ES2283070T3 - Utilizacion de oligonucleotidos inmunoestimulantes para la prevencion o tratamiento del asma. - Google Patents
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Abstract
Utilización de un oligonucleótido inmunoestimulante (ISS-ODN) en la preparación de un medicamento para el tratamiento del asma en un mamífero, sin coadministración de un antígeno inmunizante, en la que el mamífero se sensibiliza frente a un antígeno estimulante de asma, y en la que el ISS-ODN comprende la secuencia 5''-citosina-guanina-3'', en la que ISS-ODN se administra en el tejido respiratorio, por vía intranasal, por inhalación o por insuflación.
Description
Utilización de oligonucleótidos
inmunoestimulantes para la prevención o tratamiento del asma.
La presente invención se preparó con apoyo del
gobierno bajo el nº de subvención AI37305, concedida por la
National Institutes of Health. El gobierno podría presentar
determinados derechos en la presente invención.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere a procedimientos y
composiciones de oligonucleótidos para la utilización en la
reducción o en la supresión de inflamación mediada por granulocitos
en un tejido huésped y en la modulación de la respuesta
inmunológica del huésped frente a un antígeno.
\vskip1.000000\baselineskip
En vertebrados, después de la adhesión a células
endoteliales de los granulocitos (eosinófilos, basófilos,
neutrófilos y mastocitos), se liberan mediadores inflamatorios,
tales como leucotrienos, proteína básica mayor e histamina. En los
individuos susceptibles, la inflamación resultante puede dañar los
tejidos huésped afectados.
La condición inflamatoria patológica más
frecuente es el asma, que se caracteriza por una infiltración
marcada de eosinófilos en las vías respiratorias, seguido de daño de
los tejidos inducido por la inflamación. Entre otras condiciones
inflamatorias patológicas asociadas con la infiltración de los
granulocitos en los tejidos afectados se incluyen la poliposis
nasal, rinitis alérgica, conjuntivitis alérgica, dermatitis atópica,
fascitis eosinofílica, síndrome hipereosinofílico idiopático e
hipersensibilidad cutánea a los basófilos, así como inflamación y
fibrosis resultante de la producción incrementada de citoquinas
estimulantes de granulocitos, tales como interleuquina
(IL-5) y determinados interferones (INF).
El tratamiento rutinario de dichas condiciones
típicamente se dirige a inhibir la actividad de los mediadores
inflamatorios liberados tras la adhesión de los granulocitos a los
endotelios (por ejemplo mediante la administración de una
composición de corticoides en los tejidos afectados). En los casos
en que se conoce la identidad del antígeno inductor de inflamación,
puede proporcionarse cierta protección inmunológica frente a más
antígeno mediante inmunización. Sin embargo, aunque resulta eficaz
en la estimulación de la producción de anticuerpos neutralizantes,
la inmunización canónica no estimula eficazmente la inmunidad
celular de más largo plazo. Además, la inmunización frente a
antígenos estimula la producción por el huésped de
IL-4 y de IL-5.
IL-5 estimula la adhesión de granulocitos a los
endotelios, mientras que IL-4 induce el cambio de
inmunoglobulinas al isotipo IgE con riesgo de anafilaxis.
La patente WO nº 98/18810, publicada el 7 de
mayo de 1998, se refiere a moléculas de ácidos nucleicos
inmunoestimulantes que contienen un dinucleótido CpG no metilado y a
su utilización.
\vskip1.000000\baselineskip
La invención se refiere a medios para suprimir
rápidamente inflamación estimulada por antígenos en un huésped
mamífero mediante la supresión de la infiltración de granulocitos en
un tejido huésped. Asimismo, la invención se refiere a medios
libres de inmunización para proporcionar protección frente a un
huésped mamífero sensibilizado por antígeno frente a retos
posteriores sin riesgo de anafilaxis. En particular, la presente
invención proporciona la utilización de un oligonucleótido
inmunoestimulante (ISS-ODN) en la preparación de un
medicamento para el tratamiento del asma en un mamífero, y en el que
ISS-ODN comprende la secuencia
5'-citosina-guanina-3',
en el que ISS-ODN se administra a tejido
respiratorio, intranasalmente, mediante inhalación o mediante
insuflación.
Inesperadamente, ISS-ODN
presenta propiedades antiinflamatorias además de sus propiedades
inmunoestimulantes. Por lo tanto, ISS-ODN resultan
útiles en el tratamiento y la prevención de inflamación asociada a
la infiltración de granulocitos de tejido estimulada por antígenos,
tal como la que se produce en las vías respiratorias de los
asmáticos durante un ataque de asma. Ventajosamente, la
administración de ISS-ODN según la invención suprime
la infiltración de granulocitos estimulada por antígenos en el
tejido huésped incluso antes de que ISS-ODN afecte
la respuesta inmunológica del huésped frente al antígeno. De esta
manera, la invención se refiere a un procedimiento independiente de
antígeno para reducir la inflamación estimulada por antígenos
mediante la supresión de la adhesión celular, evitando de esta
manera la liberación de mediadores inflamatorios que resultarían
estimulados por la unión de granulocitos a células endoteliales.
Un ejemplo del control del asma es la
administración de ISS-ODN en el tejido pulmonar vía
intranasal. En los asmáticos, la infiltración de eosinófilos del
tejido pulmonar se produce principalmente durante la etapa tardía
de una respuesta alérgica a un alérgeno respiratorio. La
inmunoterapia canónica puede modular la respuesta inmunológica del
huésped frente al alérgeno y finalmente frenar la marea de
eosinófilos hacia el interior de las vías respiratorias del
huésped. Sin embargo, la práctica de la invención suprime la
infiltración de eosinófilos de las vía respiratorias del huésped
mucho antes de que el sistema inmunológico del huésped responda al
alérgeno respiratorio, proporcionando de esta manera una forma de
protección frente al estrechamiento de las vías respiratorias y el
daño a tejidos respiratorios que caracteriza un ataque agudo de
asma.
Asimismo, en la presente invención se describe
un medio para cambiar una respuesta inmunológica celular presente
del huésped frente a un antígeno de un fenotipo Th a un fenotipo
Th1. Con este fin, se administran ISS-ODN mediante
cualquier vía a través de la que los tejidos del huésped
sensibilizados por el antígeno entren en contacto con el
ISS-ODN. El ISS-ODN administrado de
esta manera refuerza las respuestas inmunológicas tanto humorales
(anticuerpos) como celulares (tipo Th1) el huésped. Al contrario que
la inmunoterapia canónica, se estimula la inmunidad mediante el
presente procedimiento de la invención incluso en el caso de que no
se introduzca antígeno adicional en el huésped. De esta manera, la
utilización del procedimiento para reforzar la capacidad de
respuesta inmunológica de un huésped frente al reto posterior por un
antígeno sensibilizante sin inmunización evita el riesgo de
anafilaxis inducida por inmunización, suprime la producción de IgE
en respuesta al reto de antígeno y elimina la necesidad de
identificar el agente sensibilizante para la utilización en la
inmunización. Una utilización especialmente ventajosa para ello es
el tratamiento de las respuestas alérgicas localizadas en tejidos
diana en los que los alérgenos entran en el cuerpo, tales como la
piel y mucosas.
La supresión del fenotipo Th2 tal como se
describe en la presente invención también resulta un complemento
útil a la inmunoterapia canónica para reducir la producción
estimulada por antígeno de IL-4 y
IL-5. De esta manera, puede administrarse
ISS-ODN a un huésped para suprimir el fenotipo Th2
asociado con la inmunización convencional con antígeno (por ejemplo
para la vacunación o la inmunoterapia de alergias).
El cambio a un fenotipo Th1 descrito en la
presente invención se ve acompañado por el incremento de la
secreción de IFN \alpha, \beta y \gamma, así como
IL-12 y IL-18. Cada una de estas
citoquinas potencia las defensas inmunológicas del huésped contra
los patógenos intracelulares, tales como los virus.
La angiogénesis también se encuentra
incrementada en el fenotipo Th1 (principalmente mediante
estimulación por IL1-2).
Se proporcionan composiciones farmacéuticamente
aceptables de ISS-ODN para la utilización en la
práctica de los procedimientos de la invención. El
ISS-ODN de la invención incluye oligonucleótidos de
ADN y de ARN que se encuentran enriquecidos con dinucleótidos CpG,
incluyendo aquellos que comprenden la estructura primaria
5'-purina-purina-[C]-[G]-pirimidina-pirimidina-3'.
Cuando resulte apropiado para el curso
terapéutico contemplado, el ISS-ODN puede
administrarse con otros agentes antiinflamatorios
inmunoterapéuticos. De esta manera, una composición particularmente
útil para la utilización en la práctica del procedimiento de la
invención es uno en el que se mezcla un agente antiinflamatorio
(por ejemplo un glucocorticoide) o un agente inmunoterapéutico (por
ejemplo un antígeno, citoquina o adyuvante) con un
ISS-ODN, o se conjuga con el mismo.
El ISS-ODN puede proporcionarse
en la forma de un kit que comprende ISS-ODN y
cualquier medicamento adicional, así como un dispositivo para la
administración del ISS-ODN en un tejido huésped y
reactivos para determinar el efecto biológico del
ISS-ODN sobre el huésped tratado.
La figura 1 es un gráfico que resume aspectos
del sistema inmunológico de mamífero.
La figura 2 es un gráfico de datos que confirman
un cambio de un fenotipo Th2 a Th1 (según mide la producción de
IgG2A) en ratones tratados con un ISS-ODN 3 días
antes del reto con antígeno.
Las figuras 3a y 3b son gráficos de datos que
confirman la inducción de un fenotipo Th2 (según mide la producción
de IgG1) en ratones tratados con un ISS-ODN mutante
inactivo 3 días antes del reto con antígeno.
La figura 4 es un gráfico de datos que confirma
la supresión asociada a Th1 de IgE
antígeno-específico en ratones sensibilizados por
antígeno y tratados con ISS-ODN
(pCMV-LacZ, un plásmido que contiene dos copias del
ISS-ODN DY1018) en comparación con ratones (de
control) sensibilizados por antígeno.
La figura 5 es un gráfico de datos que confirma
la supresión de la secreción de IL-4 por
ISS-ODN en comparación con un control.
La figura 6 es un gráfico de datos que confirma
la supresión de la secreción de IL-5 por
ISS-ODN en comparación con un control.
La figura 7 es un gráfico de datos que confirma
la supresión de IL-10 por ISS-ODN en
comparación con un control.
\newpage
La figura 8 es un gráfico de datos que confirma
la estimulación de la secreción de IFN-\gamma por
ISS-ODN en comparación con un control.
La figura 9 es un gráfico de datos que demuestra
un cambio mediado por ISS-ODN a un fenotipo Th1
(según indican los niveles de IFN-\gamma) en
animales tratados con ISS-ODN antes del reto con
antígeno (columnas con asteriscos) o después del reto con
antígeno.
La figura 10 es un gráfico de datos que
demuestra un refuerzo mediado por ISS-ODN en la
respuesta inmunológica (según indican los incrementos de
proliferación de linfocitos CD4+) en animales tratados con
ISS-ODN antes del reto con antígeno (columnas con
asteriscos) o después del reto con antígeno.
Mediante la administración de
ISS-ODN a un huésped sensibilizado con antígeno, es
decir, un mamífero cuyo sistema inmunológico ha aprendido a
responder al reto por un antígeno sensibilizante, el
ISS-ODN puede utilizarse en el tratamiento de la
inflamación y refuerzo de la capacidad de respuesta inmunológica del
huésped con un fenotipo Th1 contra un antígeno sensibilizante. A
los fines de la presente exposición, la expresión "agente
sensibilizante" se refiere a una proteína, péptido,
glucoproteína, lípido o polisacárido inmunogénico exógeno. A título
de referencia, se adjunta como figura 1 un gráfico que resume
aspectos de la inmunidad frente a antígenos de los mamíferos.
El efecto antiinflamatorio de
ISS-ODN resulta útil en la supresión de la
aparición, y en la reducción, de la inflamación aguda mediada por
granulocitos en un huésped sensibilizado por antígeno.
Específicamente, el tratamiento de un huésped sensibilizado por
antígeno (cebado) antes de un posterior reto con antígeno suprime
la infiltración estimulada por el antígeno del tejido del huésped
por parte de granulocitos (especialmente eosinófilos y basófilos).
De manera similar, el tratamiento de un huésped sensibilizado por
antígeno durante o después del reto con antígeno reduce la
infiltración estimulada por antígeno del tejido huésped por los
granulocitos. Ventajosamente, el impacto antiinflamatorio del
ISS-ODN administrado según la invención es rápido,
presentando efecto incluso antes del momento esperado en que
ISS-ODN impacte la respuesta inmunológica del
huésped frente al agente sensibilizante. Por lo tanto, la invención
proporciona al huésped protección prácticamente inmediata frente al
daño de los tejidos por inflamación mediada por granulocitos.
Por ejemplo, tal como se muestra en los datos en
el Ejemplo II, los modelos animales sensibilizados con antígeno de
asma alérgica tratada con ISS-ODN sin reto
concurrente con antígeno experimentaron una reducción de hasta el
90% en la infiltración de eosinófilos en el tejido respiratorio en
comparación con los animales de control y con los animales tratados
únicamente con un mutante inactivo de ISS-ODN.
Significativamente, la reducción de la infiltración de eosinófilos
en ratones previamente retados, o la supresión de la infiltración
de eosinófilos enratones no retados y cebados, se obtuvo dentro de
las 24 horas tan solo de la administración del
ISS-ODN. El efecto del ISS-ODN sobre
la infiltración de eosinófilos, por lo tanto, es independiente de
la respuesta inmunológica del huésped que se desarrolla después rene
al antígeno sensibilizante. Al ser independiente de antígenos, el
ISS-ODN puede utilizarse como supresor de
inflamación antes del reto de antígeno o durante un periodo en el
que se encuentra presente el riesgo de reto de antígeno (por ejemplo
durante una estación alérgica). Es importante, tal como se muestra
en los Ejemplos IV y VI, que ISS-ODN puede
utilizarse según la invención para prevenir la inflamación o una
respuesta inmunológica sobre el posterior reto con antígeno en un
huésped cebado por antígeno, así como para reducir la inflamación u
otras respuestas inmunológicas estimuladas por antígeno tras el
reto con antígeno.
Aunque la invención no se encuentra limitada a
ningún mecanismo de acción, resulta probable que la actividad
antiinflamatoria del ISS-ODN es por lo menos
parcialmente consecuencia de la supresión de IL-5.
Sin embargo, la supresión de la acumulación de granulocitos en el
tejido huésped se consigue antes (dentro de las 24 horas) del
momento en que se prevé se produce la activación inmunológica de los
linfocitos secretores de citoquinas. Por lo tanto, también resulta
posible que ISS-ODN administrado según la invención
interfiera físicamente con la adhesión de los granulocitos a
células endoteliales, quizás bloqueando los receptores endoteliales
VCAM-1, su ligando eosinofílico
(VLA-4) o por lisado de los granulocitos. Sea cual
fuere el mecanismo, la supresión por ISS-ODN de la
acumulación de granulocitos según la invención aparentemente es
independiente de la estimulación por ISS-ODN del
sistema inmunológico del huésped.
El efecto inmunoterapéutico de
ISS-ODN produce una respuesta inmunológica similar a
la vacunación frente al reto por un antígeno sensibilizante sin la
exposición concurrente del huésped al antígeno. La estimulación
inmunológica alcanzada es comparable a la estimulación inmunológica
que se produce al vacunar un huésped con un antígeno
sensibilizante. De esta manera, ISS-ODN proporciona
medios para inmunizar un huésped frente a un antígeno
sensibilizante sin el reto deliberado con antígeno.
Ventajosamente, la respuesta inmunológica
estimulada por ISS-ODN difiere de una respuesta de
inmunización en que ésta última se desarrolla en un fenotipo Th2,
mientras que la primera se desarrolla en un fenotipo Th1. A este
respecto, resulta útil recordar que los linfocitos CD4+ generalmente
se clasifican en dos subgrupos diferenciados: las células Th1 y las
células Th2. Las células Th1 principalmente segregan
IL-2, IFN\gamma y TNF\beta (los dos últimos
median en la activación de los macrófagos y en la hipersensibilidad
de tipo retardado), mientras que las células Th2 principalmente
segregan IL-4 (que estimula la producción de
anticuerpos IgE), IL-5 (que estimula la
infiltración de tejido con granulocitos), IL-6 y
IL-10. Estos subgrupos de CD4+ ejercen una
influencia mutua negativa, es decir, la secreción de linfoquinas Th1
inhibe la secreción de linfoquinas Th2 y viceversa.
Los factores que se cree que favorecen la
activación de Th1 son asemejan a aquellos inducidos por la
infección vírica, y entre ellos se incluyen los patógenos
intracelulares, la exposición a IFN-\beta,
IFN-\alpha, IFN\gamma, IL-12 e
IL-18 y la exposición a dosis reducidas de antígeno.
Las respuestas inmunológicas de tipo Th1 también predominan en la
enfermedad autoinmunológica. Entre los factores que se cree que
favorecen la activación de Th2 se incluyen la exposición a
IL-4 e IL-10, la actividad de APC
por parte de los linfocitos B y las dosis elevadas de antígeno. Las
células Th1 (IFN\gamma) activas incrementan la inmunidad celular
y, por lo tanto, resultan de particular valor en la respuesta a las
infecciones intracelulares, mientras que las células Th2 activas
incrementan la producción de anticuerpos y, por lo tanto, resultan
valiosas en la respuesta a las infecciones extracelulares (con el
riesgo de sucesos anafilácticos asociados a la inducción estimulada
por IL-4 de la producción de anticuerpos IgE). De
esta manera, la capacidad de cambiar las respuestas inmunológicas
del huésped del repertorio de Th1 al de Th2 y viceversa presenta una
significación clínica sustancial en el control de la inmunidad del
huésped frente al reto por antígeno (por ejemplo en las condiciones
infecciosas y alérgicas).
A este fin, el cambio por
ISS-ODN de la respuesta inmunológica del huésped
frente a un antígeno sensibilizante a un fenotipo Th1 (Ejemplo IV).
En consecuencia, se suprime la secreción de IL-4,
IL-5 e IL-10 asociada a Th2
estimulada por antígeno (Ejemplo VI), la infiltración por
granulocitos de tejido sensibilizado por antígeno estimulada por
IL- (Ejemplos II y III) y la producción estimulada por
IL-4 de IgE (Ejemplo V), reduciendo de esta manera
el riesgo del huésped de inflamación alérgica prolongada y
minimizando el riesgo de anafilaxis inducida por
antígeno.
antígeno.
Aunque la invención no se limita a ningún
mecanismo de acción particular, es concebible que
ISS-ODN facilite la incorporación de antígeno
exógeno por parte de las células presentadoras de antígeno para su
presentación por las rutas de procesamiento del MHC de clase I del
huésped. Sea cual fuere el mecanismo de acción, la utilización de
ISS-ODN para reforzar la capacidad de respuesta
inmunológica del huésped a un antígeno sensibilizante y desplazar
la respuesta inmunológica hacia un fenotipo Th1 evita el riesgo de
anafilaxis inducida por inmunización, suprime la producción de IgE
en respuesta a un antígeno sensibilizante elimina la necesidad de
identificar el antígeno sensibilizante para la utilización en la
inmunización.
Con referencia a la invención, la "reducción
de la inflamación" mediada por ISS-ODN (en un
huésped cebado y retado con antígeno), la "prevención de la
inflamación" (en un huésped cebado previamente al reto por
antígeno) y el "refuerzo de la capacidad de respuesta inmunológica
en un fenotipo Th1" en un huésped tratado con
ISS-ODN se ponen en evidencia en cualquiera de los
sucesos siguientes:
- (1)
- una reducción de los niveles de IL-4 medidos antes y después del reto por antígeno; o la detección de niveles inferiores (o incluso nulos) de IL-4 en un huésped tratado en comparación con un control cebado con antígeno o cebado y retado;
- (2)
- un incremento de los niveles de IL-12, IL-18 y/o IFN (\alpha, \beta o \gamma) antes y después del reto por antígeno; o la detección de niveles superiores de IL-12, IL-18 y/o IFN (\alpha, \beta o \gamma) en un huésped tratado con ISS-ODN en comparación con un control cebado con antígeno o cebado y retado;
- (3)
- producción de anticuerpo IgG2a en un huésped tratado; o
- (4)
- una reducción de los niveles de IgE antígeno-específico al comparar los niveles medidos antes y después del reto por antígeno; o la detección de niveles inferiores (o incluso ausentes) de IgE antígeno-específico en un huésped tratado con ISS-ODN en comparación con un control cebado con antígeno, o cebado y retado.
- Además, con respecto a la reducción y prevención de la inflamación en particular, un indicio especialmente significativo de la eficacia del procedimiento inventivo en un huésped tratado es:
- (5)
- la reducción de los recuentos de granulocitos (por ejemplo de eosinófilos o de basófilos, dependiendo de qué tipo celular se encuentra más involucrado en la condición que afecta al huésped) en el infiltrado inflamatorio de un tejido huésped afectado según se mide en un huésped retado con antígeno antes y después de la administración de ISS-ODN, o la detección de recuentos inferiores (o incluso nulos) de eosinófilos o de basófilos en un huésped tratado en comparación con un control cebado con antígeno, o cebado y tratado.
Los procedimientos ejemplares para determinar
dichos valores se describen adicionalmente en los Ejemplos.
El ISS-ODN de la invención se
administra a un huésped en el tejido respiratorio, intranasalmente,
por inhalación, o mediante insuflación. Sin embargo, los expertos
ordinarios en la materia apreciarán que resultarán preferentes
procedimientos y vías localizadas que dirijan el
ISS-ODN hacia el interior del tejido sensibilizado
por antígeno en la mayoría de circunstancias, frente a las vías
sistémicas de administración, tanto por la inmediatez del efecto
terapéutico como la evitación de la degradación de los
oligonucleótidos in vivo.
El punto de entrada para muchos antígenos
exógenos en un huésped es a través de la piel o mucosa. Los
expertos ordinarios en la materia clínica conocerán, o podrán
determinar con facilidad, medios para la administración
farmacológica en piel y mucosas. Sin embargo, a título de revisión
se comentan brevemente posteriormente procedimientos y vías de
administración farmacológica ejemplares que resultan útiles en la
invención.
Los medios de administración intranasal resultan
particularmente útiles en el tratamiento de la inflamación
respiratoria, particularmente la infamación mediada por antígenos
transmitidos desde las vías nasales a la tráquea o los bronquiolos.
Entre estos medios se incluyen la inhalación de suspensiones de
aerosol o el insuflación de las composiciones de polinucleótidos de
la invención. Los dispositivos nebulizadores, adecuados para la
administración de composiciones de polinucleótidos en la mucosa
nasal, tráquea y bronquiolos, son bien conocidos de la técnica y,
por lo tanto, no se describen en detalle en la presente memoria.
Para una revisión general de la administración farmacológica
intranasal, los expertos ordinarios en la materia pueden consultar
Chien, Novel Drug Delivery Systems, capítulo 5 (Marcel Dekker,
1992).
Una ventaja particular del
ISS-ODN de la invención es su capacidad para ejercer
actividad antiinflamatoria e inmunoterapéutica incluso a dosis
relativamente minúsculas. Aunque la dosis utilizada variará
dependiendo de las metas clínicas que deben alcanzarse, un
intervalo de dosis adecuado es uno que proporcione hasta
aproximadamente 1 a 1.000 \mug de ISS-ODN/ml de
portador en una sola dosis. En vista de las enseñanzas
proporcionadas por la presente exposición, los expertos ordinarios
en la materia clínica conocerán, o podrán determinar con facilidad,
parámetros adecuados para la administración de
ISS-ODN según la invención.
A este respecto, debe indicarse que la actividad
antiinflamatoria e inmunoterapéutica de ISS-ODN en
la invención esencialmente depende de la dosis. Por lo tanto, al
incrementar la potencia de ISS-ODN en un factor de
dos, se dobla la concentración de cada dosis individual.
Clínicamente puede resultar recomendable administrar el
ISS-ODN en una dosis reducida (por ejemplo de entre
aproximadamente 1 \mug/ml y 50 \mug/ml), incrementando después
la dosis según resulte necesario para alcanzar la meta terapéutica
deseada. Alternativamente, puede considerarse una dosis diana de
ISS-ODN aproximadamente 1 a 10 \muM en una muestra
de sangre del huésped extraída dentro de las primeras 24 a 48 horas
de la administración del ISS-ODN. Basándose en
estudios actuales, se cree que ISS-ODN presentan
una toxicidad reducida o nula a estos niveles de dosis.
Funcionalmente, ISS-ODN
incrementan las respuestas inmunológicas celulares y humorales,
particularmente la proliferación de linfocitos y la liberación de
citoquinas (incluyendo IFN) por monocitos del huésped y células
asesinas naturales (NK). La inmunoestimulación por
ISS-ODN sintético in vivo se produce poniendo
en contacto linfocitos del huésped con, por ejemplo,
oligonucleótidos ISS-ODN, conjugados de
oligonucleótidos ISS-ODN y vectores de expresión
recombinante de contienen ISS (los datos sobre actividad de los
conjugados de ISS-ODN y de los vectores de
ISS-ODN se proporcionan en las solicitudes
copendientes de patente US comúnmente asignadas números de serie
60/028.118 y 08/593.554; los datos de las cuales se incorporan como
referencia en la presente invención con el fin de demostrar la
actividad inmunoestimulante in vivo de
ISS-ODN). De esta manera, aunque los
ISS-ODN microbianos nativos estimulan el sistema
inmunológico del huésped en la respuesta a la infección, los
análogos sintéticos de estos ISS-ODN resultan útiles
terapéuticamente para modular la respuesta inmunológica del huésped
no sólo a antígenos microbianos, sino también los antígenos
tumorales, alérgenos y otras sustancias.
Estructuralmente, los ISS-ODN
son oligonucleótidos no codificantes 6-meros o de
mayor longitud que puede incluir por lo menos un motivo CpG no
metilado. La posición relativa de cada secuencia CpG en
ISS-ODN con actividad inmunoestimulante en
determinadas especies de mamífero (por ejemplo roedores) es
5'-CG-3' (es decir, la C se
encuentra en la posición 5' con respecto a la G en la posición 3').
Muchos ISS-ODN conocidos flanquean el motivo CpG
con por lo menos dos nucleótidos purina (por ejemplo GA o AA) y por
lo menos dos nucleótidos pirimidina
(5'-purina-purina-[C]-[G]-pirimidina-pirimidina-3').
Los ISS-ODN que contienen motivos CpG se cree que
estimulan la proliferación de linfocitos B (ver, por ejemplo, Krieg
et al., Nature 374:546-549, 1995).
La estructura de hexámero nuclear de los
ISS-ODN anteriores puede encontrarse flanqueada
corriente arriba y/o corriente abajo por cualquier número o
composición de nucleótidos o nucleósidos. Sin embargo, los
ISS-ODN presentan una longitud de por lo menos 6
nucleótidos, y preferentemente presentan una longitud de entre 6 y
200 nucleótidos, incrementando la incorporación de los
ISS-ODN en los tejidos diana. Los expertos
ordinarios en la materia conocerán, o podrán identificar con
facilidad, las secuencias de nucleótidos informadas de los
ISS-ODN conocidos. Con el fin de facilitar la
referencia a este respecto, las fuentes siguientes resultan
especialmente útiles:
Yamamoto et al., Microbiol.
Immunol. 36:983, 1992
Ballas et al., J. Immunol.
157:1840, 1996
Klinman et al., J. Immunol.
158:3635, 1997
Sato et al., Science 273:352,
1996
Cada uno de estos artículos se incorpora como
referencia en la presente memoria a fin de ilustrar el nivel de
conocimientos de la técnica de la composición de nucleótidos de los
ISS-ODN.
En particular, entre los ISS-ODN
útiles en la invención se incluyen aquellos que presentan las
secuencias hexaméricas de nucleótidos siguientes:
- 1.
- ISS-ODN que presentan dinucleótidos "CpG", y
- 2.
- Sustituciones con inosina y/o uracilo de nucleótidos en las secuencias de hexámeros anteriores para la utilización de ISS-ODN de ARN.
Por ejemplo, entre los ISS-ODN
basados en ADN que resultan útiles en la invención se incluyen
aquellos que presentan las secuencias hexaméricas de nucleótidos
siguientes:
- \quad
- AACGTT, AGCGTC, GACGTT, GGCGTT, ACGTC, AGCGTC, GACGTC, GGCGTC, AACGCC, AGCGCC, GACGCC, GGCGCC, AGCGCT, GACGCT, GGCGCT, TTCGAA, GGCGTT y AACGCC
- \quad
- (respectivamente las SEC ID nº 1 a 18).
Los ISS-ODN pueden ser ADN de
una o dos cadenas, ARN de una o dos cadenas y/o oligonucleósidos.
Los ISS-ODN pueden incluir o no regiones
palindrómicas. Si se encuentran presentes, un palíndromo puede
extenderse únicamente hasta un motivo CpG, si se encuentra
presente, en la secuencia de hexámero nuclear, o puede abarcar más
de la secuencia de hexámero, así como secuencias de nucleótidos
flanqueantes.
Las bases nucleótidas del
ISS-ODN que flanquean el motivo CpG del hexámero
nuclear y/o que constituyen las secuencias de nucleótidos
flanqueantes pueden ser cualesquiera bases de origen natural
conocidas o cualesquiera bases no naturales sintéticas (por ejemplo
TCAG o, en ARN, UACGI). Pueden incorporarse oligonucleósidos en la
región interna y/o en los extremos del ISS-ODN
utilizando técnicas convencionales para la utilización como puntos
de unión para otros compuestos (por ejemplo péptidos). La base o
bases, grupo azúcar, grupos fosfato y extremos del
ISS-ODN también pueden modificarse de cualquier
manera conocida por los expertos ordinarios en la materia par
construir un ISS-ODN que presente propiedades
deseadas además de la actividad descrita del
ISS-ODN. Por ejemplo, pueden unirse grupos azúcar a
las bases nucleótidas del ISS-ODN en cualquier
configuración estérica.
Además, las modificaciones de grupos fosfato del
esqueleto (por ejemplo enlaces internucleótido etilfosfonato,
fosforotioato, fosforoamidato y fosforoditioato) pueden proporcionar
actividad antimicrobiana al ISS-ODN e incrementar
su estabilidad in vivo, haciendo que resulten particularmente
útiles en aplicaciones terapéuticas. Una modificación de grupo
fosfato particularmente útil es la conversión a las formas
fosforotioato o fosforoditioato de los oligonucleótidos
ISS-ODN. Además de sus propiedades potencialmente
antimicrobianas, los fosforotioatos y fosforoditioatos son más
resistentes a la degradación in vivo que sus contrapartidas
oligonucleótidas no modificadas, haciendo que el
ISS-ODN de la invención se encuentre más disponible
para el huésped.
Pueden sintetizarse ISS-ODN
utilizando técnicas y equipos de síntesis de ácidos nucleicos que
son bien conocidos de la técnica. Para referencia en este aspecto,
ver, por ejemplo, Ausubel et al., Current Protocols in
Molecular Biology, capítulos 2 y 4 (Wiley Interscience, 1989);
Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual
(Cold Spring Harbor Lab., New York, 1982); patentes US nº 4.458.066
y nº 4.650.675. Estas referencias se incorporan en la presente
memoria como referencia con el único propósito de demostrar el
conocimiento de la técnica respecto a la producción de
oligonucleótidos sintéticos. Debido a que ISS-ODN es
no codificante, no existe el problema de mantener un marco de
lectura abierto durante la síntesis.
Pueden incorporarse los ISS-ODN
en un vector de administración, tal como un plásmido, cósmido, virus
o retrovirus, que a su vez puede codificar para polipéptidos
terapéuticamente beneficiosos, tales como citoquinas, hormonas y
antígenos. La incorporación de ISS-ODN en este
vector no afecta adversamente su actividad.
Alternativamente, pueden aislarse
ISS-ODN de especies microbianas (especialmente
microbacterias) utilizando técnicas bien conocidas de la técnica,
tales como la hibridación de ácidos nucleicos. Preferentemente,
estos ISS-ODN aislados se purifican hasta un estado
sustancialmente puro, es decir hasta que se encuentren libres de
contaminantes endógenos, tales como lipopolisacáridos. Los
ISS-ODN aislados como parte de un polinucléotido
más grande pueden reducirse hasta la longitud deseada mediante
procedimientos bien conocidos de la técnica, tales como mediante
digestión con endonucleasa. Los expertos ordinarios en la materia
conocerán, o podrán determinar fácilmente, técnicas adecuadas para
el aislamiento, purificación y digestión de polinucleótidos para
obtener ISS-ODN de utilización potencial en la
invención.
La confirmación de que un oligonucleótido
particular presenta las propiedades de un ISS-ODN
útil en la invención puede obtenerse evaluando si el
ISS-ODN afecta a la secreción de citoquinas y a la
producción de isotipos de anticuerpos IgG tal como se describe en
la sección A.I, anteriormente. Los detalles de las técnicas in
vitro útiles en la preparación de esta evaluación se
proporcionan en los Ejemplos; los expertos ordinarios en la materia
también conocerán, o podrán determinar fácilmente, otros
procedimientos para medir la secreción de citoquinas y la
producción de anticuerpos en los parámetros que se enseñan en la
presente invención.
Las técnicas para realizar modificaciones de
grupo fosfato de los oligonucleótidos son conocidas de la técnica y
no requieren una explicación detallada. Para una revisión de una de
estas técnicas útiles, se prepara un intermediario fosfato triéster
para el producto oligonucleótido diana y se oxida hasta el fosfato
triéster de origen natural con yodo acuoso o con otros agentes,
tales como aminas anhidras. Las oligonucleótido fosforamidatos
resultantes pueden tratarse con azufre para proporcionar
fosforotioatos. Puede aplicarse la misma técnica general
(exceptuando la etapa de tratamiento con azufre) para proporcionar
metilfosfoamiditas a partir de metilfosfonatos. Para más detalles
respecto a las técnicas de modificación de grupos fosfato, los
expertos ordinarios en la materia pueden consultar las patentes US
nº 4.425.732, nº 4.458.066, nº 5.218.103 y nº 5.453.496, así como
Tetrahedron Lett. 21:4149, 1995; Tetrahedron Lett. 7:5575, 1986;
Tetrahedron Lett.25:1437, 1984, y Journal Am. Chem. Soc. 93:6657,
1987, las exposiciones de las cuales ilustran el nivel estándar de
conocimientos de la técnica respecto a la preparación de estos
compuestos.
Puede utilizarse un sistema de dispersión
coloidal para la administración dirigida de los
ISS-ODN en un tejido inflamado. Entre los sistemas
de dispersión coloidal se incluyen los complejos macromoleculares,
nanocápsulas, microesferas, perlas y sistemas basados en lípidos,
incluyendo las emulsiones de aceite en agua, micelas, micelas
mixtas y liposomas. El sistema coloidal preferente de la presente
invención es un liposoma.
Los liposomas son vesículas membranales
artificiales que resultan útiles como vehículos de administración
in vitro e in vivo. SE ha demostrado que las vesículas
unilamelares grandes (LUV), con un tamaño comprendido entre 0,2 y
4,0 \mum puede encapsular un porcentaje sustancial de un tampón
acuoso que contiene macromoléculas grandes. Puede encapsularse ARN,
ADN y viriones intactos dentro del interior acuoso y puede
administrarse a células en una forma biológicamente activa (Fraley
et al., Trends Biochem. Sci. 6:77, 1981). Además de las
células de mamífero, se han utilizado liposomas para la
administración de polinucleótidos en células vegetales, de levadura
y bacterianas. Para que un liposoma sea un vehículo de transferencia
génica eficiente, deben encontrarse presentes las características
siguientes: (1) encapsulación de los genes codificantes de los
polinucleótidos antisentido a eficiencia elevada, aunque sin
comprometer su actividad biológica, (2) unión preferente y
sustancial a una célula diana en comparación con las células no
diana, (3) administración del contenido acuoso de la vesícula en el
citoplasma de la célula diana a eficiencia elevada, y (4) expresión
exacta y eficaz de la información genética (Mannino et al.,
Biotechniques 6:682, 1988).
La composición del liposoma habitualmente es una
combinación de fosfolípidos, particularmente fosfolípidos de
elevada temperatura de transición de fase, habitualmente en
combinación con esteroides, especialmente colesterol. También
pueden utilizarse otros fosfolípidos u otros lípidos. Las
características físicas de los liposomas dependen del pH, fuerza
iónica y de la presencia de cationes divalentes.
Entre los ejemplos de lípidos útiles en la
producción de liposomas se incluyen los compuestos fosfatidilo,
tales como fosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, fosfatidilserina,
fosfatidiletanolamina, esfingolípidos, cerebrósidos y gangliósidos.
Resultan particularmente útiles los diacilfosfatidilgliceroles, en
los que el grupo lípido contiene entre 14 y 18 átomos de carbono,
particularmente 16 a 18 átomos de carbono, y se encuentra saturado.
Entre los fosfolípidos ilustrativos se incluyen la fosfatidilcolina
de huevo, la dipalmitoilfosfatidilcolina y la
distearoilfosfatidilcolina.
La administración dirigida de liposomas puede
clasificarse según factores anatómicos y mecanísticos. La
clasificación anatómica se basa en el nivel de selectividad, por
ejemplo órgano-específica,
célula-específica y
orgánulo-específica. La administración mecanística
puede clasificarse como pasiva o activa. La administración pasiva
utiliza la tendencia natural de los liposomas de distribuir las
células del sistema reticuloendotelial (RES) en órganos que
contienen capilares sinusoidales. Por otra parte, la dianización
activa implica la alteración del liposoma mediante el acoplamiento
del liposoma a un ligando específico, tal como un anticuerpo
monoclonal, azúcar, glucolípido o proteína, o cambiando la
composición o tamaño del liposoma con el fin de conseguir la
administración dirigida en órganos y tipos celulares aparte de los
sitios de localización naturales.
La superficie del sistema de administración
dirigida puede modificarse de una diversidad de maneras. En el caso
de un sistema de administración dirigida liposómico, pueden
incorporarse grupos lipídicos en la bicapa lipídica del liposoma
con el fin de mantener el ligando de dianización en asociación
estable con la bicapa del liposoma. Pueden utilizarse diversos
grupos de unión bien conocidos para unir las cadenas lipídicas al
ligando de dianización (ver, por ejemplo, Yanagawa et al.,
Nucl. Acids Symp. Ser. 19:189, 1988; Grabarek tal., Anal. Biochem.
185:131, 1990; Staros et al., Anal. Biochem. 156:220, 1986, y
Boujrad et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5728, 1993,
las exposiciones de las cuales se incorporan en la presente memoria
como referencia únicamente con el fin de ilustrar el nivel estándar
de conocimientos de la técnica referente a la conjugación de
oligonucleótidos a lípidos). La administración dirigida de
ISS-ODN también puede conseguirse mediante
conjugación de los ISS-ODN a la superficie de
vectores de expresión recombinante víricos y no víricos a un
antígeno o a otro ligando, a un anticuerpo monoclonal o a cualquier
molécula que presente la especificidad de unión deseada.
Entre los ejemplos de otras parejas de conjugado
útiles se incluyen cualquier antígeno inmunogénico (incluyendo
alérgenos, partículas víricas vivas y atenuadas y antígenos
tumorales), péptidos de dianización (tales como ligandos de
receptor, anticuerpos y fragmentos de anticuerpo, hormonas y
enzimas), antígenos no peptídicos (acoplados mediante un enlace
peptídico, tales como lípidos, polisacáridos, glucoproteínas,
gangliósidos y similares) y citoquinas (incluyendo interleuquinas,
interferones, eritropoyetina, factor de necrosis tumoral y factores
estimulantes de colonias). Estas parejas de conjugado pueden
prepararse de acuerdo a técnicas convencionales (por ejemplo
síntesis de péptidos) y muchos se encuentran disponibles
comercialmente.
Los expertos ordinarios en la materia también
conocerán, o podrán determinar fácilmente, procedimientos útiles en
la preparación de conjugados de
oligonucleótido-péptido. La conjugación puede
conseguirse en cualquiera de los extremos del
ISS-ODN o en una base convenientemente modificada en
una posición interna (por ejemplo una citosina o un uracilo). A
título de referencia, se conocen procedimientos para conjugar
oligonucleótidos con proteínas y a grupos oligosacáridos de Ig
(ver, por ejemplo, O'Shannessy et al., J. Applied Biochem.
7:347, 1985, la exposición de la cual ilustra el nivel estándar de
los conocimientos de la técnica referente a la conjugación de
oligonucleótidos). Otra referencia útil es Kessler:
"Nonradioactive Labeling Methods for Nucleic Acid", en Kricka
(editor), Non-isotopic DNA Probe Techniques (Acad.
Press, 1992).
Brevemente, entre los ejemplos de procedimientos
de conjugación adecuados conocidos se incluyen: conjugación
mediante enlace 3' por unión a un soporte sólido (ver, por ejemplo,
Haralambidis et al., Nucl. Acids Res. 18:493, 1990, y
Haralambidis et al., Nucl. Acids Res. 18:501, 1990 [síntesis
en soporte sólido de pareja peptídica]; Zuckermann et al.,
Nucl. Acids Res. 15:5305, 1987; Corey et al., Science
238:1401, 1987, y Nelson et al., Nucl. Acids Res. 17:1781,
1989 [síntesis en soporte sólido de pareja oligonucleótida]. Pueden
llevarse a cabo enlaces de amino-grupo amino tal
como se describe en Benoit et al., Neuromethods 6:43, 1987,
mientras que pueden llevarse a cabo enlaces de grupo tiolcarboxilo
tal como se describe en Sinah et al., Oligonucleotide
Analogues: A Practical Approach (IRL Press, 1991). En estos últimos
procedimientos, la pareja oligonucleótida se sintetiza en un
soporte sólido y se une covalentemente un grupo de enlace que
comprende un grupo protegido amina, tiol o carboxilo frente a
fosforamidita, al 5'-hidroxilo (ver, por ejemplo,
las patentes US nº 4.849.513, nº 5.015.733, nº 5.118.800 y nº
5.118.802).
La unión de la pareja oligonucleótida a un
péptido también puede realizarse mediante la incorporación de un
brazo de enlace (por ejemplo un grupo amina o carboxilo) a una base
modificada citosina o uracilo (ver, por ejemplo, Ruth, 4th Annual
Congress for Recombinant DNA Research at 123). También pueden
utilizarse los enlaces por afinidad (por ejemplo
biotina-estreptavidina) (ver, por ejemplo, Roget
et al., Nucl. Acids Res. 17:7643, 1989).
También se conocen procedimientos para unir
oligonucleótidos a lípidos y entre ellos se incluyen la síntesis de
conjugados oligo-fosfolípido (ver, por ejemplo,
Yanagawa et al., Nucl. Acids Symp. Ser. 19:189, 1988), la
síntesis de conjugados oligo-ácidos grasos (ver, por ejemplo,
Grabarek et al., Anal. Biochem. 185:131, 1990) y conjugados
oligo-esterol (ver, por ejemplo, Boujrad et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5728, 1993).
Cada una de las referencias anteriormente
indicadas ilustra el nivel de conocimientos generales y básicos de
la técnica con respecto a los procedimientos de conjugación de
oligonucleótidos.
La coadministración de un fármaco péptido con un
ISS-ODN según la invención también puede conseguirse
incorporando el ISS-ODN en cis o en trans en un
vector de expresión recombinante (plásmido, cósmido, virus o
retrovirus) que codifique cualquier proteína terapéuticamente
beneficiosa administrable con un vector de expresión recombinante.
Si se desea la incorporación de un ISS-ODN en un
vector de expresión para la utilización en la práctica de la
invención, la incorporación puede conseguirse utilizando técnicas
convencionales que no requieran una explicación detallada para un
experto ordinario en la materia. Sin embargo, para una revisión los
expertos en la materia pueden consultar Ausubel, Current Protocols
in Molecular Biology, supra.
Brevemente, la construcción de vectores de
expresión recombinante (incluyendo aquellos que no codifican
ninguna proteína y que se utilizan como portadores para los
ISS-ODN) utiliza técnicas estándar de ligación.
Para que el análisis confirme las secuencias correctas en los
vectores construidos, las mezclas de ligación pueden utilizarse
para transformar una célula huésped y seleccionarse los
transformantes exitosos mediante resistencia a antibióticos en su
caso. Se preparan vectores a partir de los transformantes, se
analizan mediante restricción y/o se secuencian mediante, por
ejemplo, el procedimiento de Messing et al. (Nucleic Acids
Res. 9:309, 1981), el procedimiento de Maxam et al. (Methods
in Enzymology 65:499, 1980) u otros procedimientos adecuados que
resultarán conocidos por los expertos en la materia. Se lleva a cabo
la separación por tamaño de los fragmentos cortados utilizando
electroforesis en gel convencional tal como se describe, por
ejemplo, en Maniatis et al. (Molecular Cloning, páginas
133-134,
1982).
1982).
Las células huésped pueden transformarse con
vectores de expresión y cultivarse en medio nutritivo convencional
modificado según resulte apropiado para inducir los promotores,
seleccionar los transformantes o amplificar los genes. Las
condiciones de cultivo, tales como temperatura, pH y similares, son
aquéllas utilizadas anteriormente con la célula huésped
seleccionada para la expresión, y resultarán evidentes para el
experto ordinario en la materia.
Si se utiliza un vector de expresión
recombinante como portador para los ISS-ODN de la
invención, resultan particularmente preferentes los plásmidos y los
cósmidos debido a su ausencia de patogenicidad. Sin embargo, los
plásmidos y cósmidos se degradan in vivo más rápidamente que
los virus y, por lo tanto, podrían no transportar una dosis
adecuada de los ISS-ODN para inhibir sustancialmente
la actividad inmunoestimulante de ISS-ODN ejercida
por un vector de terapia génica administrado sistémicamente. De las
alternativas de vector vírico, los virus
adeno-asociados poseen la ventaja de presentar una
patogenicidad reducida. La relativamente reducida capacidad de los
virus adeno-asociados de insertar genes foráneos no
plantearía ningún problema en este contexto debido al tamaño
relativamente reducido en el que puede sintetizarse los
ISS-ODN de la invención.
Entre otros vectores víricos que pueden
utilizarse en la invención se incluyen adenovirus, virus
adeno-asociados, virus herpes, vaccinia o un virus
ARN, tal como un retrovirus. Los vectores retrovíricos
preferentemente son derivados de un retrovirus VIH murino, aviar o
humano. Entre los ejemplos de vectores retrovíricos en los que
puede insertarse un solo gen foráneo se incluyen, aunque sin
limitarse a ellos: virus de la leucemia murina de Moloney (MoMuLV),
virus del sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), virus del tumor mamario
murino (MuMTV) y virus del sarcoma de Rous (RSV). Varios vectores
retrovíricos adicionales pueden incorporar múltiples genes. Todos
estos vectores pueden transferir o incorporar un gen para un
marcador seleccionable, de manera que pueden identificarse y
generarse células transducidas.
Debido a que los retrovirus recombinantes son
defectivos, requieren asistencia para producir partículas de vector
infectivas. Esta asistencia puede proporcionarse por ejemplo,
utilizando líneas celulares ayudante que contienen plásmidos que
codifican la totalidad de los genes estructurales del retrovirus
bajo el control de secuencias reguladoras dentro del LTR. En estos
plásmidos falta una secuencia de nucleótidos que permite que
mecanismo de empaquetamiento reconozca un transcrito de ARN para la
encapsidación. Entre las líneas celulares ayudante que presentan
deleciones de la señal de empaquetamiento se incluyen, aunque sin
limitarse a ellas, \Psi2, PA317 y PA12, por ejemplo. Estas líneas
celulares producen viriones vacíos, debido a que no se empaqueta
genoma. Si se introduce un vector retrovírico en las células
ayudante en las que la señal de empaquetamiento se encuentra
intacta, pero en la que los genes estructurales han sido sustituidos
por otros genes de interés, el vector puede empaquetarse y
producirse el vector virión.
Mediante la inserción en una o más secuencias de
interés en el vector vírico, junto con otro gen que codifica el
ligando para un receptor en una célula diana específica, pro
ejemplo, el vector puede convertirse en específico para la diana.
Pueden construirse vectores retrovíricos que sean específicos de
diana mediante la inserción de, por ejemplo, un polinucleótido
codificante de un azúcar, de un glucolípido o de una proteína. La
administración dirigida preferente se consigue utilizando un
anticuerpo para dirigir el vector retrovírico. Los expertos en la
materia conocerán, o podrán determinar con facilidad sin necesidad
de experimentación indebida, las secuencias polinucleótidas
específicas que pueden insertarse en el genoma retrovírico que
permitan la administración específica de diana del vector
retrovírico que contiene ISS-ODN.
Si deben administrarse sin utilizar un vector u
otro sistema de administración, los ISS-ODN se
preparan en una composición farmacéuticamente aceptable. Entre los
portadores farmacéuticamente aceptables preferentes para la
utilización con los ISS-ODN de la invención se
incluyen las soluciones acuosas o no acuosas estériles, las
suspensiones y las emulsiones. Son ejemplos de solventes no acuosos
el propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales, tales como
el aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como el
oleato de etilo. Entre los portadores acuosos se incluyen agua,
soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones,
incluyendo solución salina y medios tamponados. Entre los vehículos
parenterales se incluyen solución de cloruro sódico, dextrosa de
Ringer, dextrosa y cloruro sódico, solución de
Ringer-lactato o aceites fijos. Entre los vehículos
intravenosos se incluyen reabastecedores de líquidos y de
nutrientes, reabastecedores de electrolitos (tales como aquellos
basados en dextrosa de Ringer) y similares. También pueden
encontrarse presentes conservantes y otros aditivos tales como, por
ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases
inertes y similares. También puede liofilizarse una composición de
ISS-ODN utilizando medios bien conocidos de la
técnica, para la reconstitución y la utilización posteriores según
la invención.
Los promotores de absorción, detergentes e
irritantes químicos (por ejemplo agentes queratinolíticos) pueden
incrementar la transmisión de una composición de
ISS-ODN en un tejido diana. A título de referencia
de los principios generales respecto a los promotores de absorción y
detergentes que se han utilizado con éxito en la administración
mucosal de fármacos orgánicos y basados en péptidos (ver Chien,
Novel Drug Delivery Systems, capítulo 4, Marcel Dekker, 1992).
Los ejemplos de promotores de absorción nasal
adecuados se proporcionan en Chien, supra en el capítulo 5,
Tablas 2 y 3; resultan preferentes agentes más suaves. Los agentes
adecuados para la utilización en el procedimiento de la presente
invención para la administración mucosal/nasal también se describen
en Chang et al., Nasal Drug Delivery, "Treatise on
Controlled Drug Delivery", capítulo 9 y Tabla
3-4B de la misma (Marcel Dekker, 1992). Se
describen los agentes adecuados que es conocido que incrementan la
absorción de fármacos a través de la piel, en Sloan, Use of
Solubility Parameters from Regular Solution Theory to Describe
Partitioning-Driven Processes, capítulo 5,
"Prodrugs: Topical and Ocular Drug Delivery" (Marcel Dekker,
1992) y en otros sitios del texto.
Todas estas referencias ilustran el nivel de los
conocimientos generales y básicos de las técnicas de administración
de fármacos.
Para la utilización en los procedimientos
indicados anteriormente, la invención también proporciona kits.
Entre estos kits pueden incluirse cualquiera o la totalidad de los
siguientes: ISS-ODN (conjugados o no conjugados);
un portador farmacéuticamente aceptable (puede encontrarse
premezclado con los ISS-ODN) o base suspensión para
reconstituir los ISS-ODN liofilizados; medicamentos
adicionales; un vial estéril para cada ISS-ODN y
medicamento adicional, o un solo vial para mezclas de los mismos;
uno o más dispositivos para la utilización en la administración de
ISS-ODN en un huésped; reactivos de ensayo para
detectar indicios de que los efectos antiinflamatorios y/o
inmunoestimulantes buscados se han conseguido en los animales
tratados y un dispositivo de ensayo adecuado.
Los ejemplos que ilustran la práctica de la
invención se proporcionan posteriormente. Los ejemplos se presentan
con fines de referencia únicamente y no deben interpretarse que
limitan la invención, que se define mediante las reivindicaciones
adjuntas. Todas las abreviaturas y términos utilizados en los
ejemplos presentan su significado esperado y ordinario a menos que
se indique lo contrario.
\vskip1.000000\baselineskip
Los ratones sensibilizados con antígeno y
retados de diferentes cepas modelan la hiperreactividad de las vías
respiratorias observada en el asma alérgico. Entre las cepas murinas
adecuadas para la utilización en el modelado de la enfermedad se
incluyen ratones Balb/c (que se encuentran sesgados genéticamente
hacia el fenotipo Th2 y producen concentraciones incrementadas de
IL-4 e IL-5 en respuesta al reto con
antígeno frente a linfocitos CD4+), ratones C57BL/6 (que son
deficientes en IL-5, para el estudio detallado del
daño tisular inducido por IL-5 en el asma) y
ratones W/W^{v} (que son deficientes en mastocitos, para el
estudio detallado de la activación de los mastocitos en el
asma).
Los ratones modelizadores de enfermedad se
preparan convenientemente mediante inyección intraperitoneal o
subcutánea de un antígeno sensibilizante modelo, ovoalbúmina
("OVA") en portador (por ejemplo solución salina estéril o un
portador con adyuvante, tal como Alum), seguido de reto con antígeno
con el antígeno aerosolizado. Por ejemplo, pueden inmunizarse
ratones con 25 \mug de OVA mediante inyección subcutánea (con o
sin adyuvante) semanalmente durante 4 a 6 semanas, después retarse
con 2 ó 3 aerosolizaciones semanales de OVA a una concentración de
50 mg/ml en solución salina tamponada con fosfato (PBS) administrada
en intervalos de 20 minutos o a una concentración de 10 mg /ml de
solución salina al 0,9% durante aproximadamente una semana (en tres
intervalos de 30 minutos diariamente). Los dispositivos
nebulizadores para la utilización en la aerosolización se encuentran
disponibles de Aerotech II, CIS-US, Bedford, MA,
con una mascarilla nasal adaptada para las vías nasales murinas
(por ejemplo una mascarilla de sólo nariz de Intox Products,
Albuquerque, NM). Cuando se regulan con aire comprimido a un caudal
de 10 litros/min, los dispositivos descritos producen partículas de
aerosol con una mediana de diámetro aerodinámico de 1,4 \mum.
Los ratones de control preferentemente son de
una misma camada que se retan con proteína-antígeno
sin inmunización previa. Para más detalles referentes a este modelo
animal, los expertos en la materia pueden referirse a Foster et
al., J. Exp. Med., 195-201, 1995, y Corry et
al., J. Exp. Med., 109-117, 1996.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon ratones BALB/c de 6 a 10 semanas
de edad como modelos de asma alérgica tal como se describe en el
Ejemplo 1 (inyección subcutánea de OVA seguido de reto con antígeno
a una concentración de 50 mg de OVA/ml de PBS). Previamente a cada
inhalación con OVA según este esquema, se trataron grupos de 8
ratones tal como se describe en la Tabla, posteriormente. Se
retaron con antígeno ratones de control dejándolos sin tratamiento,
y ratones previamente no expuestos no se retaron con antígeno. Todas
las dosis de ISS fueron de 100 \mug por administración. Las dosis
de dexametasona (un antiinflamatorio esteroideo convencional
utilizado en el tratamiento del asma) fueron de 5 mg/kg/ratón. Las
dosis de cebado de antígeno fueron de 25 \mug de OVA adsorbido en
Alum en 0,2 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Las
dosis de reto de antígeno fueron de 10 ml de 50 mg de OVA/ml de
PBS. IN=intranasal; IP=intraperitoneal; SC=subcutáneo y N/A=no
aplicable.
\vskip1.000000\baselineskip
DY1018 presenta la secuencia de nucleótidos
siguiente:
- 5'-TGACTGTGAACGTTCGAGATGA-3' (SEC ID nº 19) con un esqueleto fosfotioato,
y DY1019 presenta la secuencia de nucleótidos
siguiente:
- 5'-TGACTGTGAAGGTTGGAGATGA-3' (SEC ID nº 20) con un esqueleto fosfotioato.
\vskip1.000000\baselineskip
El día 32, se sangró cada ratón mediante corte
en la cola (volumen de aproximadamente 50 \mul) en una solución
0,1 mM de PBS y EDTA. Se lisaron glóbulos rojos en solución con
NH_{4}Cl 150 mM y KHCO_{3} 10 mM en dH_{2}O, y después se
tiñó (tinción de Wright-Giesma). Se obtuvo un lavado
pulmonar de cada ratón tras el sacrificio mediante canalización de
la traquea y lavado con 800 microlitros de PBS, tiñéndose después
el producto de lavado. Se obtuvieron muestras de médula ósea de cada
ratón mediante lavado de médula extraída de fémur con PBS. Se
obtuvieron especímenes histológicos de tejido de pulmón y de traquea
del lóbulo inferior derecho de los pulmones y de la traquea. Los
especímenes se congelaron, se cortaron en secciones de una anchura
de 5 micrómetros y se tiñeron con DAB peroxidasa.
Los resultados se expresan en la Tabla posterior
como porcentaje de eosinófilos respecto a los leucocitos totales
(infiltrado inflamatorio) en cada muestra, excepto por los
resultados "pulmonares", que representan el número de
eosinófilos por campo de microscopía (se evaluaron 5 campos
seleccionados aleatoriamente para cada muestra). En resumen, los
ratones de control presentaban una media de 67% de eosinófilos en
las muestras de tejido pulmonar/traqueal, mientras que los ratones
que habían recibido los ISS-ODN mutantes
(M-ISS-ODN; DY1019) presentaron una
acumulación media del 52% y del 88% (±12%) de eosinófilos en tejido
pulmonar tras la administración IP e IN, respectivamente. Los
valores más elevados para los ratones tratados con
M-ISS-ODN tras el reto con antígeno
muy probablemente se deben a las propiedades inmunoinhibidoras de
DY1019 (ver la solicitud copendiente de patente US de propiedad
conjunta titulada "Inhibitors of DNA Immunostimulatory Sequence
Activity", inventor: Eyal Raz; presentada el 6 de junio de 1997
(nº de serie 60/048.793)). Por lo tanto, los grupos 7 y 8 de
ratones modelizan un huésped incompetente parcialmente inmune con
asma alérgica.
Inesperadamente en contraste, los ratones
pretratados con los ISS-ODN DY1018 administrados
intranasalmente presentaron una acumulación de eosinófilos inferior
a aproximadamente el 10% en los pulmones y tráquea al tratarlos
después del reto con antígeno, y una acumulación de eosinófilos de
tan solo aproximadamente 19% al tratarlos previamente al reto con
antígeno. Estos valores representan una reducción de hasta el 80% en
la acumulación de eosinófilos comparado con los ratones de control
y una reducción superior al 90% en comparación con los ratones
tratados con M-ISS-ODN (IN).
Los ratones tratados IP con
ISS-ODN presentaron un comportamiento incluso mejor,
con una acumulación de eosinófilos del 6% en los pulmones y la
tráquea con el tratamiento antes y después del reto con antígeno.
Este valor representa una reducción del 86% en la acumulación de
eosinófilos en comparación con los ratones de control, y una
reducción del 91% en comparación con los ratones tratados con
M-ISS-ODN (IP).
Estos datos indican que la acumulación de
eosinófilos estimulada por IL-5 en tejido pulmonar
que caracteriza la fase tardía del asma alérgica resulta inhibida
por los procedimientos terapéuticos con ISS-ODN de
la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Para evaluar si la supresión de eosinófilos
demostrada por los datos en el Ejemplo II era dependiente de la
estimulación inmunológica por los ISS-ODN, se
sensibilizaron ratones frente a OVA utilizando un adyuvante
estimulante convencional de Th (Alum), se trataron con
ISS-ODN o con un control, y se midió la supresión de
eosinófilos antes de cuando se prevía la estimulación por
ISS-ODN del sistema inmunológico del ratón.
Más específicamente, se inmunizaron grupos de
cuatro ratones con 25 \mug de OVA en 1 mg de Alum mediante
inyección subcutánea los días 1, 7, 14 y 21. Este protocolo de
inmunización es conocido que estimula una respuesta de tipo Th2
frente al antígeno en los ratones. El día 27, un grupo de animales
recibió 100 \mug de los ISS-ODN DY1018 descritos
en el Ejemplo I mediante administración intraperitoneal. Un grupo de
control recibió los M-ISS-ODN
DY1019 mutantes descritos en el Ejemplo I por la misma vía.
El día 28, los animales en cada grupo recibieron
10 mg de OVA/ml de solución salina tamponada con fosfato mediante
inhalación durante 30 minutos. El día 30, algunos de los animales en
cada grupo recibió una segunda inyección de ISS-ODN
o de M-ISS-ODN y los animales que no
habían sido tratados el día 27 se trataron con
ISS-ODN o con
M-ISS-ODN. El reto por inhalación
con OVA se repitió el día 31 y los animales se sacrificaron para el
recuento de eosinófilos dentro de las 24 horas.
Los resultados de este experimento se
proporcionan en la Tabla posterior. Los animales que habían recibido
dos tratamientos con ISS-ODN los días 27 y 30
presentaban únicamente 5,8% de eosinófilos en el lavado de líquido
broncoalveolar (BALF) el día 32, aunque la estimulación inmunológica
por los ISS-ODN sería mínima tan poco después del
tratamiento. Incluso tras tan sólo un tratamiento con
ISS-ODN (el día 30), la acumulación de eosinófilos
en el BALF de los animales tratados se limitaba a 10,3%. En
contraste, los animales de control tratados dos veces con
M-ISS-ODN presentaban 42,3% de
eosinófilos en BALF extraído.
Estos datos establecen que la práctica de la
invención puede inhibir la inflamación alérgica en animales y que
la inhibición puede producirse tan rápidamente como un día después
del tratamiento.
\vskip1.000000\baselineskip
En ratones, los anticuerpos IgG 2a son
marcadores serológicos de una respuesta inmunológica de tipo Th1,
mientras que los anticuerpos IgG1 son indicativos de una respuesta
inmunológica de tipo Th2. Entre las respuestas Th2 se incluyen la
clase de anticuerpos IgE asociada a alergia; los antígenos proteicos
solubles tienden a estimular respuestas Th2 relativamente fuertes.
En contraste, las respuestas Th1 resultan inducidas por la unión de
antígenos a macrófagos y a células dendríticas.
Para determinar qué respuestas, si alguna,
producirían los ratones que recibían ISS-ODN según
la invención, se inmunizaron nueve grupos de ratones Balb/c con 10
\mug de proteína \beta-galactosidasa (conjugada
con avidina; Sigma, St. Louis, MO) para producir un modelo de
fenotipo alérgico y se trataron de la manera siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
A intervalos de 2 semanas, se midió cualquier
IgG 2a e IgG 1 contra \beta-galactosidasa presente
en el suero de cada ratón mediante ensayo de inmunosorción ligada a
enzima (utilizando anticuerpos específicos para las subclases IgG1
e IgG 2a) en placas de microtitulación recubiertas con el
enzima.
Tal como se muestra en la figura 2, sólo los
ratones que recibieron los ISS-ODN produjeron
títulos elevados de anticuerpos IgG 2a, que se incrementaron en
número a lo largo de un periodo de 12 semanas. Tal como se muestra
en la figura 3, la inmunización de los ratones con el antígeno mismo
o con los ISS-ODN mutantes indujo la producción de
títulos relativamente elevados de anticuerpos IgG 1. Los datos
mostrados en las figuras son medias de los valores obtenidos en
cada grupo de ratones.
Estos datos indican que se induce una respuesta
Th1 selectiva al administrar ISS-ODN según la
invención a un huésped retado con antígeno. Además, los datos
indican que la administración de ISS-ODN según la
invención desplaza el sistema inmunológico hacia el fenotipo Th1 al
retarlo con antígeno, incluso cuando los ISS-ODN se
administran previamente al reto con antígeno (en este caso, 72 horas
antes del reto).
Para demostrar la supresión de IgE alcanzada
mediante la estimulación de una respuesta inmunológica celulares de
tipo Th1 en preferencia a una respuesta inmunológica celular de tipo
Th2, se inmunizaron ratones Balb/c de cinco a ocho semanas de edad
con uno de los vectores de expresión recombinante siguientes:
pCMV-Lac-Z que contenía
ISS-ODN (que contiene dos copias de secuencias de
nucleótidos similares a los ISS-ODN DY1018) o un
plásmido de control, pCMV-BL. Un tercer grupo de
ratones recibió inyecciones de antígeno
(\beta-galactosidasa). El plásmido de ADN se
purificó y su contenido de endotoxina se redujo hasta
0,5-5 ng/1 mg de ADN mediante extracción con TRITON
X-114 (Sigma, St. Louis, MI). Previamente a la
inoculación, se precipitó pADN en etanol, se lavó con etanol al 70%
y se disolvió en solución salina normal libre de pirógenos.
La inmunización se realizó mediante inyección
intradérmica de plásmido de ADN cargado en púas separadas de un
dispositivo de múltiples púas MONO-VACC® (Connaught
Lab., Inc., Swiftwater, PA). Brevemente, los dispositivos de púas
se prepararon tras lavado extensivo en DDW y remojo durante la noche
en SDS al 0,5% (solución salina dodecil sulfato), se lavó
nuevamente en DDW, se remojó durante la noche en NaOH 0,1 N, se lavó
nuevamente en DDW y se secó a 37ºC durante 8 horas. Seis \mul de
plásmido de ADN disueltos en solución salina normal se pipetearon
sobre las púas del dispositivo de púas inmediatamente antes de cada
inoculación descrita posteriormente. La cantidad total de pADN
cargado en el dispositivo por inoculación fue de 25 \mug de cada
uno de pCMV-Lac-Z y
pCMV-BL. Para los fines de estimar las dosis reales,
se supuso que menos del 10% de la solución de pADN cargada en el
dispositivo de púas se introdujo realmente con la inyección de las
púas en el tejido intradérmico.
Cada ratón se trató 3 veces con 2 inoculaciones
de cada plásmido en un intervalo de una semana inyectada
intradérmicamente en la base de la cola. Otro grupo de ratones
recibió una sola inyección intradérmica en la base de la cola de 10
\mug de proteína \beta-galactosidasa (disuelta
en 50 \mul de solución salina normal) en lugar de pADN.
Para inducir una respuesta de anticuerpos IgE
frente a un reto posterior con antígeno sensibilizante, cada grupo
de ratones recibió una inyección intraperitoneal de 0,1 ml de
solución salina tamponada con fosfato (PBS) que contenía 1 \mug
de antígeno (\beta-galactosidasa; Calbiochem, San
Diego, CA) y 3 mg de ALUM hidróxido de aluminio como adyuvante
(Pierce Chemical, Rockford, IL) 14 semanas después de la
inmunización inicial. Se sometió a ensayo el IgE total en suero de
los ratones 4 veces a lo largo de las 4 semanas consecutivas
posteriores.
Se detectó IgE utilizando un radioinmunoensayo
en fase sólida (RAST) en placa de polivinilo de 96 pocillos (una
modificación radioisotópica del procedimiento ELISA descrito en
Coligan, "Current Protocols In Immunology", unidad 7.12.4,
vol. 1, Wiley & Sons, 1994) excepto que se utilizaron
anticuerpos policlonales de cabra purificados específicos para las
cadenas \varepsilon de ratón en lugar de anticuerpos específicos
para Fab humana. Para detectar el IgE
anti-Lac-Z, las placas se
recubrieron con \beta-galactosidasa (10
\mug/ml). La concentración de IgE más reducida medible mediante
el ensayo utilizado fue de 0,4 ng de IgE/ml.
Al medir específicamente la respuesta
anti-antígeno de cada grupo de ratones, tal como se
muestra en la figura 4, los niveles de IgE
anti-Lac-Z en los ratones inyectados
con plásmido que contenía los ISS-ODN fueron
consistentemente inferiores tanto antes como después del refuerzo
(con una media de aproximadamente 250 CPM en el RAST), mientras que
los ratones inyectados con proteínas desarrollaron niveles elevados
de anti-Lac-Z, particularmente tras
la primera inyección de antígeno de refuerzo, al incrementar los
niveles anti-Lac-Z hasta una media
de aproximadamente 3.000 CPM. En consistencia con la adquisición de
tolerancia, los niveles de IgE
anti-Lac-Z en los ratones inyectados
con proteínas se redujeron a lo largo del tiempo, pero continuaron
incrementándose en los ratones de control que no habían recibido
ninguna inmunización contra
\beta-galactosidasa.
Estos datos muestran que los ratones inyectados
con plásmido que contenía ISS-ODN desarrollaron una
respuesta Th1 específica de antígeno contra el producto de expresión
del plásmido, con expresión concomitante de IgE, mientras que los
ratones inyectados con proteína adquirieron tolerancia sólo tras el
desarrollo de niveles sustancialmente superiores de anticuerpos IgE
específicos de antígeno.
Se inyectaron ratones BALB/c intravenosamente
con 100 \mug de DY1018, de DY1019 o de un control de secuencia
aleatoria (DY1043), sacrificándolos tras 24 horas. Se recolectaron
los esplenocitos de cada ratón.
Se recubrieron placas de microtitulación de 96
pocillos con anticuerpo anti-CD3 (Pharmingen, La
Jolla, CA) a una concentración de 1 \mug/ml de solución salina.
El anticuerpo anti-CD3 estimula las células T
mediante el envío de una señal química que mimetiza los efectos de
la unión al complejo de receptor de las células T (TCR). Las placas
se lavaron y se añadieron los esplenocitos a cada pocillo
(4x10^{5}/pocillo) en un medio de RPMI 1640 con suero de feto
bovino al 10%. Se obtuvieron los sobrenadantes en los días 1, 2 y
3.
Se sometieron a ensayo los niveles de citoquina
de Th2 (IL-4, IL-5 e
IL-10) en los sobrenadantes utilizando un kit
comercial; los niveles de citoquina de Th1 (INF\gamma) con un
ensayo de anticuerpo murino anti-INF\gamma (ver,
por ejemplo, Coligan, "Current Protocols in Immunology", unidad
6.9.5, vol. 1, Wiley & Sons, 94). Serían de esperar niveles
relativamente elevados de IL-4 y de
IL-10 con niveles reducidos de INF\gamma en
ratones con un fenotipo Th2, mientras que serían de esperar niveles
relativamente reducidos de IL-4 e
IL-10 con niveles elevados de INF\gamma en
ratones con un fenotipo Th1. Los niveles relativamente elevados de
IL-5 caracterizan un ambiente proinflamatorio,
mientras que lo contrario es cierto de los niveles relativamente
reducidos de IL-5.
Tal como se muestra en las figuras 5 y 6, los
niveles de secreción de IL-4 e IL-10
estimulada por anti-CD3 en ratones tratados con
DY1018 fueron sustancialmente inferiores que en los ratones de
control. Los niveles en los ratones DY1019 fueron intermedios. Se
redujeron los niveles de IL-5 proinflamatorio en
ratones tratados con DY1018 en un grado comparable (figura 7).
Los niveles de proliferación de células T en
respuesta al reto con antígeno se redujeron mucho en ratones
tratados con DY1018 (ISS-ODN) en comparación con los
ratones tratados con DY1019 (ISS-ODN mutante) y en
ratones de control. Esta supresión de la proliferación de las
células T es reversible al administrar IL-2,
demostrando que la supresión se debe a la anergía de Th2 en los
ratones tratados con ISS-ODN (ver la Tabla, a
continuación).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se incrementaron mucho los niveles de secreción
de IFN-\gamma estimulada en Th1 en los ratones
tratados con DY1018, aunque se redujeron sustancialmente en los
ratones tratados con DY1019 (en comparación con el control),
indicando estimulación de un ambiente de tipo Th2 en estos últimos
ratones (figura 8). Se muestran datos adicionales que demuestran
estos resultados en la Tabla posterior. "b/f" en la Tabla se
refiere a antes; "1º", "2º" y "cada" se refieren a
la administración del compuesto antes del 1º o 2º reto con
antígeno.
Resulta importante que el tratamiento de los
ratones antes del reto con antígeno resulta incluso más efectivo en
el cambio de la respuesta inmunológica al retar con antígeno a un
fenotipo Th1 que el tratamiento posterior al reto. Tal como se
muestra en las figuras 9 y 10, los animales cebados con antígeno
(pero no retados) que se inyectaron con ISS-ODN
DY1019 72 horas antes del reto con antígeno (con
\beta-galactosidasa) desarrollaron una respuesta
inmunológica de tipo Th1 más robusta contra el antígeno que sus
compañeros de camada tratados después del reto o que los compañeros
de camada tratados previamente al reto con un oligonucleótido
mutante inactivo (DY1019), según medición de la secreción
incrementada de IFN\gamma (figura 9) y de la proliferación de
linfocitos CD4+ (figura 10).
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Además, los ISS-ODN
administrados según la invención suprimen la liberación de
citoquinas Th2 de células de ratón Th2 sensibilizadas (los
esplenocitos se recolectaron de ratones cebados con OVA, después se
incubaron durante 72 horas con 100 \mug/ml de OVA in
vitro). El tratamiento con ISS-ODN tuvo lugar
1(-1) o 3 (-3) días antes del sacrificio. Se muestran estos datos a
continuación:
SECUENCIAS ID nº 1 a 18: son representativas de
secuencias hexaméricas de nucleótidos de
ISS-ODN.
SECUENCIA ID nº 19: es la secuencia de
nucleótidos completa de ISS-ODN DY1018.
SECUENCIA ID nº 20: es la secuencia de
nucleótidos completa de un mutante inactivo de
ISS-ODN, DY1019.
(1) INFORMACIÓN GENERAL
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: The Regents of the University of California
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTOS LIBRES DE INMUNIZACIÓN PARA EL TRATAMIENTO DE INFLAMACIÓN ESTIMULADA POR ANTÍGENO EN UN HUÉSPED MAMÍFERO Y CAMBIO DE LA CAPACIDAD DE RESPUESTA INMUNOLÓGICA FRENTE AL ANTÍGENO DEL HUÉSPED A UN FENOTIPO TH1
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 20
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN POSTAL:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: Fish & Richardson, P.C.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 4225 Executive Square, Suite 1400
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: La Jolla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: CA
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: EUA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- ZIP: 92037
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM Compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: Windows 95
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: FastSEQ para Windows, versión 2.0
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/US98/-----
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (vii)
- DATOS ANTERIORES DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: 08/927.120
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 05 de septiembre, 1997
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- DATOS DEL CESIONARIO/AGENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Taylor, Stacy L.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE COLEGIADO: 34.842
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA/EXPEDIENTE: 07340/054WO1
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 619-678-5070
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: 619-678-5099
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos no codificantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACGTT
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos no codificantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCGTC
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos no codificantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACGTT
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos no codificantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCGTT
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos no codificantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACGTC
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos no codificantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCGTC
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos no codificantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACGTC
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos no codificantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCGTC
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos no codificantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACGCC
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos no codificantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCGCC
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos no codificantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACGC
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos no codificantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCGCC
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos no codificantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCGCT
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos no codificantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGACGCT
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos no codificantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCGCT
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos no codificantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTTCGAA
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos no codificantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGCGTT
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 6 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos no codificantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACGCC
\hfill6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos no codificantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGACTGTGAA CGTTCGAGAT GA
\hfill22
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN DE LA SEC ID nº 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 22 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: oligonucleótidos no codificantes
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGACTGTGAA GGTTGGAGAT GA
\hfill22
Claims (18)
1. Utilización de un oligonucleótido
inmunoestimulante (ISS-ODN) en la preparación de un
medicamento para el tratamiento del asma en un mamífero, sin
coadministración de un antígeno inmunizante, en la que el mamífero
se sensibiliza frente a un antígeno estimulante de asma, y en la que
el ISS-ODN comprende la secuencia
5'-citosina-guanina-3',
en la que ISS-ODN se administra en el tejido
respiratorio, por vía intranasal, por inhalación o por
insuflación.
2. Utilización según la reivindicación 1, en
la que dicho ISS-ODN se administra mediante un
dispositivo nebulizador que administra dicho
ISS-ODN en la mucosa nasal, tráquea o bronquiolos, o
por vía intransal en el tejido pulmonar.
3. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
en la que el ISS-ODN incluye una secuencia
hexamérica de nucleótidos que consiste de
5'-purina-purina-C-G-pirimidina-pirimidina-3'.
4. Utilización según la reivindicación 3, en
la que la secuencia hexamérica de nucleótidos consiste de
AACGTT.
5. Utilización según la reivindicación 3, en
la que la secuencia hexamérica de nucleótidos se selecciona de
entre el grupo que consiste de AACGCC, AACGTC, AGCGCC, AGCGCT,
AGCGTC, GACGCC, GACGCT, GACGTC, GACGTT, GGCGCC, GGCGCT, GGCGTC y
GGCGTT.
6. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
en la que el ISS-ODN presenta una longitud mínima de
seis nucleótidos.
7. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
en la que el ISS-ODN comprende la SEC ID nº 19.
8. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
en la que el ISS-ODN se encuentra presente en un
vector de expresión recombinante que contiene ISS.
9. Utilización según la reivindicación 1 ó 2,
en la que el ISS-ODN presenta una longitud
comprendida entre 6 y 200 nucleótidos.
10. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en la que el mamífero es un ser humano.
11. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en la que el ISS-ODN se
encuentra unido a un péptido, en la que dicho péptido no es el
antígeno frente al que se encuentra sensibilizado el mamífero, y en
la que el péptido se selecciona de entre una fracción de dianización
y una citoquina.
12. Utilización según la reivindicación 11, en
la que el péptido es una fracción de dianización.
13. Utilización según la reivindicación 11, en
la que el péptido es una citoquina.
14. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en la que el ISS-ODN se
encuentra unido a un anticuerpo.
15. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, que comprende además administrar un agente
inmunoterapéutico.
16. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, que comprende además administrar un agente
antiinflamatorio.
17. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 16, en la que se reduce la acumulación de
eosinófilos en tejido pulmonar.
18. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 17, en la que se reduce la inflamación
estimulada por el agente estimulante de asma.
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