ES2224660T3

ES2224660T3 - Productos terapeuticos de aril nitrona destinados al tratamiento de los trastornos intestinales inflamatorios.

Info

Publication number: ES2224660T3
Application number: ES99922983T
Authority: ES
Inventors: William D. Flitter; William A. Garland; Beverly Greenwood-Van Meerveld; Ian Irwin
Original assignee: Renovis Inc
Current assignee: Renovis Inc
Priority date: 1998-05-19
Filing date: 1999-05-18
Publication date: 2005-03-01
Anticipated expiration: 2019-05-18
Also published as: CA2332462A1; PT1077694E; ATE271384T1; AU3985599A; DK1077694T3; EP1077694A1; EP1077694B1; SI1077694T1; NZ508176A; DE69918826T2; DE69918826D1; WO1999059576A1

Abstract

Composición farmacéutica para el tratamiento o la profilaxis de los trastornos intestinales inflamatorios que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz para el tratamiento de los trastornos intestinales inflamatorios de un compuesto seleccionado de entre el grupo que consta de: N-tert-butil--(3, 5-di-tert-butil-2- hidroxifenil)nitrona, N-isobutil--fenilnitrona, N-bencil--(4-acetamidofenil)nitrona, N-tert-butil--(1-metilindol-3-il)nitrona, N-tert-butil--(3, 5-di-tert-butil-4- acetoxifenil)nitrona, N-tert-butil--(4-aminosulfonilfenil)nitrona y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Description

Productos terapéuticos de aril nitrona destinados al tratamiento de los trastornos intestinales inflamatorios.

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere al tratamiento de los trastornos intestinales inflamatorios (IBD). Más específicamente, la presente invención se refiere a procedimientos para tratar o prevenir la IBD utilizando compuestos de aril nitrona. La presente invención se refiere asimismo a composiciones farmacéuticas que contienen compuestos de aril nitrona y son útiles para el tratamiento o la profilaxis de IBD.

Estado de la técnica

El término trastornos intestinales inflamatorios ("IBD") describen un grupo de trastornos inflamatorios crónicos de causas desconocidas que implican al tubo digestivo ("tubo GI"). El número de casos diagnosticados de IBD en los Estados Unidos se estima que es de aproximadamente 200 para una población de 100.000 o aproximadamente 500.000 personas. Los pacientes con IBD se pueden dividir en dos grupos principales, los de colitis ulcerosa ("UC") y los de la enfermedad de Crohn ("CD").

En los pacientes con UC, existe una reacción inflamatoria que afecta principalmente a la mucosa del colon. La inflamación es normalmente uniforme y continua sin que intervengan áreas de mucosa normal. Las células de las mucosas superficiales, así como del epitelio de la cripta y de la submucosa están afectadas de una reacción inflamatoria con infiltración neutrófila. Últimamente, esta situación evoluciona normalmente a lesión epitelial con pérdida de células epiteliales dando como resultado múltiples ulceraciones, fibrosis, displasia y contracción del colon.

CD se diferencia de UC en que la inflamación se extiende a través de todas las capas de la pared intestinal y afecta al mesenterio así como a los ganglios linfáticos. CD puede afectar cualquier parte del canal alimentario desde la boca al ano. La enfermedad es con frecuencia discontinua, es decir, segmentos gravemente enfermos del intestino están separados de las áreas aparentemente libres de enfermedad. En CD, la pared del intestino también se espesa, lo que puede conducir a obstrucciones. Además, no son infrecuentes las fístulas y fisuras.

Clínicamente, IBD se caracteriza por diversas manifestaciones que producen con frecuencia un curso crónico, impredecible. La diarrea hemorrágica y el dolor abdominal van acompañadas con frecuencia de fiebre y pérdida de peso. La anemia no es infrecuente, mientras sea debilidad grave. Las manifestaciones en las articulaciones que oscilan desde la artralgia a la artritis aguda, así como anomalías en la función hepáticas están asociadas normalmente a IBD. Los pacientes con IBD presentan también un aumento de riesgo de carcinomas de colon en comparación con la población general. Durante los "ataques" agudos de IBD, el trabajo y otras actividades normales son normalmente imposibles y con frecuencia se hospitaliza al paciente.

Aunque la causa de IBD permanece desconocida, han estado implicados varios factores tales como el genético, el infeccioso y la susceptibilidad inmunológica. IBD es mucho más frecuente en los caucasianos, específicamente en los descendientes de los judíos. La naturaleza inflamatoria crónica de la enfermedad ha acelerado una investigación intensa de una posible causa infecciosa. Aunque se han encontrado agentes que estimulan la inflamación aguda, no se ha encontrado ninguno que produzca la inflamación crónica asociada a IBD. La hipótesis de que IBD es una enfermedad autoinmunitaria se apoya en la manifestación extraintestinal de IBD mencionada anteriormente como artritis de las articulaciones y la conocida respuesta positiva a IBD por el tratamiento con agentes terapéuticos tales como los glucocorticoides adrenales, la ciclosporina y la azatioprina, que son conocidos por suprimir la respuesta inmunitaria. Además, el tubo GI, más que ningún otro órgano del cuerpo, está expuesto continuamente a sustancias antigénicas potenciales tales como las proteínas de la alimentación, los subproductos bacterianos (LPS), etc.

Una vez se ha hecho el diagnóstico, normalmente por endoscopia, los objetivos de la terapia son provocar y mantener una remisión. Los últimos agentes tóxicos con los que son tratados los pacientes normalmente son los aminosalicilatos. Sulfasalazina (Azulfidina), administrada normalmente cuatro veces al día, consiste en una molécula activa de aminosalicilato (5-ASA) que está unida por un enlace azo a una sulfapiridina. Las bacterias anaeróbicas en el colon rompen el enlace azo para liberar 5-ASA activo. Sin embargo, al menos el 20% de los pacientes no puede tolerar la sulfapiridina porque está asociada a importantes efectos secundarios, tales como las anomalías del espermatozoide reversible, dispepsia o reacciones alérgicas al componente sulfa. Esos efectos secundarios se reducen en los pacientes que toman olsalazina. Sin embargo, ni la sulfasalazina ni la olsalazina son eficaces para el tratamiento de la inflamación del intestino delgado. Se han desarrollado otras formulaciones de 5-ASA las cuales se liberan en el intestino delgado (p. ej. mesalamina y asacol). Normalmente tarda de 6 a 8 semanas para que la terapia con 5-ASA muestre la eficacia completa.

Los pacientes que no responden a la terapia con 5-ASA o que padecen una enfermedad más grave, se les receta corticosteroides. Sin embargo, ésta es una terapia a corto plazo y no se puede utilizar como una terapia de mantenimiento. La remisión clínica se consigue con corticosteroides en 2 a 4 semanas, sin embargo los efectos secundarios son importantes e incluyen la cara dorada de Cushing, vello facial, cambios graves de humor e insomnio. La respuesta a las preparaciones de sulfasalazina y 5-aminosalicilato es escasa en la enfermedad de Crohn, de buena a suave en la colitis ulcerosa precoz y escasa en la colitis ulcerosa grave. Si estos agentes fallan, se prueban normalmente agentes inmunosupresores potentes tales como la ciclosporina, prednisona, 6-mercapto-purina o azatioprina (se transforma en el hígado en 6-mercaptopurina). Para los pacientes de la enfermedad de Crohn, se debe controlar con cuidado la utilización de corticoesteroides y de otros inmunosupresores debido al alto riesgo de sepsia intra-abdominal que se origina en las fístulas y abscesos corrientes en esta enfermedad. Aproximadamente el 25% de los pacientes con IBD necesitarán intervención quirúrgica (colectomía) durante el curso de la enfermedad.

Los radicales libres con oxígeno tales como HO\bullet, el anión superóxido y otras especies reactivas de oxígeno tal como HOCl, han surgido como una vía común de la lesión del tejido en una amplia variedad de enfermedades cuya causa subyacente es una respuesta inmunitaria inapropiadamente vigorosa y mantenida (insuficiente para controlar o regular por disminución la respuesta al estímulo inicial, apropiado). Ejemplos de otras enfermedades, además de IBD y artritis, en las que este mecanismo parece ser la causa operativa son ARDS, choque séptico, asma, diabetes, esclerosis múltiple, uveítis, etc. Típicamente, tanto una respuesta inmunitaria mediada por citocinas como una cascada inflamatoria no específica están implicadas en la respuesta primaria inapropiada con ambas respuestas mediadas a través de especies de oxígeno activo (agresión oxidante). La respuesta secundaria inapropiada, mediada también por la agresión oxidante puede implicar la oxidación que altera el tejido por neutrófilos y macrófagos del tejido.

Para suprimir esta respuesta inflamatoria inapropiada se han considerado varios planteamientos. Los inhibidores de moléculas pequeñas de varias vías de leucotrieno, PAD y ciclooxigenasa han mostrado solamente eficacia limitada, quizás porque bloqueando solamente una de las vías principales no proporcionan una disminuación suficientemente grande en la agresión oxidante general. Otro planteamiento ha consistido en la utilización de anticuerpos o de moléculas de receptor clonado que dirigen las proteínas específicas en la cascada inflamatoria, tales como IL-1, IL-6 o TNF-\alpha. Sin embargo, este planteamiento es práctico sólo para enfermedades agudas, como el choque séptico o ARDS, en las que la administración IV y la formación de anticuerpos contra la proteína terapéutica es de menor interés. Para una enfermedad crónica como IBD, el procedimiento preferido de tratamiento sería una molécula pequeña activa por vía oral que es completamente activa cuando se dosifica una vez al día.

Otro planteamiento para mitigar la agresión oxidante que procede de una respuesta inflamatoria es emplear productos terapéuticos relacionados con nitrona (NRT). El prototipo NRT es \alpha-fenil-t-butil nitrona (PBN) mostrado a continuación.

1

Los NRT representan una nueva categoría de productos terapéuticos con capacidad inherente para superar los inconvenientes de otros compuestos estudiados anteriormente. Entre otras propiedades, los NRT tal como PBN se cree que atrapan radicales libres (R\bullet) adicionando el radical para formar un radical libre nitroxilo más inreactivo.

Las nitronas se utilizaron al principio como herramientas analíticas capaces de reaccionar con radicales muy reactivos para dar aductos del radical libre que son mucho menos reactivos. En muchos casos, el complejo radical/aducto de nitrona es lo suficiente estable para permitir el aislamiento in vivo y la cuantificación utilizando resonancia de spin electrónico (ESR). El concepto de utilizar nitronas como productos terapéuticos, por ejemplo, en enfermedades neurodegenerativas procede de las observaciones de que la nitronas, tales como PBN, atrapan especies de oxígeno reactivo y/o radicales secundarios libres después de la isquemia. Los efectos terapéuticos de las nitronas pueden resultar porque las nitronas transforman radicales muy reactivos en productos mucho menos reactivos. Determinados NRT se ha demostrado que protegen a los animales experimentales de la lesión de isquemia/reperfusión (apoplejía). Los NRT administrados a largo plazo, invierten el aumento relacionado con la edad en la proteína dañada oxidativamente y disminuyen con la edad la actividad de la enzima sensible oxidante, glutaminasintetasa, en el cerebro.

El documento WO 99 20 601 describe composiciones farmacéuticas para el tratamiento y prevención de IBD que comprenden una clase específica de compuestos de nitrógeno con patrones de sustitución específica que tienen compuestos de nitrógeno como agente activo.

Acompañando los cambios mediados por NRT en la proteína oxidada y a la actividad de la glutamina sintetasa existe una mejora significativa en la actuación de los animales en las pruebas de comportamiento que miden la memoria espacial a corto plazo. Por ejemplo se ha demostrado que el prototipo de NRT mitiga los efectos de esta cascada inflamatoria en numerosos modelos in vivo. De particular interés es la protección constante y bien documentada demostrada por PBN contra la letalidad inducida por LPS en varios modelos de roedor de choque séptico. De forma destacada, PNB ha demostrado también aumentar el tiempo de vida de los ratones acelerado por la vejez en un tercio, quizás al mitigar la alteración por el radical libre. PBN ha demostrado asimismo bloquear la óxido nítrico-sintetasa inducible ("iNOS"), enzima responsable de producir grandes cantidades de NO\bullet sumamente dañino. Por lo tanto, PBN puede atrapar tanto HO\bullet como suprimir la formación de NO\bullet, neutralizando potencialmente los efectos de los dos agentes considerados los más dañinos para el tejido.

Al evaluar las expectativas de utilización de un antioxidante para tratar IBD con éxito, es quizás también útil considerar que la defensa con antioxidante del colon humano es relativamente deficiente comparada con el hígado humano (concentraciones en mucosas de SOD, catalasa y GSH que representan el 8%, 4% y 40%, respectivamente de las concentraciones en el hígado), dejando por lo tanto el colon particularmente sensible a la agresión oxidante. Se ha realizado un número considerable de modificaciones químicas para aumentar adecuadamente los NRT como agentes terapéuticos. Se han examinado los efectos de la reactividad química intrínseca y de la capacidad de oclusión radical sustituyendo el anillo fenilo con sustituyentes donadores de electrones o captadores de electrones. Se han preparado más análogos solubles en agua que tienen, por ejemplo, un grupo carboxilato o sulfonato de sodio en el anillo fenilo. Además, se han preparado análogos lipófilos con sustituciones del grupo funcional en el anillo fenilo o en el nitrógeno del nitronilo. Se ha variado también el sustituyente nitrógeno del alquilo por los sustituyentes C_{3}-C_{5} de cadena lineal y ramificada habituales. Los isoésteres de nitrona y los compuestos relacionados se han dirigido también y examinado su eficacia. Este planteamiento ha conducido a varias clases de compuestos, tales como las ureas, amidas, tioamidas, derivados de azoxi, sulfonas y ácidos hidroxámicos sustituidos. Entre estos, algunos compuestos de benzamida sustancialmente similares en estructura a algunas nitronas tal como PBN, han demostrado tener actividad en el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, la demencia por VIH y en las enfermedades relacionadas.

Como un aspecto final de los antecedentes, evaluando la eficacia de los compuestos en el tratamiento de IBD, se utiliza un modelo in vivo basado en ácido sulfónico de trinitrobenceno ("TNBS").

Las referencias que se refieren a los temas mencionados anteriormente incluyen:

Glickman, RM (1994) Inflammatory Bowel Disease en Harrison's Principles of Internal Medicine (McGraw Hill, New York, NY) Capítulo 255: 1403-1416.

Calkins, BM, Mendeloff, A1 (1986) Epidemiology of Inflammatory Bowel Disease, Epidemiology Review 8: 60-90.

Levin, B. (1992) Inflammatory Bowel Disease and Colon Cancer, Cancer (Supplement), 70: 1313-131 6.

Crotty. B. (1994) Ulcerative Colitis and Xenobiotic Metabolism, Lancet, 343: 35-38

Hanauer, SB, Baert, F. (1994) Medical Therapy of Inflammatoty Bowel Disease, Med Clin North Am, 78: 1413-1426.

MacDermott, RP (1994) Alterations in the Mucosal System in Ulcerative Colitis and Crohn's Disease. Med Clin North Am, 78: 1207-1231.

Hanauer, B. (1993) Medical Therapy of Ulcerative Colitis, Lancet, 342: 412-417.

Winrow, VR, Winyard, PG, Morris, CJ, Blake, DR (1993) Free radicals in Inflammation: Second Messengers and Mediators of Tissue Destruction, Br Med Bull49: 506-522.

Floyd, RA y Carney, J., Nitrone Radical Traps (NRTs) Protect in Experimental Neurodegenerative Diseases, in Neuroprotective Approaches to the Treatment of Parkinson's Disease and Other Neurodegenerative Disorders (Olanow, CW, Jenner, P and Youssim E, Eds.) Academic Press, New York, New York, in press.

Cao, X. y Phillis, JW (1994) a-Phenyl-N-tert-butyl-nitrone Reduces Cortical lnfarct and Edema in Rats Subjected to Focal Ischemia. Brain Res. 644: 267-272.

Zhao, Q., Pahlmark, K., Smith, M,-J., y Siesjo, B. (1994) Delayed Treatment with the Spin Trap a-phenyl-n-tert-butyl nitrone (PBN) Reduces Infarct Size Following Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Rats. Acta Physiol. Scad. 152: 349-350.

Oliver, CN, Starke-Reed, PE, Stadtman, ER, Carney, JM y Floyd, RA (1990) Oxidative Damage to Brain Proteins, Los of Glutamine Synthetase Activity and Production of Free Radicals During lschemia Induced Injury to Gerbil Brain. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 51 44-5147.

Carney, JM, Starke-Reed, PE Oliver, CN, Landrum, RW, Cheng, MS, Wu, JF y Floyd, RA (1991) Reversal or age-related increase in brain protein oxidation in enzyme activity, and loss in temporal and spatial memory by chronic administration of the spin-trapping compound N-tert-butyl-a-phenylnitrone. Proc. Natl. Acad. Sci., 88:3633-3636.

Novelli, GP (1992) Oxygen Radicals in Experimental Shock: Effects of Spin-Trapping Nitrones in Ameliorating Shock Pathophysiology, Critical Care Medicine, 20: 499-507.

Hamburger, SA, McCay, PB (1989) Endotoxin-Induced Mortality in Rats is Reduced by Nitrones, Circulatory Shock, 29:329-334.

Progrebniak, HW, Merino, MJ, Hahn, SM, Mitchell, JB, Pass, HI (1992) Spin Trap Salvage from Endotoxemia: The Role of Cytokine Down-Regulation, Surgery, 112: 130-139.

McKechnie, K., Furman, BL, Paratt JR (1986), Modification by Oxygen Free Radical Scavengers of the Metabolic and Cardiovascular Effects of Endotoxin Infusion in Conscious Rats, Circulatory Shock 19: 429-439.

Edamatsu, R, Mori, A., Packer, L (1995) The Spin Trap N-tert-\alpha-phenylbutylnitrone Prolongs the Life Span of the Senescence Accelerated Mouse, Biochem Biophys Res Comm 211 : 847-849.

Miyajima, T., Kotake, Y. (1995) Spin Trapping Agent, Phenyl N-Tert-Butyl Nitrone, Inhibits Induction of Nitric Oxide Synthase in Endotoxin-Induced Shock in Mice, Biochem Biophys Res Commun, 215: 114-121.

Boettner, GR (1987) ESR Parameters of Spin Adducts, Free Radical Biology, 3: 259-303.

Harris, ML, Schiller, HJ, Reilly, PM, Donowitz, M, Grisham, MB, Bulkley (1992), Free Radicals and Other Reactive Oxygen Metabolites in Imflammatory Bowel Disease: Cause, Consequence or Epiphenomenom, Pharmacol. Ther., 53: 375-408.

Grisham MB, MacDermott, RP, Deitch EA (1990), Oxidant Defence Mechanisms in the Human Colon, Inflammation, 14: 669-680.

Elson, CO, Startor, RB, Tennyson, GS, Ridell, RH (1995), Experimental Models of lnflammatory Bowel Disease, Gastroenterology, 109: 1344-1367.

Yamada, T, Marshall, S, Specian, RD, Grisham, MB (1992) A Comparative Analysis of Two Models of Colitis in Rats, Gastroenterology, 102: 1524-1534.

Wallace, JA, MacNaughton, WK, Morris, GP, Beck PL (1989) Inhibition of Leulotriene Synthesis Markedly Accelerates Healing in a Rat Model of lnflammatoty Bowel Disease, Gastroenterology, 95: 29-35.

Higa, A. McKnight, GW, Wallace, JL (1993) Attenuation of Epithelial Injury in Acute Experimental Colitis by Immunomodulators, Eur. J. Pharmacol. 239: 171 -178.

Castro, GA, Roy, SA, Stockstill, RD (1974) Trichinella Spiralis: Peroxidase Activity in Isolated Cells from the Rat Intestine, Exp. Parasitol., 36: 307-315.

Sumario de la invención

Se ha observado que determinados compuestos de aril nitrona son eficaces para el tratamiento y la profilaxis de IBD.

Por consiguiente, en uno de sus aspectos de la composición, esta invención proporciona una composición farmacéutica para el tratamiento o la profilaxis de los trastornos intestinales inflamatorios que comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz para el tratamiento de los trastornos intestinales inflamatorios de un compuesto seleccionado de entre el grupo que consta de:

N-tert-butil-\alpha-(3,5-di-tert-butil-2-hidroxifenil)nitrona,

N-isobutil-\alpha-fenilnitrona,

N-bencil-\alpha-(4-acetamidofenil)nitrona,

N-tert-butil-\alpha-(1-metilindol-3-il)nitrona,

N-tert-butil-\alpha-(3,5-di-tert-butil-4-acetoxi)nitrona,

N-tert-butil-\alpha-(4-aminosulfonilfenil)nitrona,

y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a la utilización de un compuesto tal como el mencionado anteriormente para la preparación de un medicamento para tratar a un paciente que padece o es susceptible a sufrir trastornos intestinales inflamatorios. Por consiguiente, la utilización según la invención se refiere a una medicamento que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz para el tratamiento de los trastornos intestinales inflamatorios de un compuesto seleccionado de entre el grupo que consta de:

N-tert-butil-\alpha-(3,5-di-tert-butil-2-hidroxifenil)nitrona,

N-isobutil-\alpha-fenilnitrona,

N-bencil-\alpha-(4-acetamidofenil)nitrona,

N-tert-butil-\alpha-(1-metilindol-3-il)nitrona,

N-tert-butil-\alpha-(3,5-di-tert-butil-4-acetoxi)nitrona,

N-tert-butil-\alpha-(4-aminosulfonilfenil)nitrona,

y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Las composiciones farmacéuticas según la invención se pueden administrar por vía oral, parenteral o rectal. Éstas composiciones son eficaces cuando los trastornos intestinales inflamatorios son la colitis ulcerosa o la enfermedad de Crohn.

En una forma de realización según la invención, la composición farmacéutica se debe administrar preferentemente en forma de dosis oral en una cantidad comprendida entre 0,1 y aproximadamente 150 mg/kg del peso del paciente.

En otra forma de realización, la composición farmacéutica se debe administrar preferentemente por vía intravenosa en una cantidad comprendida entre 0,01mg/kg/hora y 100 mg/kg/hora del peso del paciente durante al menos aproximadamente 1 hora.

En otra forma de realización todavía, la composición farmacéutica se debe administrar preferentemente por vía rectal en una cantidad comprendida entre 1 y aproximadamente 150 mg/kg del peso del paciente.

En uno de sus aspectos, la presente invención se refiere asimismo a nuevos compuestos de aril nitrona. Por consiguiente, la presente invención se refiere a cada uno de los compuesto siguientes:

N-isobutil-\alpha-fenilnitrona,

N-bencil-\alpha-(4-acetamidofenil)nitrona,

N-tert-butil-\alpha-(4-aminosulfonilfenil)nitrona,

y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

Descripción detallada de la invención

Las utilizaciones y composiciones farmacéuticas de la presente invención emplean una o más aril nitronas como agente activo. Para los fines de la presente invención, los compuestos de aril nitrona se denominan utilizando la nomenclatura de nitrona convencional, es decir, el átomo de carbono del doble enlace carbono-nitrógeno (C=N) se denomina posición \alpha y los sustituyentes en el átomo de nitrógeno del doble enlace carbono-nitrógeno se les da el prefijo N-. Por ejemplo, N-tert-butil-\alpha-(4-benciloxifenil)nitrona (que no forma parte de la presente invención) tiene la fórmula:

2

Todos los isómeros geométricos de los compuestos de nitrona estarían incluidos dentro del alcance de la presente invención incluyendo, por ejemplo, todos los isómeros (es decir, los isómeros E y Z) del doble enlace carbono-nitrógeno del grupo funcional nitrona. Las nitronas cíclicas se denominan utilizando la nomenclatura de la patente U.S. nº 5.292.746, concedida el 8 de marzo de 1994 a Carr.

Al describir las aril nitronas, las composiciones farmacéuticas y las aplicaciones de la presente invención, los términos siguientes tienen los significados siguientes a menos que se especifique de otra forma.

"Acetamido" se refiere al grupo "-NHC(O)CH_{3}".

"Aminosulfonilo" se refiere al grupo "-S(O)_{2}NH_{2}".

"1-hidroxi-2-metilprop-2-il" se refiere al grupo "-C(CH_{3})_{2}CH_{2}OH".

"Sulfonato" o "sulfo" se refiere al grupo "-SO_{3}H" y a las sales del mismo.

"Sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a las sales que son aceptables para la administración a mamíferos incluyendo, a título de ilustración, las sales de metales alcalinos y alcalinotérreos y las sales de adición de ácidos libres y aminas. Dichas sales farmacéuticamente aceptables pueden proceder de una variedad de contra-iones orgánicos e inorgánicos bien conocidos en la técnica e incluyen, a título de ejemplo únicamente, sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio, tetraalquilamonio y similares; y cuando la molécula contenga un grupo funcional básico, las sales de ácidos orgánicos o inorgánicos, tales como hidrocloruro, hidrobromuro, tartrato, mesilato, acetato, maleato, oxalato y similares.

El término "catión farmacéuticamente aceptable" se refiere a un contra-ion catiónico farmacéuticamente aceptable de un grupo funcional ácido. Dichos cationes están ejemplificados por cationes de sodio, potasio, calcio, magnesio, amonio, tetraalquilamonio y similares.

Procedimientos de síntesis generales

Los compuestos de aril nitrona de la presente invención se pueden preparar a partir de materiales de partida fácilmente disponibles utilizando los métodos y procedimientos generales siguientes. Se valorará que cuando se den las condiciones típicas o del proceso preferidas (es decir, temperaturas de reacción, tiempos, relaciones molares de los reactivos, disolvente, presiones, etc.) se puedan utilizar asimismo otras condiciones de proceso a menos que se indique de otra manera. Las condiciones óptimas de reacción pueden variar con los reactivos o disolventes particulares utilizados, pero dichas condiciones pueden ser determinadas por un experto en la técnica mediante procesos de optimización rutinarios.

Además, como se pondrá de manifiesto por los expertos en la técnica, pueden ser necesarios grupos protectores convencionales para impedir que determinados grupos funcionales experimenten reacciones no deseadas. La selección de un grupo protector adecuado para un grupo funcional determinado así como las condiciones adecuadas para proteger y desproteger varios grupos funcionales son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, numerosos grupos protectores y su introducción y eliminación, se describen en T. W. Greene y G. M. Wuts, Protecting Groups in Organic Synthesis, segunda edición, Wiley, Nueva York, 1991, y referencias citadas en esta memoria.

En un método preferido de síntesis, los compuestos de aril nitrona de esta invención se preparan acoplando benzaldehído o un derivado de benzaldehído, tal como 2,4-disulfobenzaldehído, 4-acetamidobenzaldehído o 4-aminosulfonilbenzaldehído con una hidroxilamina de fórmula:

HO-NH-R^{1}

en la que R^{1} es isobutilo, tert-butilo, bencilo, 1-hidroxi-2-metilprop-2-ilamina en las condiciones de reacción convencionales.

La reacción de acoplamiento se realiza normalmente poniendo en contacto el benzaldehído con al menos un equivalente, con preferencia aproximadamente 1,1 a aproximadamente 2 equivalentes, de la hidroxilamina en un disolvente polar inerte tales como metanol, etanol, 1,4-dioxano, tetrahidrofurano, dimetilsulfóxido, dimetilformamida y similares. Esta reacción se lleva a cabo preferentemente a una temperatura comprendida entre aproximadamente 0ºC a aproximadamente 100ºC durante aproximadamente 1 a aproximadamente 48 horas. Opcionalmente, se puede emplear en esta reacción una cantidad catalítica de un ácido, tal como ácido acético, ácido clorhídrico, ácido p-toluen-sulfónico y similares.

Además, al realizar la reacción de acoplamiento con 2,4-disulfobenzaldehído, los grupos sulfonatos se transforman preferentemente en sales adecuadas, tales como la sal de litio, de sodio o de potasio, antes de poner en contacto la hidroxilamina con el compuesto de benzaldehído. Los grupos sulfonato se transforman fácilmente en la correspondiente sal poniendo en contacto el disulfonato con al menos dos equivalentes de una base adecuada, tales como hidróxido de litio, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidruro de sodio y similares.

Una vez terminada la reacción de acoplamiento, la aril nitrona se recupera por métodos convencionales incluyendo precipitación, cromatografía, filtración, destilación y similares.

Los compuestos de benzaldehído empleados en la reacción de acoplamiento están disponibles en el comercio o se pueden preparar a partir de materiales de partida disponibles en el comercio utilizando procedimientos y reactivos convencionales.

Los compuestos de hidroxilamina utilizados en la reacción de acoplamiento son además compuestos conocidos o compuestos que se pueden preparar a partir de compuestos conocidos utilizando procedimientos y reactivos convencionales. Normalmente, los compuestos de hidroxilamina se preparan reduciendo el correspondiente compuesto nitro (es decir, R^{1}-NO_{2}) utilizando un catalizador adecuado tal como un catalizador de cinc activado/ácido acético, de cinc activado/cloruro de amonio o un catalizador de amalgama aluminio/mercurio. Esta reacción se realiza normalmente a una temperatura que oscila entre aproximadamente 15ºC y aproximadamente 100ºC durante aproximadamente 0,5 a 12 horas, preferentemente aproximadamente de 2 a 6 horas, en un medio de reacción acuoso, tal como una mezcla de alcohol/agua en el caso del catalizador de cinc o en una mezcla éter/agua en el caso del catalizador de amalgama de aluminio. Los compuestos nitro-alifáticos (en forma de sus sales) se pueden reducir también a hidroxilaminas utilizando borano en tetrahidrofurano.

Debido a que algunas hidroxilaminas tienen estabilidad limitada, dichos compuestos se preparan generalmente inmediatamente antes de la reacción con el compuesto de benzaldehído. Por otra parte, las hidroxilaminas se pueden reservar a menudo (o adquirir en el comercio) en forma de sus sales de hidrocloruro. En tales casos, la hidroxilamina libre se genera normalmente inmediatamente antes de la reacción con el compuesto de benzaldehído por reacción de la sal hidrocluro con una base adecuada, tal como hidróxido de sodio, metóxido de sodio y similares.

Por otra parte, las aril nitronas de la presente invención se pueden preparar acoplando el compuesto de benzaldehído con la amina apropiada para formar una imina intermedia, oxidando a continuación la imina como se describe, por ejemplo, en Hinton et al., J. Org. Chem. 1992, 57, 2646.

Además, en la patente U.S. nº 5.475.032, concedida el 12 de diciembre de 1995 a J. M. Carney se describe la síntesis de N-tert-butil-\alpha-(2,4-disulfofenil)nitrona.

La síntesis de las nitronas cíclicas se describe, por ejemplo, en la patente U.S. nº 5.292.746, concedida el 8 de marzo de 1994 a Carr.

Composiciones farmacéuticas

Cuando se utilizan como productos farmacéuticos, las aril nitronas empleadas en la presente invención se administran normalmente en forma de composición farmacéutica. Dichas composiciones se pueden preparar utilizando procedimientos bien conocidos en la técnica farmacéutica y comprenden al menos un compuesto activo.

En general, los compuestos de la presente invención se administran en una cantidad farmacéuticamente eficaz. La cantidad de compuesto administrada de hecho la determinará normalmente un médico, a la luz de las circunstancias oportunas, incluyendo la enfermedad que se ha de tratar, la vía de administración seleccionada, el compuesto administrado existente, la edad, el peso y la respuesta de cada paciente, la gravedad de los síntomas del paciente y similares.

El(los) compuesto(s) de aril nitrona se formulan normalmente en una composición farmacéutica adecuada para administración oral, parenteral (p. ej. inyección intravenosa o intramuscular) o rectal (p. ej. supositorio).

Las composiciones para administración oral pueden tomar la forma de soluciones o suspensiones líquidas, polvos, comprimidos, cápsulas o similares. En dichas composiciones, la aril nitrona es normalmente un componente menor (0,1 a aproximadamente 50% en peso) siendo el resto varios vehículos o excipientes y auxiliares del tratamiento útiles para formar la forma de dosificación deseada. Una forma líquida puede incluir un vehículo acuoso o no acuoso adecuado con tampones, agentes dispersantes en suspensión, colorantes, esencias y similares.

Una forma sólida puede incluir, por ejemplo, cualquiera de los siguientes ingredientes o compuestos de naturaleza similar: un aglutinante tal como celulosa microcristalina, goma de tragacanto o gelatina; un excipiente tal como almidón o lactosa; un agente disgregador tal como ácido algínico, Primogel o almidón de maíz; un lubricante tal como estearato de magnesio; un suavizante tal como dióxido de silicio coloidal; un agente edulcorante tal como sacarosa o sacarina; o un agente potenciador de sabor tal como menta, azúcar, salicilato de metilo o un aromatizante de naranja.

Las composiciones inyectables se basan normalmente en la solución salina inyectable esterilizada o en la solución salina tamponada con fosfato o en otros excipientes inyectables conocidos en la técnica. De nuevo, la aril nitrona activa es normalmente un componente minoritario, estando comprendida con frecuencia entre aproximadamente 0,05 y 10% en peso, siendo el resto el vehículo inyectable y similares.

La administración rectal normalmente es por supositorios. Los supositorios se preparan generalmente con un componente base de manteca de cacao, gelatina glicerinada, aceites vegetales hidrogenados, mezclas de polietilenglicoles de varios pesos moleculares o ésteres de ácido graso de polietilenglicol. La aril nitrona activa normalmente es un componente minoritario, con frecuencia comprendido entre aproximadamente 0,05 y 20% en peso, siendo el resto el componente base.

Los componentes para composiciones administrables por vía oral, inyectables y supositorios son meramente representativos. En la parte 8ª de Remington's Pharmaceutical Science, 18ª edición, 1990, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 18042 se indican otros materiales así como técnicas de tratamiento y similares.

Los compuestos de la invención se pueden también administrar en formas de liberación lenta o en sistemas de liberación de fármaco de liberación lenta. Una descripción de materiales de liberación lenta representativos se puede hallar en los materiales incorporados en Remington's Pharmaceutical Science.

Enfermedades tratadas y regímenes de tratamiento

Las enfermedades tratadas con las composiciones farmacéuticas que contienen aril nitrona de la presente invención incluyen generalmente IBD y los diversos síntomas que están comprendidos dentro de una definición de IBD. Para conseguir un efecto terapéutico se administran formulaciones que contienen aril nitrona. Para aquellos compuestos de aril nitrona que presenten un tiempo de residencia prolongado en el cuerpo, es posible un tratamiento una vez al día. Como alternativa, las dosis múltiples, tal como hasta tres dosis por día, normalmente, pueden ofrecer una terapia más eficaz. Por lo tanto, se puede utilizar un tratamiento de una sola dosis o de multidosis.

En cualquier caso, la composición farmacéutica que contiene aril nitrona se administra de tal manera que el compuesto se libera en el torrente circulatorio del paciente. Un excelente modo para realizar esto es la administración intravenosa. Las concentraciones de la dosis intravenosa para el tratamiento IBD oscilan entre aproximadamente 0,01 mg/kg/hora de aril nitrona activa hasta aproximadamente 100 mg/kg/hora, todas durante aproximadamente 1 a aproximadamente 120 horas y especialmente de 1 a 96 horas. Se puede también administrar una embolada de precarga desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 5000 mg para conseguir concentraciones adecuadas en estado estacionario. Se pueden utilizar también otras formas de administración parenteral, tal como la inyección intramuscular. En este caso, se emplean concentraciones de dosis similares.

En la dosificación oral, se emplean uno a tres dosis orales por día, cada una desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 150 mg/kg de aril nitrona activa, siendo las dosis preferidas desde aproximadamente 0,15 hasta aproximadamente 100 mg/kg.

En la dosificación rectal, se emplean uno a tres dosis rectales por día, cada una desde aproximadamente 0,1 a aproximadamente 150 mg/kg de aril nitrona activa, siendo las dosis preferidas desde aproximadamente 1 hasta aproximadamente 100 mg/kg.

En cualquier régimen de tratamiento, la atención sanitaria profesional debería evaluar la enfermedad del paciente y determinar si el paciente se beneficia o no del tratamiento con aril nitrona. Se puede necesitar algún grado de optimización de la dosis de rutina para determinar un nivel y un tipo de dosificación óptima.

Se ha observado una relación dosis-respuesta positiva. Como tal y considerando la gravedad de los efectos secundarios y las ventajas de proporcionar la mejoría máxima de los síntomas, se puede desear administrar en algunos grupos grandes cantidades de aril nitrona, tales como las descritas anteriormente.

Los siguientes ejemplos de formulación ilustran las composiciones farmacéuticas representativas de esta invención. La presente invención, sin embargo, no se limita a las siguientes composiciones farmacéuticas.

Formulación 1

Comprimidos

Se mezcla un compuesto de fórmula I en forma de polvo anhidro con un aglutinante anhidro de gelatina en una proporción en peso aproximada 1:2. Se añade como lubricante una cantidad menor de estearato de magnesio. La mezcla se forma en comprimidos de 240 a 270 mg (80 a 90 mg de compuesto de nitrona activo por comprimido) en una prensa de comprimidos.

Formulación 2

Cápsulas

Se mezcla un compuesto de fórmula I en forma de polvo anhidro con un diluyente de almidón en una proporción en peso aproximada 1:1. Se rellena la mezcla en cápsulas de 250 mg (150 mg de compuesto de nitrona activo por cápsula).

Formulación 3

Líquido

Se mezcla un compuesto de fórmula I (125 mg), sacarosa (1,75 g) y goma xantana (4 mg), se pasan a través de un tamiz de malla nº 10 U.S., y a continuación se mezcla con una solución preparada previamente de celulosa microcristalina y carboximetilcelulosa de sodio (11:89,50 mg) en agua. Se diluyen en agua benzoato sódico (10 mg), aromatizante y colorante y se añaden en agitación. Se añade a continuación agua suficiente para producir un volumen total de 5 ml.

\newpage

Formulación 4

Inyección

Se disuelve el compuesto de fórmula I en un medio acuoso inyectable de solución salina esterilizada tamponada a una concentración de aproximadamente 5 mg/ml.

Los siguientes ejemplos de síntesis y biológicos se ofrecen para ilustrar esta invención y no deben considerarse de ninguna manera limitativos del alcance de esta invención.

Ejemplos

En los siguientes ejemplos, todas las temperaturas están en grados Celsius (a menos que se indique de otra manera). Los ejemplos A a C describen la síntesis de los productos intermedios útiles para preparar las nitronas de esta invención; los Ejemplos 1 a 8 describen la síntesis de varias aril nitronas; y los Ejemplos de Bioanálisis describen el análisis de dichos compuestos.

En los siguientes ejemplos, las abreviaturas siguientes tienen los siguientes significados. Las abreviaturas no definidas a continuación tienen su significado generalmente aceptado.

	bd	= doblete ancho
	bs	= singlete ancho
	d	= doblete
	dd	= doblete de dobletes
	dec	= descompuesto
	dH_{2}O	= agua destilada
	EtOAc	= acetato de etilo
	EtOH	= etanol
	g	= gramos
	h	= horas
	Hz	= hercios
	L	= litro
	m	= multiplete
	min	= minutos
	M	= molar
	MeOH	= metanol
	mg	= miligramo
	MHz	= megahercio
	ml	= mililitro
	mmol	= milimol
	m.p.	= punto de fusión
	N	= normal
	q	= cuarteto
	quint.	= quinteto
	s	= singlete
	t	= triplete
	THF	= tetrahidrofurano
	tlc	= cromatografía en capa fina
	\mug	= microgramo
	\muL	= microlitro
	UV	= ultravioleta

Ejemplo A Síntesis de N-tert-butilhidroxilamina

Se añadió polvo de cinc (648 g) en porciones a una mezcla enfriada de 2-metil-2-nitropropano (503 g) y cloruro de amonio (207 g) en agua desionizada (6 L) a una velocidad a fin de mantener la temperatura por debajo de 18ºC. La mezcla de reacción se agitó mecánicamente durante 15 horas y a continuación se filtró. Se lavó el sólido con agua caliente (1,75 L). Se saturó el filtrado combinado con carbonato de potasio (4,6 Kg) y se extrajo con acetato de etilo (2 x 1300 ml). Se secó la solución orgánica sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se evaporó por rotación para dar el compuesto del título (329 g, rendimiento 75,7%) como cristales blancos. Este material se utilizó sin purificación posterior.

Los datos espectroscópicos fueron los siguientes:

^{1}H RMN (CDCl_{3}, 270 MHz) \delta = 1,090 (s, 3 CH_{3}).

Ejemplo B Síntesis de N-isopropilhidroxilamina

El compuesto del título se preparó utilizando el procedimiento del Ejemplo A anterior y 1-metil-1-nitroetano. Se utilizó el producto de hidroxilamina en bruto sin purificación posterior.

Ejemplo C Síntesis de N-ciclohexilhidroxilamina

El compuesto del título se puede preparar utilizando el procedimiento del Ejemplo A anterior y 1-nitrociclohexano. Como alternativa, se puede adquirir en el comercio hidrocloruro de N-ciclohexilhidroxilamina en Aldrich Chemical Company, Inc., Milwaukee, WI USA y se neutralizó con una base, tal como carbonato de potasio, para proporcionar el compuesto del título.

Ejemplo 1

(Comparativo)

Síntesis de \alpha-(4-etoxifenil)-N-ciclohexilnitrona

Se calentó a reflujo una solución de 4-etoxibenzaldehído (6,62 g, 44,1 mmol) en 200 ml de benceno con N-ciclohexilhidroxilamina (6,61 g, 57,4 mmol) en presencia de ácido p-toluensulfónico (0,8 g, 4 mmol) durante 72 h. Después de la evaporación por rotación, se purificó el residuo por recristalización en hexanos y éter dimetílico de etilenglicol (100 ml, 3:1, v:v) para dar el compuesto del título (9,2 g, rendimiento 84%) como un sólido, m.p. 124,0ºC.

Los datos espectroscópicos fueron los siguientes:

IR (KBr, cm^{-1}): 2933,0, 2862 (CH), 1599,6 (C=N), 1297,0 (C-O-C) y 1149,4 (N-O).

^{1}H RMN (CDCl_{3}, 270 MHz): \delta = 8,20 (2H, d, J = 8,9 Hz, fenil 2H), 7,32 (1H, s, nitronil H), 6,88 (2H, d, J = 8,9 Hz, fenil 2H), 4,05 (2H, cuarteto, J = 7,0 Hz, CH_{2}), 3,75 (1H, m, CH), 1,94 (6H, m, 6 CH), 1,68 (2H, m, 2 CH), 1,39 (2H, t, J = 7,0 Hz, CH_{3}) y 1,27 (2H, m, 2 CH).

^{13}C RMN (CDCl_{3}, 67,9 MHz): \delta = 160,6, 132,1, 130,7, 123,8, 114,4, 75,0, 63,4, 30,8, 24,7 y 14,3.

Ejemplo 2 Síntesis de \alpha-(3,5-di-tert-butil-2-hidroxifenil)-N-tert-butilnitrona

Se añadió 2-hidroxibenzaldehído (129,5 mmol) y 3 gotas de ácido clorhídrico al 37% a una solución de tert-butilhidroxilamina (14,98 g, 168,4 mmol) en MeOH (160 ml). La solución resultante se calentó a reflujo mediante un aparato Soxhlet conteniendo tamices moleculares (40 g) hasta que no se detectó más aldehído por TLC. Se eliminó el disolvente al vacío y se recristalizó el residuo en EtOAc. Se aisló el compuesto del título con un rendimiento del 82,1% como sólido cristalino, m.p. 234,7-235,2ºC (R_{f}=0,66 en una placa con gel de sílice utilizando EtOAc/hexanos 1:4 como eluyente).

Los datos espectroscópicos fueron los siguientes:

IR (KBr, cm^{-1}): 2955 (CH), 1586 (C=N), 1269 (N-O) y 1023 (C-O).

^{1}H RMN (CDCl_{3}, 270 MHz): \delta = 11,83 (1H, s, OH fenólico), 7,80 (1H, s, nitronil H), 7,47 (1H, d, J = 2,23 Hz, fenil H), 6,92 (1H, d, J = 2,23 Hz, fenil H), 1,64 (9H, s, 3 CH_{3}), 1,45 (9H, s, 3 CH_{3}) y 1,29 (9H, s, 3 CH_{3}).

^{13}C RMN (CDCl_{3}, 67,9 MHz): \delta = 156,60, 141,10, 139,97, 138,45, 128,32, 126,11, 117,53, 69,70, 35,07, 33,85, 31,14, 29,34 y 28,07.

Ejemplo 3 Síntesis de N-isobutil-\alpha-fenilnitrona

Se enfrió isobutilamina (14,6 g, 0,2 mol) en un baño de hielo y se añadió gota a gota benzaldehído (19,6 g, 0,1 mol), seguido de adición de perlas de NaOH en agitación. A continuación se dejó calentar la reacción a temperatura ambiente y se agitó durante 1 hora. La TLC demostró la transformación al 100% del benzaldehído. La mezcla de reacción se mezcló con 60 ml de diclorometano, se secó con NaOH (10 perlas \sim 0,8 gramos), se filtró y se enfrió en un baño de hielo. Se añadió gota a gota una solución de ácido 3-cloro-perbenzoico (MCPBA) (57%, 30,3 g, 0,1 mol) en 150 ml de diclorometano. Se formó un precipitado blanco en el momento de la adición de MCPBA y se disolvió después de agitar un instante. Después de la adición completa de MCPBA, se dejó calentar la reacción a temperatura ambiente y se agitó toda la noche. La solución amarilla transparente resultante se lavó con agua (1 x), hidróxido de sodio diluido (2 x), ácido clorhídrico al 5% (2 x), agua (2 x) y se secó sobre MgSO_{4}. Se extrajo a continuación el disolvente diclorometano, dejando el líquido incoloro. La TLC demostró la presencia de benzaldehído en el líquido. Se añadió acetonitrilo (150 ml) al líquido y la solución se calentó a reflujo toda la noche. Se extrajo a continuación el disolvente acetonitrilo, dejando el líquido incoloro. Se purificó el producto de nitrona en una columna de gel de sílice, eluyendo con hexano/EtOAc (2:1) para obtener 0,54 g del compuesto del título como un sólido amarillo pálido, m.p. 73-75ºC.

Ejemplo 4

(Comparativo)

Síntesis de \alpha-(4-benciloxifenil)-N-tert-butilnitrona

Una mezcla de 4-benciloxibenzaldehído, N-tert-butilhidroxilamina y una cantidad catalítica de monohidrato del ácido p-toluensulfónico en benceno se calentó a reflujo en una atmósfera de argón con una trampa Dean-Stark para eliminar el agua generada. A continuación la mezcla se evaporó por rotación para dar un residuo que se purificó por recristalización. Se obtuvo el compuesto del título con un rendimiento del 89,3% como polvo blanco, m.p. 111,0ºC (R_{f}=0,66 en una placa de gel de sílice utilizando EtOAc como eluyente).

Los datos espectroscópicos fueron los siguientes:

IR (KBr, cm^{-1}): 2982 (CH), 1601 (C=N y anillo de benceno), 1508 (anillo de benceno), 1242 (Ar-O), 1170 (N-O) y 1005 (bencil-O).

^{1}H RMN (CDCl_{3}, 270 MHz): \delta = 8,29 (2H, d, J=9,2 Hz, aromático 2H), 7,46 (1H, s, CH=N), 7,41-7,31 (5H, m, aromático 5H), 7,00 (2H, d, J = 9,2 Hz, aromático 2H), 5,10 (2H, s, OCH_{2}), y 1,60 (9H, s, 3 CH_{3}) ppm.

^{13}C RMN (CDCl_{3}, 67,9 MHz): \delta = 159,89, 136,47, 130,64, 129,35, 128,52, 128,00, 127,42, 124,23, 114,58, 70,05, 69,91 y 28,25 ppm.

Ejemplo 5 Síntesis de N-bencil-\alpha-(4-acetamidofenil)nitrona

Utilizando 4-acetamidobenzaldehído y N-bencilhidroxilamina (preparada a partir de la sal hidrocloruro por tratamiento con K_{2}CO_{3}) y siguiendo los procedimientos descritos en esta memoria, se preparó el compuesto del título como polvo amarillo, m.p. 230,7-237,7ºC.

Ejemplo 6

(Comparativo)

Síntesis de \alpha-(2-etoxifenil)-N-ciclopentilnitrona

Utilizando 2-etoxibenzaldehído y N-ciclopentilhidroxilamina y siguiendo los procedimientos descritos en esta memoria, se obtuvo el compuesto del título con un rendimiento de 72,6% como cristales blancos, m.p. 87,3ºC (R_{f}=0,43 en una placa de gel de sílice utilizando hexanos:EtOAc, 2:1, v:v, como eluyente).

Los datos espectroscópicos fueron los siguientes:

IR (KBr, cm^{-1}): 2976 (CH), 2957 (C=H), 1636 (C=N), 1597 y 1564 (anillo de benceno), 1251 (Ar-O), 1165 (N-O) y 1043 (Et-O.

^{1}H RMN (CDCl_{3}, 270 MHz): \delta = 9,33 (1H, dd, J=7,8 y 1,7 Hz, aromático 1H), 7,98 (1H, s, CH=N), 7,32 (1H, ddd, J = 8,2, 7,5 y 1,7 Hz, aromático 1H), 6,99 (1H, td, J = 6,1 y 7,8 Hz, CH), 4,07 (2H, q, J=7,0 Hz, OCH_{2}), 2,35-2,22 (2H, m, ciclopentil 2H), 2,07-1,88 (4H, m, ciclopentil 4H), 1,72-1,57 (2H, m, ciclopentil 2H) y 1,45 (3H, t, J=7,0 Hz, CH_{3}) ppm.

^{13}C RMN (CDCl_{3}, 67,9 MHz): \delta = 156,11, 131,00, 128,64, 127,31, 120,50, 119,88, 110,57, 76,64, 63,85, 31,38, 25,55 y 14,74 ppm.

Ejemplo 7 Síntesis de \alpha-(4-acetoxi-3,5-di-tert-butilfenil)-N-tert-butilnitrona

Se colocó 4-acetoxi-3,5-di-tert-butilbenzaldehído (113,16 g, 0,41 mol) en un matraz de fondo redondo de 2 L equipado con un agitador magnético. Se añadió benceno (500 ml) y se agitó la mezcla hasta que se disolvieron los sólidos. A la solución roja resultante se añadió tert-butilhidroxilamina (43,80 g, 0,49 mol) y gel de sílice (20 g). Se calentó a reflujo la mezcla toda la noche en cuyo momento la TLC no presentó ningún material de partida restante (R_{f}=0,31 para el producto y 0,80 para el material de partida utilizando hexanos/EtOAc 3:1). Se eliminó el benceno al vacío en un rotovapor para dar un sólido gris. Se disolvió el sólido en una cantidad mínima de acetato de etilo y se dejó el matraz en reposo en el congelador. Se separaron los cristales blancos que se formaron, se lavaron con hexanos y se secaron al vacío para dar 105,78 g del compuesto del título como un sólido cristalino blanco (rendimiento 74,4%), m.p. 227,0-248,9ºC.

Los datos espectroscópicos fueron los siguientes:

^{1}H RMN (CDCl_{3}, 270 MHz): \delta = 8,32 (1H, s, fenil H), 7,50 (1H, s, nitronil H), 2,35 (3H, s, 1 CH_{3}), 1,61 (9H, s, 3 CH_{3}) y 1,37 (s, 18 CH_{3}).

^{13}C RMN (CDCl_{3}, 270 MHz): \delta = 170,7, 149,2, 142,6, 129,7, 128,4, 127,2, 70,7, 35,5, 31,4, 28,5 y 22,6.

Ejemplo 8 Síntesis de N-tert-butil-\alpha-(4-aminosulfonilfenil)nitrona

Utilizando 4-aminosulfonilbenzaldehído y N-tert-butilhidroxilamina y siguiendo los procedimientos descritos en esta memoria, se preparó el compuesto del título como un polvo blanco, m.p. 219,1-219,4ºC.

Los datos espectroscópicos fueron los siguientes:

^{1}H RMN (CDCl_{3}, 270 MHz): \delta = 8,32 (1H, s, fenil H), 7,50 (1H, s, nitronil H), 2,35 (3H, s, 1 CH_{3}), 1,61 (9H, s, 3 CH_{3}), 1,37 (s, 18 CH_{3}).

Ejemplo 9

(Comparativo)

Síntesis de \alpha-(2-etoxifenil)-N-ciclobutilnitrona

Se combinó 2-etoxibenzaldehído con hidrocloruro de ciclobutilamina en cloroformo y se calentó a reflujo la solución durante 22 horas. Una vez terminada la reacción, se enfrió la solución a temperatura ambiente y se concentró al vacío para dar un residuo aceitoso, que era N-ciclobutil-(2-etoxi)fenil imina.

Se disolvió el residuo aceitoso en etanol y se enfrió la solución en un baño con hielo. Se añadió borohidruro de sodio en porciones y la mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante 21 horas. A continuación se concentró al vacío la solución y el residuo se puso en suspensión en diclorometano. Se formó un precipitado que se filtró. Se concentró el filtrado para dar un líquido, y se pasó a través de un embudo relleno de gel de sílice (eluyendo con hexano/acetato de etilo, 2:1) para dar N-ciclobutil-(2-etoxi)fenilamina.

La N-ciclobutil-(2-etoxi)fenilamina se puso en suspensión en propanona y se mezcló con tungstato de sodio disuelto en agua. Se enfrió la mezcla en un baño con hielo y se añadió gota a gota peróxido de hidrógeno en agitación continua. Se agitó la mezcla durante 19 horas. A continuación se concentró al vacío la solución y se puso en suspensión el residuo en diclorometano. Se filtró la mezcla y se evaporó el residuo. Se purificó el residuo por cromatografía en columna de flash en seco y a continuación se recristalizó en hexano para dar el compuesto del título como un sólido de color crema, m.p. 76,0ºC (rendimiento 9,4%).

Los datos espectroscópicos fueron los siguientes:

^{1}H RMN (CDCl_{3}, 270 MHz): \delta = 9,31 (1H, dd, J=7,7, 1,7), 7,87 (1H, ddd, J=8,2, 7,7, 1,7), 6,99 (1H, td, J=7,7, 0,7), 6,84 (1H, dd, J=8,2, 0,7), 4,59 (1H, quin. J=8,1), 2,82 (2H, m), 2,36 (2H, m), 1,92 (2H, m), 1,43 (23H, t,
J=7,0).

Ejemplo de bioanálisis 1

Evaluación de los compuestos en el modelo TNBS para IBD

En este experimento, se demuestra la capacidad de los compuestos de esta invención para reducir la inflamación del colon utilizando el modelo de ácido sulfónico con trinitrobenceno ("TNBS") para IBD. El modelo TNBS es uno de los modelos de IBD habituales utilizado en la investigación del descubrimiento de IBD y se ha evaluado extensamente en roedores. Véase, por ejemplo, C. O. Elson et al. (1995), Experimental Models of Inflammatory Bowel Disease, Gastroenterology, 109: 1344-1367 y las referencias citadas en esta memoria. En este modelo, un solo enema de TNBS provoca una respuesta inflamatoria prolongada en el colon (hasta de varias semanas) que es transparietal y está acompañada de agresión oxidante como se pone de manifiesto por un aumento en la actividad de la mieloperoxidasa ("MPO"). Además, la inflamación se caracteriza por áreas discretas de necrosis aguda, inflamación y espesamiento del músculo. Los agentes con efectos anti-inflamatorios en pacientes con IBD presentan eficacia en este modelo. Aunque el mecanismo por el cual TNBS provoca una respuesta inflamatoria es desconocido, se cree que tiene una base inmunológica.

Provocación de colitis

Se alojaron en jaulas normales (2 por jaula) ratas Sprague-Dawley macho (200-250 g) y se alimentaron a discreción con comida de rata y agua del grifo. Después de un ayuno toda la noche, se llevaron las ratas al laboratorio y se les distribuyó al azar en grupos de tratamiento. Se provocó la colitis por administración intrarrectal de 0,5 ml de solución TNBS (50 mg/kg en etanol al 50%) utilizando una jeringuilla de 1 ml conectada a un catéter de polietileno de 5 cm. Los animales de referencia recibieron solución salina (0,9%) o una suspensión de metilcelulosa al 1% en puntos de tiempo idénticos.

Análisis del tejido

Tres días después de la administración de TNBS, se sacrificaron las ratas, se les practicó una escisión en los colones y se abrieron longitudinalmente. En segmentos de colon de 5 cm, se determinó la morfología macroscópica utilizando la escala siguiente:

Grado	Observación
0	Sin alteración
1	Un área de inflamación (roja), sin úlceras
2	Úlceras, sin área de inflamación
3	Úlceras, un área de inflamación
4	Más de 2 úlceras, inflamación en un sitio
5	Más de 2 úlceras, inflamación > 1 cm

Se registraron asimismo los pesos de cada segmento de colon de 5 cm para evaluar la inflamación producida por el edema.

Régimen de dosificación

Se analizaron cada uno de los compuestos de los Ejemplos 1 a 6 en el modelo TNBS a una dosificación p.o. (oral) de 10 mg/kg. Se administró por sobrealimentación oral cada uno de los compuestos experimentales en forma de suspensión de carboximetilcelulosa ("CMC") al 1%, 1 hora antes de la administración de TNBS. A las ratas de referencia se les administró solamente CMC.

Resultados

Cada uno de los compuestos experimentales redujo la alteración producida por TNBS en comparación con las referencias. La reducción en la alteración producida por TNBS osciló entre aproximadamente el 25% y aproximadamente el 60% (puntuaciones medias).

\newpage

Ejemplo de bioanálisis 2

Modelo IBD de sulfato de dextrano para ratón

Otro modelo utilizado para identificar los compuestos experimentales del tratamiento de IBD es el modelo de sulfato de dextrano ("DSS"). Igual que en el modelo de TNBS, la colitis provocada por DSS se utiliza ampliamente como herramienta de identificación para productos terapéuticos para IBD. Cuando se administra por vía oral, DSS produce síntomas del tipo IBD en ratones Swiss-Webster. Este modelo se puede utilizar para determinar la eficacia de los compuestos de esta invención cuando dichos compuestos se administran por vía oral (p.o.)

Ratones Swiss-Webster macho de 30 a 40 g alojados individualmente (B & K Universal, Fremont, CA) recibieron DSS al 3% (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) en su agua del grifo durante 7 días. Todos los animales recibieron alimentación y agua a voluntad.

Se administran dosis por vía oral a dos grupos de ratones del compuesto experimental en un vehículo de dosificación (metil celulosa al 1%, intervalo de la dosis de 10 mg/kg a 30 mg/kg) o vehículo de dosificación solo (referencia).

Se evalúan los síntomas clínicos de la colitis por un índice de actividad de la enfermedad ("DAI") consistente en los cambios en las características de las heces, en la hemorragia fecal oculta y en la pérdida de peso corporal. El DAI es muy similar al índice de actividad de la enfermedad de Crohn utilizado en las pruebas clínicas para evaluar nuevos agentes para prevenir/tratar la IBD. Se analizan los datos de DAI utilizando Proc Anova en SAS con un análisis posterior de Bonferoni y el Modelo 108 en WinNonlin™ (Professional Version 1.5, Scientific Consulting, Apex, NC) para los índices ED_{50} y E_{max}. Los datos de peso en húmedo y de mieloperoxidada ("MPO") (recogidos solamente el día 7) se analizan por Proc TTest en SAS. MPO es un marcador para la infiltración neutrófila. En este análisis se emplean los siguientes criterios:

Puntuación DAI (diaria)

Características de las heces: 0 = normal, 2 = pérdida y 4 = diarrea

Sangría fecal oculta: 0 = negativo, 2 = positivo, 4 = hemorragia macroscópica

Cambio de peso: 0 = 0-1%, 1 = 1 a <5%, 2 = 5% a <10%, 3 = 10 a <20%, 4 = >20%

MPO (sólo el día 7)

Dos tiras de tejido de colon/ratón

Actividad de MPO por análisis espectrofotométrico

Ejemplo de bioanálisis 3

Determinación de las características de dosis-respuesta en el modelo de sulfato de dextrano para ratón

Para determinar la relación dosis-respuesta de un compuesto experimental en el modelo de DSS para ratón, se utiliza el procedimiento siguiente.

Las condiciones experimentales y los análisis estadísticos son los mismos que en el modelo para IBD de sulfato de dextrano para ratón, excepto que se utilizan cuatro grupos de ratones (n = 8-10/grupo). Se administran dosis por vía oral a los animales del compuesto experimental (3, 10 ó 30 mg/kg) o de vehículo solo. Además, se introduce el procedimiento siguiente para evaluar la histología en los animales.

Puntuación de la histología

5 a 6 secciones/segmento con 15 a 18 piezas totales/colon

Puntuación para el alcance de la alteración: 0 = 1 a 25% de afectación, 1 = 26 a 50% de afectación, 2 = 51 a 75% de afectación, 3 = 76 a 100% de afectación

Puntuación para calidad:

0 = cripta intacta, 1 = pérdida de 1/3 de la cripta, 2 = pérdida de 2/3 de la cripta, 3 = pérdida completa de la cripta con el epitelio de la superficie intacto, 4 = pérdida total de la cripta y erosión del epitelio superficial.

Puntuación por gravedad:

0 = normal, 1 = infiltrado inflamatorio focal de las células incluyendo las PMN, 2 = infiltración celular inflamatoria, reducción de la glándula y abscesos de la cripta, 3 = ulceración de la mucosa.

Un solo evaluador (anatomopatólogo cualificado) a ciegas para las condiciones del tratamiento.

Ejemplo de bioanálisis 4

Efecto de los compuestos experimentales en el flujo de especies de oxígeno reactivo provocado por TNF-\alpha

Se cree que los agentes de agresión oxidante (OSA) están implicados en la muerte celular en IBD y son la clave iniciadora en la cascada de sucesos que conducen a la apoptosis. El objeto de este estudio es evaluar el efecto de un compuesto experimental en el flujo de OSA provocado por las citocinas.

Para observar los OSA, se utiliza diacetato de dihidrodiclorofluoresceína anhidro. Este colorante no fluorescente es absorbido por las células y se desacetila en su congénere no fluorescente, dihidrodiclorofluoresceína (H_{2}DCF), que está ocluído en las células. La especie de oxígeno reactivo ("ROS") reacciona con H_{2}DCF, transformándolo en DCF muy fluorescente. La fluorescencia de DCF se puede medir por espectrofluorometría y se puede observar en las células intactas utilizando microscopía fluorescente.

Se colocan en placas Corning de 24 pocillos células SK-N-MC (American Type Culture Collection, Rockville, MD) a razón de 250.000 células/pocillo. Después de la colocación en las placas, las células se mantienen en medio de ácido retinoico (5 \muM) durante cinco días y a continuación se tratan con un compuesto experimental a 100 \muM durante 1 hora antes del tratamiento con TNF-\alpha (3,0 ng/ml). Se añaden simultáneamente TNF-\alpha y H_{2}DCF y se incuban los cultivos durante otras 4 horas. Después de la incubación, se leen los cultivos en un citofluorómetro a una longitud de onda de 485 a 530 nm para detectar el aumento de la formación de DCF. Se comparan los valores de las unidades de fluorescencia relativa (RFU) en las respectivas condiciones de tratamiento. En este análisis, las lecturas mayores de fluorescencia indican producción de ROS. Por lo tanto, las reducciones de fluorescencia indican reducción en la producción de ROS.

Ejemplo de bioanálisis 5

Efecto del compuesto A en la apoptosis provocada por TNF-\alpha en un modelo celular humano

Esta prueba se utiliza para evaluar el potencial de un compuesto experimental para prevenir la apoptosis producida por TNF-\alpha.

Se evalúa un compuesto experimental en un modelo in vitro de toxicidad producida por TNF-\alpha (véase Pulliam et al. J. Neurosci. Res. 21:521-530 (1998)). En este modelo, los agregados de las células del cerebro humano procedentes de tejido fetal se tratan con TNF-\alpha que produjo una muerte celular programada. Se incubaron agregados de células de cerebro preparados a partir de 1 cerebro durante 10 a 12 días antes de la experimentación. Se pesaron los agregados (100 mg/matraz) y se colocaron alícuotas en matraces de 10 ml. Se utiliza TNF-\alpha a una concentración de 1 ng. Se añade compuesto experimental 1 hora antes del TNF-\alpha. Los experimentos incluyen agregados de cerebro sin tratar, agregados de cerebro tratados con TNF-\alpha, TNF-\alpha- + agregados tratados con el compuesto experimental y agregados tratados con el compuesto experimental. Después de añadir TNF-\alpha, se incuban los agregados durante otras 48 h. Después de este tiempo, se centrifugan los agregados del cerebro durante 5 min a 500 rpm. Se elimina el sobrenadante y se lisa el sedimento para la determinación de la muerte celular programada. (Boeringer Mannheim Cell Death Kit ELISA).

Ejemplo de bioanálisis 6

Efecto del compuesto experimental en la reducción producida por TNF-\alpha en bcl-2

Se cree que la apoptosis mediada por citocina o la muerte celular programada está implicada en numerosas enfermedades, incluyendo IBD. Las reducciones en bcl-2 son un síntoma principal en el inicio de la cascada apoptósica (véase Jourd'heuil et al., J. Clin Gastroenterol. 25(Sup. 1):S61-S72 (1997)). El objeto de este estudio es investigar los efectos de un compuesto experimental en las concentraciones de proteína bcl-2 en un modelo celular de apoptosis mediada por citocina.

Se colocan en placas células SK-N-MC (American Type Culture Collection, Rockville, MD) a razón de 500.000 células/placa y se trataron con ácido retinoico ("RA") (5\muM) durante 5 días. Después del tratamiento con RA, se incuban las células con un compuesto experimental (100 \muM) durante 1 hora. Se tratan a continuación las células con concentraciones recientes de TNF-\alpha (0, 0,3 y 3 ng/ml) durante 6 h. Se recogen las células, se lisan y se mide bcl-2 en el lisado utilizando un análisis ELISA (Boehringer Manheim). La cuantificación de bcl-2 está basada en una curva patrón y los resultados se expresan en unidades/ml de bcl-2 en la muestra.

Claims

1. Composición farmacéutica para el tratamiento o la profilaxis de los trastornos intestinales inflamatorios que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz para el tratamiento de los trastornos intestinales inflamatorios de un compuesto seleccionado de entre el grupo que consta de:

N-tert-butil-\alpha-(3,5-di-tert-butil-2-hidroxifenil)nitrona,

N-isobutil-\alpha-fenilnitrona,

N-bencil-\alpha-(4-acetamidofenil)nitrona,

N-tert-butil-\alpha-(1-metilindol-3-il)nitrona,

N-tert-butil-\alpha-(3,5-di-tert-butil-4-acetoxifenil)nitrona,

N-tert-butil-\alpha-(4-aminosulfonilfenil)nitrona

y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el compuesto se selecciona de entre el grupo que consta de:

N-isobutil-\alpha-fenilnitrona,

N-bencil-\alpha-(4-acetamidofenil)nitrona,

N-tert-butil-\alpha-(4-aminosulfonilfenil)nitrona

y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

3. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el compuesto es N-tert-butil-\alpha-(3,5-di-tert-butil-hidroxifenil)nitrona y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

4. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el compuesto es N-isobutil-\alpha-fenilnitrona y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

5. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, en la que el compuesto es N-bencil-\alpha-(4-acetamidofenil)nitrona y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

6. Utilización de un compuesto para la preparación de un medicamento para tratar de un paciente que padece o es susceptible de padecer trastornos intestinales inflamatorios, en la que dicho compuesto se selecciona de entre el grupo que consta de:

N-tert-butil-\alpha-(3,5-di-tert-butil-2-hidroxifenil)nitrona,

N-isobutil-\alpha-fenilnitrona,

N-bencil-\alpha-(4-acetamidofenil)nitrona,

N-tert-butil-\alpha-(1-metilindol-3-il)nitrona,

N-tert-butil-\alpha-(3,5-di-tert-butil-4-acetoxifenil)nitrona,

N-tert-butil-\alpha-(4-aminosulfonilfenil)nitrona

y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

7. Utilización según la reivindicación 6, en la que dicho compuesto se selecciona de entre el grupo que consta de:

N-isobutil-\alpha-fenilnitrona,

N-bencil-\alpha-(4-acetamidofenil)nitrona,

N-tert-butil-\alpha-(4-aminosulfonilfenil)nitrona

y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

8. Utilización según la reivindicación 6, en la que el compuesto es N-tert-butil-\alpha-(3,5-di-tert-butil-2-hidroxifenil)nitrona y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

9. Utilización según la reivindicación 6, en la que el compuesto es N-isobutil-\alpha-fenilnitrona y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

10. Utilización según la reivindicación 6, en la que el compuesto es N-bencil-\alpha-(4-acetamidofenil)nitrona y las sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

11. Utilización según la reivindicación 6, en la que está previsto que dicha composición farmacéutica se administre por vía oral.

12. Utilización según la reivindicación 6, en la que está previsto que dicha composición farmacéutica se administre por vía parenteral.

13. Utilización según la reivindicación 6, en la que está previsto que dicha composición farmacéutica se administre por vía rectal.

14. Utilización según la reivindicación 6, en la que dicha enfermedad inflamatoria intestinal es la colitis ulcerosa.

15. Utilización según la reivindicación 6, en la que dicha enfermedad inflamatoria intestinal es la enfermedad de Crohn.

16. Utilización según la reivindicación 6, en la que está previsto que dicha composición farmacéutica se administre en forma de dosis oral en una cantidad comprendida entre 0,1 y aproximadamente 150 mg/kg del peso del paciente.

17. Utilización según la reivindicación 6, en la que está previsto que dicha composición farmacéutica se administre por vía intravenosa en una cantidad comprendida entre aproximadamente 0,01 mg/kg/hora y aproximadamente 100 mg/kg/hora del peso del paciente durante al menos aproximadamente 1 hora.

18. Utilización según la reivindicación 6, en la que está previsto que dicha composición farmacéutica se administre por vía rectal en una cantidad comprendida entre 1 y aproximadamente 150 mg/kg del peso del paciente.

19. Compuesto seleccionado de entre el grupo que consta de:

N-isobutil-\alpha-fenilnitrona,

N-bencil-\alpha-(4-acetamidofenil)nitrona,

N-tert-butil-\alpha-(1-metilindol-3-il)nitrona,

N-tert-butil-\alpha-(4-aminosulfonilfenil)nitrona

y las sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

20. N-isobutil-\alpha-fenilnitrona.

21. N-bencil-\alpha-(4-acetamidofenil)nitrona.

22. N-tert-butil-\alpha-(1-metilindol-3-il)nitrona.

23. N-tert-butil-\alpha-(4-aminosulfonilfenil)nitrona.