ES2291648T3 - Alergeno del polen de la artemisa. - Google Patents
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Abstract
Alergeno que consiste en un polipéptido que comprende un fragmento de al menos 18 aminoácidos consecutivos de la secuencia aminoacídica como se muestra en la SEQ ID Nº: 1.
Description
Alergeno del polen de la artemisia.
Los granos de polen que se originan a partir de
las malas hierbas, en particular los que pertenecen a la extensa
familia vegetal Compositae o Asteraceae, son fuentes
de alergenos comunes por todo el mundo. Los tres géneros mas
importantes en esta familia de plantas de polinización anemófila
(por el viento) son Ambrosia (ambrosía), Parthenium
(fiebre del heno), y Artemisia vulgaris (artemisia). A
finales de verano y en otoño, el polen de la Artemisia es una de
las principales causas de reacciones alérgicas en Europa central y
partes de Asia (J. Charpin, R. Surinyach, y A.W. Frankland (1974)
Atlas of European Allergenic Pollens (Paris: Sandoz)).
Aproximadamente 10% de los pacientes que sufren de polinosis están
sensibilizados por el polen de la artemisia. El polen de la
ambrosía representa la principal fuente de proteínas alergénicas en
los Estados Unidos y Canadá, con una prevalencia de alrededor de
50% en individuos atópicos (L.P. Boulet, H. Turcotte, c. Laprise,
c. Lavertu, P.M. Bedard, A. Lavoie, y J Hebert (1997) Comparative
degree and type of sensitization to common indoor and outdoor
allergens in subjects with allergic rhinitis and/or asthma. Clin Exp
Allergy 27, 52). En Europa, la alergia por ambrosía no es la mayor
causa de polinosis, pero está creciendo rápidamente. La ambrosía
fue introducida por primera vez en Europa a comienzos del siglo
pasado y se limitó a Hungría. Durante la segunda guerra mundial se
introdujo en Francia, a partir de entonces se expandió gradualmente
y ahora es abundante en el valle del Ródano (Francia), norte de
Italia, partes orientales de Austria, Hungría y Bulgaria (G.
D'Amato, F.T. Spieksma, G. Liccardi, S. Jager, M. Russo, K.
Kontou-Fili, H. Nikkels, B Wuthrich, y S. Bonini
(1998) Pollen-related allergy in Europe. Allergy 53,
567).
Hoy en día, está ampliamente aceptado que los
alergenos recombinantes representan herramientas prometedoras para
el diagnóstico y la terapia de las alergias de tipo I. El valor de
estas moléculas para diagnóstico ha sido evaluado en detalle y un
panel de alergenos recombinantes está ya disponible para
diagnósticos rutinarios de ciertas alergias por inhalación,
incluyendo alergias al polen de los árboles (abedul)- y hierba (R.
Valenta y otros (1992) Int Arch Allergy Immunol 97, 287; O.
Scheiner, y D. Kraft (1995) Alergy 50, 384; D. Kraft y otros (1998)
Allergy 53; 62; D. Kraft y otros (1999) Int Arch Allergy Immunol
118, 171) pero no para las alergias al polen de las malas hierbas.
Dos compuestos alergénicos principales del polen de ambrosía
conocidos como antígenos E (Amb a1) y K (Amb a 2) fueron
caracterizados y demostraron ser proteínas ácidas de alrededor de
38.000 Da (T.P. King (1980) Allergy 35; 187). El clonaje del cADN de
Amb a 1 y Amb a 2 reveló que estos alergenos son altamente
homólogos entre sí y pertenecen a la familia de las proteínas
pectato liasas (T. Rafnar y otros, (1991) J Biol Chem 266, 1229; B.
L. Rogers y otros (1991) J Immunol 147, 2547). Actualmente, no hay
información acerca de la estructura completa y no se han publicado
datos de clonaje molecular de ningún alergeno del polen de
artemisia. La única excepción es un alergeno del polen de artemisia
designado Art v 1 que está descrito en el documento de patente WO
99/49045. Art v 1 no está relacionado con Amb a 1 o con ningún otro
alergeno de ambrosía caracterizado. Diversos documentos demostraron
que la el polen de ambrosía y de Artemisia comparten estructuras
alergénicas comunes, es decir, antígenos reconocidos mediante
anticuerpos IgE de reactividad cruzada en diferentes fuentes (C.
Fernandez y otros (1993) J Allergy Clin Immunol 92, 660; R.
Hirschwehr y otros (1998) J. Allergy Clin Immunol 101, 196; H. S.
Park y otros (1994) J Korean Med Sci 9, 213). El reconocimiento de
IgE de tales antígenos comunes desencadenará reacciones alérgicas en
pacientes sensibilizados tras el contacto con diferentes fuentes de
alergenos. Por lo tanto, la caracterización de alergenos del polen
de artemisia y la identificación de estructuras alergénicas comunes
en polen de ambrosía proporcionarán información básica para la
selección y producción de alergenos recombinantes que son
suficientes para el diagnóstico y la terapia de las alergias al
polen de las malas hierbas.
El documento de patente WO 96/13589 describe
péptidos que comprenden al menos un epítopo de células T
seleccionado de los alérgenos Amb a I.1, Amb a I.2, Amb a I.3, Amb
a I.4 y Amb a II. La fuente de antígeno es Ambrosia artemisiifolia
que es la principal causa de la fiebre del heno de finales de verano
en Estados Unidos y Canadá.
Ferreira y otros, Internacional Arches of
Allergy and Immunology, p. 77-79 (2001) describe el
clonaje de alergenos putativos del polen de artemisia usando un
panel de 12 anticuerpos monoclonales generados frente a proteínas
del polen de artemisia. La publicación no describe, sin embargo,
ninguna secuencia de ninguna proteína.
Hirschwehr y otros, Journal of Allergy and
Clinical Immunology... (1998), p 196-206 describe
experimentos de inmunotransferencia e inhibición para investigar
los alergenos con reactividad cruzada de polen de artemisia y
ambrosía.
Es por lo tanto un objeto del presente invento
identificar un alergeno a partir de polen de artemisia, que podría
desencadenar la alergia del tipo I.
Los inventores aislaron con éxito cuatro clones
de cDNA completos y bona fide correspondientes al alergeno
del polen de artemisia (Artemisia vulgaris) de 40,9 KDa. La
secuencia aminoacídica del alergeno del polen de Artemisia 40,9 kDa
es mostrada en la SEQ ID Nº 1.
El invento se refiere a un alergeno que consiste
en un polipéptido que comprende un fragmento de al menos 18
aminoácidos de la secuencia aminoacídica como se muestra en la SEQ
ID Nº: 1. Tal polipéptido comprende al menos 18 aminoácidos
consecutivos de la secuencia como se muestra en la SEQ ID Nº: 1.
Preferiblemente la longitud del fragmento es al menos 21
aminoácidos, más preferiblemente al menos 25 aminoácidos, aún más
preferible al menos 35 aminoácidos, más preferible al menos 50
aminoácidos de la secuencia aminoacídica como se muestra en la SEQ
ID Nº: 1.
Preferiblemente, el alergeno consiste en un
polipéptido mediante el cual la longitud de dicho polipéptido es al
menos 25 aminoácidos, más preferiblemente al menos 35 aminoácidos.
En realizaciones adicionales, el polipéptido del invento consiste
en al menos 18 o al menos 21 o al menos 30 aminoácidos contiguos de
la secuencia aminoacídica como se muestra en la SEQ ID Nº: 1. En
aspectos adicionales, la longitud del polipéptido no es mayor de
100 ó 50 ó 30 aminoácidos. Los polipéptidos que consisten en al
menos 7 aminoácidos pueden ser reconocidos por células T de tipo
I(epítopos de células T).
Aún otro aspecto del invento es un alergeno que
consiste en un polipéptido que comprende un fragmento de la
secuencia aminoacídica como se muestra en la SEQ ID Nº: 1 en la que
dicho fragmento es capaz de unirse a anticuerpos IgE de un
individuo que es alérgico frente al polen de Artemisia. El término
"anticuerpos IgE" significa una preparación de anticuerpos que
se obtiene mediante procesos conocidos per se. En humanos
susceptibles, la exposición al alergeno lleva a una respuesta
alérgica inmediata de tipo mediada por IgE, que es un proceso en
dos etapas:
(1) en la primera exposición, las proteínas
alergénicas inducen la síntesis de IgE mediante células B (Vercelli
y Geha, 1989, J. Allergy Clin. Immunol. 9: 75-83).
Estos anticuerpos IgE específicos se unen entonces a las
superficies de células de mastocitos y basófilos vía receptores
Fc\varepsilon de alta afinidad (Fc\varepsilonRI).
(2) En exposiciones subsiguientes, los alergenos
se unen y entrelazan con estos anticuerpos IgE específicos llevando
a la liberación de mediadores inflamatorios
pre-formados y recién sintetizados (por ejemplo
histamina) y las sustancias quimotácticas (por ejemplo factor
activador de plaquetas).
En la etapa (1), la producción de IgE
específicos de alergeno por los linfocitos B requiere la
"ayuda" de linfocitos T (Vercelli y Geha, 1989, J. Allergy
Clin. Immunol. 9: 75-83), que son activados por
fragmentos peptídicos lineales del alergeno. Estos péptidos son
creados mediante células presentadoras de antígeno a través de
procesamiento de antígenos y son mostrados en la superficie celular
con moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC),
donde se hacen disponibles para el reconocimiento y unión al
receptor de células T (Schwartz, 1985, Annu Rev. Immunol. 3:
237-255; Rothbart y otros, 1989, Int. Immunol. 1:
479-486). En la etapa (2), los anticuerpos IgE
específicos de alergeno producidos mediante las células B circulan y
se unen a los receptores Fc\varepsilonRI sobre células de
mastocitos y basófilos, sirviendo de ese modo como receptores para
el alergeno. El entrecruzamiento de estos anticuerpos IgE unidos a
la superficie celular mediante alergenos representa la señal de
liberación de mediadores inflamatorios recién sintetizados y
preformados y sustancias quimotácticas, llevando a la reacción
inflamatoria alérgica típica.
Un individuo que es alérgico frente al polen de
Artemisia es un individuo que muestra anticuerpos IgE específicos
que reconocen proteínas del polen de la artemisia y tienen síntomas
alérgico típicos (mediados por IgE) cuando se exponen al polen de
Artemisia. Tales reacciones alérgicas pueden también ser
desencadenadas por la exposición a antígenos homólogos presente en
otras fuentes de alergenos. Este fenómeno es definido como
reactividad cruzada. La selección de pacientes alérgicos al polen
de artemisia fue hecha según la historia de un caso típico, ensayo
de pinchazo en la piel positivo y el ensayo radio alergoabsorbente
"RAST" >3,5.
Un polipéptido es capaz de unirse a un
anticuerpo si su afinidad al anticuerpo es significativamente mayor
que la de una composición de referencia que no se une al anticuerpo.
La unión de anticuerpos IgE específicos a un polipéptido particular
o alergeno puede ser determinada mediante diversos métodos, por
ejemplo, RAST, inmunotransferencia, ELISA, usando como referencia
suero a partir de individuos saludables no alérgicos (según la
historia del caso, ensayo de pinchazo en piel negativo, RAST
negativo), que no muestra anticuerpos IgE específicos de
alergenos.
En una realización del invento el polipéptido es
capaz de unirse a los anticuerpos IgE de un individuo que es
alérgico frente al polen de ambrosía. El presente invento hace
posible identificar estructuras alergénicas que son comunes al
polen de Artemisia y al polen de ambrosía. Esta información es útil
para la selección y producción de alergenos recombinantes que son
suficientes para el diagnóstico y terapia de alergias al polen de
malas hierbas. Los péptidos y polipéptidos que contiene tales
estructuras alérgicas comunes están abarcados por el presente
invento.
Durante la purificación de Amb a 1 de origen
natural la proteasa del polen de tipo tripsina corta este alergeno.
Así, la purificación resulta con frecuencia en el aislamiento de un
alergeno de 38 KDa de longitud completa mas dos fragmentos de 26 y
12 KDa de peso molecular, designados alfa (aminoácidos 187 a 396, la
numeración incluye péptidos señal) y beta (aminoácidos 43 a 180, la
numeración incluye el péptido señal), respectivamente. Todas las
cadenas son aún altamente reactivas con anticuerpos de conejo
policlonales e IgE humanos de pacientes alérgicos. Se espera que
los fragmentos proteolíticos del alergeno de artemisia de 40,9 KDa
presentes de manera natural correspondientes a estas cadenas
también unan anticuerpos IgE de pacientes alérgicos. El primero
corresponde a la cadena beta que abarca los aminoácidos 21 a 180 y
el segundo corresponde a la cadena alfa que abarca los aminoácidos
181 a 396, ambas numeraciones se refieren a la SEQ ID Nº: 1. Ambas
cadenas se espera que tengan epítopos que están presentes también
en las cadenas Amb a 1 dando como resultado la misma reactividad
IgE. El invento se refiere a un polipéptido que comprende un
fragmento de la secuencia como se muestra en la SEQ ID Nº: 1 en la
que dicho fragmento consiste en los aminoácidos 21 a 180 ó 181 a 396
de la secuencia como se muestra en la SEQ ID Nº: 1.
En una realización, el polipéptido del invento
es un polipéptido que consiste en la secuencia de aminoácidos
LENGAIFVASG (SEQ ID Nº: 10).
Según una realización preferida, los
polipéptidos son polipéptidos aislados, es decir, están en una forma
esencialmente pura. "Esencialmente pura" significa que
mediante la separación de los polipéptidos de otros compuestos los
polipéptidos son al menos 75% puros, preferiblemente al menos 90%
puros, más preferiblemente al menos 95% puros. La pureza de los
polipéptidos puede ser determinada por una persona con experiencia
usando técnicas conocidas en el campo, por ejemplo,
SDS-PAGE seguido por tinción de proteínas.
Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) y espectrometría
de masas son métodos adecuados para analizar polipéptidos y también
péptidos cortos.
Los polipéptidos pueden ser preparados de varias
maneras. Los polipéptidos pueden ser preparados mediante síntesis
química, preferiblemente aplicando métodos en fase sólida. Los
métodos de síntesis química de péptidos son conocidos por la
persona con experiencia en la materia (véase, por ejemplo,
Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149, 1963; Stewart y otros,
"Solid Phase Peptide Synthesis" (segunda edición), Pearce
Chemical Co., Rockford, IL, 1984 y Bayer y Rapp Chem. Pept. Prot.
3:3 (1986); y Atherton y otros, Solid Phase Peptide Synthesis: A
Practical Approach, IRL Press, Oxford, 1989). Estos métodos son
particularmente adecuados para la preparación de polipéptidos
cortos que tienen una longitud de 7 a 50 aminoácidos. Polipéptidos
más largos pueden ser preparados uniendo química o enzimáticamente
fragmentos peptídicos que han sido preparados mediante síntesis
química. Los polipéptidos del invento pueden también ser preparados
mediante la expresión de secuencias de ADN en células
hospedadoras. Estos métodos son descritos en más detalle a
continuación.
El presente invento también tiene que ver con
diversos polinucleótidos. Los polinucleótidos pueden ser moléculas
de ADN de hebra sencilla o hebra doble, moléculas de ARN o ácidos
nucleicos que pueden derivarse de estos. Según un primer aspecto,
los polinucleótidos del invento codifican la secuencia aminoacídica
como se muestra en la SEQ ID Nº: 1. Debido a la degeneración del
código genético, se pueden esperar muchos polinucleótidos
diferentes que codifican la secuencia aminoacídica como se muestra
en la SEQ ID Nº: 1
Según un segundo aspecto, los polinucleótidos
del invento codifican un polipéptido según el invento como se
describe anteriormente.
Los polinucleótidos descritos aquí pueden ser
usados para identificar secuencias similares en cualquier variedad
o tipo de artemisia y, así, identificar o aislar secuencias que
tienen suficiente homología para hibridar con, por ejemplo, ADN del
polen de artemisia. Esto puede ser llevado a cabo por ejemplo, bajo
condiciones de baja rigurosidad; esas secuencias que tienen
suficiente homología (generalmente mayor del 40%) pueden ser
seleccionadas para una evaluación adicional. De modo alternativo,
condiciones de alta rigurosidad pueden ser usadas. En general, se
seleccionan condiciones de alta rigurosidad que sean alrededor de
5ºC hasta 10ºC menores que el punto de fusión térmica (T_{M})
para la secuencia específica a una determinada fuerza iónica y pH.
La T_{M} es la temperatura (a una fuerza iónica y pH definidos) a
la que el 50% de la secuencia diana hibrida con una sonda
perfectamente complementaria. Las condiciones de alta rigurosidad
típicas son aquellas en las que la concentración de sal es hasta
alrededor de 15 mM Na^{+} (0,1 x SSC) a pH 7, y la temperatura es
al menos alrededor de 60ºC.
De esta manera, el ADN del presente invento
puede ser usado para identificar en otros tipos de polen de malas
hierbas secuencias que codifican péptidos que tienen secuencias
aminoacídicas similares a las de la proteína de 40,9 KDa descrita
aquí y, así, identificar alergenos en tales otros tipos de polen de
malas hierbas. Así, el presente invento describe no sólo la
proteína de 40,9 kDa y otros alergenos de Artemisia codificado por
las presentes secuencias de ADN, sino también otro alergenos de
polen de malas hierbas codificados por ADN que hibrida con ADN del
presente invento.
En una realización el polinucleótido comprende
la secuencia nucleotídica como se muestra en la SEQ ID Nº: 2 o la
secuencia nucleotídica como se muestra en la SEQ ID Nº: 3. En otra
realización, el polinucleótido del invento comprende al menos 100,
preferiblemente al menos 300, más preferiblemente al menos 600, más
preferiblemente al menos 1000 nucleótidos contiguos de la secuencia
como se muestra en la SEQ ID Nº: 2 o SEQ ID Nº: 3.
El invento también cubre polinucleótidos que son
degenerados a los polinucleótidos descritos anteriormente. Las
hebras complementarias respectivas de los polinucleótidos descritos
están abarcadas por el presente invento.
Los polinucleótidos del presente invento son
preferiblemente polinucleótidos aislados. Los polinucleótidos son
preferiblemente esencialmente puros, es decir, que son al menos un
80% puros, más preferiblemente al menos 90% puros, más
preferiblemente al menos 95% puros. Los polinucleótidos según el
invento pueden ser preparados de diversas maneras (véase, por
ejemplo, Glick, y Pasternack, Molecular Biotechnology, Principles
and Applications of Recombinant DNA, ASM Press, Washington D.C.
1994; Itakura y otros. Annu. Rev. Biochem.
53:323-56, 1984 y Climie y otros, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 87:633-7, 1990). Pueden ser sintetizados
mediante métodos químicos normalmente empleados en síntesis
oligonucleotídicas. Métodos basados en PCR pueden ser usados para
sintetizar los polinucleótidos, en particular polinucleótidos más
largos (véase, por ejemplo Lee y otros, Nucleic Acid Amplification
Technologies, Eaton Publishing, Natick, MA 1997; McPherson, M. J., y
otros PCR - A Practical Approach, Vol. 1 y 2 IRL Press, Oxford
1996). Polinucleótidos más largos pueden también ser preparados
uniendo química- o enzimáticamente fragmentos que han sido
sintetizados usando métodos químicos.
Otro aspecto del invento es un plásmido o un
vector que comprende un polinucleótido según el invento. Los
plásmidos pueden contener secuencias reguladoras que facilitan la
replicación de los plásmidos o la transcripción y/o traducción de
las secuencias codificadas. Ejemplos de tales secuencias son
promotores, secuencias terminadoras, etc. Los plásmidos pueden
también contener secuencias nucleotídicas que codifican secuencias
aminoacídicas que facilitan la purificación de los polipéptidos
codificados tras la expresión en una célula hospedadora. Ejemplo de
tales secuencias son una etiqueta 6xHis, una etiqueta FLAG, y
secuencias que codifican proteínas bacterianas tales como GST. La
purificación puede ser lograda mediante cromatografía de afinidad
usando anticuerpos dirigidos contra las respectivas secuencias
etiqueta o secuencias bacterianas. Los plásmidos y vectores que
contienen tales secuencias etiquetas o secuencias bacterianas son
conocidas por la persona con experiencia en el campo.
El invento se refiere además a una célula que
contiene un plásmido o un vector y un polinucleótido según el
presente invento. Las células pueden ser seleccionadas a partir de
células vegetales, células bacterianas, células de levadura y otras
células. Se prefieren las células que permiten la expresión de los
genes codificados por los polinucleótidos del invento. Más
preferiblemente, las células son células de E.coli. El
plásmido, vector y/o polinucleótido según el presente invento puede
ser introducido en las células mediante las técnica conocidas
per se, por ejemplo, transformación, transfección etc. Las
células pueden contener moléculas de ácidos nucleicos sólo de modo
transitorio o integradas de modo estable en el genoma. En el último
caso en particular, las moléculas de ácidos nucleicos pueden estar
truncadas o fragmentadas debido al proceso de integración en el
genoma. Las células que contienen tales versiones truncadas o
fragmentadas de las moléculas de ácidos nucleicos están dentro del
alcance del presente invento.
Las células pueden ser usadas para la expresión
y purificación de los polipéptidos del invento. El invento por lo
tanto se refiere a un proceso para la preparación de un polipéptidos
según el invento que comprende la etapa de cultivar las células
descritas en el presente invento en condiciones apropiadas para la
expresión del polipéptido y opcionalmente recuperación subsiguiente
del polipéptido. Las células son cultivadas de modo preferible en
un medio líquido bajo agitación. Si es apropiado, la expresión
génica es inducida mediante un agente inductor, por ejemplo IPTG.
Las técnica para manipular las moléculas de ADN clonado e introducir
ADN exógeno en una variedad de células hospedadoras, las técnica
para transformar estos hospedadores y las técnicas para expresar
secuencias de ADN foráneas clonadas ahí son bien conocidas en la
técnica y descritas en, por ejemplo, Sambrook y otros, Molecular
Cloning: A Laboratory Manual, segunda edición, Cold Spring Harbour
Laboratory Press, Cold Spring Harbour, Nueva York 1989; y Ausubel y
otros, eds. Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and
Sons, Inc., Nueva York 1987.
Tras el cultivo las células pueden ser abiertas
usando métodos establecidos y el polipéptido puede ser recuperado
mediante cromatografía de afinidad. Otros métodos conocidos de
purificación de proteínas pueden ser empleados. Etapas de
purificación ejemplares pueden incluir hidroxiapatito, exclusión por
tamaño, FPLC y cromatografía líquida de alto rendimiento de fase
inversa. Medios cromatográficos adecuados incluyen dextranos
derivatizados, agarosa, celulosa, poliacrilamida, silicas
especializadas, y similares. En una realización preferida, el
polipéptido del invento es aislado mediante un método que comprende
una etapa de cromatografía de afinidad. Según esta realización, uno
o más anticuerpos dirigidos frente al polipéptido del invento pueden
ser inmovilizados en un soporte sólido. Los métodos para unir
moléculas de anticuerpos a un medio soporte son bien conocidos en
la técnica. La selección de un método particular es una materia de
diseño rutinario y está determinado en parte por las propiedades
del soporte
elegido.
elegido.
Alternativamente, una cromatografía de adsorción
de un ión metálico inmovilizado puede ser usado para purificar
proteínas ricas en histidinas, incluyendo las que comprenden las
etiquetas de polihistidinas. Brevemente, un gel es cargado primero
con iones de metales divalentes para formar un quelato. Las
proteínas ricas en histidina serán adsorbidas a esta matriz con
diferentes afinidades, dependiendo de los iones metálicos usados, y
serán eluídas mediante elusión competitiva, disminuyendo el pH, o
usando agentes quelantes fuertes. Dentro de las realización
adicionales del invento, una fusión del polipéptido de interés y una
etiqueta de afinidad pueden ser construida para facilitar la
purificación. Las proteínas de fusión pueden ser preparadas mediante
métodos conocidos por aquellos con experiencia en la técnica
preparando cada componente de la proteína de fusión y conjugándolos
químicamente. Alternativamente, un polinucleótido que codifica ambos
componentes de la proteína de fusión en el marco de lectura
apropiado puede ser generado usando técnicas conocidas y expresado
mediante los métodos descritos aquí. Los métodos de purificación de
proteínas están descritos, por ejemplo, en Deutscher, M. P. Protein
Purification, Academic Press, Nueva York 1990; Scopes, R. K. Protein
Purification, Springer Verlag, Heidelberg 1994; Donan, S. Protein
Purification Protocols. Humana Press, 1996.
Los polipéptidos pueden ser usados, por ejemplo,
como alergenos "purificados". Tales alergenos purificados son
útiles en la estandarización de extractos de alergenos que son
reactivos esenciales para el diagnóstico y tratamiento de alergia
por ambrosía. Además, usando péptidos basados en fragmentos de la
secuencia aminoacídica como se muestra en la SEQ ID Nº: 1
antisueros antipéptido o anticuerpos monoclonales pueden ser hechos
usando métodos estándar. Estos sueros o anticuerpos monoclonales,
dirigidos frente a una proteína de 40,9 KDa del invento, pueden ser
usados para estandarizar los extractos de alergenos.
Un alergeno que es capaz de unirse a un
polipéptido puede ser producido. El anticuerpos puede ser un
anticuerpo policlonal o monoclonal, sin embargo los anticuerpos
monoclonales son preferidos. Los anticuerpos dirigidos frente al
polipéptido del invento pueden ser preparados en una manera
conocida, véase, por ejemplo Harlow y Lane 1988 "Antibodies: A
Laboratory Manual"; Cold Spring Harbour Laboratory. En una
realización particular el anticuerpo está en una forma
esencialmente pura, es decir al menos 80% puro, preferiblemente al
menos 90% puro. En el caso de anticuerpos policlonales, la
composición de anticuerpos contiene muchas especies diferentes de
moléculas de anticuerpo.
El anticuerpo puede ser específico para el
polipéptido que comprende la secuencia aminoacídica como se muestra
en la SEQ ID Nº: 1. Tal anticuerpo no se une a ninguno de los
polipéptidos Amb a I.1, Amb a I.2, Amb a I.3 y Amb a 2 de polen de
ambrosía.
Sin embargo, otro anticuerpo es capaz de unirse
a uno o varios (por ejemplo, dos, tres o cuatro) de los polipéptidos
Amb a I.1 , Amb a I.2, Amb a I.3 y Amb a 2 a partir de polen de
ambrosía.
Los anticuerpos pueden ser usados para aislar
componentes adicionales de alergenos de artemisia que pueden ser
usados para una definición adicional de las características de esta
familia de alergenos. Además, los sueros antipéptidos o anticuerpos
monoclonales dirigidos contra los polipéptidos del invento pueden
ser usados para estandarizar y definir el contenido de reactivos de
ensayo de piel.
El invento se refiere además a una composición
farmacéutica que comprende un polipéptido y/o un polinucleótido
según el presente invento.
Los materiales descritos aquí, así como
composiciones que contienen estos materiales, pueden ser usados en
métodos de diagnóstico, tratamiento y prevención de la alergia por
artemisia. Otro aspecto del invento por lo tanto es el uso de un
polipétido y/o un polinucleótido y/o un anticuerpo según el presente
invento para la preparación de un medicamento para el tratamiento o
prevención o diagnóstico de un trastorno alérgico.
El medicamento es administrado preferiblemente a
un individuo que ha de ser desensibilizado.
A través del uso de los polipéptidos del
presente invento, las preparaciones de alergeno de composición y
actividad biológica consistentes y bien definidas pueden ser
preparadas y administradas para propósitos terapéuticos (por
ejemplo, para modificar la respuesta alérgica de un individuo
sensible a artemisia al polen de artemisia). Tales polipéptidos o
versiones modificadas de los mismos pueden, por ejemplo, modificar
respuestas de células B a un alergeno de artemisia, respuesta de
células T a un alergeno de artemisia o ambas respuestas. Los
alergenos purificados pueden también ser usados para designar
derivados modificados o análogos que son más útiles en
inmunoterapia que los péptidos sin modificar presentes de manera
natural.
Altas dosis de alergenos producen generalmente
el mejor alivio de los síntomas. Sin embargo, mucha gente no tolera
altas dosis de alergenos debido a las reacciones alérgica a los
alergenos. La modificación de alergenos presentes de manera natural
puede ser diseñada de tal manera que los polipéptidos modificados
que tiene las mismas propiedades terapéuticas o potenciadas como el
alergeno presente de manera natural correspondiente pero que tienen
efectos secundarios reducidos, especialmente reacciones
anafilácticas reducidas, pueden ser producidos. Estos pueden ser,
por ejemplo, un polipéptido del presente invento o un análogo
modificado (por ejemplo, un polipéptido en el que la secuencia
aminoácido ha sido alterada para modificar la inmunogenicidad y/o
reducir la alergenicidad o al cual se ha añadido un componente para
el mismo propósito). Por ejemplo, los polipéptidos pueden ser
modificados usando el método del polietilénglicol de A. Sehon y
colaboradores. Una deleción de un segmento corto o sustituciones de
aminoácidos de la secuencia de polipéptidos resulta en una unión de
anticuerpo debilitada (debil o no). Esta modificación lleva a una
baja unión de IgE y es muy útil en la inmunoterapia debido a
menores efector secundarios.
La administración de los péptidos del presente
invento a un individuo que ha de ser desensibilizado pueden ser
llevado a cabo usando técnicas conocidas. Un péptido o una
combinación de diferentes péptidos pueden ser administrados a un
individuo en una composición que incluye, por ejemplo, un tampón, un
vehículo y/o un adyuvante apropiados. Tales composiciones serán
administradas generalmente mediante inyección, administración oral,
inhalación, aplicación transdérmica o administración rectal. Usando
la información estructural ahora disponible, es posible diseñar un
polipéptido de polen de artemisia que, cuando es administrado a un
individuo sensible a la artemisia en cantidades suficientes,
modificará la respuesta alérgica del individuo a un alergeno de
artemisia. Esto puede ser hecho, por ejemplo, examinando las
estructuras de las proteínas de artemisia, produciendo péptido para
ser examinados en lo que ser refiere a su capacidad para influir en
las respuestas de células B y/o células T en individuos sensibles
a artemisia y seleccionando epítopos apropiados reconocidos por las
células. Las secuencias de aminoácidos sintéticos que mimetizan los
de los epítopos y que son capaces de disminuir los niveles de
respuesta alérgica al alergeno de artemisia pueden también ser
usados.
Los polipéptidos o anticuerpos pueden también
ser usados para detectar y diagnosticar la alergia por artemisia.
Por ejemplo, combinando sangre o productos de la sangre obtenidos a
partir de un individuos para ser evaluado en lo que se refiere a la
sensibilidad al alérgeno de artemisia con un péptido alergénico
aislado del polen de artemisia, en condiciones apropiadas para la
unión de los componentes (por ejemplo, anticuerpos, células T,
células B) en la sangre con el polipéptido y determinar la extensión
a la cual tal unión tiene lugar.
Ahora también es posible diseñar un agente o un
fármaco capaz de bloquear o inhibir la capacidad de los alergenos
de artemisia de inducir una reacción alérgica en individuos
sensibles a artemisia. Tales agentes podrían ser diseñados, por
ejemplo, de tal manera que se unirían a anti IgEs de artemisia
relevantes, impidiendo así la unión IgE-alergeno y
subsiguiente desgranulación de células de mastocitos.
Alternativamente, tales agentes podrían unirse a componentes
celulares del sistema inmune, dando como resultado una supresión o
desensibilización de la respuesta alérgica a alergenos de
artemisia. Un ejemplo no restrictivo de esto es el uso de epítopos
peptídicos de células B y T apropiados, o modificaciones de los
mismo, basadas en las estructuras de cADN/polipéptidos del presente
invento para suprimir la respuesta alérgica a alergenos de
artemisia. Esto puede ser llevado a cabo definiendo las estructuras
de epítopos peptídicos de células B y T que afectan la función de
las células B y T en estudios in vitro con células de la
sangre a partir de individuos sensibles a artemisia.
Finalmente, el invento se refiere a kits que son
útiles para el diagnóstico, el tratamiento y/o la prevención de un
trastorno alérgico que comprende un polipéptido y/o un
polinucleótido. Los materiales descritos aquí, así como
composiciones y kits que contienen estos materiales, pueden ser
usados en los métodos de diagnóstico, tratamiento y prevención de
alergia por Artemisia.
El presente invento está basado en moléculas de
ADN recombinantes y fragmento de los mismos que codifican un
alergeno de polen de artemisia de 40,9 kDa (Artemisia
vulgaris), que muestra homología de secuencia con Amb a 1, un
alergeno principal de polen de ambrosía (Ambrosia
artemisiifolia), sobre un método para aislar moléculas de Art
v1 o fragmentos de las mismas, y en un vector de expresión y una
célula hospedadora transformada para expresar las secuencias de
ácido nucleicos del invento. El presente invento se refiere además
a método de diagnósticos y terapia de pacientes alérgicos al polen
de malas hierbas. Debido a que el alergeno de Artemisia de 40,9 kDa
muestra homología de secuencia a Amb a 1, esta proteína de artemisia
puede represente un alergeno de reacción cruzada y podría ser usada
para diagnóstico y terapia de no sólo alergia al polen de
artemisia, sino de alergias al polen de malas hierbas en
general.
La presente solicitud describe el aislamiento de
cuatro clones de cADN bona fide completos que corresponden a
un alergeno del polen de artemisia (Artemisia vulgaris) de
40,9 kDa. Las secuencias nucleotídicas de cADN y secuencia
aminoacídicas derivadas de los clones M4, M6, y M15 fueron idénticos
(véase Figuras 1 y 2). El clon M8 se diferenció del otro en 8
sustituciones nucleotídicas, que no condujeron a cambios en
aminoácidos (véase Figura 3). Los clones están completos en sus
extremos 5' ya que contienen el codon de inicio AUG en un contexto
eucariótico típico y algunas secuencias aguas arriba del codon de
inicio. Los clones están completos en la región 3' ya que contienen
90-120 nucleótidos tras el codon stop seguido por
una cadena poliA+. Las secuencias fuera del marco de lectura
abierto no se muestran en las Figuras 2 y 3. Los alineamientos de
las secuencias nucleotídicas de los clones M4, M6, M8 y M15 están
mostradas en la Figura 1A-D. La secuencia
nucleotídica de la región codificante y la secuencia aminoacídica
deducida de los clones M4, M6 y M15 se muestran en la Figura 2. La
secuencia nucleotídica de la región codificante y la secuencia
aminoacídica deducida de clon M8 se muestran en la Figura 3.
Las Figuras 1A, 1B, 1C y 1D muestran un
alineamiento de las secuencias nucleotídicas de los clones M4, M6,
M8 y M15 (SEQ ID Nº: 6, 7, 8, Y 9). Las mayúsculas en la secuencia
consenso indican nucleótidos idénticos en los cuatro clones.
La Figura 2 muestra la secuencia nucleotídica de
la región codificante (SEQ ID Nº: 2 mas el codon stop) y la
secuencia aminoacídica deducida (SEQ ID Nº: 1) de los clones M4, M6
y M15.
La Figura 3 muestra la secuencia nucleotídica de
la región codificante (SEQ ID Nº: 3 mas codon stop) y la secuencia
aminoacídica deducida (SEQ ID Nº: 1) del clon M8.
La Figura 4 muestra la estructura del sitio de
clonaje múltiple del plásmido "pHis-Parallel2"
como se usa en el Ejemplo 2. Los aminoácidos que codifican una
etiqueta 6xHis, una región espaciadora y un sitio de corte de
proteasas están también indicados.
La Figura 5A muestra el extracto de polen de
artemisia, alergeno de polen de artemisia purificado y Amb a1
purificado a partir de polen de ambrosía separado mediante gel de
electroforesis seguido por tinción Coomassie. La Figura 5B muestra
una immunotransferencia con anticuerpos de conejo
anti-Amb a 1 (véase los Ejemplos 3 y 4).
La Figura 6 muestra una inmunotransferencia con
anticuerpos IgE (véase los ejemplos 3 y 4).
La Figura 7 muestra un gel teñido con Coomassie
tras SDS-PAGE. El Carril 1 (izquierda): marcador de
peso molecular RPN 756 (Amersham Biosciencies); carril 2 (medio):
extracto de polen de artemisia; carril 3 (derecha): proteína de
polen de artemisia de 40,9 kDa recombinante purificada, \sim3
\mug (véase el Ejemplo 5).
El presente invento se ilustrará además mediante
los siguiente que no pretenden ser limitantes.
El aislamiento de clon de cADN que codifica para
el alergeno del polen de artemisia de 40,9 kDa fue hecho de la
siguiente manera.
La primera etapa para el clonaje de cADN del
alergeno de 40,9 kDa fue aislado de ARN de polen de artemisia, la
cual resultó ser un procedimiento muy difícil. Usando varios
procedimientos estándar para el aislamiento de ARN, había siempre
pigmentos y otras sustancias orgánicas que copurificaban con el ARN
que inhiben las enzimas usadas para la síntesis de cADN. Sin
embargo, tras una serie de ensayos fue posible aislar mARN
suficientemente puro para construir una librería de cADN, que fue
también hecha en el vector de expresión lambda ZAP.
Sueros de ratones inmunizados con Amb a 1 fueron
amablemente proporcionados por Dr. Te Piao King, (Rockefeller
University, USA). Para cribar la librería de cADN de artemisia los
autores primero purificaron anticuerpos específicos de Amb a 1
mediante cromatografía de afinidad. Para tal propósito, 5 mg de Amb
a 1 purificado de polen de ambrosía fue acoplado a Sepharosa
activada por CNBr (Pharmacia). Tras la unión de los sueros de
conejo, la resina fue lavada y los anticuerpos específicos de Amb a
1 fueron eluídos con glicina 0,2 M, pH 2,8. Los anticuerpos fueron
neutralizados y dializados frente a PBS. Con estos anticuerpos
anti-Amb a 1 purificados de conejo se cribaron
450.000 placas de una librería de cADN de polen de artemisia
construida en fagos ZAP II lambda (Stratagene, CA, USA). En total,
13 clones positivos fueron aislados y usados para una excisión
in vivo de clones individuales del fagómido pBluescript a partir
del vector Uni-ZAP XR. Cuatro clones (M4, M6, M8, y
M15) fueron seleccionados para análisis de secuencias de ADN, que
fueron llevados a cabo por la técnica de "paseo con cebadores"
usando 5 cebadores incluyendo los cebadores flanqueantes T7 y T3.
Ambas hebras fueron secuenciadas dos veces. Las secuencias
nucleotídicas alineadas de los cuatro clones M4, M6, M8 y M15 se
muestran en las Figuras 1A-1D. Las secuencias de
cADN de los clones M4, M6 y M15 fueron idénticas (Figura 2). La
secuencia de cADN en la región codificante de M8 difirió de los
otros 3 clones mediante 8 bases (Figura 3). Sin embargo, los cuatro
clones llevaron a la misma proteína con un peso molecular calculado
de 40,9 kDa (Figuras 2 y 3).
Finalmente, la secuencia de la proteína de 40,9
kDa fue usada para búsquedas de similitudes en las bases de datos.
Se encontró una homología de secuencia significativa con Amb a 1, un
alergeno principal de polen de Artemisia que pertenece a la familia
de las pectato liasas (63,9% de identidad).
El cADN del invento puede ser ahora obtenido
basado en la información de secuencias como se describe aquí. El
cADN puede ser clonado a partir de una librería de cADN usando como
sonda un oligonucleótido o polinucleótido que fue preparado
mediante síntesis química. Alternativamente, el cADN puede ser
obtenido mediante PCR usando cebadores que son derivados de la SEQ
ID Nº: 2. Tales métodos son conocidos por la persona con
experiencia en el campo.
El plásmido de expresión que contiene el cADN
del alergeno de artemisia de 40,9 kDa fue construido en el vector
pHis-parellel2 (véase la Figura 4). Para el
procedimiento de clonaje dos cebadores de clonaje flanqueantes
fueron construidos. La secuencia de cADN completa fue truncada en el
extremo 5' por 60 nucleótidos que codifican el péptido señal
putativo. De este modo solo la forma madura de la proteína fue
producida en E.coli.
Los siguientes cebadores fueron usados:
Mug-Nco-fwd 5' GAG AGA GAC CAT GGC
TCG GGC TGA CAT TGG TGA TGA GCT CG 3' (SEQ ID Nº: 4) y
Mug-Xho-rev 5' GAG AGA GAC TCG AGT
TAA CAA GGT TTT CCA GGA ACG CAT TTG 3' (SEQ ID Nº: 5) para PCR, los
sitios de restricción Nco I y Xho I fueron introducidos en los
extremos 5' y 3'. Los productos de PCR fueron digeridos con enzimas
de restricción Nco I y Xho I y ligados a los sitios respectivos del
vector pHis-parallel 2. El clon fue analizado
mediante secuenciación de ADN.
Para la producción recombinantes del alergeno de
artemisia de 40,9 kDa, la cepa BL21 de E. coli competente
(DE3, Stratagene, CA, USA) fue transformada con el plásmido de
expresión
pHis-parallel-2-M4 y
seleccionada en placas LB que contienen 100 mg/l de ampicilina. Un
única colonia transformante fue seleccionada y las bacterias fueron
hechas crecer en un procultivo de 25 ml durante toda la noche con
medio LB que contenía ampicilina a una densidad óptica de 0,6 a 600
nm. El medio con LB-amp fue añadido a un volumen de
250 ml.
Isopropil-\beta-D-galactopiranósido
(IPTG) fue añadido a una concentración final de 1 mM y con
incubación continua durante 7 horas a 37ºC. Las células bacterianas
fueron cultivadas mediante centrifugación y los precipitados fueron
resuspendidos en tampón fosfato 50 mM pH 8 que contiene NaCl 300 mM
e imidazol 10 mM. Las células fueron entonces rotas mediante tres
ciclos de congelación en nitrógeno líquido, seguido por
descongelación a 37ºC. Tras centrifugación a 5500 rpm durante 25
minutos, el sobrenadante fue retirado (fracción soluble) y se añadió
urea 6 M al precipitado. Tras centrifugación, el sobrenadante fue
retirado (fracción insoluble), y ambas fracciones, soluble e
insoluble, fueron analizadas mediante SDS-PAGE. La
proteína de artemisia de 40,9 kDa recombinante fue recuperada en la
fracción insoluble, que fue entonces usada para inmunotransferencias
con anticuerpos anti Amb a 1 (Figura 5B, carril 4) y con IgE de
suero a partir de pacientes alérgicos al polen de malas hierbas
(Figura 6, carriles 3 y 4). Como testigo, la cepa de E. coli
BL21 transformada con
pHis-parallel-2 sin inserto fue
procesada como se describe anteriormente y la fracción insoluble
usada para los experimentos de inmunotransferencia (Figuras 6,
carriles 5 y 6).
La Figura 5A, carril 1 muestra el extracto de
polen de artemisia que contiene todas las proteínas (alergenos o no
alergenos) liberadas a partir del polen.
150 mg de granos de polen de artemisia (Allergon
AB, Suecia) fueron mezclados con 1 ml de agua. La suspensión de
polen fue suavemente agitada a temperatura ambiente durante un
período de 10 horas. Tras la centrifugación, el patrón de proteínas
liberadas a partir del polen de artemisia fue analizado mediante
SDS-PAGE y tinción de Coomassie.
Carril 2 de la Figura 5ª muestra el alergeno del
polen de Artemisia de 40,9 kDa natural purificado. La purificación
fue hecha vía el método de cromatografía de inmunoafinidad.
Anticuerpos anti Amb a 1 purificados de conejo fueron acoplados a
Sepharosa CL4B activada con bromuro de cianógeno purificado
(Pharmacia Bitech) y usada para la purificación de la proteína de
artemisia de 40,9 kDa natural a partir de un extracto de polen
filtrado durante 10 horas.
El carril 3 de la Figura 5A muestra el Amb a 1
natural purificado, un alergeno principal en el polen de ambrosía.
La purificación fue hecha también vía cromatografía de
inmunoafinidad. Los anticuerpos de conejo anti Amb a 1 purificados
fueron acoplados a Sepharosa CL4B activada con bromuro de cianógeno
(Pharmacía Biotech) y usada para la purificación del Amb a 1
natural de un extracto de polen de ambrosía filtrado durante 10
horas incluyendo un inhibidor de proteasas 1 10 fenantrolina a 10
mM.
El alergeno de 40,9 kDa natural fue purificado a
partir de un extracto acuoso del polen de artemisia mediante
cromatografía de inmunoafinidad. Los anticuerpos
anti-Amb a 1 de conejo purificados fueron acoplados
a Sepharosa CL4B activada por CNBr y usada para la purificación del
alergeno de 40,9 kDa. El alergeno de 40,9 kDa natural purificado
fue luego ensayado en inmunotranferencias con anticuerpos
anti-Amb a 1 (Figura 5A, carril 2) y con
anticuerpos IgE de pacientes alérgicos (Figura 6, carriles 1 y
2).
Una reactividad cruzada tiene lugar entre un
paciente norteamericano sensibilizado para la ambrosía y la proteína
de 40,9 kDa natural y recombinante en artemisia. Por lo tanto una
señal positiva puede ser observada en la Figura 6A y 6B. Se espera
que muchos otros pacientes muestren una reactividad cruzada entre
estos dos alergenos.
La expresión de proteínas fue llevada a cabo en
E.coli BL21-dE3 que albergaba el plásmido
pHis parallel 2 con el cADN que codifica la proteína del polen de
artemisia de 40,9 kDa insertado.
El medio de cultivo (1% peptona, 0,5% extracto
de levadura, 0,5% NaCl, 100 g de Glicerina/1L, MgSO_{4} 2 mM, 20
g de (NH_{4})_{2}SO_{4}, PO_{4} 10 mM, pH ajustado a
7,4) fue inoculado con 3% de un cultivo saturado crecido durante
toda la noche, hecho crecer en el medio de cultivo con 150 \mug/ml
de penicilina G (Biochemie, Kundl, Austria). La fermentación fue
llevada a cabo en un fermentador de 10 L Bioflow 3000 (New
Brunswick Scientific co., Edison, NJ) a 37ºC con 7% de saturación de
oxígeno con agitación de 200-400 rpm e inducción
con 0,4 mM de IPTG a una densidad óptica de 0,8.
Las bacterias fueron recogidas mediante
centrifugación 5 horas tras la inducción (20 g de peso de células
húmedas a partir de un cultivo de 10 L) y resuspendidas en 100 mL de
tampón de lisis (50 mM de base Tris, EDTA 1 mM, 0,1% Triton
X-100, pH no ajustado, 5 mL/g de células). Tras la
adición de lisozima añadida en fresco (100 \mug/g células) e
incubación durante 1 hora a temperatura ambiente, las células fueron
lisadas mediante tres ciclos de congelación -descongelación a -70ºC
y 37ºC. El ADN fue roto con un ultraturax. La separación de la
fracción soluble fue hecha mediante centrifugación y los cuerpos de
inclusión crudos fueron lavados dos veces con 15 de Tritón
X-100, Tris-HCl 20 mM pH 8,0, EDTA 1
mM, seguido por dos lavados con 50% de etanol,
Tris-HCl 20 mM pH 8,0. Los cuerpos de inclusión
purificados fueron disueltos en 500 ml de urea 8 M, NaCl 0,5 M,
Tris HCl 20 mM pH 8,0, y cargados en una columna quelante Cellufine
de 150 ml (Millipore, Bedford, MA, USA) preequilibrada con el mismo
tampón, tras cambiarlo con 0,1 M de NiCl_{2} según las instrucción
del fabricante. Todas las etapas cromatográficas fueron llevadas a
cabo en un sistema de FPLC Biopilot (Amersham Biosciences, Uppsala,
Suecia). La proteína unida fue eluída con un gradiente lineal de
imidazol que va desde 0 a 500 mM. La pureza de las fracciones fue
analizada mediante SDS-PAGE convencional. Debido a
las impurezas (elevado fondo) de las fracciones que contiene la
proteína de polen de artemisia de 40,9 kDa recombinante, se llevó a
cabo la cromatografía de intercambio catiónico en condiciones
desnaturalizantes.
desnaturalizantes.
Una columna de 180 ml con la matriz CEC
"Matrex Cellufine C-500" (Millipore) fue
equilibrada con 200 ml de NaAc 100 mM a pH 5,5. Tras lavar la
columna con 400 ml de tampón de unión (5M de urea, 20 mM de NaAc, 10
mM de \beta-mercaptoetanol, 2 mM EDTA, pH 5,5) la
disolución proteica fue aplicada con un pH de 5,5.
De nuevo, las fracciones fueron analizadas
mediante SDS-PAGE y tinción de Coomassie. Las
fracciones que contienen la proteína de interés fueron recogidas y
preparadas para la etapa de filtración en gel en condiciones
desnaturalizantes y un pH básico.
La filtración en gel fue llevada a cabo en urea
6 M, NaCl 0,3 M, Tris HCl 30 mM pH 8,0, EDTA 2 mM,
\beta-mercaptoetanol 10 mM en una columna
Sephacryl S-200 HR (Amersham Biosciences, Uppsala,
Suecia) de dimensiones (50 x 1000 mm).
Las fraciones de proteínas de polen de artemisia
de 40,9 kDa puras fueron concentradas y replegadas mediante
filtración a través de un dispositivo de ultrafiltración de Amicon
(Millipore) mientras que se añadía NH_{4}HCO_{3} 5 mM. El
rendimiento total fue de 4-6 mg de proteínas.
La Figura 7, carril 3 muestra el alergeno de
polen de artemisia de 40,9 kDa recombinante purificado con
His-tag (\sim3 \mug) tras
SDS-PAGE y tinción de Coomassie.
Sueros de diferentes pacientes alérgicos o
sensibilizados fueron testados en lo que se refiere a su reactividad
frente al nuevo alergeno de polen de artemisia de 40,9 kDa. Los
ensayos fueron llevados a cabo según el siguiente protocolo:
- \bullet
- Geles de 15% SDS preparativos
- \bullet
- Carga \sim80 \mug de proteína de 40,9 kDa recombinante purificada (obtenida, por ejemplo, según el Ejemplo 5)
- \bullet
- Electroforesis en gel-SDS 100 V, 2,5 h
- \bullet
- Transferencia Western: sobre una membrana de PVDF 2 horas, 300 mA
- \bullet
- Incubación con el anticuerpos primario: suero humano: dilución 1:10 en tampón gold durante al menos 6 horas a temperatura ambiente.
- \bullet
- Etapas de lavado 3 x 10' en tampón gold
- \bullet
- Incubación con anticuerpo secundario: Anti IgE humano marcado radiactivamente [^{125}I] (también referido como RAST), suministrado por MedPro (Nº de Catálogo VE39020, 5,2 ml, 5 \muCi) 1:40 en tampón gold, durante toda la noche a temperatura ambiente
- \bullet
- Lavado 3 x 10' en tampón gold
- \bullet
- Colocar la pantalla del phosphorimager con el sitio blanco hacia las tiras de membranas
- \bullet
- Exponer la pantalla en el casete del phosphorimager 24-48 h
- \bullet
- Revelar la pantalla en el phosphorimager
\vskip1.000000\baselineskip
| Tampón de bloqueo= tampón gold (1L): | Na_{2}HPO | 47,5 g | |
| NaH_{2}PO | 41,0 g | ||
| BSA | 5,0 g | ||
| Tween-20 | 5,0 ml | ||
| Tampón de transferencia (por 5L): | base Tris | 15,13 g | |
| Glicina | 72,06 g | ||
| Metanol absoluto 1L | |||
| Añadir dH_{2}O |
\vskip1.000000\baselineskip
Un suero fue clasificado como "IgE
positivo" cuando la señal correspondiente a la banda de 40,9 kDa
fue significativamente más alta que la señal de fondo.
\newpage
Se obtuvieron los siguientes resultados:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Pacientes alérgicos a artemisia de Austria
(cantidad total de sueros de pacientes ensayados = 61)
- IgE- positivos: 36 = 59%
- IgE- negativos: 25 = 41%
Pacientes de EEUU, Canadá y Austria alérgicos a
ambrosía (cantidad total de sueros de pacientes ensayados = 56)
- IgE- positivos: 27 = 48%
- IgE- negativos: 29 = 52%
Cantidad total de sueros disponibles de
pacientes alérgicos a Artemisia: 73
- IgE- positivos: 27 = 49,4%
- IgE- negativos: 29 = 50,6%
Cantidad total de sueros disponibles a partir de
pacientes alérgicos a ambrosía: 130
- IgE- positivos: 27 = 20,8%
- IgE- negativos: 103 = 79,2%
Casi el 50% de los pacientes sensibilizados a
artemisia y alrededor del 20% de los pacientes sensibilizados a
ambrosía tienen anticuerpos IgE frente al alergeno de 40,9 kDa. Este
es un porcentaje relativamente elevado de pacientes sensibilizados
a este alergeno del polen de artemisia. Por consiguiente es
importante añadir esta molécula a una preparación de vacunas para
el tratamiento de esta alergia de los pacientes. Nuevas
aproximaciones para la terapia de la alergia van en la dirección de
preparaciones de vacunas adaptadas a los pacientes.
<110> Biomay Produktions- und
Handels-Aktiengesellschagt
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Proteína alergénica del polen de
artemisa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> Proteína alergénica del polen de
artemisa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 396
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PTR
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artemisia vulgaris
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1188
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artemisia vulgaris
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1188
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artemisia vulgaris
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 41
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagagagacc atggctcggg ctgacattgg tgatgagctc g
\hfill41
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 42
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Cebador
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgagagagact cgagttaaca aggttttcca ggaacgcatt tg
\hfill42
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1523
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artemisia vulgaris
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1513
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artemisia vulgaris
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1520
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artemisia vulgaris
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1535
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Artemisia vulgaris
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PTR
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Péptido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Glu Asn Gly Ala Ile Phe Val Ala Ser
Gly}
Claims (15)
1. Alergeno que consiste en un polipéptido que
comprende un fragmento de al menos 18 aminoácidos consecutivos de
la secuencia aminoacídica como se muestra en la SEQ ID Nº: 1.
2. Alergeno según la reivindicación 1, en la que
dicho fragmento es capaz de unirse a anticuerpos IgE de un
individuo que es alérgico frente al polen de artemisia.
3. Alergeno según la reivindicación 1 ó 2, que
comprende la secuencia aminoacídica como se muestra en la SEQ ID
Nº: 1.
4. Alergeno según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque es capaz de
unirse a anticuerpos IgE de un individuo que es alérgico frente al
polen de ambrosía.
5. Un polinucleótido seleccionado de un grupo
que consiste en
a) polinucleótidos que codifican la secuencia
aminoacídica como se muestra en la SEQ ID Nº: 1;
b) polinucleótidos que codifican un polipéptido
como se reivindica en la reivindicación 1 y
c) polinucleótidos que comprenden la secuencia
nucleotídica como se muestra en la SEQ ID Nº: 2 o la secuencia
nucleotídica como se muestran en la SEQ ID Nº: 3,
o la hebra complementaria de tal
polinucleótido.
6. Un plásmido o un vector que comprende un
polinucleótido como se reivindica en la reivindicación 5.
7. Una célula que contiene un plásmido o un
vector como se reivindica en la reivindicación 6.
8. Una célula según la reivindicación 7, que es
seleccionada del grupo que consiste en células vegetales, células
bacterianas y células de levadura.
9. Un proceso para la preparación de un alergeno
como se reivindica en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4
que comprende la etapa de cultivar células como se reivindica en la
reivindicación 7 u 8 en condiciones apropiadas para la expresión
del polipéptido y opcionalmente recuperar subsiguientemente el
polipéptido.
10. Un proceso según la reivindicación 9, en la
que las células están abiertas y el polipéptido es recuperado
usando cromatografía de afinidad.
11. Una composición farmacéutica que comprende
un alergeno como se reivindica en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 y/o un polinucleótido como se reivindica en
al reivindicación 5.
12. El uso de un alergeno como se reivindica en
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un polinucleótido
como se reivindica en la reivindicación 5, para la preparación de un
medicamento para el tratamiento o la prevención de la alergia al
polen de las malas hierbas.
13. Un uso según la reivindicación 12, en el que
el medicamento es administrado a un individuo que ha de ser
desensibilizado.
14. Un kit útil para el diagnóstico, el
tratamiento y/o la prevención de un trastorno alérgico que comprende
un alergeno como se reivindica en una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4 y/o un polinucleótido como se reivindica en
la reivindicación 5.
15. El uso de un alergeno como se reivindica en
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 o un polinucleótido
como se reivindica en la reivindicación 5, para el diagnóstico de la
alergia al polen de malas hierbas.
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|---|---|---|---|
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