JPH08224089A - グルタリルアミダーゼの組換え生産のための改善された誘導を伴わない方法 - Google Patents

グルタリルアミダーゼの組換え生産のための改善された誘導を伴わない方法

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JPH08224089A
JPH08224089A JP7271521A JP27152195A JPH08224089A JP H08224089 A JPH08224089 A JP H08224089A JP 7271521 A JP7271521 A JP 7271521A JP 27152195 A JP27152195 A JP 27152195A JP H08224089 A JPH08224089 A JP H08224089A
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Abstract

(57)【要約】 【課題】 グルタリルアミダーゼの組換え生産の改善。 【解決手段】 グルタリルアミダーゼ（ＧＡ）遺伝子が
発現ベクターから構成的に発現される細菌においてＧＡ
を生産するための組み換え方法。ＧＡ遺伝子を構成的に
発現するためのプロモーターは、いかなるリプレッサー
も有しないかまたは非機能性リプレッサーを有するｔｒ
ｃプロモーターまたはｔｒｃ等価プロモーターであるこ
とが好ましい。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の背景】発明の分野 本発明は、グルタリルアミダーゼ（以下、単に「ＧＡ」
ということがある）を細菌において生産するための組換
え方法に関し、詳細にはＧＡの組換え生産のための改善
された発現ベクターに関する。
【０００２】背景技術 セファロスポリンＣからの７‐アミノセファロスポラニ
ン酸の酵素生産において、グルタリルアミダーゼ酵素は
グルタリル側鎖を除去するために無条件で要求される。
これに関連して、欧州特許出願ＥＰ‐Ａ‐０ ４６９
９１９には、ＧＡの発現がｔａｃプロモーターにより誘
導されるＧＡの組換え生産方法が記載されている。この
方法によれば低収率のＧＡが得られるにすぎない。ＥＰ
‐Ａ‐０５０４ ７９８には、高収率のＧＡ（７０００
〜１００００Ｕ／培地リットル）が形質転換された大腸
菌および特別に適合化された醗酵方法を用いてうまく得
られる方法が記載されている。それは全体的プロセスを
経済的にするこの方法の使用にすぎない。
【０００３】
【発明の概要】意外にも、収率のそれ以上の改善は、Ｇ
Ａ遺伝子を構成的に発現させることにより、特に同様に
プラスミドにコードされるｌａｃＩｑリプレッサーを不
活化することにより、および／または細胞内活性選択マ
ーカー、特にプラスミドにコードされる選択マーカーで
あるクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
（ＣＡＴ）、の発現を減少させることにより、得られ、
それにより収率が約２〜２．５倍多くなることがわかっ
た。
【０００４】したがって、本発明はＧＡ遺伝子が発現ベ
クターから構成的に発現される、細菌でＧＡを生産する
ための方法に関する。好ましくは、ＧＡ遺伝子を構成的
に発現するためのプロモーターは、いかなるリプレッサ
ーも有しないかまたは非機能性リプレッサーを有するｔ
ｒｃプロモーターまたはｔｒｃ等価プロモーターであ
る。
【０００５】ＧＡ遺伝子を構成的に発現するための発現
ベクターが、細菌中に存在し、かつペリプラズム性でな
いタンパク質、例えばクロラムフェニコールアセチルト
ランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、についてコードする選択
遺伝子を更に含むならば、特にこの選択タンパク質が単
に弱く発現されるものであるならば、特に有利である。
【０００６】
【発明の具体的説明】ｌａｃＩｑリプレッサー遺伝子の
不活化は、大腸菌株の増殖が妨げられたりせずに、また
は細胞溶解が過剰発現の結果として起きたりせずに、Ｇ
Ａ酵素の強い連続的な発現および選択を結果として生ず
る。したがって、ＧＡを発現する上で、他の構成性プロ
モーター、即ち誘導により調節されないプロモーター、
の使用を考えることも可能である。Ｔ３６３大腸菌クロ
ーンとは対照的に、対応組換えクローンではもはやＩＰ
ＴＧで誘導される必要がなく、プロセスの一層の簡素化
を行える。
【０００７】ＥＰ‐Ａ‐０ ５０４ ７９８では発現プ
ラスミドＴ３６３の構築と、大腸菌Ｋ１２Ｗ３１１０中
へのその形質転換について記載している。この特許はプ
ラスミドｐＣＭ１４５についても記載し、これはブダペ
スト条約に従い寄託番号：ＤＳＭ６４０９でDeutsche S
ammlung fur Mikroorganismen （微生物のドイツ寄託機
関）に既に寄託されており、これは既知低コピープラス
ミドｐＡＣＹＣ１８４(A.C.Y.Chang and S.N.Cohen,J.B
act.,134(1978),1141-1156) の複製起点とPseudomonas
ＧＡの完全遺伝子を含んでいる。図２は、クローニング
に重要な制限酵素開裂部位の列挙と一緒に、プラスミド
ｐＣＭ１４５の制限地図を示している。
【０００８】ベクターｐＴｒｃ９９Ａ(E.Amann et al.,
Gene,69(1988),301-315)中へのＧＡ遺伝子のクローニン
グでは下記の合成リンカーの使用を要する： （ＮｃｏＩ） （ＳｔｙＩ） C ATG CTG AGA GTT CTG CAC CGG GCG GCG TCC GC GAC TCT CAA GAC GTG GCC CGC CGC AGG CGG AAC
【０００９】０．５７kbＢａｍＨＩ（４）‐ＳｔｙＩ
（２）断片はＳｔｙＩおよびＢａｍＨＩ酵素での切断後
にプラスミドｐＣＭ１４５から単離される（公表された
ＤＮＡ配列において、ＳｔｙＩ開裂部位はアミノ酸１１
〜１３の領域に位置する）。この断片と上記リンカーは
ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで切断されたプラスミドｐＴ
ｒｃ９９Ａ中に結合されて、ＮｃｏＩ開裂部位を失った
プラスミドＴ２９７を与える。
【００１０】加えて、１．５kbＳａｌＩ断片（ＳａｌＩ
（６）‐ＳａｌＩ（９））と０．３４kbＢａｍＨＩ‐Ｓ
ａｌＩ断片がプラスミドｐＣＭ１４５から単離され、Ｓ
ａｌＩおよびＢａｍＨＩで開環されたベクターｐＵＣ１
８中に結合される。これによりＳａｌＩ（６‐９）断片
の正確な向きについて試験されたプラスミドＴ３０６を
得る。２．１kb断片（ＢａｍＨＩ（４）部位〜ＳａｌＩ
（９）部位の断片を含む）はＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄ
III 酵素を用いてプラスミドＴ３０６から単離される。
この断片はＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄIII 酵素で開環さ
れたベクターＴ２９７中に結合されて、プラスミドＴ３
０７を与える（図３）。２８℃で２日間の醗酵後に、こ
のプラスミドで形質転換された大腸菌集団は２６０Ｕ／
リットル以内でＧＡを生産する。醗酵条件が変わると、
この収率は７８０Ｕ／リットル以上に増加することがあ
る。
【００１１】３７℃でＩＰＴＧによる系の誘導は、高コ
ピー数ベクターＴ３０７の使用と、同様に分泌されるβ
‐ラクタマーゼの同時共発現との明らかな結果として、
形質転換された大腸菌株にとり致死的である。したがっ
て、誘導は約３０℃以下の温度で行われる。
【００１２】プラスミドＴ３０７はβ‐ラクタマーゼ遺
伝子を有しており、その遺伝子産物のβ‐ラクタマーゼ
酵素は組換えクローンを選択するために用いられる。Ｇ
Ａと同様に、β‐ラクタマーゼも分泌されてペリプラズ
ムに位置する酵素である。β‐ラクタマーゼ構造遺伝
子、特にそのシグナルペプチド領域、をクロラムフェニ
コールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子に置き換える
ことにより収率を更に改善することができた。クロラム
フェニコールアセチルトランスフェラーゼはもっぱら細
胞質に位置し、したがってペリプラズム空間に分泌され
ない。実施された構築からプラスミドＴ３６３（図４）
を得たが、これも欧州出願ＥＰ‐Ａ‐０５０４ ７９８
で記載されている。
【００１３】例えばＣＡＴ遺伝子産物の発現が減少する
ならば、ＧＡを回収する上で特に有利である。ベクター
Ｔ３６３でその天然プロモーターにより発現されると
き、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ
は破壊物質中で多量に存在するタンパク質である。その
発現の減少は大腸菌タンパク質対ＧＡの比率をＧＡの方
に有利に著しく改善し、それにより分離カラム充填量を
増加させて、単位時間当たりでより多くのＧＡを精製す
ることを可能にできる。ＣＡＴ発現が減少する対応ベク
ター構築物Ｔ３９６、Ｔ４０６およびＴ４１５は、図５
〜７で示されている。
【００１４】したがって、本発明は用いられる選択タン
パク質が好ましいことに単に弱く発現される方法にも関
する。
【００１５】醗酵方法について以下で説明される最適化
によって、酢酸の蓄積なしに、細菌、好ましくは大腸
菌、の増殖期を延長できることが更にわかった。しか
も、これはバイオマス収率を増加させる。
【００１６】主培養期、好ましくは対数増殖期、中の炭
素源供給速度を増加させることにより醗酵方法を最適化
することができた。使用できる炭素源の例は糖、アルコ
ールまたは有機酸、好ましくはグルコースまたはグリセ
ロール、特にグリセロール、である。使用できる複合窒
素源の例は酵母エキス、肉ペプトン、カゼインペプトン
および当業者に知られる他の複合窒素源である。主培地
中における複合窒素源の濃度は約１０〜５０ｇ／リット
ル、特に２０〜４０ｇ／リットル、好ましくは約４０ｇ
／リットルである。
【００１７】下記例は、収率を増加させるために要求さ
れる発現ベクターの構築および醗酵測定について更に詳
細に記載している。クローニングに用いられる酵素はNe
w England Biolabs またはGibco/BRL から得られ、製造
業者の指示に従い用いられた。プラスミドの大きさに関
するすべての値（bp）は大体である。
【００１８】
【実施例】実施例１ ＣＡＴ遺伝子の発現減少（プラスミドＴ３９
６） ＣＡＴ発現を減少させるために、プロモーターのないＣ
ＡＴ遺伝子をβ‐ラクタマーゼプロモーターの後にクロ
ーニングした。この目的のため、単離されたＴ３０７プ
ラスミドＤＮＡ（図３）を制限酵素ＳｓｐＩおよびＤｒ
ａＩで完全に切断し、得られた断片を０．６％アガロー
スゲルで分別した。次いで、ＧＡ遺伝子を含む約３２０
０bpＳｓｔＩ断片と、ｌａｃＩｑ遺伝子およびベクター
の複製起点を含む約２６００bpＳｓｔＩ‐ＤｒａＩ断片
とを電気溶出（electroelution）により単離した。
【００１９】プロモーターのないＣＡＴ遺伝子を下記の
ようにプラスミドｐＣＭ４(T.Closeand R.Rodriguez,Ge
ne,20(1982),305-316) から得た。単離されたｐＣＭ４
プラスミドＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩで完全に切断
し、突出末端をＡＴＰ、ＴＴＰ、ＣＴＰおよびＧＴＰの
存在下でＤＮＡポリメラーゼＩにより補充し、それによ
り平滑末端断片にした。１．２％アガロース中で切断混
合物のアガロースゲル電気泳動後に、ＣＡＴ遺伝子を含
んだ大きさが約７８０bpの断片を電気溶出により単離し
た。
【００２０】次いで、この断片とＴ３０７からの２つの
３２００bpおよび２６００bp断片をＤＮＡリガーゼを用
いて結合用混合物中で一緒に結合させた。結合用混合物
を大腸菌Ｗ３１１０Ｍ中に形質転換し、低濃度のクロラ
ムフェニコール（１２．５μg/ml）の存在下のみで最適
に増殖してグルタリルアミダーゼ形成を示すそれらの組
換えクローンを単離した。単離されたクロラムフェニコ
ール耐性クローンは３つの断片を含むプラスミドを保有
していて、そこでは２６００bp断片が２方向に存在して
いた。最高の産物収率はプラスミドＴ３９６を用いて得
た。Ｔ３６３の場合（２５μg/ml）と比較して低レベル
の耐性は、ＣＡＴ遺伝子がβ‐ラクタマーゼプロモータ
ーと最適な状態で並べられていないためである。ＣＡＴ
遺伝子とβ‐ラクタマーゼプロモーター配列の残基との
結合は図１に示される通りであった。
【００２１】誘導条件下で２日間の細胞増殖の後におい
て、大腸菌株Ｗ３１１０により形成されたタンパク質
（Ｔ３９６）の１０〜１７．５％ＳＤＳポリアクリルア
ミドゲルにおける分析から、同条件下で培養された株Ｗ
３１１０のタンパク質バンド（Ｔ３６３、図４）と比較
して、ＣＡＴタンパク質が８０％以上減少したことが確
認された。このため、ＧＡ酵素の収率は２つの株で非常
に類似しているが、細胞破壊後における溶解ＧＡの量対
全可溶性タンパク質の量の比率は有意に改善されてお
り、ＧＡに対して少ない量の外来タンパク質のために、
グルタリルアミダーゼの回収が著しく簡素化される。
【００２２】実施例２ ｌａｃＩｑリプレッサー遺伝子
の不活化（プラスミドＴ４１５） 振盪培養実験および醗酵では、ＧＡの合成が、期待され
ていたように、ＧＡ形成に用いられたいずれのプラスミ
ドおよび大腸菌株においてもＩＰＴＧによる誘導前に大
きくスイッチ・オフされないことが示された。更に、Ｉ
ＰＴＧ依存性ｌａｃ誘導系について記載された誘導速度
は文献中の値と違っていた。ＩＰＴＧのようなインデュ
ーサーの使用に全く依存せずにＧＡの発現を行うため
に、ｌａｃＩｑリプレッサーについてコードする読取り
枠を破壊した。これで不活化リプレッサーを得て、それ
によりインデューサー不在下における遺伝子読取りの障
害をなくした。
【００２３】単離されたＴ３９６プラスミドＤＮＡ（図
５）を制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄIII で切断
し、ＣＡＴ遺伝子とＣＡＴ遺伝子発現を減少させるβ‐
ラクタマーゼプロモーターとの連結領域を含んだ約７５
０bp断片を電気溶出により単離した。次いでこのインサ
ートを、プラスミドＴ３６３から同様に単離された約６
０００bpＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄIII 断片と一緒に結合し
た。これで発現ベクターＴ４０６を得る（図６）。意外
にも、ベクターＴ４０６は醗酵中にＴ３９６よりも安定
であることがわかった。
【００２４】ｌａｃＩｑ遺伝子を不活化するために、単
離されたＴ４０６プラスミドＤＮＡを制限酵素ＢｓｔＥ
IIで完全に切断した。そのベクターにおける唯一の開裂
部位はリプレッサーについての構造遺伝子中に位置して
いる。突出末端をｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰおよび
ｄＣＴＰの存在下でＤＮＡポリメラーゼを用いて補充
し、ベクターをＤＮＡリガーゼの存在下で再結合させ
た。このステップでは機能性ｌａｃＩｑリプレッサーが
形成されないように２つの塩基対で読取り枠を移動させ
る。プラスミドＴ４１５が得られる（図７）。振盪培養
において、組換え大腸菌Ｗ３１１０（Ｔ４１５）クロー
ンは、２日後の約５１０Ｕ／リットル（インデューサー
のあるＴ３６３）からインデューサーが加えられていな
いＴ４１５の場合の１５９０Ｕ／リットルまでのＧＡ形
成の増加を示す。コントロール実験において、収率はＴ
４１５系にインデューサーを加えても改善されない。
【００２５】ベクターＴ３９６を保有する大腸菌株につ
いて証明された回収利点は、プラスミドＴ４１５保有大
腸菌にも等しくあてはまる。
【００２６】ｌａｃＩｑリプレッサー遺伝子の不活化が
有利であるとわかったため、ＧＡを構成的に発現する構
築物を作る上で、大腸菌で複製してかつ最初からｌａｃ
Ｉｑ遺伝子を欠くベクターの使用も考えることができ
る。ｌａｃプロモーター／オペレーター系が用いられた
ときに、ｌａｃ野生型リプレッサーまたはその変異体の
発現がないかまたは低レベルで生じる、ＧＡ生産用の大
腸菌株を用いることも可能と思われる。
【００２７】実施例３ 大腸菌Ｔ４１５の醗酵 ＥＰ‐Ａ‐０ ５０４ ７９８による大腸菌クローンＴ
３４７およびＴ３６２／３３とは対照的に、グルタリル
アミダーゼ（ＧＡ）は構築物Ｔ４１５の場合でＩＰＴＧ
によりもはや誘導される必要がない。最適醗酵の説明を
以下に示す。
【００２８】（１）培養条件 変動させたパタメーターを除いて、すべての培養は下記
条件下で行った：株を好ましくは下記ＹＴ／グリセロー
ル培地中−１８℃で保った： グリセロール １７．０％ 酵母エキス ０．７％ バクトトリプトン ０．４％ ＮａＣｌ ０．４％ クロラムフェニコール １２．５μg/ml 同培地の寒天プレートをこの懸濁液から作り、２８℃で
２４時間インキュベートし、前培養物（ＰＣ）を単一コ
ロニーで接種した。
【００２９】 ＰＣ培地： バクトトリプトン ２．０％ （ＮＬ５２９５） バクト酵母エキス １．０％ ＮａＣｌ ０．５％ クロラムフェニコール １２．５μg/ml ｐＨ＝７．２ ３００mlエルレンマイヤーフラスコ中この栄養溶液１０
０mlを接種し、その後２８℃、２２０rpm で１６〜２４
時間インキュベートした。培養物はその時６．０〜８．
０のＯＤ578nm を有していた。
【００３０】下記主培養物（ＭＣ）をこのＰＣ５〜１０
％（ＯＤ578nm ＝３．０のＰＣに基づく）で接種した： ＭＣ：ＮＬ５２９２＋デスモフェン１ml ２０．０ｇ／リットル 酵母エキス(Oxoid) １．２ｇ／リットル ＮａＨ２ＰＯ４×Ｈ２Ｏ ８．５ｇ／リットル Ｎａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏ １．０ｇ／リットル ＫＣｌ ２．０ｇ／リットル ＭｇＳＯ４×７Ｈ２Ｏ（別にオー
トクレーブ処理） ０．２５ｇ／リットル クエン酸 ５．０ｇ／リットル ＮＨ４Ｃｌ ４．０ｇ／リットル ＳＬＡ５０２９ ０．００５ｇ／リットル トリアミン→濾過滅菌 （５mg／１０ml→０．５mg／５０mlのＮＬ） ｐＨ＝６．５
【００３１】（２）醗酵条件 温度：２８℃ vol. ３．５リットル vvm: ０．７５ rpm: ５００（ｒ＝７cm） ｐＨ：７．０±０．２（２５％ＮＨ４ＯＨを用いて一定
に保つ）
【００３２】（３）流加バッチ グリセロール溶液：グリセロール５２５ｇ（９９％）／
ＭＣ培地リットル（ＮＨ４Ｃｌなし） 供給速度：３．４ml/l/hで連続添加（醗酵槽中の最大グ
リセロール濃度：０．２％） 供給開始：醗酵の５時間目 供給時間：４０〜７０時間 ｐＯ２：約４０％で一定に保つ
【００３３】実施例４ ＧＡの発現がＩＰＴＧに依存し
ないことの証明 この目的のため、クローンＴ４１５を醗酵槽中において
上記条件下で培養し、２つのエルレンマイヤーフラスコ
を各々の場合に異なる時間に培養溶液５０mlで充填し
た。１つのフラスコは１mMＩＰＴＧで誘導したが、他方
はしなかった。下記ＧＡ容量活性を測定した： ＧＡ（Ｕ／リットル）* 取出時間 ＋ＩＰＴＧ ＩＰＴＧなし ２３ｈ ２７００ ２８００ ３１ｈ ２６００ ２６００ ４７ｈ ４４００ ４５００ *フラスコ充填の２４時間後 実験はＩＰＴＧがＧＡを誘導する上でもはや要求されな
いことを明らかに証明している。
【００３４】実施例５ 大腸菌Ｔ４１５の醗酵 ＧＡ８２００Ｕ／リットル培養溶液（ＣＳ）を上記条件
下で７３時間の醗酵後に得た。比活性は約７０Ｕ／ｇ湿
潤重量であった。バイオマス収率は約１２０ｇ湿潤重量
／リットルであった。
【００３５】実施例６ 修正ＭＣ培地を用いた醗酵 ＭＣ培地中酵母エキスの濃度を２０から４０ｇ／リット
ルに倍増させることで増殖の速度を速めて、バイオマス
収率を約１４０ｇ／リットルに増加させた。ＧＡ容量活
性は７３時間後に９６００Ｕ／ＣＳリットルに上がっ
た。８０００Ｕ／リットルにはわずか４８時間後に達し
たが、これは醗酵時間の１日短縮を示している。
【００３６】実施例７ 修正流加バッチ供給を用いた醗
酵 ＧＡ発現のＩＰＴＧ依存性調節の解消は、ＭＣ培地をう
まく増幅させる可能性について試験するだけでなく（実
施例６）、酢酸の形成のために以前制限されていたグリ
セロールの供給速度を変えることも可能にした。例え
ば、供給速度が醗酵の５時間目から８時間目まで連続的
に３．４ml/l/hから６．６ml/l/hに増加して、その後醗
酵の最後まで一定のままであったならば、これは急速な
最適増殖期を延長し、その結果としてクローンが７３時
間目まで一定の高い合成速度で酵素を形成し、最終的に
１８８００Ｕ／ＣＳリットルまで生産された。このため
ＧＡの７Ｕ／タンパク質mgの比活性を考慮すれば、２．
５ｇ以上の酵素がＣＳリットル当たりで形成された。バ
イオマス収率は約２００ｇ／ＣＳリットルであった。単
に３〜４ｇ／リットルの少量の酢酸が中間体としてなお
形成された。
【図面の簡単な説明】
【図１】ＣＡＴ遺伝子が発現される速度を減少させるた
めのＣＡＴ遺伝子プロモーター結合領域を示した図であ
る。
【図２】発現ベクターｐＣＭ１４５を示した図である。
【図３】発現ベクターＴ３０７を示した図である。
【図４】発現ベクターＴ３６３を示した図である。
【図５】発現ベクターＴ３９６を示した図である。
【図６】発現ベクターＴ４０６を示した図である。
【図７】発現ベクターＴ４１５を示した図である。

Claims (9)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】グルタリルアミダーゼ（ＧＡ）遺伝子が発
    現ベクターから構成的に発現される、細菌においてＧＡ
    を生産するための組換え方法。
  2. 【請求項２】ＧＡ遺伝子を構成的に発現するためのプロ
    モーターがいかなるリプレッサーも有しないかまたは非
    機能性リプレッサーを有するｔｒｃプロモーターまたは
    ｔｒｃ等価プロモーターである、請求項１に記載の方
    法。
  3. 【請求項３】発現ベクターが、細菌中に存在し、かつペ
    リプラズム性でないタンパク質についてコードする選択
    遺伝子を更に含んでいる、請求項１または２に記載の方
    法。
  4. 【請求項４】タンパク質が単に弱く発現されるものであ
    る、請求項３に記載の方法。
  5. 【請求項５】選択遺伝子がクロラムフェニコールアセチ
    ルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）についてコードしてい
    る、請求項３または４に記載の方法。
  6. 【請求項６】細菌の醗酵中において、主培養中の炭素源
    供給速度が増加される、請求項１〜５のいずれか一項に
    記載の方法。
  7. 【請求項７】供給速度が対数増殖期に増加される、請求
    項６に記載の方法。
  8. 【請求項８】炭素源がグリセロールである、請求項６ま
    たは７に記載の方法。
  9. 【請求項９】約１０〜５０ｇ／リットルの複合窒素源が
    細菌の醗酵中に用いられる、請求項１〜８のいずれか一
    項に記載の方法。
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