ES2224616T3 - Alergeno principal recombinado del polen de artemisa vulgaris (artemisa). - Google Patents

Alergeno principal recombinado del polen de artemisa vulgaris (artemisa).

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ES2224616T3
ES2224616T3 ES99911505T ES99911505T ES2224616T3 ES 2224616 T3 ES2224616 T3 ES 2224616T3 ES 99911505 T ES99911505 T ES 99911505T ES 99911505 T ES99911505 T ES 99911505T ES 2224616 T3 ES2224616 T3 ES 2224616T3
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Christof Ebner
Dietrich Kraft
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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Abstract

La presente invención se refiere a moléculas de ADN recombinante que codifican el alérgeno Art v 1a y a un procedimiento para la obtención de una molécula Art v 1a, así como a un vector y una célula huésped transformada. Un objetivo de la presente invención consiste en crear una molécula de ADN recombinante que codifica para el alérgeno del polen de artemisa. Según la presente invención, dicho objetivo se alcanza creando una molécula de ADN recombinante que codifica para el alérgeno de Art v 1a, presentando dicho alérgeno la secuencia indicada en SEC ID nº 2.

Description

Alérgeno principal recombinado del polen de Artemisa vulgaris (Artemisa).
La presente invención se refiere a moléculas de ADN recombinante que codifican el alérgeno Art v 1a y a un procedimiento para la obtención de una molécula Art v 1a, así como a un vector y una célula huésped transformada.
El polen de artemisa es uno de los causantes principales de las alergias que se producen a finales del verano en Europa (1,2). Considerando la población total de pacientes que padecen de alergias al polen, aproximadamente el 10-14% de las afecciones de alergia se deben al polen de artemisa (2,3). Inmunoblots efectuados con toda la proteína contenida en el extracto de polen de artemisa demuestran que las inmunoglobulinas IgE de los pacientes reconocen un alérgeno principal cuyo peso molecular es de 27-29 kDa, denominándose por tanto dicho alérgeno como Art v 1a. Más del 95% de los pacientes alérgicos al polen de artemisa reconocen el Art v 1a en los inmunoblots realizados para determinar la fijación de IgE. Estos inmunoblots se denominarán en lo que sigue "blots de paciente". Algunas otras proteínas del polen de artemisa migran también en la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS presentando un peso molar aparente de 27-29 kDA. Por eso resultó tan difícil aislar un clon de ADNc y demostrar que codifica para el Art v 1a.
Un objetivo de la presente invención consiste en crear una molécula de ADN recombinante que codifica para el alérgeno del polen de artemisa.
Según la presente invención, dicho objetivo se alcanza creando una molécula de ADN recombinante que codifica para el alérgeno de Art v 1a, presentando dicho alérgeno la secuencia indicada en SEC ID nº 2. Se ha hallado así el alérgeno principal de la Artemisia vulgaris, haciéndose por tanto asequible su diagnóstico o terapia. Estas moléculas de ADN se caracterizan por presentar una secuencia de nucleótidos según SEC ID nº1. No obstante, estas moléculas pueden derivarse también a través de una degeneración del código genético en la secuencia de aminoácidos según SEC ID nº 2. La secuencia de las moléculas según la presente invención coincide preferentemente en más del 60% con la de SEC ID nº 1. Además, la molécula de ADN recombinante según la presente invención puede codificar para las secuencias de aminoácidos de las isoformas de Art v 1b y Art v 1c indicadas en la SEC ID nº 4 y la SEC ID nº 6. Estas moléculas de ADN recombinante pueden presentar también las secuencias de nucleótidos de la SEC ID nº 3 y la SEC ID nº 5. Las moléculas de ADN recombinante según la presente invención pueden hibridizar con la secuencia indicada en la SEC ID nº 1 y permanecer unidas por hibridación bajo condiciones de lavado rigurosas.
Lo mismo puede decirse para las secuencias indicadas en la SEC ID nº 3 y la SEC ID nº 5. Como condición de hibridación rigurosa puede considerarse p.ej., 1 M de NaCl en H_{2}O a 60ºC y una condición de lavado rigurosa puede consistir, p.ej., en lavar 2 veces durante 30 min y a 50ºC en 5x SSPE y 0,1% SDS (1x SSPE consiste en 0,18 M de NaCl, 0,01 M de fosfato de sodio con pH 7,4 y 1mM de EDTA).
Un procedimiento según la presente invención para obtener un alérgeno Art v 1 se caracteriza porque comprende las siguientes etapas:
a)
cultivo de células huésped procarióticas o eucarióticas que comprenden ADN (SEC ID nº 1) que codifica para el Art v1 o ADN que coincide en un 60% con dicha secuencia, pudiéndose por tanto expresar el alérgeno Art v1 mediante las células huésped
b)
aislamiento del alérgeno Art v1.
Este alérgeno biotecnológico puede glicosilarse. Para el procedimiento correspondiente puede preverse un vector de expresión procariótico o eucariótico susceptible de multiplicación que comprende moléculas de ADN como las mencionadas en la etapa a) del procedimiento. Dicho vector de expresión está contenido en las células huésped mencionadas anteriormente que consisten preferentemente en escherichia coli o pichia pastoris.
Se expone por tanto el aislamiento de un clon auténtico y completo de ADNc que codifica para el Art v 1a (Fig. 1), o sea, para el alérgeno principal del polen de artemisa. La letra a en Art v 1a hace referencia a la isoforma a. Se aislaron también otros dos clones que codifican para isoformas auténticas y completas Art v1 denominadas Art v 1b y Art v 1c. Las secuencias de estas dos últimas isoformas se han ilustrado en las Fig. 2 y Fig. 3. Los clones son completos en el extremo 5', pudiéndose deducir por tanto que contienen un codón de iniciación AUG en un contexto típicamente eucariótico. Los clones son asimismo completos en el extremo 3', pues contienen, tras el codón de terminación 177-200, nucleótidos seguidos de una secuencia poliA. Las figuras presentadas no ilustran las secuencias de clones ubicadas fuera de los marcos de lectura abiertos. En las figuras 4 y 5 pueden apreciarse alignments (o alineaciones) de las secuencias de nucleótidos y secuencias deducidas de aminoácidos Art v1a, b y c. Estas comparaciones indican que el Art v 1 consiste en una mezcla de distintas isoformas que se diferencian entre sí por variaciones relativamente importantes en las secuencias de nucleótidos así como en las secuencias de aminoácidos. Estas variaciones en las secuencias son mayores en las partes no trasladadas de las secuencias de ADNc que dentro de los márgenes de lectura abiertos (datos sin ilustrar). Las isoformas de Art v 1 se codifican muy probablemente a partir de una familia de genes. No se trata sin embargo de una familia específica para la especie o variedad Artemisia vulgaris, ya que se encontró también una secuencia homóloga de ADNc en el girasol (4). Esta proteína de girasol (SF18) se sintetiza en las células epidérmicas de las arterias y es posible que presente una función específica relacionada con el polen. Presenta similitudes con la familia de las gamma purotioninas.
Ejemplo
El aislamiento del clon, que codifica para el Art v 1a, se realizó de la forma siguiente:
Se creó un banco de expresión de ADNc en fagos de lambda ZAP II (Stratagene, La Jolla, California; catálogo nº 237612). El material de partida era ARNm de polen de artemisa aislado. Este banco de ADNc se sometió a un "screening" con una mezcla de suero de 20 pacientes que reconoce el Art v 1 en biots de paciente. El clon que reaccionaba positivamente se sometió a análisis ulteriores a fin de obtener finalmente placas 100% inmunopositivas. La inmunoreactividad de este clon era bastante débil, pero claramente positiva. La demostración de que el clon codifica para el Art v 1 se realizó de la forma siguiente:
El alérgeno principal de Art v 1 se extrajo del polen de artemisa considerando condiciones muy benignas, es decir, a temperatura ambiente y realizando la extracción con agua durante 15-30 min bajo agitación moderada. Se prosiguió con la separación del extracto realizando una electroforesis preparativa en gel y se analizaron las fracciones así obtenidas mediante inmunoblots. La Fig. 6a ilustra tres fracciones (F1, F2 y F3) que estaban libres de impurezas proteínicas tras someterlas a una coloración con Coomassie Brilliant Blue y que presentaban bandas de proteínas con pesos moleculares aparentes entre 22 y 29 kDa. Se detectó también ocasionalmente una banda de dímeros con 50 kDa. La Fig. 6b ilustra los biots de paciente correspondientes a estas fracciones. Resulta evidente que la fracción de peso molecular más elevado une los sueros de los 3 pacientes aquí estudiados, mientras que la fracción de peso molecular más bajo es apenas reconocida por el suero de dichos pacientes. La Fig. 6c ilustra los mismos blots de proteína tras una coloración mediante el kit de etiquetado de Boehringer Mannheim denominado "glycoprotein detection kit" (kit de etiquetado doble DIG glucano/proteína; nº de catálogo 1500783). Resulta evidente que las tres fracciones consisten en glucoproteínas. Se caracterizaron estas tres fracciones por degradación de Edman, evidenciándose la presencia de secuencias idénticas de terminal N. Estas secuencias han sido subrayadas en las figuras 1-3. El análisis numérico según Nielsen et al. (5) de la secuencia deducida de proteínas de Fig. 1 predice que el Art v 1 contiene una secuencia de señal de terminal N característica que es hidrófoba y que implica el "targeting" en el retículo endoplasmático y en el aparato de Golgi. La secuencia que sigue al inicio de la secuencia madura de proteínas predicha con el análisis numérico es idéntica a la secuencia de terminal N que se encuentra en la proteína natural (subrayada en las figuras 1-3). Matthiesen et al. (6) encontraron una secuencia parcial de terminal N muy similar. Se puede deducir por tanto que el Art v 1 es una glucoproteína segregada cuyo terminal N se forma a través del desprendimiento de una secuencia de señal ER característica. La proteína natural es heterogénea debido a variaciones en el grado de glicosilación, siendo la forma completamente glicosilada (F3 en Fig. 6) la que une mejor la inmunoglobulina IgE.
El primer clon de ADNc Art v 1 aislado de esta forma se marcó con fósforo 32 y se utilizó como muestra de hibridación. Se examinó sistemáticamente el banco de clones de ADNc mencionado anteriormente utilizando esta muestra de hibridación y se encontraron otros dos clones que eran del Art v 1b y v 1c. Estos clones se sometieron seguidamente a un análisis de secuenciación de ADN. Las secuencias pueden apreciarse en las figuras 2 y 3.
Se utilizó E. Coli para expresar la forma madura (corta) de Art v 1a como proteína recombinada sin fusión. Se clonificó para ello la parte correspondiente del ADNc en el sistema de expresión pMW172. Es un hecho bien conocido que las proteínas recombinadas y expresadas en E. Coli no presentan ninguna modificación possintética, exceptuando la posible disociación de la metionina de terminal N. Dichas proteínas recombinadas no contienen ninguna molécula de azúcar. La construcción de la plasmida de expresión puede verse en la Fig. 7. La proteína recombinada Art v 1 se enriqueció en la fracción soluble de proteínas de E. Coli. La Fig. 8 ilustra blots de paciente de la fracción soluble correspondientes a 15 pacientes. El peso molecular aparente de la proteína natural es de aprox. 27 kDa (Fig. 8 polen de artemisa) mientras que el peso molecular aparente de la proteína recombinada asciende sólo a 18 kDa debido a la ausencia de azúcar. Dado que el peso molecular teórico sería de 10,8 kDa, se deduce que la proteína recombinada presenta una movilidad electroforética muy inusual en la electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS. En la Fig. 8 (Art v 1a) puede apreciarse claramente en el blot de paciente que 10 de 15 pacientes reconocen la proteína no glicosilada. No obstante, también hay pacientes que no reconocen esta forma de proteína. Un hecho sorprendente es que los pacientes 3, 4 y 10 reconocen mejor la forma no glicosilada que la forma natural glicosilada. Las muestras de control en la Fig. 8 indican que la proteína de E. Coli no es reconocida o casi no es reconocida por los pacientes o anticuerpos secundarios. Estas bandas muy débiles se distinguen por igual en los tres blots de paciente ilustrados en la Fig. 8.
Con el fin de explicar los resultados experimentales expuestos en el primer párrafo, se formula la siguiente hipótesis: es posible que los componentes de azúcar Art v1 sean necesarios para que la columna vertebral de la proteína adquiera la configuración natural y la IgE de algunos pacientes pueda unirse a los epítopos así formados. Existen en cambio algunos otros epítopos que los sueros de paciente pueden reconocer fácilmente en ausencia de azúcar. Una explicación alternativa pero menos verosímil para estas observaciones es que los sueros de los pacientes que no reconocen la forma sin glicosilar están de hecho directamente dirigidos contra epítopos formados por moléculas de azúcar.
Caracterización preliminar del componente de azúcar que se encuentra en el alérgeno principal natural Art v. 1 de Artemisia vulgaris.
El alérgeno principal natural de Artemisia vulgaris se purificó para su homogeneización mediante:
1. Cromatografía de intercambio aniónico en Q-sefarosa (Pharmacia, Uppsala, Suecia) y pH = 5,2
2. Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) por infiltración gelatinosa con gel TSK G2000SW (Tosohaas. Stuttgart, Alemania).
El material era homogéneo por lo que respecta a la secuencia de proteínas de terminal N y a la composición de aminoácidos, pero era heterogéneo en lo que se refiere al peso molecular debido a variaciones en la glicosilación. El peso molecular se determinó mediante un espectrómetro de masas MALDI-TOF. Se obtuvieron con él dos picos anchos, siendo las masas moleculares medias de 13,5 kD y 15,5 kD. El peso molecular aparente obtenido mediante SDS-PAGE era sin embargo de 24-28 kD, indicando estos resultados una estructura muy poco corriente de la proteína o una estructura poco común del componente glucósido. El análisis preliminar por hidrólisis o mediante HPLC del azúcar unido por enlace covalente a la proteína indicó que no se produjo ninguna glicosilación N y muy probablemente tampoco ninguna glicosilación O, sino probablemente una glicosilación de la hidroxiprolina ya descrita anteriormente en estudios relacionados con glucoproteínas de origen vegetal. La proteína Art v 1 muy rica en prolina (20% de prolina) se modificó possintéticamente por lo que la proteína madura contiene prolina e hidroxiprolina en la proporción de 4:6. Estudios extensos efectuados con cinco lectinas distintas (aglutinina de Galanthus nivalis, aglutinina de Sambucus nigra, aglutinina de Maackia amurensis, aglutinina de cacahuete y aglutinina de Datura stramonium), que son específicas de estructuras de azúcar bien conocidas asociadas a la glicosilación N y glicosilación O, demostraron que el Art v 1 no incluye estas estructuras de azúcar. El papel que desempeña esta estructura inusual de proteína y la estructura del componente glucósido en la formación del epítopo de célula B de este alérgeno es un aspecto que se está investigado detenidamente en la actualidad. La Fig. 8 presenta una primera impresión de esta investigación, pudiéndose considerar según ella que los componentes glucósidos juegan en estos alérgenos un papel importante en la fijación de la IgE.
Bibliografía
1. Charpin J., Surinyach R. y Frankland A.W. (1974) Atlas of European Allergenic pollens. Sandoz, Paris.
2. Spieksma F.T.M., Charpin H., Nolard N. y Stix E. (1980) Clin. Allergy 10: 319-329.
3. Cornillon J., Bernard J-P., Gueho E. y Touraine R. (1972) Rev. Franc. Allergol. 12: 131-135.
4. Domon C., Evrard J.L., Herdenberger F., Pillay D.T.N. y Steinmetz A. (1990) Plant. Mol. Biol. 15: 643-646.
5. Nielsen H., Engelbrecht J., Brunak S. y von Heijne G. (1997) Prot. Eng. 10: 1-6.
6. Martthiesen E., Ipsen H. y Lowenstein H. (1991) en: Allergenic pollen and pollinosis in Europe, págs. 36-44; D'Amato G., Spieksma F.T.M. y Bonini S. eds., Blackwell Scientific Publications, Cambridge.
(iii) NÚMERO DE SECUENCIAS: 6
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS RELATIVOS A SEC. ID nº: 1
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 399 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: secuencia de nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE HEBRA: bicatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Artemisia vulgaris 
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
FASE DE DESARROLLO: polen
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 1:
\vskip1.000000\baselineskip
1 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS RELATIVOS A SEC. ID nº: 2
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 132 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Artemisia vulgaris 
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
FASE DE DESARROLLO: polen
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 2:
2 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS RELATIVOS A SEC. ID nº: 3
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 399 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: secuencia de nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE HEBRA: bicatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Artemisia vulgaris 
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
FASE DE DESARROLLO: polen
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 3:
3 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS RELATIVOS A SEC. ID nº 4
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 132 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Artemisia vulgaris 
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
FASE DE DESARROLLO: polen
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 4:
\vskip1.000000\baselineskip
4 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS RELATIVOS A SEC. ID nº: 5
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 399 pares de base
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: secuencia de nucleótidos
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE HEBRA: bicatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Artemisia vulgaris 
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
FASE DE DESARROLLO: polen
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 5:
\vskip1.000000\baselineskip
5 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) DATOS RELATIVOS A SEC. ID nº 6
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 132 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE HEBRA: monocatenaria
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: desconocida
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: no
\vskip0.800000\baselineskip
(vi)
PROCEDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
ORGANISMO: Artemisia vulgaris 
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
FASE DE DESARROLLO: polen
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº 6:
6

Claims (19)

1. Moléculas de ADN recombinante que codifican para el alérgeno de Art v 1a que presenta la secuencia indicada en SEC ID nº 2.
2. Moléculas de ADN recombinante según la reivindicación 1, caracterizadas porque estas moléculas de ADN presentan la secuencia de nucleótidos de SEC ID nº 1.
3. Moléculas de ADN recombinante según la reivindicación 1, caracterizadas porque estas moléculas presentan una secuencia de nucleótidos que se ha derivado de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID nº 2 a causa de la degeneración del código genético.
4. Moléculas de ADN recombinante según la reivindicación 1, que presentan una secuencia que coincide en más del 60% con la SEC ID nº 1.
5. Moléculas de ADN recombinante según la reivindicación 4, que codifican para las isoformas Art v 1b y Art v 1c, caracterizadas porque estas isoformas presentan las secuencias de aminoácido indicadas en la SEC ID nº 4 y la SEC ID nº 6.
6. Moléculas de ADN recombinante según la reivindicación 5, caracterizadas porque estas moléculas de ADN presentan las secuencias de nucleótidos indicadas en la SEC ID nº 3 y la SEC ID nº 5.
7. Moléculas de ADN recombinante según la reivindicación 1 ó 5, que hibridan bajo condiciones rigurosas con la secuencia indicada en SEC ID nº 1 y permanecen unidas por hibridación bajo condiciones de lavado rigurosas.
8. Moléculas de ADN recombinante según la reivindicación 7, caracterizadas porque las isoformas Art v 1b y Art v 1c, que presentan las secuencias de nucleótidos indicadas en la SEC ID nº 3 y la SEC ID nº 5, pueden hibridar bajo condiciones rigurosas con la secuencia de Art v 1a indicada en la SEC ID nº 1.
9. Procedimiento para la producción del alérgeno Art v 1, que comprende las etapas siguientes:
(a) cultivo de células huésped procarióticas o eucarióticas que comprenden ADN según las reivindicaciones 2, 4 ó 7, que codifica para Art v1, de modo que el alérgeno Art v1 es expresado por las células huésped; y
b) aislamiento del alérgeno Art v1.
10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque el alérgeno recombinado está glicosilado.
11. Procedimiento para la fabricación de ADN recombinante según la reivindicación 7, caracterizado porque contempla como condiciones de hibridación rigurosas el uso de 1 M de NaCl en H_{2}O a 60ºC y como condiciones de lavado rigurosas lavar 2 veces durante 30 min y a 50ºC en 5x SSPE y 0,1% SDS, siendo 1x SSPE = 0,18 M de NaCl, 0,01 M de fosfato de sodio con pH 7,4, 1 mM de EDTA.
12. Vector de expresión procariótico o eucariótico susceptible de multiplicación que comprende como inserto moléculas de ADN según las reivindicaciones 2, 4 ó 7.
13. Célula huésped procariótica o eucariótica que comprende un vector de expresión según la reivindicación 11.
14. Célula huésped según la reivindicación 13, caracterizada porque dicha célula huésped es Escherichia coli.
15. Célula huésped según la reivindicación 13, caracterizada porque dicha célula huésped es Pichia pastoris.
16. Célula huésped según la reivindicación 13, caracterizada porque dicha célula huésped es de naturaleza vegetal.
17. Célula huésped según la reivindicación 16, caracterizada porque dicha célula huésped es un cultivo celular de tabaco (Nicotiana).
18. Organismo huésped vegetal que comprende un vector de expresión eucariótico según la reivindicación 12, caracterizado porque dicho organismo huésped es una planta de tabaco (Nicotiana).
19. Utilización del alérgeno recombinado Art v 1 según la reivindicación 9, para la elaboración de un medio apto para el diagnóstico y tratamiento de pacientes alérgicos.
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