ES2224112T3 - Procedimiento exento de induccion mejorado para la obtencion por tecnica genica de glutarilamidasa. - Google Patents

Abstract

LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO TECNICO DE GENES PARA LA ELABORACION DE GLUTARILAMIDASA (GA), CARACTERIZANDOSE DE TAL MODO, QUE SE EXPRIME EL GEN GA CONSTITUTIVO DE UN VECTOR DE EXPRESION Y DONDE EL PROMOTOR PARA LA EXPRESION CONSTITUTIVA DEL GEN GA ES UN PROMOTOR TRC O TRC-EQUIVALENTE CON O SIN UN REPRESOR NO FUNCIONAL.

Description

Procedimiento exento de inducción mejorado para la obtención por técnica génica de glutarilamidasa.

En la obtención enzimática de ácido 7-amino-cefalosporánico a partir de cefalosporina C, se requiere esencialmente el enzima glutarilamidasa (GA) para la disociación de la cadena lateral de glutarilo. La solicitud de patente europea EP-A-0 469 919 describe ahora un procedimiento técnico génico para la obtención de GA, en el que se induce la expresión de GA a través del promotor Tac. Los rendimientos en GA son sólo reducidos. En la EP-A-0 504 798 se describió ahora un procedimiento con el que, bajo empleo de bacterias de E. coli transformadas, y un procedimiento de transformación ajustado especialmente, se consiguen rendimientos elevados en GA (70000 a 10000 U/l de medio de cultivo). El empleo de este procedimiento hace rentable el procedimiento total por primera vez.

Ahora se descubrió que, mediante la expresión constitutiva del gen GA, en especial mediante el desactivado del represor Lac I^{q}, igualmente codificado con plásmido y/o mediante la reducción de la expresión del marcador de selección activo intracelularmente, en especial del marcador de selección codificado con plásmido cloranfenicol-acetiltransferasa (CAT), se puede conseguir una sorprendente mejora adicional del rendimiento a aproximadamente el doble a dos veces y media.

Por lo tanto, es objeto de la presente invención un procedimiento para la obtención de GA en bacterias, exprimiéndose el gen GA por un vector de expresión de manera constitutiva. Preferentemente, el promotor para la expresión constitutiva del gen GA es un promotor Trc o equivalente a Trc, que no posee represor, o posee un represor no funcional.

En especial es ventajoso que el vector de expresión para la expresión constitutiva del gen GA contenga adicionalmente un gen de selección, que codifica para una proteína que permanece en bacterias, no periplasmática, a modo de ejemplo la cloranfenicolacetiltransferasa (CAT), sobre todo si se exprime sólo débilmente esta proteína de selección.

El desactivado del gen represor Lac I^{q} resulta en una expresión fuerte, continua, y secreción del enzima, sin que se presenten desventajas de crecimiento para la cepa de E. coli o lisis celular debido a la sobreexpresión.

Por lo tanto, también es concebible emplear otros promotores constitutivos, es decir, no regulados a través de inducción, para la expresión de GA. En contrapartida a los clones de E. coli T 363, los correspondientes clones recombinantes ya no necesitan ser inducidos con IPTG, lo que conduce a una simplificación adicional del procedimiento.

En la EP-A-0 504 798 se expone la construcción del plásmido de expresión T 363, así como la transformación en E. coli K 12 W 3110. Además se describe el plásmido pCM 145, que se depositó ya en la colección alemana de microorganismos bajo el número de depósito DSM 6409, según el contrato de Budapest, y contiene, entre otros, el origen de replicación del conocido plásmido "low copy" pACYC 184 (A. C. Y. Chang u. S. N. Cohen, J. tomo. 134 (1978) 1141 a 1156), así como el gen completo para una GA a partir de Pseudomonas. La figura 2 muestra un mapa de restricción de plásmido pCM 145 con numeración de los puntos de corte de enzima de restricción importantes para clonaciones.

Para la introducción por clonación del gen GA en el vector pTrc 99 A (E. Amann et al., Gene 69 (1988) 301 a 315), se requiere un engarce sintético (SEQ ID Nº: 1 y SEQ ID Nº: 2).

1

A partir del plásmido pCM 145, tras digestión con los enzimas Styl y BamHI, se aísla un fragmento de 0,57 kb de tamaño de BaHI(4)-Styl(2) (en la secuencia de ADN publicada, se encuentra el punto de corte Styl en la zona de aminoácidos 11 a 13). Este fragmento, y el engarce citado anteriormente, se unen en el plásmido pTrc 99 A cortado con Ncol y BamHI, obteniéndose el plásmido T 297 bajo pérdida del punto de corte Ncol.

Además, a partir del plásmido pCM 145, se aísla un fragmento de 1,5 kb Sall, (Sall(6)-Sall(9)), así como un fragmento de 0,34 kb BamHI-Sall, y se unen en el vector pUC 18, que se abrió con Sall y BamHI. En este caso resulta el plásmido TG 306, que se analizó para verificar la orientación correcta del fragmento Sall(6-9). A partir del plásmido T 306 con los enzimas BamHI y HidIII se aísla un fragmento de 2,1 kb de tamaño (que comprende el fragmento a partir del punto BamHI (4)- hasta Sall(9). Se incorporó este fragmento en el vector T 297 abierto con los enzimas BamHI y Hindi, obteniéndose el plásmido T 307 (fig. 3). La población de E. coli transformada con ello produce hasta 260 U/l GA después de fermentación de 2 días a 28ºC. Bajo condiciones de fermentación modificadas, se puede aumentar este rendimiento a más de 780 U/l.

Una inducción del sistema con IPTG a 37ºC es letal para la cepa de E. coli transformada, lo que se puede atribuir, según parece, al empleo del "high-copy-number-vector" T 307, así como a la coexpresión, que se efectúa
simultáneamente, de la \beta-lactamasa, igualmente secretada. Por lo tanto, se lleva a cabo a temperaturas por debajo de aproximadamente 30ºC.

El plásmido T 307 presenta un gen de \beta-lactamasa, cuyo producto génico, el enzima \beta-lactamasa, sirve para la selección de clones recombinantes. En el caso de \beta-lactamasa, como en el caso de GA, se trata de un enzima secretado, localizado periplasmáticamente. Otra mejora del rendimiento se pudo conseguir mediante la substitución del gen estructural de \beta-lactamasa, en especial del intervalo de péptidos de señal, por el gen de cloranfenicolacetiltransferasa. La cloranfenicolacetiltransferasa se encuentra exclusivamente en el fitoplasma de las células, no se esclusa al espació periplasmático. Las construcciones condujeron al plásmido T 363 (fig. 4), que se describe igualmente en la solicitud de patente europea EP-A-0 504 798.

Una ventaja especial para la elaboración de GA resulta de la reducción de la expresión, a modo de ejemplo del producto génico CAT. Exprimida a través de su promotor natural en el vector T 363, la cloranfenicolacetiltransferasa es una proteína que se presenta masivamente en el material de exclusión. Mediante la reducción de la expresión se mejora la proporción de proteína de E. coli respecto a GA, claramente a favor de GA, mediante lo cual se puede aumentar la carga de columnas de separación, y purificar más GA por unidad de tiempo. En las figuras 5 a 7 se representan las correspondientes estructuras vectoriales T 396, T 406 y T 415, que conducen a una expresión de CAT reducida.

Por lo tanto, la invención se refiere a un procedimiento en el que se exprime, de modo preferente sólo débilmente, la proteína de selección empleada. Además se descubrió que el optimizado del procedimiento de fermentación explicado a continuación conduce sorprendentemente a una prolongación de la fase de crecimiento de bacterias, preferentemente E. coli, sin acumulación de acetato. Esto condujo adicionalmente a un aumento de los rendimientos de
biomasa.

Se pudo optimizar el procedimiento de fermentación aumentándose la velocidad de alimentación de la fuente de carbono durante el cultivo principal, preferentemente durante la fase de crecimiento logarítmica. A modo de ejemplo, se pueden emplear como fuentes de carbono azúcares, carbono o ácidos orgánicos, preferentemente glucosa o glicerina, en especial glicerina. Como fuentes de nitrógeno complejas, a modo de ejemplo se pueden emplear extracto de levadura, peptonas de pescado, peptonas de caseína, y otras fuentes de nitrógeno complejas, conocidas por el especialista. La concentración de las fuentes de nitrógeno complejas en el medio de cultivo principal es aproximadamente 10-50 g/l, en especial 20-40 g/l, de modo preferente aproximadamente 40 g/l.

Los siguientes ejemplos se describen ahora más detalladamente las estructuras de vectores de expresión necesarias para la consecución de rendimientos elevados, así como las medidas fermentativas. Se adquirieron los enzimas empleados para la clonación de New England Biolabs, o bien, Gibco/BRL, y se emplearon correspondientemente a las prescripciones del fabricante. Todos los datos con respecto al tamaño de los plásmidos (bp) son magnitudes recomendadas.

Descripción de las figuras

Figura 1: Unión al promotor del gen de CAT para la reducción de la velocidad de expresión del gen de CAT.

Hebra de ADN superior:	SEQ ID Nº: 3
Hebra de ADN inferior:	SEQ ID Nº: 4

1. Marco de lectura SEQ ID Nº: 5 y SEQ ID Nº: 6

2. Marco de lectura SEQ ID Nº: 7

3. Marco de lectura SEQ ID Nº: 8 y SEQ ID Nº: 9

Figuras 2-7: Vectores de expresión pCM 145, T 307, T 363, T 396, T 406 y T 415.

Ejemplo 1 Reducción de la expresión del gen de CAT (plásmido T 396)

Para reducir la expresión en CAT, se clonó un gen de CAT sin promotor tras el promotor \beta-lactamasa. A tal efecto se digirió completamente el plásmido aislado (ADN de T 307 (fig. 3) con los enzimas de restricción Sspl y DraI, y se separó los fragmentos producidos en un gel de agarosa al 0,6%. Mediante electroelución se aisló entonces el fragmento SstI de aproximadamente 3.200 bp de tamaño con el gen GA, y el fragmento SstI-DraI, de aproximadamente 2.600 bp de tamaño con el gen de Lac Iq y el origen de replicación del vector.

Se obtuvo el gen de CAT sin promotor como sigue a partir del plásmido pCM 4 (T. Close y R. Rodriguez, Gene 20 (1982), 305 a 316). Se cortó completamente el plásmido aislado ADN de pCM 4 con el enzima de restricción Bam HI y se cargaron los extremos sobresalientes con polímeros de ADN I en presencia de ATP, TTP, CTP y GTP, de modo que se produjeron fragmentos con extremos truncados. Se aisló el fragmento de aproximadamente 780 bp de tamaño con el gen de CAT, tras electroforesis en gel de agarosa de la carga de digestión en agarosa al 1,2% a través de electroelución.

Después se reunieron este fragmento, así como ambos fragmentos de 3.200 bp, o bien, 2.600 bp de tamaño, a partir de T 307, en una carga de unión con ayuda de ADN-ligasa. Se transformó la mezcla de unión en E. coli W 3110 M, y se aislaron aquellos clones recombinantes que crecían de manera óptima sólo en presencia de concentraciones reducidas de cloranfenicol (2,5 \mug/ml), y mostraban formación de glutarilamidasa. Los clones aislados y resistentes a cloranfenicol presentaban plásmidos con los tres fragmentos, presentándose el fragmento de 2.600 bp en 2 orientaciones. Resultó un mejor rendimiento en producto con ayuda del plásmido T 396. Mediante la adaptación no óptima del gen de CAT al promotor de \beta-lactamasa, se produce el nivel de resistencia más reducido en comparación con T 363 (25 \mug/ml). La unión del gen de CAT al resto remanente de la secuencia de promotor de \beta-lactamasa se representa en la figura 1.

El análisis de las proteínas formadas por la cepa de E. coli W 3110 (T 396) en gel de SDS poliacrilamida al 10 hasta el 17,5% después de crecimiento de dos días de las células bajo condiciones de inducción, en comparación con las bandas de proteínas de la cepa W 3110 (T 363; fig. 4) cultivada bajo las mismas condiciones, demuestra una reducción de la proteína CAT en más de un 80%. Por consiguiente, en el caso de rendimientos en enzima GA aproximadamente similares en ambas cepas, se mejora significativamente la proporción cuantitativa de GA presente en disolución respecto a proteína total disuelta, tras disgregación de las células, lo que conduce a una elaboración claramente simplificada de glutarilamidasa, debido a las cantidades más reducidas en proteína ajena con relación a GA.

Ejemplo 2 Desactivado del gen represor Lac I^{q} (plásmido T 415)

Los ensayos de cultivos vibratorios y fermentaciones habían dado por resultado que, en todos los plásmidos empleados para la formación de GA, y cepas de E. coli, no se había detenido sensiblemente, como era de esperar, la síntesis de GA antes de la inducción con IPTG. Las velocidades de inducción descritas para el sistema de inducción Lac dependiente de IPTG no correspondían tampoco a los valores de la literatura. Para hacer completamente independiente la expresión de GA el empleo de un inductor, como IPTG, se destruyó el marco de lectura codificante para el represor Lac I^{q}. Resulta un represor inactivo, mediante lo cual se aumenta el bloqueo de la lectura del gen en dependencia del inductor.

Se cortó el plásmido aislado ADN de T 396 (fig. 5) con los enzimas de restricción EcoRI y Hindi, y se aisló el fragmento de aproximadamente 750 bp con la parte de unión del gen de CAT con el promotor de \beta-lactamasa, que condujo a expresión génica de CAT reducida. Después se reunió este elemento de inserción con el fragmento de EcoRI-HindIII de aproximadamente 6.000 bp de tamaño, igualmente aislado, a partir del plásmido T 363. Resultó el vector de expresión T 406 (fig. 6). Sorprendentemente, en la fermentación se ha mostrado ahora que el vector T 406 es más estable que T 396.

Para el desactivado del gen Lac I^{q} se digirió completamente plásmido aislado ADN de T 406 con el enzima de restricción BstEII. El punto de corte singular en el vector se sitúa en el gen estructural para el represor. Los extremos sobresalientes se cargaron en presencia de d ATP, d TTP, d GTP y d CTP de modo concomitante por medio de ADN-polimerasa, y se unieron de nuevo al vector en presencia de ADN-ligasa. Mediante este paso se efectúa un cambio de marco de lectura en dos pares de bases, de modo que no se puede formar un represor Lac I^{q} funcional. Resulta el plásmido T 415 (fig. 7). Los clones recombinantes de E. coli W 3110 (T 415) muestran un aumento de la formación de GA de aproximadamente 510 U/l, en el cultivo vibratorio, después de 2 días (T 363 con inductor) a 1590 U/l a T 415, sin añadir inductor. Mediante adición de inductor al sistema T 415 no se mejora el rendimiento en un experimento de control.

Las ventajas de elaboración mostradas para cepas de E. coli con el vector T 396, son válidas en la misma medida para E coli con el plásmido T 415.

Ya que el desactivado del gen represor Lac I^{q} se ha mostrado ventajoso, también es concebible utilizar vectores replicantes en E. coli para las construcciones para la expresión constitutiva de GA, en los que el gen Lac I^{q} falta de antemano. Del mismo modo, parece posible emplear cepas de E. coli para la producción GA a las que, en el caso de empleo del sistema promotor-operador Lac, falta, o se efectúa en medida reducida, la expresión del represor del tipo salvaje Lac, o bien de los mutantes del mismo.

Ejemplo 3 Fermentación de E. coli T 415

En contrapartida a los clones de E. coli T 347 y T 362/33 según la EP- A-0 504 798, en el caso de la estructura T 415 ya no se debe inducir la glutaril-amidasa (GA) mediante IPTG. Se describe la fermentación optimizada como sigue:

Condiciones de cultivo

Se llevaron a cabo todos los cultivos, con excepción de los parámetros a variar, bajo las siguientes condiciones:

Se efectuó el mantenimiento de cepa preferentemente a -18ºC en medio de YT-glicerina:

Glicerina	17,0%
Extracto de levadura	0,7%
Bactotriptona	0,4%
NaCl	0,4%
Cloranfenicol	12,5 \mug/ml.

A partir de esta suspensión se elaboraron placas de agar del mismo medio, se incubaron 24 horas a 28ºC, y se inoculó el cultivo previo (VK) con una colonia aislada.

Medio VK:	Bactotriptona	2,0%
(NL 5295)	Extracto de Bacto-levadura	1,0%
	NaCl	0,5%
	Cloranfenicol	12,5 \mug/ml
	pH = 7,2

Se incubaron 100 ml de esta disolución nutriente en matraces Erlenmeyer de 300 ml tras el inoculado durante 16 a 24 horas a 28ºC, y 220 rpm. El cultivo mostraba entonces una OD_{578nm} de 6,0 a 8,0.

A partir de este VK se inoculó el siguiente cultivo principal (HK) con un 5 a un 10% (referido a VK con
OD_{578nm} = 3,0):

HK: NL 5292 + 1 ml de desmofen

20,0 g/l	de extracto de levadura (oxoide)
1, 2 g/l	de NaH_{2}PO_{4} x H_{2}O
8,5 g/l	de Na_{2}PO_{4} x 2H_{2}O
1,0 g/l	de KCl
2,0 g/l	de MgSO_{4} x 7H_{2}O (tratado en autoclave por separado)
0,25 g/l	de ácido cítrico
5,0 g/l	de NH_{4}Cl
4,0 g/l	de SLA 5029
0,005 g/l	de tiamina \rightarrow esterilizada por filtración. (5 mg/10 ml \rightarrow 0,5/50 ml NL)
pH = 6,5

Condiciones de fermentación

Temp.:	28ºC
Vol.:	3,5 L
vvm:	0,75
rpm:	500 (r = 7 cm)
pH:	7,0 \pm 0,2 (mantener constante con NH_{4}OH al 25%).

Carga de alimentación

Disolución de glicerina:	525 g de glicerina (99%)/l de medio HK (sin NH_{4}Cl)
Velocidad de alimentación:	3,4 ml/L hora en el caso de alimentación continua (concentración de gliceri-
	na máxima en el fermentador: 0,2%)
Comienzo de alimentación:	en la 5 hora de fermentación.
Tiempo de alimentación:	40 a 70 horas.
pO_{2}: mantener constante a aproximadamente un 40%.

Ejemplo 4 Identificación de la independencia IPTG de la expresión de GA

Con este fin se cultivó el clon T 415 en el fermentador bajo las condiciones anteriores, y se envasó, en diferentes momentos, respectivamente en dos matraces Erlenmeyer con 50 ml de disolución de cultivo. Se indujo un matraz con IPTG 1 mM, el segundo no. Se midieron las siguientes actividades volumétricas de GA.

Momento de	\hskip20mm GA (U/L)\text{*}
extracción	+ IPTG	Sin IPTG
23 horas	2.700	2.800
31 horas	2.600	2.600
47 horas	4.400	4.500
* 24 horas tras envasado en matraz.

El ensayo evidencia que ya no es necesario IPTG para la inducción de GA.

Ejemplo 5 Fermentación de E. coli T 415

Bajo las condiciones de fermentación descritas anteriormente se alcanzaron 8.200 U GA/L de disolución de cultivo (KL) después de 73 horas. La actividad especifica ascendía aproximadamente a 70 U/g. Rendimiento de biomasa aproximadamente 120 g de masa húmeda/L.

Ejemplo 6 Fermentación con medio HK modificado

Una duplicación de la concentración de extracto de levadura en el medio HK de 20 a 40 g/L condujo a un aumento de la velocidad de crecimiento, y a un rendimiento del aumento de biomasa aproximadamente 140 g/L. La actividad volumétrica de GA aumentó a 9.600 U/L de Kl tras 73 horas. Se alcanzaron 8.000 U/L ya después de 48 horas, lo que significa una reducción del tiempo de fermentación en un día.

Ejemplo 7 Fermentación con alimentación por cargas modificada

Mediante la eliminación de la regulación, dependiente de IPTG, de la expresión de GA, se pudo probar no sólo una intensificación exitosa de medio HK (ejemplo 6), sino también la velocidad de alimentación de glicerina limitante hasta el momento, a causa de la formación de acetal. A modo de ejemplo, se alimentó la velocidad de alimentación continuamente de 3,4 ml/L* hora a 6,6 ml/L* hora, de la quinta a la octava hora de fermentación, y después se mantuvo la misma constante hasta el final de la fermentación, de este modo, esto condujo a una prolongación de la fase de crecimiento rápida, óptima con el resultado de que el clon formaba constante el enzima con velocidad de síntesis acrecentada hasta la hora 73, y en último lugar se produjeron hasta 18.800 U/L de KL. Bajo consideración de la actividad específica de GA de 7 U/mg de proteína, se formaron, por consiguiente, más de 2,5 g de enzima por litro de KL. El rendimiento de biomasa ascendía aproximadamente a 200 g/L de KL. Provisionalmente se llegó a una formación de acetato reducida, de un máximo de 3-4 g/L.

Claims (10)

1. Procedimiento técnico génico para la obtención del glutarilacilasa (GA) en bacterias, caracterizado porque se exprime el gen de GA de manera constitutiva por un vector de expresión bajo empleo de un sistema promotor, operador Lac, en el que el gen represor Lac I^{q} falta o está desactivado.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el promotor para la expresión constitutiva del gen de GA es un promotor Trc, o equivalente a Trc, que no posee represor, o posee un represor no funcional.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el vector de expresión conocido contiene adicionalmente un gen de selección, que codifica para una proteína que permanece en bacterias, no periplasmática.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque la expresión de la citada proteína está reducida frente a una expresión con su promotor natural.

5. Procedimiento según la reivindicación 3 ó 4, caracterizado porque el gen de selección codifica para cloranfenicolaciltransferasa (CAT).

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque, en la fermentación de bacterias, se aumenta la velocidad de alimentación de la fuente de carbono durante el cultivo principal.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, caracterizado porque se aumenta la citada velocidad de alimentación durante la fase de crecimiento logarítmica.

8. Procedimiento según la reivindicación 6 ó 7, caracterizado porque la citada fuente de carbono es glicerina.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque, en el caso de la fermentación de bacterias, se emplea aproximadamente 10 - 50 g/l de una fuente de nitrógeno compleja.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque, en el caso de las bacterias, se trata de E. coli.