ES2224138T3 - Aceleradores polimericos para la cicatrizacion de heridas. - Google Patents

Aceleradores polimericos para la cicatrizacion de heridas.

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ES2224138T3 ES95937679T ES95937679T ES2224138T3 ES 2224138 T3 ES2224138 T3 ES 2224138T3 ES 95937679 T ES95937679 T ES 95937679T ES 95937679 T ES95937679 T ES 95937679T ES 2224138 T3 ES2224138 T3 ES 2224138T3
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Sharon Pulfer
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University of Akron
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Abstract

LA INVENCION DESCRIBE COMPLEJOS POLIMERICOS, INSOLUBLES EN AGUA DE NONOATO QUE SON CAPACES DE ACELERAR LA CURACION DE HERIDAS A TRAVES DE LA LIBERACION TERAPEUTICA CONTROLADA DE NO. LA COMPOSICION ESTA ADICIONALMENTE INDICADA PARA SER CAPAZ DE CONTENER UN MATERIAL ABSORBENTE, OPCIONALMENTE CON UN MATERIAL DE MATRIZ INCLUIDO.

Description

Aceleradores poliméricos para la cicatrización de heridas.
La presente invención se refiere de manera general a complejos poliméricos NONOato insolubles en agua que son capaces de acelerar la cicatrización de heridas mediante la liberación terapéutica controlada de NO.
Antecedentes
Investigaciones recientes han demostrado que el óxido nítrico (NO) es una molécula biológica vital. El NO desempeña un papel central en procedimientos tan diversos como la defensa del hospedador, la regulación cardiovascular, la transducción de señales, la neurotransmisión y la cicatrización de heridas. La enzima óxido nítrico sintasa (NOS) convierte la L-arginina en L-citrulina y NO, y numerosas células implicadas en los procedimientos de cicatrización de heridas han mostrado actividad NOS. No se han establecido las funciones exactas del NO en la reparación tisular, aunque probablemente un papel importante del NO es el de agente citotóxico o citostático liberado por macrófagos y otras células fagocíticas durante la fase inflamatoria temprana. El NO liberado de las células residentes lesionadas también puede ser importante en rutas de señalización celular únicas y en el restablecimiento de la microcirculación a medida que se forma nuevamente tejido vascularizado.
La oxidación del NO produce intermedios inestables (tales como N_{2}O_{3} y N_{2}O_{4}) y posteriormente productos metabólicos estables nitrito (NO_{2}) y nitrato (NO_{3}). Estudios previos han demostrado que el NO_{2} en orina es insignificante en ratas infectadas o lesionadas y que el NO_{3} en orina es una medida indirecta precisa de la producción de NO.
Trabajos previos han demostrado que los niveles de NO_{3} en orina en ratas normales lesionadas por escisión aumentan bruscamente tras la lesión y permanecen significativamente altos durante el transcurso de la reparación tisular hasta 18 días después del cierre de la herida externa. Sin embargo, dos modelos habituales de heridas deterioradas, ratas tratadas con esteroides y ratas diabéticas inducidas experimentalmente, presentan la supresión de síntesis de NO durante la reparación de la herida. Esto sugiere que el metabolismo del NO en células biológicas funcionales puede ser de una importancia crítica durante la reparación tisular. Además, la aplicación tópica de los inhibidores de la NOS N^{G}-monometil-L-arginina (LMMA) y N^{G}-nitro-L-arginina (LNA) reducen significativamente la síntesis de NO (p < 0,05) en heridas de ratas normales, demostrando que la aplicación tópica de terapéuticos puede alterar el metabolismo normal del NO. Si la síntesis insuficiente de NO en el lugar de la lesión es un factor clave en la cicatrización de heridas deterioradas, entonces la administración tópica controlada de NO en el entorno local de la herida puede ser una nueva terapia para la aceleración de la cicatrización tanto de heridas crónicas como normales. La administración tópica de NO también puede ser un componente crucial de una nueva generación de vendajes para heridas, ya que actualmente están disponibles pocos fármacos de liberación controlada.
Recientemente, se han introducido complejos formados por la reacción del óxido nítrico con ciertos nucleófilos como una nueva clase de compuestos liberadores de NO. Keefer y col. han sintetizado aductos poliamina bipolar/NO denominados como NONOatos. En el documento de EE.UU. 5.250.550, Keefer y col. presentan los siguientes complejos óxido nítrico-poliamina, con sus sales farmacéuticamente aceptables, como agentes cardiovasculares útiles:
1
2
3
4
Alternativamente, el documento de EE.UU. 5.212.204 de Keefer y col., describe composiciones antihipertensivas y un procedimiento para la disminución de la presión sanguínea en mamíferos, en el que el componente activo de la composición es un compuesto de la siguiente fórmula (IV), en la que J es una fracción orgánica o inorgánica y M^{+X} es un catión farmacéuticamente aceptable que no provoca la inestabilidad del compuesto o su insolubilidad en agua.
5 
\vskip1.000000\baselineskip
6
Las patentes previas de Keefer, por ejemplo, el documento de EE.UU. 5.208.233 también se refieren a composiciones antihipertensivas y procedimientos de disminución de la presión sanguínea en mamíferos, se pueden caracterizar como se muestra en la siguiente fórmula (V) en la que se presenta una asociación de tipo iónico, y en la que cuando R_{1} y R_{2} están enlazados al mismo átomo, se prefieren los siguientes grupos (VI-1 hasta VI-4):
7
Usos adicionales para el NO se presentan en el documento de EE.UU. 5.185.376 en el que se demuestra la inhibición de la agregación plaquetaria in vivo con compuestos compatibles fisiológicamente que contienen al menos una fracción N-oxo-N-nitrosamina en su molécula, en la que compuestos compatibles fisiológicamente liberan óxido nítrico de manera sostenida y controlable in vivo. Los tipos de compuestos listados para esta solicitud fueron DEANO (VII)
8
y el producto de adición del óxido nítrico de la poliamina espermina (VIII);
9
NIPRIDE (nitroprusside), fórmula (IX);
10
Y ASA (aspirina), fórmula (X).
11
Estos NONOatos liberan cantidades cuantitativas de NO en medio acuoso, y la tasa y el grado de generación de NO parece depender del pH, la temperatura, y la naturaleza del residuo nucleofílico.
Los compuestos NONOato se pueden usar como vasodilatadores basados en NO, y pueden tener otras aplicaciones clínicas, tales como terapia antitumoral. Sin embargo, la administración de NO en heridas a través de estos NONOatos solubles basados en aminas es complicada debido a la solubilidad de las aminas tóxicas que permanecen después de que se libere el NO.
Está invención incluye aductos polímero/NO que son insolubles, no tóxicos, y presentan una liberación controlada y prolongada de NO en disolución acuosa para formar una nueva clase de NONOatos. El NONOato polimérico, NO-polietilenimin celulosa (PEIC-NO), libera una cantidad importante de NO durante un periodo de tiempo prolongado en un entorno acuoso. La PEIC-NO se escogió para estudios de cicatrización de heridas debido a su baja toxicidad, facilidad de aplicación, y semivida relativamente prolongada (aproximadamente 960 min). Además, otro derivado de la celulosa, la carboximetil celulosa, es un componente importante de la mayoría de vendajes hidrocoloides existentes para heridas, y por tanto la incorporación de PEIC-NO en formulaciones de vendajes disponibles comercialmente sería factible.
Resumen de la invención
De acuerdo con la presente invención, se proporciona un sistema de administración tópica de NO de una forma de liberación controlada.
Es un objeto de esta invención proporcionar un sistema de administración tópica para el NO usando un vehículo polimérico.
Es otro objeto de esta invención usar la liberación controlada de NO aplicado tópicamente sobre una lesión para promover la reparación de la herida.
Todavía es otro objeto de esta invención usar un material de vendaje absorbente polimérico que se deriva con NO, que cuando se aplica tópicamente liberará cantidades terapéuticas de NO sobre la herida.
Aún es otro objeto de esta invención usar un complejo NONOato insoluble que libere cantidades terapéuticas de NO sobre la herida en contraste con complejos NONOato solubles que pueden migrar de la superficie de la herida, y causar potencialmente efectos sistémicos perjudiciales.
Aún es otro objeto más de esta invención usar NONOato PEI celulosa como sistema polimérico insoluble de administración de NO.
Estos y otros objetos de esta invención serán evidentes a la vista de los dibujos, descripción detallada, y reivindicaciones adjuntas.
Breve descripción de los dibujos
La invención puede tomar forma física en ciertas partes y disposiciones de partes, de las cuales se describirá con detalle en la memoria descriptiva una forma de realización preferida y se ilustra en los dibujos adjuntos que forman parte de ésta, en los que:
La Fig. 1 es un gráfica de la salida de nitrato en orina por día en ratas comparando un control (PEIC aplicado tópicamente sobre una herida) y una muestra (PEIC-NO aplicado tópicamente sobre una herida) mostrando el aumento en la salida de nitrato en orina para la herida tratada con NO;
la Fig. 2 es una gráfica de la cicatrización de heridas en ratas comparando un control (PEIC aplicado tópicamente sobre una herida) y una muestra (PEIC-NO aplicado tópicamente sobre una herida) mostrando diferencias en la tasa de cicatrización de heridas;
la Fig. 3 es una gráfica de la presión sistólica a lo largo del tiempo comparando un control (PEIC aplicado tópicamente sobre una herida) y una muestra (PEIC-NO aplicado tópicamente sobre una herida); y
la Fig. 4 es un perfil de liberación de PEIC-NO a lo largo del tiempo.
Descripción detallada de invención
De acuerdo con la invención, se proporciona un aducto que cuando se aplica tópicamente sobre la superficie de la herida acelera su cicatrización, el aducto está formado por:
(a) un polímero insoluble en agua seleccionado del grupo compuesto por polietilenimin celulosa y poli(etilen diamin-co-1,4-butano-diglicidiléter) y;
(b) óxido nítrico,
en el que el óxido nítrico esta unido químicamente al polímero insoluble en agua mediante un enlace químico disociable con agua.
Ahora, en lo referente a los dibujos, en los que las representaciones tienen solamente como propósito ilustrar la forma de realización preferida de la invención y no la limitación de la misma, las Figuras muestran la capacidad de los NONOatos poliméricos, que cuando se aplican tópicamente liberan cantidades terapéuticas de NO que acelera la cicatrización de heridas.
Ahora se describirá la mejor forma de llevar a cabo la invención con el propósito de ilustrar la mejor manera conocida por el solicitante en este momento. Los ejemplos son solamente ilustrativos.
Ejemplos Materiales
Se adquirió polietilenimin celulosa (PEI-celulosa) de la Sigma Chemical Company (St. Louis, MO) (resina de intercambio aniónico de red fina o media). Se adquirió nitrato potásico (99,999%) y acetonitrilo (99,5%) de la Aldrich Chemical Company (Milwaukee, WI). Se adquirió arginina modificada (2%) y dieta baja en nitratos AIN-76 de ICN Biochemicals (Cleveland, OH). Se adquirió cloruro de vanadio (III) (99%) de Johnson Matthey/Alfa Products (Ward Hill, MA). La gomaespuma densa de silicona fue proporcionada por la VariSeal Corporation (Parkman, OH). Se adquirió vendaje transparente Sterile Bioclusive (TM) de Johnson & Johnson Medical Inc. (Arlington, TX). El agua para la preparación de la disolución y el consumo de las ratas se purificó con un sistema de filtración de cartuchos Milli-Q (TM) (Millipore Corporation, Bedford, MA). El óxido nítrico se adquirió de Matheson Products, Inc. (Twinsburg, OH). Otros materiales reactivos de calidad se adquirieron de Fisher Scientific (Pittsburgh, PA).
Procedimiento experimental
Todos los procedimientos para la experimentación con animales fueron aprobados por el Comité para el Cuidado de los Animales de la Universidad de Akron. Se adquirieron ratas Sprague Dawley macho (75-99 g) de Zivic Miller Co. (Zelienople, PA). La instalación de almacenamiento de animales suministraba alternativamente ciclos de 12 horas de luz/oscuridad con una humedad (50-60%) y temperatura (21-25ºC) constantes. Las ratas fueron puestas en cuarentena durante dos semanas tras la fecha de llegada, y entonces se transfirieron a otro lugar y se aclimataron durante otros 7 días. Se proporcionó a las ratas jaulas limpias, se les dio agua destilada y desionizada ad libitum, y se alimentaron con una dieta normal baja en nitratos (NO_{3}) que contenía un 2% de arginina. Las ratas fueron transferidas a jaulas metabólicas y asignadas aleatoriamente a uno de los dos grupos, control (n = 6) o en tratamiento (n = 9).
Se recogió la orina en intervalos de 24 horas durante 9 días previos a la lesión para establecer niveles de salida basales de nitrato en orina. El crecimiento bacteriano se inhibió mediante la adición de 5 ml de HCl 3 mol/l a cada vial de recolección de orina, que mantenía la orina a pH 1 o inferior. El bajo pH de la orina también ayudó a mantener un rendimiento óptimo del analizador de NO durante el análisis de nitratos. La orina también fue recogida en intervalos de 24 horas en el transcurso de la cicatrización de las heridas. Las muestras se usaron inmediatamente o se mantuvieron congeladas hasta su análisis.
El día de la lesión, se recogió la orina y las ratas fueron anestesiadas con Nembutal (40 mg/Kg i.p.). Se afeitó la zona dorsal de cada rata y a continuación se limpió con una gasa empapada con isopropanol estéril. Usando instrumentos estériles y técnicas asépticas, se realizó una herida a cada rata de un grosor máximo de 2 cm x 2 cm cuadrados por eliminación de la dermis y el panniculus carnosus. Se colocó sobre la piel adyacente a la herida la gomaespuma de silicona con un agujero de 4 cm x 4 cm cuadrados y con un adhesivo de uso médico en la parte trasera para mantener el compuesto del tratamiento y prevenir la contaminación de la herida. Los depósitos de silicona también evitaron la contracción de la piel en el borde de la herida observado normalmente durante la cicatrización temprana de la herida en los roedores. Después de aplicar el tratamiento de lesión, los depósitos de silicona se cubrieron con película Bioclusive y a continuación con Vetrap.
Las ratas tratadas recibieron 200 mg de NONOato (PEIC-NO) y 200 \muL de PBS IX estéril. Las ratas control recibieron 200 mg de PEIC y 200 \muL de PBS IX estéril. También se inyectó gentamicina (4,4 mg/kg i.m.) a las ratas mientras estaban anestesiadas. Después de la operación y la filmación de la herida, cada rata se colocó en una almohadilla isotérmica y se monitorizaron estrechamente hasta que se recuperaron de la anestesia, y entonces se devolvieron a sus jaulas metabólicas. Las aplicaciones tópicas control y de tratamiento fueron previamente codificadas para conseguir un estudio ciego en el transcurso del experimento.
Síntesis de NONOato PEI-celulosa
En una ligera modificación de la técnica de alta presión desarrollada por Drago y Karstetter, se colocó PEI celulosa (7,0 g, 15,4 mmol) con 70 ml de acetonitrilo en un frasco de reacción a rosca Ace modificado equipado con una barra de agitación magnética. La disolución se cargó con nitrógeno gaseoso durante 10 minutos a través de un sistema de válvulas de gas de 4 vías compuesto de dos entradas de gas para NO y N_{2} que se podrían suministrar simultáneamente, una tercera salida se usó para mantener el sistema abierto. Todas las conexiones gaseosas se hicieron con tubos de Teflón transparentes (0,25 en OD) y fijaciones Swagelock de acero inoxidable. A continuación se administró óxido nítrico gaseoso a una presión de 482,633 KPa durante 30 minutos y se cerró el frasco de reacción, manteniendo la reacción bajo presión. Este procedimiento para la administración de NO gaseoso se repitió cada día durante 10 días tras los cuales se ventiló el exceso de NO y se administró N_{2} gaseoso durante 15 min. El producto amarillo (6,82 g) se aisló por filtración, se lavó con acetonitrilo y a continuación con éter, y se secó sobre vacío durante toda la noche. El polímero de polietilenimin celulosa liberó 67 nmol de NO/mg de polímero aproximadamente en un tampón a pH 7,4.
El producto resultante se muestra a continuación en forma de diagrama (XI).
12
13
Síntesis NONOato de ED-BDE
Se preparó poli(etilendiamina-co-1,4-butano-diglicidil éter) reticulado por reacción de cantidades aproximadamente equimoleculares de etilen diamina y 1,4-butanodiglicidil éter dando un polímero frágil. Se añadió 150 ml aproximadamente de agua destilada y se dejó dilatar el polímero, seguido por filtración y lavado con acetona. El polímero se secó en un horno a 50ºC. El valor de x es dependiente de las cantidades iniciales de reactivos polimerizados.
Se añadió NO gaseoso a 0,5 g aproximadamente de polímero en 25 ml de acetonitrilo a 482,633 KPa durante 25 minutos. Se cerró la válvula del frasco de reacción y se prosiguió con la reacción durante 48 horas. El reactor se ventiló y se purgó con nitrógeno y se añadió NO adicional durante 30 minutos a 482,633 KPa. Tras cerrar la válvula del reactor, se dejó continuar la reacción durante 24 horas más. El producto final se filtró y se lavó con éter. El polímero NONOato final resultó un polvo sólido blanco que era insoluble en agua. Sin embargo, tras el contacto con el agua, el polímero NONOato liberó NO gaseoso y regeneró el copolímero inicial. El polímero poli(etilendiamina-co-1,4-butano-diglicidil éter) liberó 65 nmol de NO/mg de polímero en un tampón a pH 7,4.
La reacción anterior se muestra en el siguiente diagrama.
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Ya que los dos procedimientos sintéticos están descritos anteriormente, no hay necesidad de limitar la solicitud a los polímeros específicos discutidos, aunque representen la mejor manera conocida por los inventores hasta la fecha. El uso de otros polímeros, tales como el uso de un sustrato dextrano también está contemplado dentro del alcance de esta solicitud. La discusión de este sustrato está contenida en la solicitud pendiente de tramitación US-A-5.549.908.
Análisis de la imagen de vídeo
Seguido inmediatamente a la lesión y cada 3 días después de eso, cada herida se grabó usando una cámara de vídeo (Nikon VN-3000 con microenfoque de lentes de 6x aumentos) y una cinta VHS (FUJI A/V Master Super XG). Después de limpiar cuidadosamente de cualquier residuo cada herida con PBS IX estéril, se colocó adyacente a la herida una etiqueta circular autoadhesiva (1,9 cm de diámetro). Esto sirvió como patrón externo durante el análisis de la imagen de vídeo y permitió la variación de la distancia entre la lente y la herida. La lente de la cámara se situó perpendicularmente a la posición de la herida, con la herida y el patrón externo en el mismo plano horizontal, y la lente se enfocó para dar la imagen más grande posible.
El análisis digital por ordenador de las imágenes de la herida se realizó conectando la señal de salida a un espectro NTSC y una capturadora de vídeo (Redlake Corporation, Morgan, Hill, CA) instalada en un ordenador Gateway 2000 386/16SX (Gateway 2000, Inc. North Sioux City, SD). Usando el software de análisis de imágenes Accuware (Automated Visual Inspection, Santa Clara, CA), se capturaron consecutivamente varias imágenes óptimas que mostraban la herida y el patrón externo y se mostraron en un monitor Samsung CSA7571 multiscanning RGB de 17'' (Samsung Information Systems America, Inc.; San José, CA). El perímetro de la herida y el patrón externo se trazaron con un ratón, y se computó el área de píxeles de cada imagen. Se obtuvieron las áreas relativas de las heridas usando la relación entre la lesión y el patrón externo, dando medidas que eran independientes de la distancia entre la cámara y la herida. Cada área relativa de la lesión se expresó como una fracción del original y se representó frente al tiempo para determinar el progreso de la cicatrización de la herida. Se usó un Student's t-test de dos colas acopladas para valorar diferencias significativas en la cicatrización de la herida entre las ratas control y las tratadas.
Análisis de nitratos
Todas las muestras de orina se analizaron para nitratos (NO_{3}) usando un analizador de óxido de nitrógeno modelo 8440 Monitor Labs (Lear-Siegler Corporation, Englewood, CO) y una modificación del procedimiento descrito por Braman y Hendrix. Se llenó un "impinger" normal con 40-50 ml de una disolución reductora de cloruro de vanadio (III) (VCl_{3}, 0,4 mol/l) en 1,5 mol/l de HCl. La disolución reductora se calentó a 95-100ºC y se desgasificó con helio a una tasa de flujo de 125 ml/min. Las muestras de orina se inyectaron en la disolución reductora a través de un tabique revestido de teflón, y el VCl_{3} redujo todo el NO_{3} presente a NO. El flujo de helio transportó el NO generado de novo a través de un segundo "impinger" cargado con 1 mol/l de NaOH para eliminar cualquier gas ácido. La tasa de flujo de la bomba de vacío analizadora (por ejemplo, el flujo de entrada de la muestra) se dispuso a 150 ml/min con una válvula micromedidora. Un conector en forma de "T" entre la entrada del analizador y el "impinger" de NaOH proporcionó un sistema abierto que mantenía una tasa de flujo de entrada constante y evitaba el problema de igualar las tasas de entrada del analizador y del flujo de helio. La entrada de NO en el analizador y la reacción quimioluminiscente posterior (entre el O_{3} generado por el analizador y el NO) determinó la cantidad de NO por muestra. También se inyectaron concentraciones conocidas de KNO_{3} y se usaron para determinar diariamente las curvas patrón, que se usaron para calcular la salida media de NO_{3} (\mumol/día) por animal. La señal de salida se capturó mediante una grabadora de integración HP3392A (Hewlett-Packcard CO; Avondale, PA). Se llevaron a acabo inyecciones dobles de todas las muestras de orina y se usaron los valores medios como salida de NO_{3} diaria para cada animal. Se usó un Student's t-test de dos colas acopladas para valorar diferencias significativas en la concentración de NO_{3} en orina antes y después de la lesión entre las ratas control y tratadas.
Análisis de NONOato
El análisis del PEIC-NO se realizó en un analizador de óxido de nitrógeno modelo 8440 Monitor Labs (Lear-Siegler Corporation, Englewood, CO) conectado a un integrador de datos de cromatografía LC/9540 (IBM, Inc., Danbury CT). La cámara de muestras estaba compuesta de un frasco de gas "impinger" modificado con válvulas de dos vías que permitían que se acumulase el NO gaseoso en la cámara. Uno de los extremos de la cámara de muestras se conectó al analizador de NO, mientras que el otro extremo se conectó a un medidor de flujo y a un tanque de helio gaseoso. Se bombeó helio gaseoso a través del sistema a 68,948 kPa y el medidor de flujo se ajustó a 150-200 ml/min. Los 150 ml de la cámara de muestras se cargaron con 50 ml de PBS a pH 7,4 y la disolución se desgasificó durante 15 minutos. Se añadió una muestra de 10 mg de PEIC-NO, se cerraron las válvulas y se tomaron lecturas periódicas abriendo las válvulas y arrastrando con helio gaseoso el NO producido hacia el detector.
Se obtuvieron medidas cinéticas calculando la concentración de NO liberado a partir de PEIC-NO usando una curva patrón de KNO_{3} de 100 \mumol/l. Se obtuvo un perfil de liberación representando la suma de las carreras de NO producido (nmol) frente al tiempo (horas). A partir de esta gráfica, se determinó la concentración de NO en el infinito. Se calculó la tasa de reacción de primer orden representando el Ln (Conc_{1} - Conc_{2}) frente al tiempo (horas), tratando por ordenador los valores de K y de semivida del polímero.
Medidas de la presión sanguínea
Se implantaron previamente dispositivos de telemetría en ratas espontáneamente hipertensivas (SHR) o Wistar-Kyoto (WKY). Se midió continuamente la presión sanguínea sistólica (SBP), la presión sanguínea diastólica (DBP), la presión arterial media (MAP), la frecuencia cardiaca (HR), y la actividad locomotora (ACT) en intervalos de 24 horas, usando el sistema de recolección de datos Dataquest IV (Data Sciences Inc., St. Paul, MN). El dispositivo de telemetría se implantó realizando una incisión media en el abdomen de ratas anestesiadas e insertando el extremo de un catéter flexible del transmisor de radio en la aorta descendente entre los vasos renales y la arteria iliaca. El transmisor se colocó en la cavidad peritoneal y se cosió a la pared abdominal de forma que se cerró la incisión media. Los animales se colocaron en jaulas de recuperación individuales durante una semana. Se colocó un receptor bajo cada jaula, que enviaba señales continuamente a un sistema de recopilación de datos computerizado en una habitación aparte. Los parámetros se midieron y se salvaron entre cada 20 segundos a cada 5 minutos, y a continuación se hizo la media en intervalos de 30 minutos. La presión sanguínea basal se tomó antes de la lesión, en el momento de la lesión, y tras la aplicación tópica de NONOato o de la inyección anestésica (i.p.). Se administró durante un intervalo de 3 días NONOato tópico y una disolución anestésica de brevital sódico (50 mg/kg i.p.) al 3%. Se tomó la presión sanguínea sistólica y la media de los datos obtenidos se representó frente al tiempo para indicar cualquier cambio significativo en la presión sanguínea a lo largo del tiempo tanto para el NONOato tópico como para la inyección de brevital. Se realizó un Student's t-test de dos colas acopladas para valorar diferencias significativas en la presión sanguínea sistólica en ratas de administración tópica (NONOato) o inyectadas (brevital).
Discusión
El perfil de NO_{3} en orina, que mide indirectamente la liberación de NO de las heridas, se muestra en la Figura 1. El día cero (0) es el día de la lesión, y cada punto de los datos representa la salida media de NO_{3} en orina diaria para cada grupo. La salida media de NO_{3} en orina (n = 9 días) antes de la lesión fue de 6,7 \pm 0,34 S.E.M. frente a 7,4 \pm 0,37 S.E.M. \mumol/día de NO_{3} para los grupos control y NONOato respectivamente. No había diferencias significativas en la salida de NO_{3} en orina para ambos grupos antes de la lesión.
En la fase temprana de cicatrización (n = 3 días, días 0-2), la salida media de NO_{3} en orina fue de 12,4 \pm 2,4 S.E.M. y 22,5 \pm 1,1 S.E.M. \mumol/día de NO_{3} para los grupos control y NONOato respectivamente (p < 0,019). El día tres (3) el grupo PEIC-NO presentó una salida media de NO_{3} en orina 3,5 veces superior a la correspondiente al grupo control. La salida media de NO_{3} en orina de los días 4-10 (n = 7 días), fue 28,1 \pm 1,2 S.E.M. y 21,0 \pm 0,81 S.E.M. \mumol/día de NO_{3} para los grupos PEIC-NO y control, respectivamente (p < 0,0004).
Sin embargo, al principio de la fase de cicatrización tras la lesión (n = 11 días, días 0-10), la salida media de NO_{3} en orina fue de 17,7 \pm 1,5 S.E.M. frente a 27,4 \pm 1,4 S.E.M. \mumol/día de NO_{3} para los grupos control y NONOato respectivamente, que resultó extremadamente significativo (p < 0,0002). La salida media de NO_{3} en orina en la fase tardía de cicatrización (n = 14 días, días 16-29), fue de 10,2 \pm 0,43 S.E.M. y 12,3 \pm 0,61 S.E.M. \mumol/día de NO_{3} para los grupos control y NONOato respectivamente (p < 0,011).
La salida de NO_{3} en orina descendió progresivamente 11 días después de la lesión para ambos grupos. A pesar de todo, la producción de NO_{3} para el grupo de NONOato fue un 79% superior a la basal entre los días 16-25 (n = 9 días, p < 0,0001), cuando la herida externa estaba cerrada un 93% aproximadamente el día 21.
La Figura 2 muestra los datos de cicatrización de la herida tanto para las ratas control como para las tratadas con PEIC-NO. Basándose en el porcentaje de herida abierta (en relación con el área de lesión inicial), la cicatrización de las heridas del grupo PEIC-NO se mejoró significativamente (p < 0,05) los días 7, 10, y 17 en relación con los controles. La Figura 3 muestra un perfil de presión sanguínea sistólica típico incrementado por la aplicación tópica de PEIC-NO. La presión sistólica descendió a 60 mm de Hg durante 45-50 minutos aproximadamente y entonces comenzó subir a medida que los animales se recuperaban. Aproximadamente 3 horas después del tratamiento, la presión sistólica volvió a niveles normales. Sin embargo, el descenso inicial de la presión sanguínea sistólica se debió principalmente al efecto del anestésico brevital, como se observa por el estrecho paralelismo entre las ratas tratadas con PEIC-NO y las mismas ratas tratadas solamente con el anestésico. Esto indica que el NONOato PEIC-NO tiene un efecto hipotensivo de 
\hbox{corta duración.}
La Figura 4 muestra el perfil de liberación de NO a partir de PEIC-NO polimérico. La muestra de 10 mg de PEIC-NO liberó 685 nmol de NO con un tiempo de semivida de 16 horas, lo que demuestra que el PEIC-NO proporciona una liberación de NO controlada en tampón fisiológico durante un periodo de tiempo prolongado.
Los NONOatos poliméricos usados en los estudios de cicatrización de heridas tienen las siguientes propiedades deseadas: (1) son sólidos estables; (2) son insolubles en agua; (3) producen NO sin activación redox; (4) se comportan bien cinéticamente (liberación de NO de 1^{er} orden); y (5) se puede formular en varias estructuras físicas. Es posible usar en estos estudios de lesiones NONOatos solubles en agua, pero encapsulados en dispositivos poliméricos o liposomas. La preocupación principal es que el NONOato permanezca en el lugar de la herida y no migre para producir potencialmente efectos secundarios sistémicos. El NONOato soluble también se puede fijar a un soporte polimérico mediante interacciones iónicas, por ejemplo, (ya que los NONOatos están formados a partir de poliaminas poli catiónicas) se podrían complejar con resinas polianiónicas.
15
Resina insoluble habitual (polianiónica)
Esta interacción podría retener al donador de NO en el lugar de la herida de manera similar a lo observado para el NONOato polimérico.
Los NONOatos solubles también se podrían encapsular en materiales habituales usados en el vendaje de heridas. Por ejemplo, se podrían mezclar NONOatos sólidos solubles en polímeros de uretano. Estos polímeros se podrían aplicar sobre películas o moldes para producir un vendaje. Todo lo que se necesita para liberar NO sobre una herida es una fuente de H^{+} (mediante la hidratación parcial del uretano) y una vía simple para la migración de NO. Por tanto, es posible atrapar al donador de NO y aún conseguir la liberación localizada de NO.
Aparte de los NONOatos están previstos otros donadores de NO. Por ejemplo se podrían usar compuestos S-nitrosos. Por ejemplo, la S-nitroso-N-acetilpenicilamina (SNAP) libera NO en condiciones biológicas. Este material se podría incorporar en un polímero o encapsularse en un sistema de liberación controlada que permitiría la liberación del NO en el lugar de la herida sin migración que causase efectos sistémicos. Se podrían usar proteínas tales como S-nitrosoalbumen para la administración de NO.
Otros donadores de NO requieren algún tipo de oxidación o reducción biológica antes de que se pueda formar el NO. Compuestos tales como la nitroglicerina (requiere reducción) podrían proporcionar NO sobre la herida si se fijasen a un copolímero o se encapsulasen y se redujeran satisfactoriamente. Otros como la SIN-I (molsidomina) requieren la oxidación con oxígeno para liberar NO. De nuevo se podrían contemplar polímeros de análogos de la molsidomina bajo las condiciones apropiadas, para la administración de NO sobre una herida.
Lo que se ha demostrado es la capacidad para promover la cicatrización de todas las heridas, incluyendo todas las ulceraciones eruptivas de la piel mediante la liberación controlada de complejos poliméricos de NO aplicados tópicamente. Esto se consigue por el hecho de que el NONOato es insoluble en entornos acuosos en contraste con la técnica anterior de complejos NONOato que eran solubles. El beneficio de la incorporación del óxido nítrico en matrices poliméricas es que el tiempo de vida del complejo se incrementa dramáticamente frente a los productos de la técnica anterior, que tienden a descomponerse inmediatamente si no se usan, por ejemplo, no poseyendo tiempo de vida.
Otro beneficio de los vehículos complejos poliméricos es que después del consumo o uso del sustituyente óxido nítrico en el complejo, el polímero que queda es biocompatible, a diferencia de los complejos amina usados por la técnica anterior.
Sin embargo el vehículo complejo polimérico puede incluir adicionalmente otros materiales, tales como vendajes. Actualmente se usan varios tipos de vendajes en el tratamiento de lesiones dérmicas crónicas y agudas. De éstos, los vendajes hidrocoloides (HCD) se usan más frecuentemente en el ámbito clínico. La alta capacidad absortiva característica de estos vendajes junto con el entorno oclusivo y húmedo conduce a una rápida granulación, re-epitelización y cierre de la herida.
Las aplicaciones clínicas para los vendajes HCD incluyen el tratamiento de quemaduras y zonas donantes para quemaduras, úlceras venosas crónicas, úlceras decúbitas, úlceras leprosas, epidermolisis bullosa, esclerodermia, soriasis y heridas gruesas parcialmente no infectadas.
Los vendajes HDC convencionales incorporan una mezcla adhesiva, compuesta normalmente de un poliisobutileno de bajo y alto peso molecular, y absorbentes tales como gelatina, pectina y carboximetil celulosa, sílice y fibras de algodón. Vendajes HCD representativos se describen, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. Nº 3.972.328 (3 de agosto de 1976) de Chen y col., 4.253.460 (3 de marzo de 1981) de Chen y col., y 4.538.603 (3 de septiembre de 1985) de Pawelchak y col.
Actualmente se usan diversos absorbentes en la formulación de vendajes y agentes de relleno para heridas. La característica clave de estos absorbentes para su elección como componentes del vendaje para heridas parece ser su capacidad de tratamiento de los fluidos; la cuestión de la biodegradabilidad no ha sido una preocupación importante. A la vista de esto, no sorprende que estudios histológicos recientes muestren que el uso de ciertos vendajes para heridas produzca una extensa inflamación crónica profunda no resuelta en el tejido cicatrizado externamente. Dicha inflamación se puede reducir potencialmente mediante el uso de componentes para vendajes que se degraden en condiciones fisiológicas a productos no tóxicos y no inflamatorios. En este contexto se debería tener en cuenta que ninguna de las microesferas biodegradables usadas habitualmente en la administración controlada del fármaco (tales como poliactidas o glicoloides) posee ninguna capacidad absortiva o de tratamiento de los fluidos
apreciables.
Los absorbentes útiles incluirían composiciones poliméricas polisacarídicas reticuladas (preferiblemente dextranos) que son dilatables en agua, insolubles en agua, hidrolíticamente lábiles y farmacéuticamente aceptables en forma de gotas o micropartículas. Las micropartículas son esencialmente de forma esférica y por tanto se pueden denominar como microesferas. Cuando el producto está seco es un polvo suelto. Los grupos de reticulación son grupos imidocarbonato lineales, grupos carbonato lineales o sus mezclas. Los productos son insolubles en agua a 25ºC y son degradables a polisacáridos no reticulados solubles en agua en medio acuoso esencialmente neutro a una temperatura de al menos 37ºC. Debido a que los productos son degradables en medio acuoso esencialmente neutro, se pueden caracterizar como hidrolíticamente lábiles (o degradables hidrolíticamente). La labilidad hidrolítica también indica que los productos son biodegradables, por ejemplo, capaces de descomponerse en productos solubles en agua en presencia de fluidos corporales acuosos tales como sangre y linfa a una temperatura corporal normal (37ºC).
Las microesferas se forman por reticulación de un polisacárido no reticulado soluble en agua con un haluro de cianógeno en condiciones alcalinas bajo las cuales se produce la reticulación, en la fase acuosa de una dispersión agua en aceite. El haluro de cianógeno preferido es bromuro de cianógeno. El producto reticulado está formado por cadenas de polisacárido y grupos de reticulación formados por la reacción con el haluro de cianógeno y la base. Los grupos de reticulación se cree que cuando se forman son grupos imidocarbonato lineales que están unidos a diferentes cadenas de polisacáridos (o a partes alejadas de la misma cadena) mediante grupos hidroxilo de las cadenas de polisacárido. Estos grupos imidocarbonato lineales se pueden hidrolizar parcialmente en medio ácido a grupos carbonato lineales durante el procedimiento.
El producto reticulado está esencialmente libre de grupos de reticulación distintos de aquellos introducidos mediante la reacción con el haluro de cianógeno y la base. En particular, el producto reticulado está libre de grupos de reticulación degradables no hidrolíticamente.
El polisacárido de partida es soluble en agua y puede tener un peso molecular de 40.000 aproximadamente a 1.000.000 o más aproximadamente. Preferentemente el polisacárido de partida tiene un peso molecular (medio) de 100.000 aproximadamente a 1.000.000 aproximadamente, más preferentemente de 200.000 aproximadamente a 600.000 aproximadamente. El polisacárido de partida preferido es dextrano.
Las micropartículas son esencialmente de forma esférica y están predominantemente en el intervalo de 1 aproximadamente a 100 micrómetros aproximadamente. Generalmente las micropartículas están predominantemente en el intervalo de 2 aproximadamente a 50 micrómetros aproximadamente de diámetro. Las microesferas del producto final están en forma de polvo suelto.
Es esencial llevar a cabo la reacción de activación en la fase acuosa de una dispersión agua en aceite para obtener micropartículas esféricas en el intervalo de tamaños definido anteriormente. Si se usa agua (sin ninguna fase oleosa) como medio de reacción, inicialmente se forma un gel. Este gel se debe fraccionar (por ejemplo, en una batidora) en presencia de un disolvente deshidratante tal como etanol para obtener un producto útil. El producto final de dicho procesamiento no está en forma de esferas si no que está más bien en forma de agregados irregularmente configurados.
Los productos que están en forma de microesferas, ofrecen varias ventajas sobre los productos en forma de agregados. Primero, el procesamiento y la formulación son más sencillos. Segundo, el producto es más uniforme. Como consecuencia, los productos de esta invención presentan más uniformidad y grados de dilatación, tasas de dilatación y tasas de hidrólisis o degradación en presencia de humedad más predecibles que los de un producto en forma de agregados.
En una forma de esta invención, los NONOatos poliméricos se insertan químicamente en las partículas de dextrano descrito anteriormente, aunque también es posible un atrapamiento químico dependiendo del procedimiento sintético elegido.
Un vendaje para heridas de acuerdo con esta invención puede comprender, por ejemplo, una mezcla de microesferas polisacarídicas reticuladas de esta invención con una matriz de material polimérico adhesivo hidrófobo, cuya mezcla se aplica sobre una cara o superficie de una lámina con reverso impermeable inerte.
A veces, se puede incorporar un material para la matriz en los materiales absorbentes descritos previamente. Éste puede ser un polímero amorfo (que presenta temperatura de transición cristalina pero no punto de fusión) que es hidrófobo, químicamente inerte, farmacéuticamente aceptable, adhesivo, y sólido a temperaturas corporales. Por último, la temperatura de transición cristalina debería ser, al menos, ligeramente superior a la temperatura corporal normal, por ejemplo, no inferior a 45ºC aproximadamente.
Materiales apropiados para la matriz son conocidos en la técnica. El material para la matriz es elástico (por ejemplo, elastomérico) e hidrófobo. Ejemplos de materiales para la matriz adecuados incluyen cauchos de estireno-butadieno poliisobutileno de varias calidades, y caucho de butilo (un copolímero de isobutileno con una pequeña cantidad de isopreno). Un componente de la matriz normalmente es un poliisobutileno de bajo peso molecular (P.M. medio de 10.000 aproximadamente a 50.000 aproximadamente).
La invención se ha descrito con referencia a formas de realización preferidas y alternativas. Obviamente, a otras personas se les ocurrirán modificaciones y alteraciones tras la lectura y el entendimiento de la memoria descriptiva.

Claims (19)

1. Un aducto que cuando se aplica tópicamente sobre la superficie de una herida acelera su cicatrización, comprendiendo el aducto:
(a) un polímero insoluble en agua seleccionado del grupo compuesto por polietilenimin celulosa y poli(etilen diamin-co-1,4-butano-diglicidiléter) y;
(b) óxido nítrico,
en el que el óxido nítrico esta unido químicamente al polímero insoluble en agua mediante un enlace químico disociable con agua.
2. El aducto de la reivindicación 1 en el que el polímero insoluble en agua es biocompatible.
3. El aducto de la reivindicación 2 que además comprende un vendaje absorbente.
4. El aducto de la reivindicación 3 en el que el vendaje se selecciona del grupo compuesto por poliisobutileno de bajo y alto peso molecular, gelatina, pectina, carboximetil celulosa, sílice, fibras de algodón y composiciones poliméricas que son dilatables en agua, insolubles en agua, hidrolíticamente lábiles y polisacáridos reticulados farmacéuticamente aceptables en forma de micropartículas.
5. El aducto de la reivindicación 4 en el que los grupos de reticulación se seleccionan del grupo compuesto por grupos imidocarbonato lineales, grupos carbonato lineales o sus mezclas.
6. El aducto de la reivindicación 5 en el que el polisacárido tiene un peso molecular de 40.000 a 1.000.000.
7. El aducto de la reivindicación 6 en el que el polisacárido tiene un peso molecular de 100.000 a 1.000.000.
8. El aducto de la reivindicación 7 en el que el polisacárido tiene un peso molecular de 200.000 a 600.000.
9. El aducto de la reivindicación 8 en el que el polisacárido es dextrano.
10. El aducto de la reivindicación 3 que además comprende un material para la matriz.
11. El aducto de la reivindicación 10 en el que la matriz es una mezcla de polisacáridos reticulados y un material polimérico adhesivo hidrófobo.
12. El aducto de la reivindicación 11 en el que la matriz es un polímero amorfo, hidrófobo, químicamente inerte, farmacéuticamente aceptable, adhesivo, que es sólido a temperaturas corporales.
13. El aducto de la reivindicación 12 en el que la temperatura de transición cristalina de la matriz no es inferior a 45ºC.
14. El aducto de la reivindicación 13 en el que la matriz se selecciona del grupo compuesto por caucho de estireno-butadieno poliisobutileno, caucho de butilo y poliisobutileno de bajo peso molecular.
15. El aducto de cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso en el tratamiento de heridas de la piel.
16. Uso de un aducto como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 en la preparación de una medicación para el tratamiento tópico de lesiones de la piel.
17. Uso de acuerdo con la reivindicación 16 en el que el aducto es esencialmente no tóxico para el organismo vivo cuando se administra en cantidades terapéuticas.
18. Uso de acuerdo con la reivindicación 16 o con la reivindicación 17 en el que el óxido nítrico se administra en cantidades terapéuticas durante un periodo de tiempo de al menos tres semanas.
19. Uso de acuerdo con la reivindicación 16, 17 ó 18 en el que el aducto tiene un tiempo de semivida de al menos 960 minutos.
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