ES2224367T3 - Procedimiento para determinar la activacion del receptor de citocinas mediante el uso de un anticuerpo. - Google Patents
Procedimiento para determinar la activacion del receptor de citocinas mediante el uso de un anticuerpo.Info
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Abstract
La presente invención se refiere a un procedimiento para determinar la activación del receptor de citoquinas, especialmente del receptor de la hormona de crecimiento (GHR), por medio del uso de un anticuerpo capaz de discriminar entre una conformación activada e inactiva del receptor de citoquinas, especialmente la conformacion de GHR o de la proteína de unión a la hormona de crecimiento (GHBP), comprendiendo el procedimiento: poner en contacto el anticuerpo y el receptor de citoquinas para formar un complejo, poner en contacto un ligando candidato con el complejo, medir la unión del anticuerpo al receptor de citoquinas inactivo y de esta manera discriminar entre una conformación activada y una conformación inactiva. También se refiere a un procedimiento para seleccionar agonistas y antagonistas funcionales de citoquinas, especialmente agonistas funcionales de la hormona de crecimiento (GH), entre ligandos candidatos, por medio del uso de un anticuerpo específico para la conformación del receptor de citoquinas activada. La invención también se refiere a un anticuerpo dirigido a los subdominios I y II que abarcan la bisagra de la región extracelular de la hormona de crecimiento y que es capaz de discriminar entre una conformación del receptor activada e inactiva. La invención también se refiere al uso del anticuerpo, por ejemplo, para la caracterización de interacciones del receptor de la hormona de crecimiento y para la selección de compuestos que estabilizan la dimerización de GHR.
Description
Procedimiento para determinar la activación del
receptor de citocinas mediante el uso de un anticuerpo.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para determinar la activación del receptor de la
hormona de crecimiento humana (hGHR) mediante el uso de un
anticuerpo monoclonal que se une al hGHR o hGHBP, y cuya unión no se
inhibe con la hGH soluble y que está dirigido al epítopo
conformacional situado en los subdominios articulados I y II de la
región extracelular del hGHR y es capaz de discriminar entre un hGHR
activado e inactivo.
El procedimiento comprende las siguientes etapas:
poner en contacto el anticuerpo monoclonal y el hGHR para que formen
un complejo, poner en contacto un ligando candidato con el complejo,
medir la unión del anticuerpo al hGHR y de este modo, discriminar
ente una conformación del hGHR activada y una inactiva.
La hormona de crecimiento humana (hGH)
polipeptídica de 22 kDa, esencial para un crecimiento y desarrollo
normales, induce una variedad de efectos biológicos, incluido el
crecimiento lineal, la lactancia, la retención de nitrógeno, efectos
diabetogénicos y similares a los de la insulina y activación de
macrófagos (1-4). Cada uno de estos efectos se
inicia mediante la interacción de la hGH con receptores celulares
específicos. El receptor de la hGH (hGHR) pertenece a una amplia
familia de receptores de citocinas (5), en la que se incluyen los
receptores de prolactina, eritropoyetina, interleucinas (IL) 2, 4 y
6, factor estimulante de colonias de macrófagos granulocitos
(GM-CSF) (6-10) y factor estimulante
de colonias de granulocitos (G-CSF). La organización
en tres dominios de estos receptores comprende un dominio de unión a
ligando, extracelular y con una abundante
N-glucosilación, un único segmento transmembrana y
un dominio intracelular, este último comparte poca identidad de
secuencia en la familia (11). La región extracelular del hGHR tiene
dos subdominios, uno implicado principalmente en la unión a la hGH
(subdominio I) y el otro en la dimerización del hGHR (subdominio II)
(7, 8).
El dominio extracelular de hGHR se encuentra en
el suero en forma de una proteína de unión a hormonas (hGHBP) que se
une a la hGH con aproximadamente la misma afinidad y especificidad
que el receptor intacto (12). La hGHBP recombinante humana no
glucosilada (13) tiene la misma afinidad de unión (Kd= 0,4 nM) (14)
y especificidad por la hGH que la proteína de unión a mamíferos. En
los estudios de cristalización de hGH y hGHBP muestran que una única
molécula de hGH se une a dos moléculas de hGHBP (15). Cada molécula
de hGH es divalente y contienen dos sitios distintos de unión a la
hGHBP; el sitio I es un sitio de alta afinidad y el sitio II lo es
de baja afinidad. Por el contrario, la hGHBP es monovalente, ya que
usa los mismos aminoácidos para unirse al sitio I o al sitio II de
la hGH. Un exceso de hGH disocia el complejo
hGH-(hGHBP)_{2} para formar un complejo monomérico. El
desencadenamiento de la respuesta biológica requiere la unión
secuencial de la subunidad del primer receptor al sitio I de una
molécula de GH, seguido por la unión del segundo receptor al sitio
II de la GH, formando el complejo GH-(GHR)_{2} (16). Además
de las interacciones hormona-receptor, también hay
un contacto de superficie considerable entre las subunidades del
subdominio II de las regiones extracelulares de las dos moléculas de
receptor. Este modelo de dimerización secuencial se ha confirmado
usando varios enfoques, incluidas cristalización, cromatografía de
exclusión por tamaño, calorimetría y ensayos de inactivación por
fluorescencia (14).
Aunque se conoce poco acerca del mecanismo de
transducción de señal del hGHR, varias líneas de evidencia indican
que la activación del hGHR desencadena la fosforilación de la
tirosina de la JAK2 quinasa (17) y algunos factores de transcripción
STAT, principalmente STAT 2, STAT3 Y STAT5
(18-21).
Los procedimientos previos para determinar si un
ligando candidato es un agonista o un antagonista de un receptor de
la hormona de crecimiento se han basado en la teoría de que se debe
determinar si el ligando forma o no un complejo de uno o dos
receptores de la hormona de crecimiento. Véase el documento WO
92/21029.
Sin embargo, Hardinger y col. en J Biol Chem,
1996, vol. 271 (12) 6708-12 han encontrado que la
hGH y el hGH-G120R nativos forman complejos de
tamaño similar al esperado para la hGH cuando se unen a la proteína
de unión a hGH recombinante. Además concluyen con ``nuestros
resultados indican que el antagonista de la GH
hGH-G120R es capaz de unirse, dimerizar e
internalizar los GHR de forma similar a la de la hGH. Sin embargo,
el complejo dimérico formado con hGH-G120R no es
funcional como en el dímero hGH:GHR. Beattie y col. en Euro. J of
Biochemistry, 1996, V239, N2, 479-486 identifican
anticuerpos frente a un epítopo discontinuo del dominio extracelular
del GHR bovino y la unión específica de tales anticuerpos
policlonales.
Baumgartner y col. en J of Biological Chemistry,
1994, V269, N46 (nov. 18), 29094-29101 describen que
los miembros de la familia de receptores de citocinas tienen una
secuencia consenso WSXWS (motivo WS) en el dominio extracelular y en
sus estudios también describen el uso de anticuerpos monoclonales
específicos de conformación.
El documento US 5599681 describe un procedimiento
para producir anticuerpo y se demuestra un procedimiento para
discriminar entre el GHR fosforilado activo y el GHR no fosforilado
inactivo usando anticuerpos que son capaces de identificar esta
modificación química reversible.
El documento US 5470952 describe un antagonista
de IL-6, capaz de unirse a la IL-6
para formar un complejo no funcional. Lobiet y col. en J. of
Biological Chemistry, 1991, V266, N33, 22645-52
describen el uso de anticuerpos monoclonales frente al dominio
extracelular del receptor con el único propósito de identificar el
mecanismo de GHR internalizado y su presencia en el núcleo celular.
Además se ha propuesto que la GH puede regular la transcripción de
genes específicos bien directa o bien indirectamente a través de la
activación de la quinasa C nuclear.
El documento US 5506107 describe un procedimiento
para determinar si un ligando candidato es antagonista de un ligando
nativo y analiza tres anticuerpos diferentes (tres monoclonales;
AcMo13E1, AcMo 263 y 3D9) con capacidad agonista de GHR.
En el presente documento, presentamos el nuevo
hallazgo de que la medición de un cambio de conformación del
receptor de GH es la medición adecuada para la determinación de si
un ligando es un agonista o un antagonista del receptor de la
hormona de crecimiento.
| EDC/NHS | Clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida/N-hidroxisuccinimida |
| EIA | Inmunoensayo ligado a enzimas |
| SBF | Suero bovino fetal |
| GAM-PO | Anticuerpo inmunoglobulina anti-ratón de cabra |
| G-CSF | Factor estimulador de colonias de granulocitos |
| GM-CSF | Factor estimulador de colonias de granulocitos macrófagos |
| hGH | Hormona de crecimiento humana |
| hGHBP | Proteína de unión a la hormona de crecimiento humana |
| hGHR | Receptor de la hormona de crecimiento humana |
| IL-2, IL-4, IL-6 | Interleucinas 2, 4 y 6 |
| PBS | Suero salino tamponado con fosfato |
| PO | Peroxidasa |
| OPD | Diclorhidrato de o-fenilendiamina |
| RAM | Anti-ratón de conejo |
| sc | Subcutáneo |
| SDS-PAGE | Electroforesis en geles de poliacrilamida con dodecil sulfato sódico |
Hemos desarrollado un panel de anticuerpos
monoclonales (AcMo) específicos del receptor de la hormona de
crecimiento humana, que se usan para la caracterización de señales
desencadenadas por la unión de hGH. En la presente se usó uno de
ellos para caracterizar las interacciones hormona/receptor. Este
anticuerpo, el GHR05, está dirigido contra los subdominios
articulados I y II de la región extracelular del receptor y reconoce
el hGHR de la superficie de la célula que no está en forma de
complejo. Los ensayos de unión indican que el GHR05 tiene una
afinidad mayor por el complejo hGH-hGHR que por el
hGHR solo, lo que indica que el AcMo reconoce mejor una conformación
del receptor inducida tras la unión del ligando. La unión del
anticuerpo al receptor de la superficie celular aumenta tras la
unión del receptor a la hormona de crecimiento, pero no cuando se
une a una forma mutante, hGHG120R, que no desencadena la activación
del receptor. Por tanto, parece que la unión de la hormona de
crecimiento conduce a un cambio conformacional en el epítopo del
receptor reconocido por GHR05 y da lugar a la configuración activa
del dímero, necesaria para la transducción de señal. Por
consiguiente, parece que el anticuerpo activa las células a través
de cambios conformacionales, que son diferentes de los
desencadenados por la GH.
Los ensayos de unión indican una afinidad mayor
del GHR05 por el complejo hGH-hGHR que por el hGHR
solo, lo que indica que el AcMo reconoce mejor una conformación del
receptor inducida tras la unión del ligando.
Usando una línea celular murina dependiente de
hormona de crecimiento en la que se expresan receptores quiméricos
hemos encontrado que el GHR05 se une al receptor en ausencia de hGH
y produce una señal que conduce a la proliferación celular, es decir
a la activación. Por último, el tratamiento de células
IM-9, una línea de células humanas que expresan un
hGHR funcional, con GHR05 conduce a proliferación celular mediada
por la generación de señales específicas para GH, incluyendo la
fosforilación de la JAK2 tirosina quinasa y la activación de
STAT5.
La invención se refiere a un procedimiento para
determinar la activación del receptor de la hormona de crecimiento
humana (hGHR) mediante el uso de la unión de un anticuerpo
monoclonal al hGHR o a la hGHBP y cuya unión no se inhibe por la
acción de hGH soluble, y que está dirigido al epítopo conformacional
situado en los subdominios articulados I y II de la región
extracelular del hGHR y es capaz de discriminar entre un hGHR
activado y uno inactivo.
El procedimiento comprende las siguientes etapas:
poner en contacto el anticuerpo monoclonal y el hGHR para formar un
complejo, poner en contacto un ligando candidato con el complejo,
medir la unión del anticuerpo al hGHR y de este modo discriminar
entre una conformación de GHR activada y una inactiva.
La invención puede usarse para seleccionar un
ligando capaz de activar o inactivar el hGHR, especialmente un
agonista de la hormona de crecimiento humana (hGH) o un antagonista
de la hGH.
Se podría añadir hGH.
La invención se define según las reivindicaciones
adjuntas.
La unión del anticuerpo de se reivindica al GHR o
a la GHBP no se inhibe con GH soluble y el anticuerpo tiene la
capacidad para reconocer el GHR y la GHBP en un ensayo de
inmunotransferencia de tipo western.
El anticuerpo también tiene la capacidad para
reconocer, mediante citometría de flujo, todas las células que
expresan GHR de forma natural o las células que se han sometido a
transfección con un plásmido que contenía el gen que codifica el
GHR. Otra capacidad es la de inmunoprecipitación del complejo
BP-GH-1125.
Mediante esta invención es posible seleccionar
compuestos con propiedades similares al GHR05.
Se desarrolló un AcMo específico del hGHR de
igual isotipo, GHR19, que reconoce el monómero y desencadena la
apoptosis.
Para analizar las consecuencias de la interacción
hGHR/hGH probamos el efecto de GHR05 en células IM-9
que expresan hGHR y en la línea celular Ba/F3 (8/6). Estas últimas
células se generaron a partir de la línea celular Ba/F3
pro-B murina dependiente de IL-3
(22) sometida a transfección con un gen quimérico que contiene el
dominio extracitoplásmico del hGHR y el dominio intracitoplásmico de
hG-CSFR; para su crecimiento in vitro
requieren IL-3 o hGH. Tras su unión al receptor y en
ausencia de hormona o citocinas, el GHR05 desencadena una señal que
conduce a la expresión de bcl-2 y el crecimiento
celular en células Ba/F3 (8/6). Ambos, el GHR05 y la hGH, inducen la
proliferación de las células IM-9 y activan la vía
de JAK/STST. Se ha propuesto un modelo en el que la primera etapa en
la proliferación celular mediada por GH está asociada con un cambio
conformacional en la estructura del receptor de la hormona de
crecimiento.
Figura 1. Características principales del AcMo
GHR05.
Figura 2. Unión de GHR05 a diferentes líneas
celulares que expresan hGHR.
Figura 3. Efecto de la hGH, el hGHG120R o la
permeabilización sobre la unión del AcMo antiGHR a Ba/F3 (8/6).
Figura 4. Efecto de la hGH y el GHR05 sobre la
distribución del ciclo celular de las células Ba/F3 (8/6).
Figura 5. Expresión de los genes implicados en la
supervivencia o muerte celular en las células Ba/F3 (8/6) tratadas
con hGH o GHR05.
Figura 6. Efecto del AcMo GHR05 sobre la
proliferación de las células Ba/F3 (8/6) e IM-9.
Figura 7. Activación de JAK2 y STAT5 sobre las
células IM-9 tratadas con hGH o GHR05.
Proteínas, anticuerpos y líneas celulares.
La GH recombinante humana de 22 K (rhGH-22K,
Genotropin) y la GHBP recombinante humana se obtuvieron de Pharmacia
& Upjohn (Estocolmo, Suecia). El Dr. Gunnar Norstedt amablemente
donó el hGHG120R (Centro de Biotecnología, Karolinska Inst.,
Huddinge, Suecia). Las células IM-9 procedían del
ATCC (Rockville, MD). Las células Ba/F3 (8/6) se generaron mediante
transfección de células Ba/F3 con el constructo quimérico
hGHR/hG-CSFR y se cultivaron en medio RPMI 1640
complementado con IL-3 (10 U/ml) y 10% de suero
bovino fetal (SBF) a 37ºC en CO_{2} al 5%. El AcMo JAK2 antihumano
procedía de Upstate Biotechnology, Inc. (UBI, Lake Placid, NY), los
AcMo STAT5 antihumano, c-myc antimurino y bax
antimurino procedían de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz,
CA), el AcMo bcl-2 antimurino procedía de Oncogene
Science Inc. (Cambridge, MA) y el AcMo p53 antimurino se obtuvo de
Transduction Laboratories (Lexington, KY).
Preparación de anticuerpos monoclonales.
Ratones BALB/c se inmunizaron por vía subcutánea (s.c.) con 10
\mug de GHBP en 0,1 ml de suero salino tamponado con fosfato (PBS)
estéril y adyuvante completo de Freund (Difco, Detroit, MI). Se
inyectó por vía subcutánea los días 30 y 60 con 10 \mug de
proteína en adyuvante incompleto de Freund y por vía intraperitoneal
en PBS el día 90. Los días -3 y -2 antes de la fusión celular se
inoculó a los ratones por vía intravenosa 10 \mug de proteína en
PBS. Se fusionaron células de bazo de ratón y/o de ganglio linfático
con la línea celular de mieloma P3X63-Ag8.653 (CRL
1580, American Type Culture Collection, Rockville, MD) usando
polietilenglicol 4000 (Merck, Darmstadt, Alemania) siguiendo
protocolos estándar (23, 24). Los sobrenadantes se sometieron a
pruebas para detectar anticuerpos usando un inmunoensayo ligado a
enzimas (EIA) y se clonaron hibridomas positivos. Los hibridomas se
cultivaron en medio RPMI 1640, 10% deSBF a 37ºC en CO_{2} al 5%.
Los anticuerpos monoclonales se produjeron en sobrenadantes de
cultivo tisular y líquido ascítico murino (25) y se purificaron
mediante precipitación (NH_{4})_{2}SO_{4} (24). Los
isotipos de los anticuerpos se determinaron mediante EIA usando
antisuero específico de subclase marcado con peroxidasa (PO) (ICN,
Irvine, CA).
Biotinilación de proteínas. La
biotinilación de proteínas se llevó a cabo como se describe (26). Se
incubó GHBP y AcMo (0,5 mg en 0,5 ml de NaCl 150 mM, tampón
carbonato 0,1M, pH 9) con 50 \mul de biotín
N-hidroxisuccinimida a 1 mg/ml en dimetilsulfóxido
(Sigma, San Louis, MO) durante 120 minutos a temperatura ambiente.
Mediante diálisis contra PBS se eliminó la biotina libre. La
proteína marcada con biotina se diluyó a una proporción de 1:22 con
glicerol y se almacenó a -20ºC.
Inmunoensayos ligados a enzimas. Se
llevaron a cabo cuatro inmunoensayos ligados a enzimas (EIA)
distintos que variaban en su mecanismo de presentación del antígeno
al anticuerpo.
1. Ensayo de captación de anticuerpos. La
GHBP marcada con biotina (0,5 \mug/ml en PBS, 100 \mul/pocillo)
se adsorbió a placas de microtitulación recubiertas con avidina (3
\mug/ml) (Maxi-sorb, Nunc, Copenhague, Dinamarca)
durante 90 minutos a 37ºC. Los sitios restantes de unión a proteína
se bloquearon con BSA al 0,5% en PBS. Las placas se lavaron con agua
destilada y el AcMo se incubó durante 60 minutos a 37ºC, seguido por
un anticuerpo inmunoglobulina anti-ratón de cabra
marcado con PO (GAM-PO; Tago, Burlingame, CA) y
diclorhidrato de o-fenilendiamina (OPD, 4 mg/ml en
tampón citrato sódico 0,15M, pH 5,0; Sigma). La reacción se detuvo
con ácido sulfúrico 3N y la densidad óptica se determinó a 492
nm.
2. Ensayo de captación de antígenos. Los
anticuerpos monoclonales se adsorbieron a la fase sólida,
directamente (3 \mug/ml en PBS) o a través de un anticuerpo GAM
purificado por afinidad. Después de bloquear, se incubó GHBP marcada
con biotina (1/1000) en PBS-0,5% de BSA durante 60
minutos a 37ºC, seguido por estreptavidina marcada con PO (Sigma)
durante 30 minutos a 37ºC, y OPD. La reacción se detuvo como
antes.
3. Ensayo de captación de tipo sandwich.
El AcMo purificado (3 \mug/ml en PBS) se adsorbió a placas de
microtitulación. Después de incubar durante la noche a 4ºC y
bloquear con BSA al 0,5%, se añadieron diluciones de GHBP en
PBS-BSA al 0,5% y se incubó durante 60 minutos a
37ºC. Después de lavar se añadió un segundo AcMo marcado con
biotina, seguido por estreptavidina-PO y OPD. La
reacción de detuvo como antes.
4. Ensayo competitivo. La GHBP (1
\mug/ml en PBS) se adsorbió a placas de microtitulación durante la
noche a 4ºC, después se bloqueó con PBS-BSA al 0,5%
durante 60 minutos a 37ºC. Las placas se lavaron y se añadió el AcMo
biotinilado, solo o mezclado con anticuerpos competidores, y se
incubó durante 90 minutos a 37ºC, seguido por
estreptavidina-PO. La reacción se detuvo como antes.
Se supuso la competición por la unión a GHBP cuando se observó una
disminución de la señal de más del 40% en presencia del anticuerpo
añadido en comparación con la que se produjo con GHR05 solo; es
decir, los dos AcMo reconocían epítopos similares o proximales en la
molécula de GHBP.
Determinación de los parámetros cinéticos
usando análisis de la interacción a tiempo real. Para
determinar los parámetros cinéticos de la unión de AcMo a la GHBP y
al complejo hGH-hGHBP se usó BIAcore®, un análisis
de interacción a tiempo real (Pharmacia, Uppsala, Suecia). La matriz
de dextrano carboxilado CM-5 de una placa sensora se
activó con una mezcla de EDC/NHS
(N-etil-N`-(3-dimetilaminopropilo)
carbodiimidaclorhidrato/N-hidroxisuccinimida)
(Pharmacia). A continuación se inmovilizó la cadena ligera de la
inmunoglobulina anti-ratón de conejo (35 \mul a 50
\mul/ml, Pharmacia) solubilizada en tampón acetato 10 mM, a pH
4,5, en la matriz a través de grupos amina primarias en Hepes 10 mM,
NaCl 150 mM, EDTA 3,4 mM, tensioactivo P20 al 0,05%, pH 7,4 (HBS) a
una velocidad de flujo de 5 \mul/min. Los grupos sin reaccionar se
bloquearon con 35 \mul de etanolamina-HCl, pH 8,5.
Las determinaciones se realizaron a 25ºC usando ocho concentraciones
de GHBP (4-500 nM), sola o en complejo con un exceso
molar de hGH 20 veces mayor. Se inyectó GHBP o GH/GHBP en HBS a una
velocidad de flujo constante de 5 \mul/min sobre el AcMo GHR05,
previamente captado por las cadenas ligeras
anti-ratón de conejo inmovilizadas con dextrano.
Después de cada determinación, la superficie se regeneró durante 3
minutos con HCl 30 mM. Las constantes cinéticas de la velocidad (Kon
y Koff) y las aparentes constantes de afinidad en equilibrio (Ka=
Kon/Koff) se determinaron usando el software de evaluación cinética
BIAlogue® (Pharmacia).
Análisis citofluorométrico. Las células
(2 x 10^{5}/100 \mul) se sembraron en placas de 96 pocillos de
fondo en V y se incubaron con 100 \mul de etanol al 70% durante 10
minutos a 4ºC para permeabilizar, o en PBS con BSA al 2% y 2% de SBF
(PBSst). Después de lavar con PBSst, las células se incubaron con 1
\mug/ml de hGH o PBSst durante 30 minutos a 4ºC, se lavaron dos
veces y se incubaron con 100 \mul de sobrenadantes sin diluir
durante 30 minutos a 4ºC. Las células se lavaron dos veces con
PBSst, se añadió GAM marcado con fluoresceína isotiocianato
(GAM-FITC, Southern Biotechnologies, Birmingham, AL)
y se incubaron durante 30 minutos a 4ºC. Las muestras se analizaron
en un citómetro de flujo EPICS XL (Coulter Electronics, Inc.,
Hialeah, FL).
Análisis de inmunoprecipitación,
SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western.
Las células tratadas con hormonas o anticuerpos (2 x 10^{6}) se
lisaron en Tris-HCl 50 mM a pH 7,6, 1% de Nonidet
P40®, NaCl 250 mM, EDTA 0,5 mM, NaF 10 mM, pirofosfato sódico 10mM
con inhibidores de proteasa durante 20 minutos a 4ºC, y se
centrifugaron a 15.000 x g. Los extractos proteicos se separaron
mediante electroforesis en geles de poliacrilamida dodecil sulfato
sódico (SDS-PAGE) al 12,5% y se transfirieron a
membranas de nitrocelulosa. Para los análisis de inmunotransferencia
de tipo Western, las membranas se bloquearon con 5% de leche seca
desgrasada(singrasa) en Tris-HCl 20 mM a pH
7,5, NaCl 150 mM (TBS) y se incubaron durante la noche a 4ºC con
anticuerpo primario en 5% de leche seca
desgrasada-TBS. Las membranas se lavaron con Tween
20® al 0,1% en TBS-leche seca desgrasada y se
incubaron con el segundo anticuerpo marcado con PO. Después de
lavar, se desarrollaron las proteínas usando el sistema ECL
(Amersham, Little Chalfont, RU). Cuando se requirió la recuperación,
las membranas se incubaron con Tris-HCl 62,5 mM a pH
6,8, SDS al 2%, 2-mercaptoetanol 0,1M durante 90
minutos a 60ºC y se lavaron extensamente con TBS antes de volver a
bloquear y de usar la sonda.
La inmunoprecipitación se llevó a cabo como se
describe (27). Brevemente, los extractos proteicos se aclararon
previamente mediante incubación con 20 \mug de IgG
anti-ratón-agarosa (Sigma) durante
60 minutos a 4ºC y centrifugación durante 1 minuto a 15.000 x g. Las
proteínas que contenían fosfotirosina se inmunoprecipitaron con AcMo
antifosfotirosina (5 \mug/muestra) (Transduction Laboratories)
durante 90 minutos a 4ºC, seguido por IgG
anti-ratón-agarosa. Las muestras se
centrifugaron, los precipitados de agarosa se lavaron dos veces en
tampón detergente y tres veces en Tris-HCl 50 mM a
pH 7,6, se resuspendieron en tampón Laemmli y las proteínas se
resolvieron mediante electroforesis.
Ensayo de proliferación celular. Células
Ba/F3 (8/6) (20 x 10^{5}/ml) se lavaron con medio RPMI 1640 basal
sin IL-3. Después se añadieron 25 \mul de la
suspensión celular a placas de 96 pocillos y se trataron con hGH
(0,001 mM-10 mM) o AcMo en un volumen final de 100
\mul durante 18 horas a 37ºC. Las células IM-9
confluentes (1 x 10^{6}/ml) se lavaron en medio RPM 1640 sin suero
y 100 \mul de la suspensión celular se incubaron en placas de 96
pocillos en presencia de hGH o AcMo durante 8 horas a 37ºC. Para
medir la síntesis de ADN, se añadió 1 \muCi/pocillo de
timidina
^{3}[H] (Amersham) (5 Ci/mmol), se incubó durante 6 horas a 37ºC en CO^{2} al 5%. Se recogieron las células, se lavaron en filtros de fibra de vidrio y se cuantificó la captación de timidina [^{3}H] mediante contaje de centelleo líquido.
^{3}[H] (Amersham) (5 Ci/mmol), se incubó durante 6 horas a 37ºC en CO^{2} al 5%. Se recogieron las células, se lavaron en filtros de fibra de vidrio y se cuantificó la captación de timidina [^{3}H] mediante contaje de centelleo líquido.
Análisis del ciclo celular. La etapa del
ciclo celular se valoró mediante el contenido de ADN de la células
usando marcaje con yoduro de propidio y análisis de citometría de
flujo. Brevemente, las células subconfluentes se lavaron tres veces
en medio RPMI-SBF al 10% sin IL-3
(medio basal), se sembraron en placas a 3 x 10^{5} células/pocillo
en placas de 24 pocillos (Nunc®) y se trataron con hGH (10
\mug/ml) o AcMo (1\mug/ml), hasta llegar a un volumen final de 1
ml. Después de una incubación de 24 horas a 37ºC en CO_{2} al 5%,
las células se centrifugaron 10 minutos a 200 x g y se
resuspendieron en 100 \mul de PBS. Las células se permeabilizaron
y se marcó el ADN mediante la adición de 100 \mul de detergente
seguido por una solución de 1,2 ml de yoduro de propidio (reactivos
de Coulter DNA-Prep®). Después de agitar en un
vórtex, las muestras se incubaron a 37ºC durante 30 minutos y se
analizaron en un citómetro EPICS-XL® (Coulter).
Caracterización del anticuerpo anti receptor
de la hormona de crecimiento. Mediante el uso de hGHBP
recombinante derivada de E. coli como inmunógeno, hemos
generado una serie de AcMo, uno de los cuales (GHR05) se caracterizó
más adelante. El GHR05 es una IgM, anticuerpo k específico del
receptor de la hGH, con una Ka de 2,5 ó 6 x 10^{6} M^{-1}según
se ha medido en BIAcore® usando GHBH o complejo GH/GHBP,
respectivamente. El BIAcore® mide las interacciones a tiempo real y,
por tanto, determina la asociación entre GHR05 y GHBP o GH/GHBP sin
que se observen diferencias apreciables (1,7 x 10^{3} y 3,2 x
10^{3} M^{-1} s^{-1}, respectivamente) (figuras 1A, B). Sin
embargo, el GHR05 se disocia menos rápido de la GHBP (2,6 x
10^{-4}s^{-1}) de lo que lo hace del complejo GH/GHBP (1,2 x
10^{-3} s^{-1}). Por tanto, este anticuerpo se une a GHBP y al
complejo con una K_{on} similar, aunque los datos de disociación
indican que el complejo GHR05/GHBP es más estable que el formado por
GHR05/GH/GHBP.
Dado que una característica de los receptores de
citocinas es su fuerte glucosilación y el uso último de GHR05 era el
estudio del GHR, hemos probado su reconocimiento en GHBP derivado de
CHO. En ensayos EIA de captación de antígenos, GHR05 reconoce la
GHBP, esté o no glucosilada (figura 1C). El reconocimiento también
fue evidente en los ensayos EIA de captación de anticuerpos,
transferencia western, inmunoprecipitación e interacciones
específicas a tiempo real usando GHR05 acoplado a una matriz de
dextrano o en fase líquida (no se muestra).
Para determinar la región del hGHR reconocida por
GHR05, se diseñaron tres ensayos diferentes en función de la
capacidad de este AcMo para unirse de forma simultánea o competir
por la unión de GHBP con otros AcMo antiGHR que reconocen epítopos
secuenciales o conformacionales. Estos ensayos incluyen un EIA de
tipo sándwich, un EIA competitivo y un ensayo de adición en
BIAcore®. Los datos proporcionan información acerca de los AcMo que
se unen de forma simultánea a una única molécula de GHBP, los que se
unen a epítopos superpuestos o idénticos y, usando hGH, aquellos con
interacciones que interfieren o que no interfieren con el sitio de
unión al ligando. Con estos ensayos, se determinó que el epítopo
reconocido por GHR05 residía en la zona articulada entre los
subdominios I y II del dominio extracelular del receptor. Este
epítopo no forma parte del sitio de unión a hGH.
Hemos valorado la reactividad de GHR05 con el
hGHR expresado en la superficie de dos líneas celulares diferentes.
Hemos probado la IM-9, una línea de células B
humanas que expresa un hGHR funcional (28) según muestra su
capacidad para responder a hGH intensificando la proliferación
celular (29), la producción de IgG (30) y el influjo de
[Ca^{2+}])i (31). También hemos usado la línea de células B
murinas dependiente de IL-3 Ba/F3 (22) que han
sufrido una transfección con un gen quimérico que contiene el
dominio extracitoplásmico del hGHR y el dominio intracitoplásmico
del receptor del factor estimulador de colonias de granulocitos
humanos (Ba/F3 (8/6). Aunque tanto las células de tipo salvaje como
las que se han sometido a transfección crecen en presencia de
IL-3 exógena, sólo las células sometidas a
transfección proliferan en presencia de hGH (32), GHR05 reconoce
hGHR en ambas líneas celulares, IM-9 y Ba/F3 (8/6),
ya que se observó un desplazamiento significativo de la
fluorescencia (15%) en la citometría de flujo, mientras que no se
observó unión en las células Ba/F3 sin transfeccionar (figura
2).
El anticuerpo GHR05 reconoce un epítopo de
activación en el receptor de la hormona de crecimiento. Parece
que la dimerización del hGHR es esencial para una correcta
transmisión de la señal. Para evaluar la capacidad del GHR05 para
reconocer el complejo dimérico hGH-(hGHR)_{2}, se estudió
la unión de varios AcMo a las células Ba/F3 (8/6) previamente
tratadas con concentraciones de hGH saturantes (0,45 x 10^{-6} M).
La unión de GHR05 al receptor en forma de complejo aumenta, mientras
que la unión de otro AcMo no se ve afectada (AcMo 263) o disminuida
(GHR25) (figuras 3A, B, C). Parece que estos fenómenos no se deben a
la estabilización de la unión de los AcMo al complejo hGH/hGHR, al
menos en términos de afinidad, ya que las mediciones den BIAcore®
muestran que el GHR05 tiene una Ka aparente similar para tanto la
hGHBP como para el complejo hGH/hGHBP (figuras 1A, B).
La unión de GHR05 al hGHR aumenta de forma
espectacular cuando las células se han permeabilizado previamente
(Figura 3E). Este fenómeno es específico de GHR05, ya que este AcMo
se une al 100% de las células tras la permeabilización, que no es el
caso para el AcMo específico para otros dominios del hGHR (figura
3F). Este aumento no se puede atribuir a la internalización del
complejo hGH/hGHR, ya que el experimento se realizó en ausencia de
hGHm ni al patrón de glucosilación del receptor, ya que la
glucosilación no alteró el reconocimiento del GHR05 (figura 1C). Por
tanto, el incremento de la unión puede deberse a una exposición
mejorada del epítopo de unión de GHR05.
Para analizar la posible relación entre el
incremento de la unión de GHR95 y el cambio conformacional del
receptor inducido por hGH, se empleó un mutante de hGH (hGHG120R)
que es capaz de unirse al hGHR pero no de formar el complejo
hGH-(hGHR)_{2}activo. El hGHG120R tiene una mutación
Gly120> Arg que afecta al segundo sitio de unión de la GH, lo que
impide la correcta dimerización del receptor y la posterior
inducción de la proliferación (33). Se ha mostrado que esta molécula
actúa como antagonista del GH tanto in vitro (13, 16, 34)
como in vivo (34). A diferencia de la hGH, la presencia de
hGHG120R no modifica la unión de GHR05 al receptor (figura 3D), lo
que nos ha permitido concluir que GHR05 reconoce mejor un epítopo
que se ve expuesto en el complejo activo del receptor, pero no en el
inactivo.
GHR05 señaliza a través del hGHR e induce la
proliferación celular. Como se ha mostrado anteriormente, el
GHR05 se une a las células que expresan hGHR en ausencia de ligando.
Para estudiar la significación biológica de esta unión hemos
estudiado el estado del ciclo celular en células Ba/F3 (8/6)
dependientes de hGH tratadas con hGH, GHR05 o GHR19, un AcMo
específico de hGHR y de igual isotipo. Después de 24 horas, se
analizó la distribución del ciclo celular mediante citometría de
flujo. Las células tratadas con hGH crecían de forma subconfluente,
mientras que las células tratadas con GHR19 mostraban un incremento
marcado de la subpoblación en la fase sub-G_{1},
indicativo de apoptosis. Sin embargo, cuando las células se trataron
con GHR05, la proporción de apoptosis fue significativamente
inferior a la de las células tratadas con GHR19, mientras que la
proporción de células en proliferación aumentó (figura 4). Esto
indica que la unión de GHR05 induce una señal del tipo de la de
GH.
El efecto de supervivencia celular desencadenado
por GHR05 se caracterizó más adelante mediante el estudio de la
expresión de las proteínas de control de la supervivencia celular
bcl-2 (35), bax, p53, así como de
c-myc, cuya expresión desregulada conduce a ciertas
células a la apoptosis después de que se vena privadas del factor de
crecimiento. El tratamiento con hGH o GHR05 de las células produce
la expresión de bcl-2 mientras se impide la
inducción de bax, p53 y c-myc, que se expresan tras
el tratamiento con oros AcMo antihGHR (figura 5).
Para valorar más el efecto proliferativo inducido
por la unión de GHR05, medimos la incorporación de timidina
[^{3}H] inducida por hGH y GHR05 a las células Ba/F3 (8/6). El
GHR05 induce una proliferación celular significativamente mayor
(25%) que un AcMo control (8%, equivalente a la anterior) (figura
6A). El máximo nivel de incorporación de timidina [^{3}H] inducido
por GHR05 es equivalente al estimulado por hGH 4 pM. Por tanto, la
unión de GHR05 al GHR estimula señales específicas responsables de
la inducción del crecimiento celular. Dado que el epítopo reconocido
por GHR05 se modifica cuando la hGH se une al receptor, hemos
probado si la unión del anticuerpo en presencia de hGH tiene un
efecto sinérgico o aditivo sobre la proliferación celular. No se
observaron diferencias en la proliferación cuando las células se
incubaron de forma simultánea con GHR05 y hGH (datos no
mostrados).
Dado que las células Ba/F3 (8/6) son células
respondedoras a GH que se han generado de forma artificial, los
resultados se validaron usando la línea celular humana
IM-9, que expresa el hGHR de longitud total. Tanto
GHR05 como hGH estimulan la proliferación de células
IM-9 (figura 6B). Para verificar la especificidad de
la señalización de GHR05, las células IM-9 se
trataron con hGH y GHR05 y se determinó el estado de fosforilación
de la tirosina de JKA2 y STAT5. En ambos tratamientos se observó el
mismo patrón de expresión de JAK2 y STAT5, lo que indica un
comportamiento agonista de GHR05 (figura 7). Por tanto, hemos
concluido que GHR05 desencadena la activación y proliferación
celular de tipo GH tras la unión a hGHR.
Usando rhGHBP derivada de E. coli como
inmunógeno, hemos obtenido el AcMo específico de hGHR GHR05. La
caracterización exacta de su reactividad mediante el uso de la
región extracelular soluble del receptor (GHBP) y la unión
competitiva con otros AcMo antiGHR permite establecer el mapa del
epítopo reconocido por este AcMo en la región articulada entre los
subdominios de GHR I (dominio de unión) y II (dominio de
dimerización). Este epítopo no está relacionado con las secuencias
implicadas en la unión de GH al receptor (15). Estos datos se
correlacionan bien con el hecho de que este AcMo reconoce tanto GHBP
como GHR formando complejo con GH. Sin embargo, se han puesto de
manifiesto algunas diferencias interesantes cuando se compara el
comportamiento del AcMo con GH/GHBP o con los complejos GH/GHR.
La unión de GHR05 al hGHR de la membrana celular
aumenta tras la activación de hGH, según se ha determinado mediante
análisis de citometría de flujo con células que expresan el hGHR
nativo o una forma hGHR7hG-CSFR quimérica. Su
afinidad por la forma soluble del receptor, GHBP, es similar al la
que tiene por el complejo GH/GHBP, lo que indica que el epítopo
reconocido por GHR05 no se altera por la unión de GH en condiciones
saturantes. Cuando se analizan las constantes de asociación y de
disociación, la unión de GHR05 al complejo GH/GHBP parece menos
estable que su unión a la GHBP sola. En cada uno de estos ensayos
las características son diferentes, ya que el flujo continuo en el
BIAcore® permite la medición de la asociación y la disociación a una
única molécula de GHBP, mientras que la medición de la unión a
células intactas en la citometría de flujo permite el equilibrio con
varias moléculas de GHR. Sin embargo, los datos sugieren que la
conformación del dominio extracelular de GHR varía considerablemente
en función de si está en fase líquida (GHBP) o unido a la membrana
(hGHR nativo o hGHR/hG-CSFR quimérico). Por
consiguiente, los modelos que usan GHBP para caracterizar las
interacciones GH/GHR deben interpretarse con precaución.
Para determinar si estos cambios conformacionales
del receptor inducidos por la unión de GH están relacionados con la
señalización, estudiamos si hGHG120R induce o no cambios similares.
Dado que este mutante carece de sitio de unión 2 para hGH, no puede
inducir la dimerización funcional del receptor y, por tanto, actúa
como antagonista de hGH (13, 16, 34). Como también se ha descrito
para células FDC-P1 sometidas a transfección con un
híbrido del dominio extracelular de hGHR unido a los dominios
intracelular y transmembrana del GM-CSFR murino
(16), no puede inducir la proliferación de las células Ba/F3 (8/6) o
IM-9 (34, 36). Esto se atribuyó en un principio a la
ausencia de la formación del complejo hGH-(hGHR)_{2}
"activo", pero datos recientes muestran que hGHG120R dimeriza e
internaliza el GHR como lo hace la GH (37). La unión de GHR05 no
aumenta en las células Ba/F3 (8/6) incubadas con hGHG120R, al
contrario de su comportamiento con hGH nativa. Por tanto, la mayor
cantidad de unión de este AcMo se debe a la exposición del epítopo
del receptor tras la dimerización con hGH y GHR05 sí reconoce una
conformación activa de GHR necesaria para la transducción de señal)
en respuesta a la hormona de crecimiento. Por tanto, la conformación
de hGHR difiere dependiendo de si está en forma de complejo con hGH
o con hGHG120R, y su alteración es suficiente como para justificar
las diferencias de señalización observadas entre estos dos ligandos.
Se ha probado que GHR05 es un instrumento extremadamente útil para
la discriminación y caracterización de la forma activada del
receptor.
Dado que GHR05 reconoce la conformación activa de
hGHR y el epítopo reconocido es sensible a la conformación e
importante para la transducción de la señal, hemos probado si GHR05
actúa sobre la señalización a través del receptor en ausencia de
hGH. Hemos usado una línea celular dependiente de hGH sometida a
transfección que prolifera en presencia de hGH o cuando se trata con
GHR05. La proporción de proliferación inducida por GHR05 se
correlaciona con la proporción de células que expresan el epítopo
activo reconocido por el anticuerpo. La unión de hGH y GHR05 con el
hGHR se correlaciona con la expresión de genes que controlan la
supervivencia celular y el ciclo celular, ya que ambos tratamientos
inducen señales que conducen a la expresión de
bcl-2, una proteína implicada en el rescate de la
apoptosis. Además, bax, p53 y c-myc, expresados
durante la apoptosis, se detectan cuando las células se tratar con
el AcMo irrelevante, pero no en presencia de hGH o GHR05. Por tanto,
el crecimiento celular estimulado por GHR05 es un proceso específico
desencadenado por la unión específica de este AcMo a la zona
articulada entre los dominios I y II del hGHR, que no es el caso del
AcMo que se une a otros epítopos de
hGHR.
hGHR.
Aunque son dependientes de hGH, las células Ba/F3
(8/6) expresan un receptor de hGH quimérico cuyo dominio
intracelular corresponde al del receptor de hG-CSF.
GHR05 también induce crecimiento cuando se usan células que expresan
el hGHR de longitud total, tal como células IM-9. El
crecimiento de las células IM-9 es independiente de
hGH, aunque responde a hGH mediante fosforilación de la tirosina de
JAK2 (36), producción de inmunoglobulina y proliferación en ciertas
condiciones experimentales (30). GHR05 también genera señales
específicas para GH en las células IM-9, ya que
simula la activación inducida por hGH de la vía de JAK/STAT.
Nuestros resultados son compatibles con un modelo
en el que el hGHR se transporta a la membrana como una única cadena
que, tras su expresión en la superficie de la célula, se agrega o
asocia con otras proteínas. En tal complejo se dificulta el
reconocimiento de GHR05 de la secuencia de aminoácidos de la región
articulada entre los dominios I y II. Después de la unión a hGH, el
hGHR sufre una transición a una etapa activa; esta etapa se
distingue por una conformación modificada que el anticuerpo
reconoce. Esta conformación activa desencadena una vía de
transducción que implica la fosforilación de motivos de tirosina
específicos en el dominio citoplásmico de hGHR, así como la
inducción de factores de transcripción específicos que conducen a la
proliferación celular. En cada célula, una fracción de células o una
fracción del hGHR está en la conformación activa y. Por tanto,
sujeta al reconocimiento por el anticuerpo. Estos cambios
diferenciales de conformación o de la accesibilidad del dominio
pueden ser importantes en el reconocimiento físico y la asociación
del dominio intracitoplásmico del hGHR con las JAK tirosina quinasas
o en su interacción con los STAT adecuados. La caracterización de
este estado "activo" podría así ser importante para una
comprensión más clara de las vías de señalización desencadenadas por
la hormona de
crecimiento.
crecimiento.
Figura
1
A, Superposición de seis sensorigramas que
muestran la unión de hGHBP por GHR05. Las concentraciones de hGHBP
(que varían de 4-500 nM) en un volumen de 30 \mul
se pasaron secuencialmente sobre la célula de flujo y en el
sensorigrama la asociación se controló como unidades de resonancia
(UR). Después de la inyección de hGHBP, se continuó con el flujo del
tampón y se midió la disociación. El histograma representa en tiempo
del ensayo en segundos (eje x) frente a la respuesta relativa en UR
(eje y). Las flechas indican la inyección del AcMo GHR05 (1), hGHBP
(2) y tampón (3). Sustituyendo el complejo hGH/hGHBP por hGHBP se
obtuvo una figura similar. B, valores de la concentración de hGHBP o
del complejo hGH-hGHBP (eje x) frente al valor de
la constante de disociación (ks) para cada condición (eje y). La
pendiente de regresión corresponde a la constante de disociación
verdadera; se llevó a cabo un cálculo similar para la constante de
disociación. C, reconocimiento de hGHBP glucosilado o no glucosilado
por parte de GHR05 en un EIA de tipo sándwich usando AcMo 263 como
anticuerpo de captación. El gráfico representa la fuente de hGHBP
(eje x) frente a la DO_{\text{492 nm}}obtenida por GHR05 como un
porcentaje de la señal máxima (eje y). Los datos representan las
medias de determinaciones por triplicado, con la DE indicada.
Figura
2
Se marcaron células Ba/F3, Ba/F3 (8/6) e
IM-9 en crecimiento exponencial con GHR05. Los
histogramas muestran el marcaje con GHR05 (eje x, línea continua)
frente al número de células (eje y), en comparación con un AcMo
irrelevante de igual isotipo (línea discontinua).
Figura
3
Las células Ba/F3 (8/6) en crecimiento
exponencial se marcaron con GHR05 (A, D y E), GHR25 (B y F) o AcMo
263 ©. Las gráficas superiores muestran el efecto de la incubación
previa con hGH (10 \mug/ml) (- - - - -)
sobre la unión del AcMo (A, B y C). La gráfica D muestra el efecto
de la incubación previa con hGHG120R (- - - - ) o hGH
(- - - - - - -) sobre la unión
de GHR05. Las gráficas E y F muestran el efecto de la
permeabilización con etanol
(- - - - - - - -) sobre la
unión del AcMo antiGHR en comparación con la de las células intactas
(______). Los histogramas muestran el marcaje con AcMo antiGHR (eje
x) frente al número de células (eje y). En cada gráfica, las líneas
discontinuas representan el marcaje de un AcMo irrelevante de igual
isotipo.
Figura
4
Las células Ba/F3 (8/6) se expusieron a los
estímulos indicados durante 24 horas en medio basal sin hGH o
IL-3 y se determinó la distribución del ciclo
celular mediante marcaje con yoduro de propidio y citofluorometría
de flujo. Se cultivaron células quiescentes en condiciones de
crecimiento exponencial en 10 \mug/ml de hGH, 1 \mug/ml de GHR05
o 1 \mug/ml del AcMo control de igual isotipo GHR19. Los
histogramas muestran el contenido relativo en ADN (eje x) frente al
número de células (eje y). Los recuadros indican el porcentaje de
células que se encuentra en cada fase del ciclo celular.
Figura
5
Células Ba/F3/8/6) privadas de citocinas se
incubaron durante 20 horas a 37ºC con hGH (10 \mug/ml, carril 1),
GHR05 (1 \mug/ml, carril 2) o GHR19 (AcMo control de igual
isotipo, 1 \mug/ml, carril 3). La figura muestra los lisados
totales de 10 x 10^{6} sometidas a electroforesis, transferidas y
sometidas a inmunotransferencia con A, AcMo bcl-2
anti-ratón, B, AcMo p53 anti-ratón,
C, AcMo c-myc anti-ratón y D, AcMo
bax anti-ratón.
Figura
6
La proliferación de células Ba/F3 (8/6) en
presencia de hGH (500 nM) o GHR05 (1 \mug/ml) se determinación
mediante la incorporación de timidina [^{3}H] en el ADN. Las
células cultivadas en ausencia de citocinas se incubaron durante 20
horas a 37ºC en placas de 96 pocillos de fondo plano con hG11, GHR05
o GHR25 como control. La timidina [^{3}H] se añadió durante 6
horas y las células se recogieron en filtros de fibra de vidrio.
Gráfica inferior, la proliferación de células IM-9
en presencia de hGH (500 nM) o GHR05 (100 ng/ml) se determinó
después de 8 horas a 37ºC mediante la incorporación de timidina
[^{3}H] como antes. Se presentan los resultados de los tres
experimentos realizados por cuadriplicado y se indican las DE. Los
histogramas muestran el tratamiento de las células (eje x) frente a
la incorporación de timidina [^{3}H] en cpm (eje y).
Figura
7
Durante 5 minutos a 37ºC se incubaron células
IM-9 privadas de suero con hGH (500 nM, gráfica
superior) o GHR05 (100 ng(ml, gráfica inferior). La figura
muestra los inmunoprecipitados de fosfotirosina de 10 x 10^{6}
células (+, células tratadas durante 5 minutos; - células sin
tratar), inmunotransferencia con AcMo JAK2 antihumano (izquierda) o
AcMo STAT5 (derecha).
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Claims (5)
1. Procedimiento para determinar la activación
del receptor de la hormona de crecimiento humana (hGHR), mediante el
uso de un anticuerpo monoclonal que se une al hGHR o a la hGHBP y
cuya unión no se inhibe con la hGH soluble, y que está dirigido al
epítopo conformacional situado en los subdominios articulados I y II
de la región extracelular del hGHR y es capaz de discriminar entre
un hGHR activado e inactivo, comprendiendo el procedimiento las
siguientes etapas: poner en contacto el anticuerpo monoclonal y el
hGHR para que formen un complejo, poner en contacto un ligando
candidato con el complejo, medir la unión del anticuerpo al hGHR y
de este modo discriminar entre una conformación del hGHR activada y
una inactiva.
2. Procedimiento según la reivindicación 1 en el
que la región extracelular del hGHR es la proteína de unión a la
hormona de crecimiento humano (hGHBP).
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2
para seleccionar un ligando capaz de la activación o la inactivación
del hGHR.
4. Procedimiento según la reivindicación 3 para
seleccionar un agonista de la hormona de crecimiento humana (hGH) o
un antagonista de hGH.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1-4, en el que se añade hGH.
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