteriormente con medio RPMI a efectos de eliminar el péptido. A continuación los macrófagos fueron tratados a las 72 horas con LPS de E. coli 0111: B4, Sigma (1\mug/ml). Se evaluó la viabilidad de las células por reducción dependiente de mitocondrio de MTT a formazan (Szabo^{30}, c, Mitchell,JA, Gross, SS, Thiemermann,C, y Vane, Jr. J. Pharm. Exp. Therap., 1992, 265: 674-80). Se mezclaron 50 \mul de medio de cultivo con un volumen igual de reactivo de Greiss (1% sulfanilamida, 0,1% de diclorohidrato de naftiletilendiamina, 2,5% H_{3}PO_{4}). Se registró la absorbancia a 540 nm en un lector de microplacas (SUMA) con nitrito sódico como estándar (Green^{28}, LC, Wagner, DA, Glogowski, J, y otros. Anal Biochem 1982; 126: 131-8). Se restó el contenido de nitrito de medio libre de células incubado de manera similar.

Ensayo de TNF-\alpha: Se aplicaron células en placas de 96 pocillos a 2\times10^{6} células/ml en 200 \mul de medio y se incubaron a 37ºC durante 2 horas. Las células no adherentes fueron retiradas por lavado repetido con PBS. Se preincubaron macrófagos con 5 \muM de péptido LALF durante 18 horas, y se lavaron posteriormente con medio RPMI a efectos de eliminar el péptido. A continuación los macrófagos fueron tratados con LPS de E. coli 0111: B4, Sigma (1\mug/ml). Se determinó el TNF-\alpha en los sobrenadantes de células cultivadas a las 1h, 2h, 4h, 6h y 24h utilizando un equipo de ensayo ELISA amablemente proporcionado por [Dr. W. Buurman Univ. Hosp. Maastricht, Holanda].

Tal como se muestra en la figura 6, los niveles de TNF fueron regulados de modo decreciente en el péptido tratado con macrófagos. Por el contrario, se reguló de modo creciente la producción de NO, figura 7. La viabilidad de las células no quedó afectada durante el ensayo. La viabilidad no resultó en ningún momento inferior a 98%.

Parece que constituye una modulación preferente y específica de la respuesta inducida por LPS. Considerado en su conjunto, es posible que el péptido tenga acción mediadora de un cierto tipo de interacción con las células del sistema inmune y conduce a un efecto inmunoregulatorio capaz de aumentar y/o modular la respuesta inmune en el hospedante.

Ejemplo 8 Estimulación de los PBMC con péptido derivado de LALF Análisis de la expresión del gen de citoquina utilizando el ensayo de protección de ribonucleasa (RPA)

El ensayo de protección de ribonucleasa (RPA) es un método altamente sensible y específico para la detección, cuantificación y caracterización de moléculas RNA (Gilman, M. In Current Protocols in Molecular Biology. J. Wiley and Sons, Nueva York, p. 4.7.1-4.7.8. 1988 y Dent, A.L., Shaffer, A.L., Yu X., Allman, D., Staudt, L.M., 1997. La expresión de citoquina y formación de centro germinal por Bcl-2. Science. 276: 589-592). Se analizaron muestras de RNA total de PBMC humano estimulado y no estimulado en cuanto las distintas especies de mRNA mediante el sistema de ensayo de protección de ribonucleasa PharMingens RiboQuant™ Multi-Probe con el juego de matriz de sonda hck-1 (Cat. Nº 45031 P) que incluye análisis de las especies mRNA para diferentes citoquinas por ejemplo (IL-5, IL-4,IL-10, IL-15, IL-9, IL-2, IL-13, IFN-\gamma).

De modo breve, se hibridiza un equipo de sonda de RNA de citoquina antisentido marcado [^{32}P] y [hck-1, Cat. Nº 45031P] en exceso a muestras de RNA objetivo procedente de PBMC incubados con 5 \muM del péptido durante 18 horas. Las sondas libres y otras moléculas de RNA de hebra única se digieren con Rnases, es decir, sonda equilibrada: los dúplex de RNA objetivo son protegidos contra la digestión por RNase. Estas sondas restantes protegidas Rnase son purificadas, redisueltas en geles de poliacrilamida desnaturalizante de acuerdo con sus dimensiones, formando imágenes por autoradiografía. La identidad y cantidad de cada una de las especies de mRNA en la muestra de RNA original se pueden determinar basándose en la intensidad de señal y las dimensiones apropiadas de las bandas de fragmento de sonda protegida. Un equipo de sonda sin proteger y una sonda para mantener transcriptos del gen se incorporan a efectos de identificar y cuantificar las moléculas de RNA en las muestras originales. Para más detalles, ver Hot-Lines (PharMingen) Vol. 3, Nº 1 pp. 1 1997 o PharMingen RiboQuant™ Multi-Probe Rnase Protection Assay System, Instruction Manual 4^{th} Edition, Agosto 1997.

El RNA total fue obtenido utilizando un método de aislamiento RNA de etapa única por extracción AGPC
(Chomczynski y otros 1987, Analytical Biochemistry. Vol. 162: 156-159).

La tabla 6 muestra que la preparación del péptido LALF no contenía contaminación en dotoxina.

Tal como se muestra en la figura 8, el péptido es capaz de inducir preferentemente expresión de gen IFN-\gamma, IL-2 e IL-13 en PBMC humanos. La expresión y liberación subsiguiente de IFN-\gamma puede ser responsable de las características antivíricas observadas en los sobrenadantes de los PBMC incubados con el péptido. Además, esta respuesta típica Th-1 caracterizada por la producción de IL-2 y IFN-\gamma se puede correlacionar con el efecto de protección del péptido durante la infección por P. aeruginosa en ratones. En efecto, se ha informado que IFN-\gamma disminuye la respuesta inflamatoria en infección crónica de P. aeruginosa en ratas (H.K.Johansen, H.P.Hougen, J.Rygaard y N. Hoiby. Clin. Exp. Immnunol. 1996, 103: 212-218.). Además, se ha descubierto que el tratamiento con IFN-\gamma influye en la respuesta mediada por células y se ha demostrado potencial terapéutico in vivo contra Cryptococcus neoformans (Joly V, Saint-Julien L, Carbon C, Yeni P.Journal de Infect. Dis. 1994; 170: 1331-4), Toxoplasma gondii (Benedetto N, Auriault C, Darcy F y otros Eur Cytokine Net. 1991; 2: 107-14) y Klebsiella pneumoniae (Hagen TLM, Vianen von W, Bakker-Woudenberg IAJM. J. Infect Dis. 1995; 171: 385-92). En este caso, los inventores han demostrado que el péptido derivado de LALF es capaz de producir una mejora en el sistema inmune y puede ser utilizado para prevenir o tratar enfermedades infecciosas provocadas por un amplio espectro de patógenos. Además, se puede utilizar en pacientes que pueden tener su sistema inmune debilitado.

Métodos estadísticos. Todos los valores de las figuras y las tablas se expresan como media \pm desviación estándar (SD). El análisis estadístico fue llevado a cabo utilizando la prueba de Kruskal Wallis. La diferencia entre grupos se determinó por una prueba Dunn. Un valor de p menor de 0,05 se supuso que era significativo.

Breve descripción de las figuras

Figura 1: Muestra una secuencia del péptido LALF que se utiliza para definir la actividad que se da a conocer.

Figura 2: Muestra la purificación cromatográfica RP-HPLC del péptido LALF. Pico A: elución del péptido con 98% de pureza.

Figura 3: Muestra el cambio en niveles de TNF en el suero, a lo largo del tiempo, tomado de infusión intravenosa de ratones con solución salina a 50 \mug de péptido LALF.

Figura 4: Comparación de los niveles sistémicos de TNF en ratones tratados con péptido derivado de LALF y grupo de control. Se inyectaron ratones de ocho semanas de edad i.p. con 14 \mug de péptido, 0,1 ml de solución salina o solución salina sola. Veinte horas después, los ratones fueron inyectados i.p. con una dosis letal de P. aeruginosa. Después de 0, 20, 40, 60, 90, 120, 180 y 240 minutos de la acción infecciosa, los ratones fueron sangrados en el seno retroorbital y se midió la concentración de TNF en el suero.

Figura 5: Muestra las características antivíricas del péptido LALF sobre la línea celular MDBK. Las células fueron tratadas con cantidades crecientes de péptido durante 18 horas. Después de ello, las células fueron atacadas con enterovirus bovino. La actividad antivírica se indica como U/ml de \alpha-IFN.

Figura 6: Efecto regulador del péptido derivado de LALF en la producción de TNF-\alpha en macrófagos estimulados peritonealmente. Los macrófagos fueron pretratados con 5 \muM de péptido LALF durante 18 horas y a continuación las células fueron activadas con 1 \mug de E. coli LPS. Se midió el TNF-\alpha en los sobrenadantes del cultivo celular en tiempos distintos.

Figura 7: Efecto regulador del péptido derivado de LALF sobre la producción de NO en macrófagos estimulados peritonealmente. Los macrófagos fueron pretratados con 5 \muM de péptido LALF durante 18 horas y a continuación las células fueron activadas con 1 \mug de E. coli LPS durante 72 horas. Se midieron los niveles de NO en los sobrenadantes del cultivo celular utilizando el método de Greiss.

Figura 8: Muestras de RNA total procedentes de PBMC humano estimuladas con 5 \muM de péptido durante 18 horas se analizaron en cuanto a especies distintas de mRNA utilizando el sistema de ensayo de protección de ribonucleasa PharMingens RiboQuant Multi-Probe con el juego de matriz de sonda hck-1 (Cat. Nº 45031 P). El autoradiograma de este análisis muestra el hck-1 como conjunto de sonda no protegida (vía 1). También muestra las correspondientes sondas protegidas por RNase después de hibridación con RNA total aislado a partir de PBMC no estimulados (vía 2) y RNA total aislado de PBMC estimulados con 5 \muM de péptido LALF durante 18 horas (vía 3).

Claims (8)

1. Utilización de un compuesto que comprende un péptido o proteína que comprende aminoácidos 31-52 del factor anti-LPS de Limulus polyphemus (LALF) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de enfermedades infecciosas de origen vírico.

2. Utilización de un compuesto, según la reivindicación 1, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento profiláctico o terapéutico de infecciones crónicas o resistentes.

3. Utilización de un compuesto, según la reivindicación 1, en el que dicha enfermedad infecciosa de origen vírico es artritis o un desorden reumatoide.

4. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que la cadena principal de dicho péptido o proteína ha sido sustituida por entidades orgánicas miméticas de la cadena principal.

5. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicho péptido comprende un polipéptido lineal.

6. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en la que dicho péptido comprende un polipéptido cíclico.

7. Utilización, según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en la que dicho péptido comprende un polipéptido híbrido.

8. Utilización, según la reivindicación 7, en la que dicho polipéptido híbrido comprende un conjugado péptido-Ig.