ES2354509T3 - Derivados de isoíndigo, índigo e indirubina y su uso en el tratamiento del cáncer. - Google Patents

Abstract

Compuesto de fórmula (I), (II) o (III) **(Ver fórmula)**FÓRMULA (I) **(Ver fórmula)**FÓRMULA (II) **(Ver fórmula)**FÓRMULA (III) en las que R1 o R2 son independientemente un 10 monosacárido acetilado; y R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 o R10 son independientemente un hidrógeno, un monosacárido, un disacárido, un halógeno, un grupo hidrocarbilo o un grupo hidrocarbilo funcional no sustituido o sustituido con uno o más restos hidroxilo, restos carboxilo, restos nitroxilo, monosacáridos, disacáridos, aminas, amidas, tioles, sulfato, sulfonato, sulfonamida o halógenos, en el que el hidrocarbilo tiene de 1 a 12 átomos de carbono.

Description

CAMPO TÉCNICO

La invención se refiere a compuestos nuevos y útiles que son derivados de isoíndigo, índigo e indirubina para tratar cáncer de tumor sólido en un sujeto.

ANTECEDENTES

La prevención y el tratamiento del cáncer han mejorado significativamente en los Estados Unidos durante la última década debido a avances en epidemiología, la tecnología del tratamiento, y la capacidad de ofrecer diagnósticos más precoces. Sin embargo, el hallazgo de una cura para una diversidad de cánceres, tales como de pulmón, mama, próstata, colon y otros, sigue siendo un desafío principal. Sin embargo, los enfoques actuales para el tratamiento de cánceres aún se limitan a la prolongación de la vida o el aumento de la calidad de vida. Adicionalmente, los agentes terapéuticos más importantes aún tienen efectos secundarios significativos. Por tanto, es imperativo encontrar agentes terapéuticos más eficaces con menos efectos secundarios.

Las células tumorales se caracterizan por proliferación celular no controlada debido a la pérdida de la integración y coordinación de señales extracelulares con la maquinaria del ciclo celular. Un ciclo celular típico se clasifica en fases G1, S, G2 y M [1-3] y se ilustra en la figura 2. En las células de mamíferos, la proliferación se controla en la fase G1 del ciclo celular. En el punto de restricción, las células pueden tener diferentes destinos. Ejemplos de estos destinos celulares incluyen: 1) dejar el ciclo celular y entrar en una fase quiescente reversible; 2) salir del ciclo celular y experimentar apoptosis; 3) diferenciarse y salir irreversiblemente del ciclo celular; y 4) pasar a través del punto de restricción y volverse muy independiente de señales extracelulares y evolucionar automáticamente a través de fases del ciclo celular posteriores (S, G2, M) hasta la siguiente

fase G1. Una variedad de proteínas son a su vez responsables de la evolución regulada de las células a través del ciclo celular. Los componentes clave de la maquinaria del ciclo celular son las ciclinas, las cinasas dependientes de ciclina (CDK) y sus inhibidores. Las ciclinas son una familia de proteínas sorprendentemente diversa, que se sintetizan desde la etapa media/tardía de la fase G1 hasta la fase M del ciclo celular y luego se degradan rápidamente. Una CDK contiene normalmente un dominio catalítico de 300 aminoácidos, que es inactivo por sí mismo. Las CDK se activan mediante la unión a una ciclina. Las actividad de las cdk se inhibe mediante sus inhibidores endógenos (inhibidores de cdk, o cdkI incluyen p15/p16/p18/p19 y p21/p27). Se forman complejos ciclina/CDK específicos en estadios específicos del ciclo celular y se requieren sus actividades para la evolución del ciclo celular a través de la fase S y la mitosis.

La sobreactivación de las CDK es una característica de la mayoría de células tumorales humanas. Se han desarrollado estrategias para modular la actividad de CDK para la intervención terapéutica o bien seleccionando directamente como diana la subunidad de CDK catalítica o bien afectando indirectamente las rutas reguladoras de CDK [3]. Se diseñaron inhibidores de CDK de molécula pequeña para interaccionar específicamente con el sitio de unión a ATP de las CDK, tales como congéneres de flavopiridol, polisulfatos, derivados de toyocamicina, etc. Se han mostrado efectos anticancerígenos en ensayos clínicos para estos agentes. La modulación de las actividades de CDK puede lograrse regulando la fosforilación de las CDK o alterando la expresión de las CDK o la de sus inhibidores o (CKDI). Es difícil encontrar moduladores específicos que no interfieran con otros componentes del ciclo celular y no afecten a las células normales.

Por tanto existe una necesidad de compuestos que se produzcan fácilmente o sean altamente eficaces en el

tratamiento del cáncer pero que tengan toxicidad mínima para las células normales.

Muchas hierbas chinas contienen potentes componentes químicos anticancerígenos. Por ejemplo, varias plantas chinas tales como Camptotheca acuminata (camptotecina), Cephalotaxus sp. (homoharringtonina/harringtonina) han proporcionado compuestos con actividad antitumoral significativa [6]. PCSPES, una mezcla que consiste en extractos de ocho hierbas para el tratamiento del cáncer de próstata, ha demostrado tener potente actividad antiandrógena [7]. Recientemente se ha mostrado que huanglian, un extracto de hierbas chinas, inhibe el crecimiento celular suprimiendo la expresión de ciclina B1 e inhibiendo la actividad de cinasa CDC2 en células cancerosas humanas [8]. Además, muchos productos de hierbas chinas han demostrado un papel importante en la quimioprevención del cáncer.

Recientemente, estudios han demostrado que las moléculas de indirubina de la hierba china anticancerígena Qing Dai, presentan su actividad anticancerígena mediante la modulación de cinasas dependientes de ciclina [9].

Liu et al. (Biochemical Pharmacology, Vol. 51, 1996, 1545-1551) da a conocer el uso de metilisoindigotina (meisoíndigo) como un agente antileucémico.

El documento WO 00/61555 (publicado el 19-10-2000) da a conocer compuestos de indirubina útiles para tratar cáncer, en los que se une un monosacárido no protegido al anillo indol mediante un etilenglicol éter.

Estudios anteriores demostraron que el meisoíndigo, una segunda generación de indirubinas, detiene las células de leucemia en la fase G1, inhibe la expresión del oncogén c-myb e induce la diferenciación y maduración celular a bajas concentraciones (baja toxicidad) en las que el crecimiento celular se inhibe completamente sin una disminución en la viabilidad celular [10, 11]. Estudios recientes demostraron que la indirubina inhibe selectivamente las cinasas

dependientes de ciclina (cdk) compitiendo con el ATP por la unión al sitio catalítico de la cinasa (figura 2) [12].

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

5 La presente invención proporciona derivados novedosos de isoíndigo, índigo e indirubina que pueden usarse para tratar cáncer en animales. Estos compuestos novedosos presentan toxicidad y efectos secundarios mínimos con un índice quimioterápico sustancial. Estos compuestos permiten el

10 tratamiento de una variedad de cánceres con efectos secundarios mínimos experimentados por el paciente. Además, los compuestos novedosos son moléculas químicas estables, sencillas que son sustancialmente fáciles de producir y administrar.

15 Una de las ventajas de la presente invención es que los compuestos novedosos tienen un aumento de la solubilidad y biodisponibilidad en comparación con las moléculas de la técnica anterior y por tanto son más adecuados para el tratamiento del cáncer.

20 La presente invención se refiere a un grupo específico de compuestos novedosos que son derivados de isoíndigo, índigo e indirubina tal como se muestran en las fórmulas (I), (II) y

(III) respectivamente

imagen1

FÓRMULA (I)

y

imagen1

FÓRMULA (II)

y

imagen1

5 FÓRMULA (III) en las que R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 o R10 son independientemente un hidrógeno, un monosacárido, un disacárido, un halógeno, un grupo hidrocarbilo o un grupo hidrocarbilo funcional no sustituido o sustituido con uno o

10 más restos hidroxilo, restos carboxilo, restos nitroxilo, monosacáridos, disacáridos, aminas, amidas, tioles, sulfato, sulfonato, sulfonamida o halógenos, en el que el hidrocarbilo tiene de 1 a 12 átomos de carbono.

Una realización preferida es una en la que R1 o R2 son un 15 monosacárido y normalmente se prefiere que el monosacárido esté acetilado.

Una realización particularmente preferida de la

invención, denominada en el presente documento como NATURA, es

el compuesto de la siguiente fórmula (IV)

imagen1

FÓRMULA (IV)

Los compuestos de la presente invención pueden usarse para tratar cáncer de tumor sólido y leucemia, comprendiendo administrar al animal una cantidad terapéuticamente eficaz de los derivados novedosos de índigo, isoíndigo e indirubina proporcionados por la invención. Preferiblemente, el compuesto administrado tiene la estructura química de la fórmula (IV) o

imagen1

10 FÓRMULA (V) Generalmente, el cáncer de tumor sólido que está tratándose es cáncer de colon, cáncer de próstata dependiente

o independiente de hormonas, cáncer de mama o cáncer de pulmón. Preferiblemente, el cáncer de tumor sólido es cáncer 15 de próstata dependiente o independiente de hormonas.

Ventajosamente, el compuesto puede administrarse en combinación con agentes terapéuticos adicionales. Normalmente, estos agentes incluyen agentes radioterápicos, agentes de terapia hormonal, agentes inmunoterápicos, agentes

quimioterápicos, agentes crioterápicos o agentes de terapia génica. Preferiblemente, se administra al menos uno de los agentes conocidos como Casodex o Proscar en combinación con el compuesto para resultados óptimos.

La presente invención también proporciona composiciones farmacéuticas que pueden usarse para tratar cáncer o enfermedades en un animal, que comprenden una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto de la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

La figura 1 muestra las estructuras químicas de

indirubina, meisoíndigo,

y NATURA, a nueva entidad química

según la invención.

La

figura 2 muestra un modelo de mecanismos

anticancerígenos de derivados de isoíndigo e indirubina.

La figura 3 es un gráfico de efectos anticancerígenos de NATURA en células de cáncer de mama MCF-7.

La figura 4 es un gráfico de la actividad anticancerígena de NATURA en células de cáncer de colon DLD-1.

La figura 5 es un gráfico de la actividad anticancerígena de NATURA en células de cáncer de próstata dependiente de hormonas LNCaP.

La figura 6 es un gráfico de los efectos de NATURA sobre el crecimiento de células de cáncer de próstata dependiente e independiente de hormonas.

La figura 7 es un gráfico del compuesto inhibidor NATURA sobre la actividad de cdk4/6.

La figura 8 muestra el nivel de fragmentación del ADN en células LNCaP de cáncer de próstata (panel A) y células N2A de neuroblastoma (panel B) que se han expuesto a meisoíndigo, NATURA o taxol.

La figura 9 muestra los efectos de Nature sobre cdk2 y cdk4 en una línea celular de cáncer de próstata dependiente de andrógenos LNCaP.

La figura 10 muestra los efectos de NATURA sobre la actividad de PKC y ERK1/2 en células LNCaP. La figura 11 muestra la inhibición directa de NATURA sobre la actividad de cdk2 inmunopurificada. 5 La figura 12 muestra el efecto de meisoíndigo y NATURA sobre el nivel de proteína de ciclina D1. La figura 13 muestra la degradación de poli(ADP-ribosa) polimerasa en células N2A de neuroplastoma.

10 DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS REALIZACIONES PREFERIDAS La presente invención se refiere a derivados de isoíndigo, índigo e indirubina que pueden usarse para tratar cáncer y otras enfermedades en un animal y también pueden usarse para inhibir actividades, lo que es útil en el

15 tratamiento de otros trastornos humanos, tales como enfermedad de Alzheimer, psoriasis, enfermedades cardiovasculares, glomerulonefritis.

La presente invención se refiere a un grupo específico de compuestos que son derivados de isoíndigo, índigo, e 20 indirubina tal como se muestran en las fórmulas (I), (II) y

(III) respectivamente

imagen1

FÓRMULA (I)

y

imagen1

FÓRMULA (II)

y

imagen1

5 FÓRMULA (III) en las que R1, R2, R3, R4, R3, R6, R7, R8, R9 o R10 son independientemente un hidrógeno, un monosacárido, un disacárido, un halógeno, un grupo hidrocarbilo, o un grupo hidrocarbilo funcional no sustituido o sustituido con uno o

10 más restos hidroxilo, restos carboxilo, restos nitroxilo, monosacáridos, disacáridos, aminas, amidas, tioles, sulfato, sulfonato, sulfonamida o halógenos, en los que el hidrocarbilo tiene de 1 a 12 átomos de carbono. Los compuestos preferidos son aquellos en los que al

15 menos un R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 o R10 es independientemente un monosacárido, un disacárido, o un grupo hidrocarbilo o un grupo hidrocarbilo funcional sustituido con uno o más restos hidroxilo, restos carboxilo, restos nitroxilo, monosacáridos, disacáridos, aminas, amidas, tioles

20 o halógenos, en el los que el hidrocarbilo tiene de 1 a 8 átomos de carbono; y al menos uno de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 o R10 potencia la bioactividad o biodisponibilidad del compuesto. Por ejemplo, imitando el grupo ribosa del ATP, aumentando así la bioactividad de los compuestos.

Es preferible que R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 o R10 potencien la bioactividad o biodisponibilidad del compuesto imitando más estrechamente la estructura del ATP o aumentando la solubilidad del compuesto. Es más preferible que se aumenten tanto la bioactividad como la biodisponibilidad mediante uno o más de R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 o R10.

Los compuestos preferidos adicionales son aquellos en los que R1 o R2 son un monosacárido, un disacárido, o un grupo hidrocarbilo o un grupo hidrocarbilo funcional sustituido con uno o más restos hidroxilo, restos carboxilo, restos nitroxilo, monosacáridos, disacáridos, aminas, amidas, tioles, sulfato, sulfonato, sulfonamida, o halógenos, y preferiblemente en los que el hidrocarbilo tiene de 1 a 8 átomos de carbono y el hidrocarbilo funcional tiene de 1 a 8 átomos de carbono y un grupo hidroxilo por cada dos átomos de carbono. En muchos casos sólo uno de R1 o R2 necesita ser uno de los restos mencionados, siendo uno de los sustituyentes preferidos -CH2CH2OH.

Es preferible que el monosacárido o disacárido esté acetilado. Los compuestos preferidos de fórmulas (I), (II), y

(III) son unos en los que R1 o R2 son un monosacárido acetilado. El monosacárido acetilado R1 o R2 puede ser

cualquier

monosacárido, pero preferiblemente es glucosa,

fructosa,

ribulosa, galactosa, manosa, celobiosa, alosa,

altrosa,

ribosa, xilosa o arabinosa acetilada, y más

preferiblemente xilosa, glucosa, arabinosa, manosa o ribosa acetilada. Preferiblemente, el monosacárido tiene de 1 a 8 grupos acetilo, más preferiblemente de 2 a 4 grupos acetilo.

Uno de los compuestos más preferidos de la invención es NATURA, que tiene la estructura química que se expone en la fórmula (IV).

imagen1

FÓRMULA (IV)

Otros compuestos altamente preferidos de la invención son derivados de NATURA, en los que la molécula de xilosa acetilada está sustituida con un monosacárido acetilado diferente preferiblemente, glucosa, ribosa, manosa o arabinosa acetilada. En el ejemplo 6 a continuación, los inventores proporcionan resultados del aumento de la actividad de NATURA y sus derivados. Basándose en los resultados, parece que la acetilación del monosacárido aumenta en gran medida la actividad de NATURA, y sus derivados, aumentando su biodisponibilidad. Los derivados de NATURA que tienen grupos de azúcar no acetilados mostraron una actividad mucho más débil contra células LNCaP en comparación con los derivados acetilados. Un factor en la determinación de la biodisponibilidad de una molécula es si ésta puede o no pasar a través de la membrana celular. La difusión a través de las membranas celulares se determina mediante la razón aceite/agua (o/w). Si la polaridad es demasiado alta (soluble en agua) o demasiado baja (soluble en aceite), la molécula tendrá un aumento de la dificultad para pasar a través de la membrana mediante difusión simple. NATURA y los derivados de NATURA acetilados tienen una polaridad reducida en comparación con los derivados no acetilados, lo que aumenta sus capacidades de difusión en la membrana y su biodisponibilidad.

Sorprendentemente, se ha encontrado que los compuestos de la invención, en particular NATURA y sus derivados, son altamente eficaces en el tratamiento de cánceres de tumor sólido tales como cáncer de colon, cáncer de próstata

5 dependiente o independiente de hormonas, cáncer de mama o cáncer de pulmón. Preferiblemente, el cáncer de tumor sólido que está tratándose es cáncer de próstata dependiente o independiente de hormonas.

Preferiblemente el compuesto administrado al animal que 10 tienen un cáncer de tumor sólido tiene la estructura química de la fórmula (IV) o

imagen1

FÓRMULA (V) No se pretende que las siguientes listas lo abarquen

15 todo, sino simplemente que sean demostrativas. El término “hidrocarbilo” en el contexto de la presente invención, y en las fórmulas anteriores, se refiere de manera amplia a un grupo hidrocarbonado monovalente en el que la valencia se deriva mediante la extracción de un hidrógeno de un átomo de

20 carbono. El hidrocarbilo incluye, por ejemplo, grupos alifáticos (cadena lineal y ramificada), cicloalifáticos, aromáticos y de carácter mixto (por ejemplo, aralquilo y alcarilo). El hidrocarbilo también incluye tales grupos con insaturación interna e insaturación activada. Más

25 específicamente, el hidrocarbilo incluye (pero no se limita a) grupos tales como alquilo, cicloalquilo, arilo, aralquilo, alcarilo, alquenilo, cicloalquenilo y alquinilo, que tienen preferiblemente hasta 12 átomos de carbono. Las realizaciones

preferidas incluyen aquellas en las que el grupo hidrocarbilo tiene de 1 a 8 átomos de carbono. Estos y otros grupos hidrocarbilo pueden opcionalmente contener un grupo o grupos carbonilo (que se incluye(n) en el número de carbonos) y/o un heteroátomo o heteroátomos (tales como al menos un oxígeno, azufre, nitrógeno o silicio), en la cadena o el anillo.

El término “hidrocarbilo funcional” en el contexto de la presente invención, y en las fórmulas anteriores, se refiere de manera amplia a un hidrocarbilo que posee una funcionalidad colgante y/o “reactiva” terminal y/o “reactiva latente” y/o

grupos

salientes. Funcionalidad reactiva se refiere una

funcionalidad

que es reactiva con funcionalidad de

monómero/polímero

común en condiciones normales que los

expertos habituales en la técnica relevante entienden bien. Como ejemplos de funcionalidad reactiva pueden mencionarse grupos que contienen hidrógeno activo tales como hidroxilo, amino, carboxilo, tio, amido, carbamoílo y metileno activado; isocianato; ciano; epoxilo; grupos etilénicamente insaturados tales como alilo y metalilo; y grupos insaturados activados tales como acriloílo y metacriloílo, y maleato y maleimido (incluyendo aductos de Diels-Alder de los mismos con dienos tales como butadieno). La funcionalidad reactiva latente dentro del significado de la presente invención y, tal como los expertos habituales en la técnica relevante entenderían claramente, se refiere a una funcionalidad reactiva que está bloqueada o enmascarada para evitar una reacción prematura. Como ejemplos de funcionalidad reactiva latente pueden mencionarse cetiminas y aldiminas (aminas bloqueadas, respectivamente, con cetonas y aldehídos); sales de aminocarboxilato; e isocianatos bloqueados tales como variaciones bloqueadas de alcohol (carbamatos), oxima y caprolactama. Un grupo “saliente” dentro del significado de la presente invención y, tal como los expertos habituales en la técnica relevante entenderán claramente, es un sustituyente unido a la cadena o anillo hidrocarbilo que durante la reacción se

desplaza para crear una valencia en un átomo de carbono o heteroátomo en la cadena o anillo hidrocarbilo. Como ejemplos de grupos salientes pueden mencionarse átomos de halógeno tales como cloro, bromo y yodo; sales de amonio cuaternario; sales de sulfonio y sulfonatos.

Un monosacárido o disacárido de la presente invención es preferiblemente glucosa, fructosa, ribulosa, galactosa, manosa, celobiosa, alosa, altrosa, ribosa, xilosa, arabinosa, sacarosa o lactosa. Preferiblemente se usa D-glucosa, Dribosa, D-galactosa, D-lactosa o D-sacarosa. Ventajosamente, el monosacárido o disacárido está acetilado.

El término “halógeno” indica flúor, cloro, bromo o yodo. Un halógeno preferido es flúor o cloro.

Tal como se usa en el presente documento, aminoácido

significa

un L o D-aminoácido (o un residuo del mismo),

preferiblemente

L, seleccionado del grupo que consiste en

alanina,

arginina, asparaginas, ácido aspártico, cisteína,

glutamina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina o valina. El término péptido es dos o más aminoácidos unidos por un enlace peptídico, que contiene preferiblemente de 2 a 8 aminoácidos, y más preferiblemente que contiene de 2 a 6 aminoácidos.

Los compuestos de la presente invención pueden usarse para tratar un animal con cáncer comprendiendo administrar a un animal una terapéuticamente eficaz de los compuestos descritos anteriormente. La invención también puede usarse para prevenir el cáncer. Los compuestos dados a conocer en el presente documento desempeñan un papel en la quimioprevención. Los compuestos pueden usarse para prevenir el cáncer actuando como inhibidores de cdk, que bloquean la evolución del cáncer (segunda etapa en la carcinogénesis), previniendo así su aparición.

La invención puede usarse para un animal con cáncer,

siendo preferible que el animal sea un mamífero y más

preferible que el animal sea un ser humano. Además, se cree que puede usarse la invención para tratar cualquier tipo de cáncer, y se proporcionan datos en el presente documento para demostrar la eficacia para el cáncer de colon, cáncer de próstata dependiente e independiente de hormonas, cáncer de mama y leucemia. Sin embargo, es preferible, que el cáncer que está tratándose sea un cáncer de tumor sólido.

También debe observarse que pueden percibirse beneficios terapéuticos mediante la administración de al menos dos, tres

o más de los compuestos simultánea o secuencialmente. Los compuestos también pueden combinarse con otras terapias para proporcionar cantidades combinadas terapéuticamente eficaces. El compuesto puede administrarse, por ejemplo, en combinación con agentes adicionales seleccionados del grupo que consiste en agentes radioterápicos, agentes de terapia hormonal, agentes inmunoterápicos, agentes quimioterápicos, agentes crioterápicos y agentes de terapia génica. Preferiblemente, se administra Casodex o Proscar en combinación con el compuesto.

La presente invención proporciona además una composición farmacéutica para tratar cáncer en un animal que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un derivado de isoíndigo o indirubina o combinación de derivados y un portador farmacéuticamente aceptable. Esto puede adoptar una variedad de formas adaptadas a la vía de administración elegida tal como se trató anteriormente.

Los expertos en la técnica reconocerán diversas metodologías de síntesis que pueden emplearse para preparar composiciones farmacéuticamente aceptables no tóxicas de los compuestos abarcados por las fórmulas I, II y III. Los expertos en la técnica reconocerán una amplia variedad de disolventes farmacéuticamente aceptables no tóxicos que pueden

usarse

para preparar solvatos de los compuestos de la

invención,

tales como agua, etanol, aceite mineral, aceite

vegetal y dimetilsulfóxido.

Los compuestos de las fórmulas generales I, II y III pueden administrarse por vía oral, por vía tópica, por vía parenteral, mediante inhalación o aerosol o por vía rectal en formulaciones unitarias de dosificación que contienen portadores, adyuvantes y vehículos farmacéuticamente aceptables no tóxicos convencionales. Se entiende además que el mejor método de administración puede ser una combinación de métodos. Particularmente se prefiere la administración oral en la forma de una píldora, cápsula, elixir, jarabe, pastilla, trocisco o similares. El término parenteral tal como se usa en el presente documento incluye inyecciones subcutáneas, inyección intradérmica, intravascular (por ejemplo, intravenosa), intramuscular, espinal, intratecal o técnicas de inyección o infusión similares. Además, se proporciona una formulación farmacéutica que comprende un compuesto de fórmulas generales I, II y III y un portador farmacéuticamente aceptable. Pueden estar presentes uno o más compuestos de fórmulas generales I, II y III en asociación con uno o más portadores y/o diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables no tóxicos y si se desea, otros principios activos. Las composiciones farmacéuticas que contienen compuestos de fórmulas generales I, II y III pueden estar en una forma adecuada para su uso oral, por ejemplo, como comprimidos, trociscos, pastillas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsión, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elíxires.

Las composiciones destinadas a uso oral pueden prepararse según cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas y tales composiciones pueden contener uno o más agentes seleccionados del grupo que consiste en agentes edulcorantes, agentes aromatizantes, agentes colorantes y agentes conservantes con el fin de proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y agradables. Los comprimidos contienen el principio activo en mezcla con excipientes farmacéuticamente aceptables

no tóxicos que son adecuados para la fabricación de comprimidos. Estos excipientes pueden ser por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes de granulación y disgregación, por ejemplo, almidón de maíz o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo almidón, gelatina o goma arábiga, y agentes lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Los comprimidos pueden no estar recubiertos o pueden recubrirse mediante técnicas conocidas para retardar la disgregación y absorción en el tracto gastrointestinal y proporcionando de ese modo una acción sostenida durante un periodo más largo. Por ejemplo, puede emplearse un material de retardo del tiempo tal como monoestearato de glicerol o diestearato de glicerol.

Las formulaciones para su uso oral también pueden presentarse como cápsulas de gelatina dura en las que se mezcla el principio activo con un diluyente sólido inerte, por ejemplo, carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina blanda en las que se mezcla el principio activo con agua o un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuate, parafina líquida o aceite de oliva.

Las suspensiones acuosas contienen los materiales activos en mezcla con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Tales excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa sódica, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto y goma arábiga; los agentes dispersantes o humectantes pueden ser un fosfátido que se produce de manera natural, por ejemplo lecitina, o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grasos, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo heptadecaetilenoxicetanol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como

monooleato de polioxietilensorbitol, o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polietilensorbitano. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes, por ejemplo etilo, o p-hidroxibenzoato de n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes aromatizantes, y uno o más agentes edulcorantes, tales como sacarosa o sacarina.

Las suspensiones oleosas pueden formularse suspendiendo los principios activos en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de cacahuete, aceite de oliva, aceite de sésamo o aceite de coco, o en aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abejas, parafina dura o alcohol cetílico. Pueden añadirse agentes edulcorantes tales como los expuestos anteriormente y agentes aromatizantes para proporcionar preparaciones orales agradables. Estas composiciones pueden conservarse mediante la adición de un antioxidante tal como ácido ascórbico.

Los polvos o gránulos dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa mediante la adición de agua proporcionan el principio activo en mezcla con un agente dispersante o humectante, agente de suspensión y uno o más conservantes. Agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados se muestran a modo de ejemplo mediante los ya mencionados anteriormente. También pueden estar presentes excipientes adicionales, por ejemplo agentes edulcorantes, aromatizantes y colorantes.

Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden estar en forma de emulsiones aceite-en-agua. La fase oleosa puede ser un aceite vegetal, por ejemplo aceite de oliva o aceite de cacahuete, o un aceite mineral, por ejemplo parafina líquida o mezclas de estos. Agentes emulsionantes adecuados pueden ser gomas que se producen de manera natural, por ejemplo goma arábiga o goma tragacanto, fosfátidos que se

producen de manera natural, por ejemplo de soja, lecitina y ésteres o ésteres parciales derivados de ácidos grasos y hexitol, anhídridos, por ejemplo monooleato de sorbitano, y productos de condensación de los dichos ésteres parciales con óxido de etileno, por ejemplo monooleato de polioxietilensorbitano. Las emulsiones también pueden contener agentes edulcorantes y aromatizantes.

Pueden formularse jarabes y elíxires con agentes edulcorantes, por ejemplo glicerol, propilenglicol, sorbitol o

sacarosa.

Tales formulaciones también pueden contener un

demulcente,

un conservante y agentes aromatizantes y

colorantes.

Las composiciones farmacéuticas pueden estar en

forma de una suspensión acuosa u oleaginosa inyectable estéril. Esta suspensión puede formularse según la técnica conocida usando aquellos agentes dispersantes o humectantes y agentes de suspensión adecuados que se han mencionado anteriormente. La preparación inyectable estéril también puede ser disolución o suspensión inyectable estéril en un diluyente

o disolvente aceptable por vía parenteral no tóxico, por ejemplo como disolución en 1,3-butanodiol. Entre los vehículos y disolventes aceptables que pueden emplearse están agua, disolución de Ringer y disolución de cloruro de sodio isotónica. Además, convencionalmente se emplean aceites fijos, estériles como disolvente o medio de suspensión. Para este fin, puede emplearse cualquier aceite fijo insípido incluyendo mono o diglicéridos sintéticos. Además, ácidos grasos tales como ácido oleico encuentran su uso en la preparación de productos inyectables.

Los compuestos de fórmulas generales I, II y III también pueden administrarse en forma de supositorios, por ejemplo, para la administración rectal del fármaco. Estas composiciones pueden prepararse mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado que es sólido a temperaturas habituales pero líquido a la temperatura rectal, y por tanto se fundirá

en el recto para liberar el fármaco. Tales materiales son la manteca de cacao y polietilenglicoles.

Los compuestos de fórmulas generales I, II y III pueden administrarse por vía parenteral en un medio estéril. El fármaco, dependiendo del vehículo y la concentración usada, puede bien suspenderse, o bien disolverse, en el vehículo. Ventajosamente, en el vehículo pueden disolverse adyuvantes tales como anestésicos locales, conservantes y agentes de tamponamiento.

Para la administración a animales no humanos, puede añadirse el compuesto o una composición que contiene el compuesto al agua potable o la comida del animal. Además, será conveniente formular los productos de agua potable y comida del animal de modo que el animal ingiera una cantidad apropiada del compuesto en su dieta. Será conveniente además presentar el compuesto en una composición como una premezcla

para la adición a la comida o al agua potable.

Niveles

de dosificación del orden de desde

aproximadamente

0,01 mg hasta aproximadamente 140 mg por

kilogramo

de peso corporal por día son útiles en el

tratamiento de los estados anteriormente indicados (de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 7 g por paciente por día). Sin embargo, es preferible que la cantidad de dosificación sea de aproximadamente 10 mg a 500 mg por día cuando se administra a un ser humano. La cantidad de principio activo que puede combinarse con los materiales portadores para producir una forma farmacéutica individual variará dependiendo del huésped tratado y el modo particular de administración. Las formas unitarias de dosificación contendrán generalmente desde aproximadamente 1 mg hasta aproximadamente 500 mg de un principio activo.

La frecuencia de la dosificación también variará dependiendo del compuesto usado y la enfermedad particular tratada. Sin embargo, para el tratamiento de la mayoría de trastornos, se prefiere un régimen de dosificación de 4 veces

al día o menos. Sin embargo, se entenderá que el nivel de dosis específico para cualquier paciente particular dependerá de una variedad de factores incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, momento de administración, vía de administración, y tasa de excreción, combinación de fármacos y

la

gravedad de la enfermedad particular que se somete a

terapia.

Compuestos

preferidos de la invención tendrán

propiedades farmacológicas deseables que incluyen, pero no se limitan a, biodisponibilidad oral, baja toxicidad, baja unión a proteínas séricas y semividas in vitro e in vivo deseables. Es necesaria la penetración de la barrera hematoencefálica por los compuestos usados para tratar trastornos del SNC, mientras que a menudo se prefieren bajos niveles en el cerebro de los compuestos usados para tratar trastornos periféricos.

Pueden usarse ensayos para predecir estas propiedades farmacológicas deseables. Los ensayos usados para predecir la biodisponibilidad incluyen transporte a través de las monocapas de células intestinales humanas, incluyendo monocapas de células Caco-2. Puede usarse la toxicidad a hepatocitos cultivados para predecir la toxicidad del compuesto. La penetración de la barrera hematoencefálica de un compuesto en seres humanos puede predecirse a partir de los niveles en el cerebro en animales de laboratorio que reciben el compuesto por vía intravenosa.

La unión a proteínas séricas puede predecirse a partir de ensayos de unión a albúmina. Tales ensayos se describen en una revisión de Oravcova, et al. (Journal of Chromatography B (1996) volumen 677, páginas 1-27).

La semivida del compuesto es inversamente proporcional a la frecuencia de dosificación de un compuesto. Las semividas in vitro de los compuestos pueden predecirse a partir de ensayos de semivida en microsomas tal como se describe en

Kuhnz y Gieschen (Drug Metabolism and Disposition, (1998) volumen 26, páginas 1120-1127).

Ha de entenderse que lo anterior describe realizaciones preferidas de la presente invención y que pueden realizarse modificaciones en las mismas sin apartarse del espíritu o el alcance de la presente invención tal como se expone en las reivindicaciones. Para indicar particularmente y reivindicar con claridad el contenido considerado como la invención, las siguientes reivindicaciones concluyen esta memoria descriptiva.

La cantidad de la composición requerida para su uso en el tratamiento variará no sólo con el compuesto particular seleccionado sino también con la vía de administración, la naturaleza del estado que está tratándose y la edad y el estado del paciente y en última instancia quedará a discreción del médico encargado o médico adjunto.

EJEMPLOS

En los siguientes ejemplos se describen ejemplos de los compuestos de fórmulas I-V y sus usos para tratar el cáncer.

Se diseñaron y examinaron varios derivados de indirubina para determinar sus actividades anticancerígenas. Entre los derivados examinados, se ha encontrado que 1-(�-D-O-triacetilxilopiranosil)-isoíndigo, con fórmula química C27H24N2O9 (NATURA, véase la estructura química en la figura 1) es el más activo no sólo contra la leucemia, sino también contra diversas células cancerosas humanas con efectos de toxicidad inferiores.

Reactivos: Se sintetizaron meisoíndigo y NATURA y otros derivados de azúcar mediante Natrogen, purificado mediante PHLC con una pureza del 98,5%, y se verificaron las estructuras mediante espectro de masas, infrarrojo y resonancia magnética nuclear. NATURA es un polvo cristalino rojizo, sin olor e insípido. Es soluble en dimetilsulfóxido (DMSO), y se disuelve ligeramente en etanol, acetona,

cloroformo, y raras veces se disuelve en agua, Se obtuvieron ácido retinoico, daunomicina, paclitaxel de Sigma Chemical Company (St. Louis, MO), Casodex y Proscar provinieron de píldoras comerciales y se calculó la cantidad equivalente según sus etiquetas. Se adquirieron anticuerpos frente a cdk2 (cdc-2), cdk4/6, PKC, ERK2 y anticuerpos secundarios para la inmunotransferencia de tipo Western de Santa Cruz Biotechnology Inc., y el anticuerpo frente a ciclina D1 de DAKO. Se proporcionó agarosa para proteínas A+G de Oncogene.

Se adquirió �-[32P]-ATP de PerkinElmer Scientific Inc. Se proporcionó el kit de detección de inmunotransferencia de tipo Western por Amersham. Se adquirieron reactivos para SDS-PAGE y electroforesis en agarosa de ADN de Bio-Rad, Inc., y se adquirieron otros compuestos químicos de Sigma.

Cultivos celulares: se adquirieron líneas celulares de cáncer humano de mama (MCF-7 y SKBR-3), colon (LOVO y DLD-1), próstata (LNCaP, DU 145 y PC-3), neuroblastoma, (N2A) y la línea celular epitelial humana HUVEC de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, Maryland). Se mantuvieron las células según las instrucciones del fabricante.

Actividad anticancerígena contra 256 de Walker: Se

dividieron al azar ratas Wistar con pesos corporales entre 50 y 55 gramos, en varios grupos, diez de cada uno, respectivamente. Se trasplantaron aproximadamente 2 x 106 de las células de sarcoma de Walker en una rata Wistar. Veinticuatro horas tras el trasplante, se administró una dosificación molar igual (0,384 mM/kg) de NATURA u otros derivados de azúcar por vía oral durante 10 días. Se administró a los animales en el grupo control 0,1 ml de solución salina (vehículo del fármaco, control negativo) durante los mismos periodos de tiempo que el grupo tratado.

Veinticuatro

horas tras la última administración, se

sacrificaron

los animales y se extrajeron y pesaron los

tumores.

Ensayo para determinar la actividad cinasa dependiente de ciclina: Se cultivaron células HUVEC y LNCaP en EMB (medio basal para células endoteliales) y RPMI 1640 que contenía FBS al 10%, respectivamente. Se expusieron las células que crecieron de manera exponencial a las concentraciones indicadas de meisoíndigo o NATURA durante 24 h. Se recogieron las células, se lavaron y se extrajeron las proteínas totales tal como se describió anteriormente [13]. Se

inmunoprecipitaron cien �g de las proteínas usando anticuerpos frente a cdk2, cdk4/6, PKC, ERK2 o ciclina D1 durante la noche a 4ºC en presencia de un cóctel de inhibidores de proteasas. Se lavaron los inmunoprecipitados 4 veces con tampón para extracción de proteínas y una vez con tampón para ensayo de

cinasas, y se hicieron reaccionar con 75 �g/ml de histona H1 en presencia de [�-32P]-ATP (2,5 �Ci/10 �M). Se midió la histona H1 fosforilada (representa la actividad de cdk) mediante recuento de centelleo o mediante electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida [14, 15]. También se midieron los efectos inhibidores directos de meisoíndigo y NATURA mediante la reacción de la enzima específica inmunopurificada proveniente de células no tratadas directamente con el meisoíndigo o NATURA.

Se observó que este agente inhibe fuertemente las actividades CDK mediadas por ciclina D y el crecimiento celular de diversos tipos de células cancerosas humanas que incluyen líneas celulares de cáncer de mama, próstata, colon y pulmón (CI50 están entre 1,5 y 9,0 �M). Tanto el meisoíndigo como NATURA también presentan muy baja toxicidad con DL50 en ratones. Los datos de prueba a continuación son para meisoíndigo 3,9 � 0,8 g/kg, y para NATURA 7,33 � 1,15 g/kg en comparación con un valor para cisplatino de 15,9 � 1,3 mg/kg en las mismas condiciones experimentales.

Se encontró que a concentraciones superiores, el meisoníndigo bloquea las células tumorales en fase G2+ M en el

segundo punto de control, lo que permite la selección como diana de aquellas células cancerosas que escapan del tratamiento en el estadio temprano del ciclo. A bajas concentraciones, el meisoíndigo inhibe la actividad de cdk mediada por ciclina-D, y a una concentración superior, éste interfiere tanto con la actividad de cdk mediada por ciclina A y/o B como induce la apoptosis (véase la figura 8).

La figura 2 muestra un modelo de mecanismos anticancerígenos de NATURA. Un ciclo celular típico se clasifica en fases G1, S, G2 y M. R: el punto de restricción, en este punto, las células pueden tener diferentes destinos: 1) dejar el ciclo celular y entrar en una fase quiescente reversible, fase G0; 2) salir del ciclo celular y experimentar apoptosis; 3) diferenciarse y salir irreversiblemente del ciclo celular, y 4) pasar a través del punto de restricción y entonces pasar a ser en gran parte independientes de las señales extracelulares y avanzar automáticamente a través de posteriores fases del ciclo celular (S, G2, M) a la siguiente fase G1. Una variedad de proteínas son responsables a su vez de la regulación de la evolución de las células a través del ciclo celular. Los componentes clave de la maquinaria del ciclo celular son las ciclinas (ciclinas D, ciclina A, ciclina B y ciclina E), las cinasas dependientes de ciclina (CDK, cdk4/6, cdk2 y cdc2) y sus inhibidores (p15/p16/p18/19, p21/p27). Meisoíndigo y NATURA inhiben específicamente las actividades de cdk4/6, cdk2, y cdc2, por tanto contra la proliferación celular. Estos compuestos también han demostrado que inducen la diferenciación/maduración celular sin afectar a la viabilidad celular, y promueven la apoptosis. -: inhibe y +: induce o promueve la actividad.

EJEMPLO 1 Actividades anticancerígenas de NATURA in vitro

mediante MTT

Se determinaron efectos inhibidores del crecimiento de NATURA y otros agentes sobre células cancerosas humanas

mediante MTT convencional (prueba de bromuro de 3-(4,5dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio) tal como se describió anteriormente [16]. En resumen, se distribuyeron en alícuotas células cancerosas que crecieron de manera exponencial en placas de 96 pocillos a una densidad de 5000 células/200 �l por pocillo en medio RPMI 1640 que contenía FBS al 10% durante la noche. Entonces se expusieron las células en las placas a series de dilución del agente indicado. Tras 72 h de incubación, se eliminaron 100 �l del medio de cada uno de los pocillos y se añadieron 50 �l de una disolución 1 mg/ml de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MTT) a cada pocillo y se incubaron las células durante 4 h adicionales. Se añadieron 200 �l de disolución de HCl 0,04 N

isopropanol a cada pocillo para disolver los precipitados de de formazán negro, y se midió la absorbancia a 540 nm en una placa de 96 pocillos.

Actividad anticancerígena en modelos animales de

Meisoíndigo y NATURA: Se han usado dos modelos de cáncer de animal establecido, carcinoma de pulmón de Lewis, y sarcoma 256 de Walker [17-20], para evaluar actividades antitumores sólidos de meisoíndigo y NATURA tal como se describió anteriormente. En resumen, se dividieron al azar en varios grupos, ratones C57, de peso corporal entre 18 y 22 gramos, y ratas, peso corporal entre 50 y 55 gramos, diez de cada uno, respectivamente. Se trasplantaron aproximadamente 2 x 106 de células cancerosas de Lewis o células de sarcoma de Walker en ratones o ratas. Veinticuatro horas tras el trasplante, se proporcionaron dosificaciones molares iguales de indirubina, meisoíndigo, NATURA o sus derivados de azúcar por vía oral durante 10 días. Se administró a los animales en el grupo control 0,1 ml de solución salina (vehículo del fármaco, control negativo) durante los mismos períodos de tiempo que el

grupo tratado. Se sacrificaron los animales al final del tratamiento y se extrajeron y se pesaron los tumores.

Efectos de NATURA sobre células cancerosas humanas: Se obtuvo una buena respuesta de diferentes tipos de células cancerosas humanas al tratamiento con meisoíndigo y NATURA mediante MTT tras tres días de exposición, incluyendo líneas celulares de cáncer de mama (MCF-7 y SKBR-3, tabla 1); colon (LOVO y DLD-1, tabla 2) y de próstata dependiente e independiente de hormonas (LNCaP, PC-3 y DU145, tabla 3). Tal como se muestra en las tablas 1-3, los efectos inhibidores del

crecimiento del meisoíndigo (CI50 de 2,15 a 8,31 �M) sobre todas las líneas celulares cancerosas humanas sometidas a prueba son mucho más fuertes que del ácido retinoico (CI50 de 21,45 a > 50 �M), un inductor de diferenciación, y NS389 (CI50 > 200 �M), un nuevo inhibidor de Cox 2 desarrollado. La actividad anticancerígena basada en CI50 de NATURA (CI50 desde 1,64 hasta 6,92 �M), las actividades anticancerígenas de NATURA, es ligeramente más fuerte que su compuesto original meisoíndigo (CI50 de 2,1 a 8,3 �M). Se espera que se produzca una actividad anticancerígena mucho más fuerte de NATURA que de meisoíndigo in vivo debido a una mejora significativa de su biodisponibilidad aumentando su solubilidad. También se obtuvieron resultados similares para todas estas pruebas usando SRB (sulforrodamina B, datos no mostrados). Las actividades de NATURA contra cánceres de próstata tanto dependientes como independientes de hormonas también son mucho más fuertes que las de agentes terapéuticos hormonales actuales clínicos, Casodex y Proscar (tabla 3). No se observaron diferencias significativas de las células cancerosas en respuesta al tratamiento con Meisoíndigo y NATURA mientras que las células cancerosas de mama y colon parecen más sensibles que las de próstata (tabla 3) en respuesta al tratamiento con daunomicina. Estos datos soportan

que meisoíndigo y NATURA están contra una diana común de

células cancerosas, es decir cinasas dependientes de ciclina,

por tanto se demostrará que son un agente quimioterápico útil

para el tratamiento de diversos tipos de tumores sólidos

5 humanos. Aunque el efecto anticancerígeno de meisoíndigo y

NATURA es más débil que el del ensayo de daunomicina o

paclitaxel in vitro, se observa que las toxicidades de

meisoíndigo y NATURA pueden ser muy inferiores a las de otros

agentes tal como se implica mediante su DL50 (3,90 � 0,8 g/kg 10 para Meisoíndigo y 7,33 � 1,15 g/kg para NATURA en ratones).

Tabla 1. Comparación de CI50 (�M) de meisoíndigo y NATURA con agentes quimioterápicos contra líneas celulares de cáncer de mama mediante MTT

Agente

LÍNEA CELULAR

MCF-7

SKBR-3

Meisoíndigo

4,37�0,3 2,17�0,17

NATURA

2,91�0,28 1,71�0,14

Daunomicina

0,054�0,011 0,061�0,0051

Retinoide

21,45�3,78 >50

NS389

>200 >200

Tabla 2. Comparación de CI50 (�M) de NATURA con agentes quimioterápicos contra células de cáncer de colon mediante MTT

Agente

LÍNEA CELULAR

LOVO

DLD-1

Meisoíndigo

5,76�0,72 2,15�0,17

NATURA

4,31�0,59 1,64�0,181

Daunomicina

0,035�0,004 0,094�0,0130

Ácido retinoide

75,34�12,49 49,70�5,72

Paclitaxel

0,00364�0,00051 0,00315�0,00037

NS389

> 200 > 200

Tabla 3. Comparación de CI50 (�M) entre meisoíndigo, NATURA y agentes quimioterápicos contra líneas celulares de cáncer de próstata.

Agente

LÍNEA CELULAR

LNCaP

PC-3 DU145

Meisoíndigo

2,34�0,33 3,26�0,51 8,31�0,93

NATURA

1,72�0,27 2,41�0,39 6,92�0,73

Daunomicina

N/A 0,24�0,018 0,107�0,004

Ácido retinoide

15,95�3,19 > 50 > 50

NS389

65,54�9,46 > 200 > 200

Proscar

40,60�7,12 133,68�12,94 N/A

Casodex

57,40�7,21 120,11�17,31 N/A

5 Las figuras 3 -5 muestran los efectos anticancerígenos de NATURA en células MCF-7 de cáncer de mama, células DLD-1 de cáncer de colon, y células LNCaP de cáncer de próstata dependiente de hormonas. Se distribuyeron en alícuotas las células cancerosas que crecieron de manera exponencial en

10 placas de 96 pocillos a una densidad de 5000 células/200 �l por pocillo en medio RPMI 1640 que contenía suero bovino fetal (FBS) al 10% durante la noche. Entonces se expusieron las células en las placas a series de dilución del agente

indicado. Tras 72 h de incubación, se retiraron 100 �l del

15 medio de cada uno de los pocillos y se añadieron 50 �l de una disolución 1 mg/ml de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)2,5-difeniltetrazolio (MTT) a cada pocillo y se incubaron las células durante 4 h adicionales. Se añadieron 200 �l de disolución de HCl 0,04 N-isopropanol a cada pocillo para

20 disolver los precipitados de formazán negro, y se midió la absorbancia a 540 nm en un lector de microplacas de 96 pocillos [16]. Se repitió cada experimento al menos tres veces.

La figura 6 muestra los efectos anticancerígenos de NATURA en células de cáncer de próstata dependientes e independientes de hormonas. Se cultivaron células HUVEC y LNCaP en EMB (medio basal para células endoteliales) y RPMI 1640 que contenía FBS al 10%, respectivamente. Se expusieron las células que crecieron de manera exponencial a concentraciones indicadas de meisoíndigo o NATURA, durante 24 horas. Se recogieron las células, se lavaron, y se extrajeron las proteínas totales tal como se describió anteriormente

[13]. Se inmunoprecipitaron cien �g de las proteínas usando anticuerpos contra o bien cdk4/6 o bien ciclina D1 durante la noche a 4ºC en presencia de un cóctel de inhibidores de proteasa. Se lavaron los inmunoprecipitados 4 veces con tampón para extracción de proteínas y una vez con tampón para ensayo

de cinasas, y se hicieron reaccionar con 75 �g/ml de histona H1 en presencia de [�-32P]-ATP. Se midió la histona H1 fosforilada (representa actividad de cdk) mediante recuento de centelleo.

Se muestra la naturaleza inhibidora de NATURA y meisoíndigo sobre la actividad de Ckd4/6 en la figura 7. Se usaron dos concentraciones diferentes de 5,0 y 15,0 �m. La concentración inferior de 5,0 �m de NATURA tuvo un mayor efecto inhibidor sobre la actividad de cdk4/6, luego lo hizo la misma concentración de meisoíndigo. Pueden usarse dosificaciones más pequeñas de NATURA para tratar un sujeto que tiene cáncer haciendo a NATURA útil en cantidades pequeñas, lo que aumenta la posibilidad de usar NATURA en combinación con otros fármacos terapéuticos.

La figura 8 muestra la inducción de fragmentación del ADN en células LNCaP de cáncer de próstata (panel A) y células N2A de neuroblastoma (panel B) una señal de apoptosis. Una vez que se han detenido las células cancerosas en fase G1 mediante cualquiera de los derivados de la invención, tales como, Meisoíndigo o NATURA, éstas se diferenciarán o entrarán en

apoptosis. Los estudios han demostrado que aproximadamente el 48% de células ML-1 se diferencian morfológicamente 5 días tras la exposición a meisoíndigo o NATURA. También se observó que algunas células L1210 de leucemia pasan a ser apoptóticas mediante citometría de flujo (FCM), lo que sugiere que

meisoíndigo

y NATURA tienen una capacidad para inducir

apoptosis

celular. La figura 8 confirma que meisoíndigo y

NATURA

provocan apoptosis. Se midió la formación de

fragmentación del ADN (escalera de ADN fragmentado), un indicador de la apoptosis celular, tanto en células LNCaP de próstata como en N2A de neuroblastoma. Para realizar esto se expusieron células LNCaP y N2A de neuroblastoma en fase de crecimiento exponencial a concentraciones indicadas de meisoíndigo o NATURA o taxol (20 nM, como control positivo) durante 2 días. Se recogieron las células, se lavaron y se

extrajo el ADN. Se sometieron aproximadamente 2 �g por carril de ADN a electroforesis en gel de agarosa al 2%. Tal como se muestra en la figura 8, tanto meisoíndigo como NATURA indujeron una fragmentación del ADN significativa en células

LNCaP a concentración de 15 �M. Esta acción se encontró más

potente en células N2A de neuroblastoma que en células LNCaP en las que 5 �M de o bien meisoíndigo o bien NATURA eran suficiente para inducir significativamente escaleras de ADN fragmentado (panel B) que concordaba con los datos de MTT, lo que indica que las células N2A de neuroblastoma son más sensibles a o bien Meisoíndigo o bien NATURA.

EJEMPLO DE REFERENCIA 1 Actividad anticancerígena de

meisoíndigo in vivo

Tal como se muestra en la tabla 4, el meisoíndigo mostró actividades anticancerígenas significativas tanto para cáncer de pulmón de Lewis como para sarcoma 256 de Walker y las actividades fueron mucho más fuertes que las de su compuesto original indirubina.

Tabla 4. Actividades anticancerígenas de meisoíndigo y NATURA en animales

Tumor

Grupo Dosis (mg/ kgxd) N.º de animales Tamaño del tumor X�SD Inhibición (%) Estadística (prueba ST)

Cáncer de pulmón de Lewis

Control - 10 3,5 � 0,44 0

Indirubina

100 x 9 10 2,58�0,21 26,3�2,8 P<0,05

Meisoíndigo

106 x 9 10 1,80�0,15 48,6�4,1 P<0,01

256 de Walker

Control - 10 9,7�1,02 0

Indirubina

100 x 9 10 3,94�0,71 59,4�2,9 P<0,01

Meisoíndigo

106 x 9 10 2,10�0,17 71,6�3,1 P<0,01

5 Estudios anteriores han mostrado que meisoíndigo induce diferenciación y maduración de células ML-1 mientras suprime la expresión del oncogén c-myb, y detiene las células cancerosas en la fase G1 [11]. Un estudio reciente ha mostrado que la activación de myb está relacionada con la fosforilación

10 mediada por cinasas dependientes de ciclina, y la supresión de ciclina D y se han indicado que su actividad cinasa desempeña un papel en la inducción de la diferenciación celular. En esta observación preliminar, se confirmó además que meisoíndigo suprime fuertemente la actividad de cdk4/6 mediada por

15 ciclinas D (fig. 2). Se inhibió más del 56% de la actividad enzimática mediante 5,0 �M y se logró la inhibición completa cuando se expusieron células LNCaP de cáncer de próstata a 15

�M de meisoíndigo durante 24 h. También se obtuvieron resultados similares en células HUVEC de línea celular 20 epitelial humana (datos no mostrados), lo que indica que meisoíndigo también puede tener actividad antiangiogénesis.

Estos análisis indican que meisoíndigo es un agente terapéutico atractivo contra diversos tipos de cánceres humanos puesto que se dirigen específicamente a cinasas

dependientes de ciclina. Meisoíndigo ya ha mostrado actividades anticancerígenas fuertes en animales. La estructura química estable y sencilla de meisoíndigo lo hace fácil de sintetizar y administrar. Además, posee nueva estructura química que presenta actividad anticancerígena, que puede usarse como un agente quimioterápico solo o en combinación con otros agentes convencionales para el tratamiento de diversos tipos de cáncer con resultados potenciados.

EJEMPLO 2 Síntesis química de meisoíndigo, NATURA y sus

derivados:

Normalmente, para sintetizar meisoíndigo, añadir igual cantidad molar de 2-hidroxiindol (véase la estructura a continuación) y N-metil-indolinil-dicetona, ácido acético glacial (2,0 l de ácido acético glacial para uno molar de las sustancias de reacción), y ácido clorhídrico (concentrado, 6,67 ml de HCl para uno molar de las sustancias de reacción) en matraz de tres bocas, calentar hasta 70-80ºC, agitar durante 2 h, enfriar hasta temperatura ambiente. Entonces se forman precipitados de cristal marrones a granel. Filtrar, y lavar secuencialmente con ácido acético glacial, agua destilada y etanol. Se mide el punto de fusión. Debe estar entre 235 – 237ºC.

Se vierte la disolución de reacción madre en agua destilada, y se forman precipitados de cristal de color rojo de tipo ladrillo. Lavar con agua destilada hasta neutralidad. Combinar dos partes del producto cristalino, y recristalizar con ácido acético glacial. El rendimiento es aproximadamente del 63%, el punto de fusión es 236 – 237ºC.

imagen1

También el método de síntesis química de NATURA y sus

compuestos derivados se sintetizaron usando la siguiente ruta

química.

imagen1

Se hicieron reaccionar compuestos (1) (glicósidos) con

ClCOCOCl (cloruro de oxalilo) en disolución de alcohol al 95%

para formar compuestos 2 intermedios que pasan a ser

10 compuestos estables 3 (isatin-glucósidos) en presencia de AlCl3 anhidro. En la que R1’ representa grupo de azúcar de xilosa, ribosa, arabinosa, glucosa o manosa. Además, se hicieron reaccionar compuestos 3 con 2-cetona-indol (oxindol, compuesto 4) o sus compuestos derivados 5 (R2 representa

15 grupos metilo o etilo) en presencia de ácido p-metil

bencenosulfónico para obtener compuestos 6, (Natura). Finalmente se obtuvieron derivados desacetilados de compuestos 7 mediante reacción de compuestos 6 con NaOCH3.

Se sintetizó NATURA usando el método anterior en el que R1’ representaba 1-(�-D-O-triacetil-xilopiranosil) y R2 hidrógeno. Se filtraron precipitados cristalinos marrones a granel de NATURA, y se lavaron secuencialmente con ácido acético glacial, dH2O, y etanol. Se recristalizó el compuesto con ácido acético glacial y se confirmó la estructura química mediante espectro de masas, infrarrojo y resonancia magnética nuclear. Se encontró que el rendimiento era de aproximadamente el 63,8%.

El peso de fórmula (C28H26N2O9) de NATURA, 1-(�-D-Otriacetil-xilopiranosil)-isoíndigo, es de 534,52. Es un polvo cristalino rojizo, sin olor e insípido. Es soluble en dimetilsulfóxido (DMSO), y se disuelve ligeramente en etanol, acetona, cloroformo, y raras veces se disuelve en agua.

EJEMPLO DE REFERENCIA 2 Combinaciones sinérgicas de

meisoíndigo:

Se evaluaron los efectos del meisoíndigo en combinaciones con Casodex o Proscar o Casodex más Proscar sobre el crecimiento celular del cáncer de próstata mediante MTT en células LNCaP. Se realizó un experimento típico tal como sigue: Se sembraron en placa de 96 pocillos las células LNCaP en crecimiento exponencial a densidad de 5.000 células por pocillo. Veinticuatro horas tras la incubación, se expusieron las células a series de dilución de meisoíndigo, o Casodex o Proscar solo. Para combinaciones, se expusieron las células a meisoíndigo con o bien Casodex o bien Proscar, o con Casodex más Proscar a razón de 1:10, 1:4 ó 1:10:4, respectivamente. Las concentraciones máximas fueron de 5 �M para meisoíndigo, 50 �M para Casodex y 20 �M para Proscar, respectivamente. Tres días tras la incubación, se midió el

crecimiento celular mediante MTT tal como se describe en el EJEMPLO 1, se calcularon los porcentajes de inhibición, y se analizaron los datos mediante un programa informático CalcuSyn de Biosoft editado por T.-C. Chou, Memorial Sloan-Kettering 5 Cancer Center, Nueva York, y Hayball, M.P. en Cambridge, RU, 1996 [24]. Se usa el índice de combinación (IC) para evaluar los resultados de una combinación. Si IC > 1, la combinación es antagonista, IC = 1, aditiva, y IC < 1, sinérgica. Tal como se muestra en las tablas 5 -7, las combinaciones de

10 meisoíndigo o bien con Casodex o Proscar o bien Casodex más Proscar dieron como resultado efectos antiproliferación sinérgicos significativos tal como se indica mediante su índice de combinación (IC).

15 Tabla 5. Índice de combinación (IC) de meisoíndigo y Casodex en células LNCaP

Meisoíndigo (�M)

CASODEX (�M) Porcentaje de inhibición IC

0,0098

0,0980 0,9580 0,454

0,0195

0,1950 0,8585 0,213

0,0390

0,3900 0,8000 0,275

0,0780

0,7800 0,5780 0,186

0,1560

1,5600 0,6320 0,466

0,3125

3,1250 0,5306 0,616

0,6250

6,2500 0,4750 0,990

1,2500

12,5000 0,3040 0,975

2,5000

25,0000 0,1200 0,644

5,0000

50,0000 0,0555 0,585

Tabla 6. Índice de combinación (IC) de Meisoíndigo y Proscar en células LNCaP

Meisoíndigo (�M)

Proscar (�M) Porcentaje de inhibición IC

0,0195

0,0780 0,919 4,555

0,0390

0,1560 0,900 5,243

0,0780

0,3120 0,814 1,908

0,1560

0,6240 0,633 0,449

0,3125

1,2500 0,572 0,510

0,6250

25,000 0,567 0,976

1,2500

5,0000 0,457 0,753

2,5000

10,0000 0,409 1,000

5,0000

20,0000 0,282 0,645

Tabla 7. Índice de combinación (IC) de Meisoíndigo y Casodex más Proscar en células LNCaP

Meisoíndigo (�M)

CASODEX (�M) Proscar (�M) Porcentaje de inhibición IC

0,0098

0,0980 0,03904 0,8940 1,228

0,0195

0,1950 0,0780 0,8600 1,214

0,0390

0,3900 0,1560 0,7000 0,350

0,0780

0,7800 0,3120 0,6570 0,498

0,1560

1,5600 0,6240 0,5150 0,403

0,3125

3,1250 1,2500 0,427 0,506

0,6250

6,2500 25,000 0,3420 0,658

1,2500

12,5000 5,0000 0,2700 0,902

2,5000

25,0000 10,0000 0,1570 0,892

5,0000

50,0000 20,0000 0,0600 0,636

5 EJEMPLO DE REFERENCIA 3 Estudio toxicológico de Meisoíndigo Toxicidad aguda Determinación de dosis letal mediana DL50 (la dosis

provoca la muerte del 50% de los animales sometidos a prueba): Se dividieron al azar ochenta ratones blancos Kuan Ming con 10 peso corporal entre 18 -22 g en 8 grupos cada uno con 10 animales. Se administró a los animales una suspensión de meisoíndigo por vía oral a dosificaciones de 0, 1,85, 2,60, 3,60, 5,10, 7,14 y 10,00 g/kg respectivamente. Se sometieron a prueba los animales durante dos semanas, y se midió la DL50

usando el método de Bliss modificado tal como sigue. Se observó la primera muerte de los animales en 2 días tras la administración en el grupo con la dosis más alta. Los datos se mostraron en la tabla 8.

Tabla 8. Resumen de frecuencia de muerte tras la administración de meisoíndigo

Dosis (g/kg)

Dosis logarítmica DFP* [DF]2P2 Unidad de DF

10,00

1,00 1,00 1,00 7,326

7,14

0,85 0,80 0,64 5,842

5,10

0,70 0,70 0,49 5,524

3,60

0,55 0,60 0,36 4,642

2,60

0,41 0,20 0,04 3,249

1,86

0,27 0 0 2,674

*:DF: Frecuencia de muerte; ��DFP: Suma de DFP = 3,30, y suma [DF]2P2 = 2,53 10 DL50 se calculó usando la siguiente ecuación: DL50 = log-1 [Xm – i(�(DFP – 0,5)]

En el presente documento, Xm es la frecuencia máxima de

muerte, Xm = 1 en este caso; i es la distancia de grupo. Esto

se determina mediante la siguiente ecuación, en este caso r =

15 1,4 i = log 1/r = 0,146 Por tanto, se obtuvo la DL50 como 3,9 � 0,8 g/kg.

Toxicidad subaguda y crónica

20 a) Toxicidad subaguda en ratas: Se dividieron al azar cuarenta ratas Westar con peso corporal entre 60 -70 g en 4 grupos cada uno con 10 animales, y se les administró por vía oral meisoíndigo diariamente a dosificaciones de 0, 100, 200 y 400 mg/kg respectivamente 25 durante 30 días. Se examinaron semanalmente los pesos corporales de todos los animales sometidos a prueba. Después,

se sacrificaron los animales para el examen de la función bioquímica y alteraciones patológicas de sangre, oído, hígado, bazo, pulmón y riñón. Se observó una ligera reducción del aumento de peso corporal en el grupo de animales a los que se les administraron 400 mg/kg de meisoíndigo. No se observó ninguna diferencia entre los grupos control y los sometidos a prueba en las funciones bioquímicas de la sangre, el hígado y riñón. El examen histoquímico del corazón, hígado, bazo, pulmón y riñón mostró que sólo apareció una tumefacción ligeramente turbia en el hígado de algunas ratas a las que se les administró la dosificación más alta (400 mg/kg), y no se observó ninguna otra alteración patológica en cualquier otro tejido u órgano.

b) Toxicidad subaguda en perros:

Inicialmente se sometieron a prueba dos perros para determinar la toxicidad subaguda de meisoíndigo. Se les administraron por vía oral 10 mg/kg diariamente durante 3 meses. Ocasionalmente se observaron irritaciones gastrointestinales menores. No se observó ningún cambio bioquímico en la sangre, el hígado y riñón incluyendo glucemia, K+, Na+, etc. durante el período de prueba.

Dado que no se encontró ninguna toxicidad principal durante el estudio inicial, se sometieron a prueba 3 perros adicionales administrándoles por vía oral una dosis superior (20 mg/kg). Entre ellos, se administró a un perro 20 mg/kg durante 46 días, y se administró a otros 2 perros durante 2 meses. No se observó ninguna anomalía en todos los parámetros sometidos a prueba, pero los animales experimentaron irritaciones intestinales en diversos grados, tales como anorexia, náusea y vómitos así como heces verdes negruzcas. Sin embargo, todos estos síntomas desaparecieron tras la finalización del tratamiento con meisoíndigo. Por tanto, se administró a un perro una dosificación escalonada es decir, desde 20 mg/kg hasta 40 mg/kg durante 12 días adicionales tras

el día 73, y no se encontraron anomalías bioquímicas excepto la irritación gastrointestinal mencionada anteriormente. Se realizaron exámenes histoquímicos en los perros a los que se les administró la dosis más alta, y mostraron edema celular, degeneración grasa, e inflamación con hiperplasia en dispersión en tejidos hepáticos.

c) Toxicidad crónica en perros:

Basándose en pruebas iniciales anteriores, se examinaron además las toxicidades subagudas de meisoíndigo en perros. Se dividieron al azar doce perros en 3 grupos teniendo cada uno números iguales de machos y hembras, y se les administró por vía oral meisoíndigo a dosis de 0, 5 y 10 mg/kg al día, respectivamente, durante 6 meses. No se encontraron diferencias significativas entre animales control y sometidos a prueba durante este período en hemograma (glóbulos rojos, glóbulos blancos, plaquetas, hematocrito, volumen corpuscular medio, proteínas séricas totales, y albúmina sérica), funciones del hígado (SGPT), riñón (BUN) y corazón (ECG). Todos los parámetros sometidos a prueba, en todos los animales, incluyendo los controles fluctuaron dentro de intervalos normales. Ocasionalmente sólo unos pocos animales experimentaron irritaciones gastrointestinales menores, tales como anorexia.

Veinticuatro horas tras la finalización del meisoíndigo, se sacrificaron la mitad de los animales de cada grupo, y se diseccionaron para examen patológico. No se observó ninguna anomalía de manera histoquímica en el corazón, hígado, pulmón, riñón, estomago, el tracto gastrointestinal, los testículos, ovario y ganglios linfáticos.

Toxicidad especial

a) Mutación inversa: Se examinó la mutación inversa usando la prueba de Ames.

Se sometió a prueba meisoíndigo a concentraciones de 2, 20, 50, 100 y 200 �g/placa (10 cm), metabólicamente activado (+S9) e inactivado (-S9), en cepas de TA97, TA98, TA100 y TA102 (Salmonella typhimurium por déficit de aminoácidos) respectivamente. Se usaron daunomicina, 2-aminofluoreno (2AF), metilmetanosulfonato (MMS), 2,7-2AF, y 2-hidroxi-antraquinona como s. No se observó ninguna inducción de mutaciones inversas en todos los grupos sometidos a prueba de meisoíndigo, metabólicamente activado o inactivado, mientras que todos los grupos de controles positivos mostraron aumentos significativos en la formación de colonias mutadas inversas.

b) Inducción de micronúcleos en animales roedores:

Se dividieron diez ratones blancos KM en 5 grupos, y se les administró por vía oral meisoíndigo a dosificaciones de 0, 0,4, 0,8 y 2,0 g/kg (igual a 1/10, 1/5 y 1/10 de DL50, respectivamente) diariamente durante 2 días. Se administró ciclofosfamina a dosificación de 48 mg/kg por vía intraperitoneal diariamente durante 2 días como control positivo. Seis horas tras la última administración, se sacrificaron los animales, y se tiñeron eritrocitos policromáticos de médula ósea con Giemsa para contar los micronúcleos. No se obtuvo ninguna diferencia entre los grupos de control negativo y los sometidos a prueba con meisoíndigo (1,86, 1,33 y 2,66 por mil para los grupos sometidos a prueba en comparación con 1,33 por mil del grupo control), mientras que, los micronúcleos aumentaron significativamente en el control positivo (41,16 por mil contra 1,33 por mil del control negativo). Estos datos demostraron una inducción negativa de micronúcleos con meisoíndigo.

c) Aberración del cromosoma en linfocitos humanos:

Se cultivó sangre humana extraída de hombres sanos en presencia de diferentes concentraciones de meisoíndigo (0, 5,

10 y 25 �M) metabólicamente activado o inactivado durante 72

horas, o aflatoxina B1 (AFB1) y mitomicina C (MMC) como controles positivos. Entonces, se examinó la aberración de los cromosomas en el microscopio. No se encontró ninguna diferencia entre los controles negativos y todos los grupos sometidos a prueba con meisoíndigo, metabólicamente activado o inactivado, (P > 0,05), mientras que, las diferencias entre controles positivos y negativos fueron significativas (P < 0,01).

EJEMPLO 3 Actividades anticancerígenas de NATURA y sus

derivados in vivo:

Estudios anteriores han mostrado que meisoíndigo induce la diferenciación y maduración de células ML-1 mientras suprime la expresión del oncogén c-myb, y detiene las células cancerosas en la fase G1 [11]. Estudios recientes muestran que la activación de myb está relacionada con la fosforilación mediada por cinasas dependientes de ciclina, y se han indicado que la supresión de ciclina D y su actividad cinasa desempeñan un papel en la inducción de la diferenciación celular. En esta observación preliminar, se confirmó que NATURA y sus derivados suprimen fuertemente la actividad de cdk4/6 mediada por ciclinas D (figura 2 y 3). Se inhibió más del 56% de la

actividad enzimática mediante 5,0 �M y se logró la inhibición

completa cuando se expusieron células LNCaP de cáncer de próstata a 15 �M de NATURA durante 24 h. También se obtuvieron resultados similares en células HUVEC de línea celular epitelial humana (datos no mostrados), lo que indica que NATURA y sus derivados también pueden tener actividades antiangiogénesis.

Estos análisis indican que NATURA y sus derivados también son agentes terapéuticos atractivos contra diversos tipos de cánceres humanos ya que se dirigen específicamente a cinasas dependientes de ciclina. Se encontró que CI50 de NATURA para todas las líneas celulares de cáncer humano sometidas a prueba estaba entre aproximadamente 1,64 y 6,92

�M, un intervalo eficaz tal como se muestra mediante muchos agentes terapéuticos clínicos. La estructura química estable y sencilla de NATURA la hace fácil de sintetizar y administrar. Además, la nueva estructura química de NATURA y sus derivados que presentan actividad anticancerígena, pueden usarse como un agente quimioterápico solo o en combinación con otros agentes convencionales para el tratamiento de diversos tipos de cáncer con resultados potenciados.

Por ejemplo, pacientes con cáncer que se someten a quimioterapia experimentan con frecuencia pérdida del cabello. Aunque es temporal, este efecto es causa de angustia emocional, un recordatorio visual constante del estado del individuo. Muchos fármacos anticancerígenos que conducen a fases específicas diana de CIA del ciclo celular. Como resultado, demuestran ser selectivamente tóxicas para células que experimentan división. El epitelio del folículo piloso es particularmente sensible a estos efectos porque se divide con bastante rapidez. Se sabe que la inhibición de la evolución del ciclo celular disminuye la toxicidad de los fármacos. Por consiguiente, la combinación de NATURA tomada por vía oral, a baja dosificación de modo que tiene muy baja toxicidad, sería beneficiosa en la reducción del grado de pérdida del cabello en pacientes que se someten a tratamiento para tales situaciones. Además, se reduciría la cantidad de agente quimioterápico convencional, a su vez se reduciría adicionalmente el grado de pérdida del cabello en el paciente.

Por

tanto, la combinación de NATURA con un agente de

tratamiento

convencional contra cáncer dará como resultado

eficacias de

tratamiento similares con menos efectos

secundarios que en la quimioterapia convencional.

Comparación de actividades de NATURA y sus derivados de azúcar contra 256 de Walker

Con el fin de evaluar las actividades anticancerígenas de NATURA y otros derivados de azúcar, se les administró a

ratas Wistard trasplantadas con W256 la misma cantidad molar de los compuestos sometidos a prueba (0,384 mM/kg) durante el mismo período de tiempo (10 días). Tal como se muestra en la tabla 9, NATURA (Xyl-Ac) presentó la mejor actividad con el 5 77% de inhibición sobre el tumor. Todos los derivados que sólo contienen grupo de azúcar mostraron una actividad mucho más débil o no mostraron ninguna actividad en todos contra el tumor W256, posiblemente debido a que las moléculas no pueden pasar a través de la membrana celular debido a alta polaridad.

10 Tabla 9, Actividad de NATURA y sus derivados contra 256 de Walker

R (grupo sustituido)

Porcentaje de inhibición Valor de P

Xyl-Ac*NATURA)

77,5 < 0,001

Xyl

17,5 > 0,05

Glu-Ac

29,4 < 0,05

Glu

Sin actividad N/A

Ara-Ac

54,4 < 0,01

Ara

Sin actividad N/A

Manno-Ac

N/A N/A

Manno

N/A N/A

Ribo-Ac

N/A N/A

Ribo

N/A N/A

Xyl: xilosa, Glu: glucosa, Ara: arabinosa, Manno: manosa, Ribo: ribosa, Ac: triacetilada en las mismas posiciones que NATURA.

Inhibición de Meisoíndigo y NATURA sobre la actividad de

15 cdk Estudios anteriores han mostrado que meisoíndigo induce la diferenciación y maduración de células ML-1 mientras que suprime la expresión del oncogén c-myb, y detiene las células cancerosas en la fase G1 [11]. Un estudio reciente ha mostrado

que la activación de myb está relacionada con la fosforilación mediada por cinasas dependientes de ciclina. Además, se ha mostrado que las supresiones de ciclina D y su actividad cinasa desempeñan un papel en la inducción de la diferenciación celular [25-27]. Además, se confirma que meisoíndigo suprime fuertemente la actividad de cdk4/6 mediada por ciclinas D. De manera similar a meisoíndigo, tras 24 horas de incubación con células LNCaP de cáncer de próstata, NATURA a 5,0 �M y 15 �M inhibió la actividad enzimática de cdk2 en aproximadamente el 46% y el 92%, respectivamente. Se obtuvo una ligera actividad más fuerte sobre cdk4 a 5 �M de NATURA. Un ejemplo típico de estos ensayos se muestra en la figura 9, panel A&B. CI50 de NATURA en las cdk sometidas a prueba (cdk

2, 4/6) de experimentos separados estaba entre 1,5 y 6,0 �M en células LNCaP. No se observó ninguna diferencia notable en las inhibiciones de meisoíndigo y NATURA en las cdk.

También se obtuvieron resultados similares en células HUVEC de línea celular epitelial humana (datos no mostrados), lo que indica que meisoíndigo y NATURA también pueden tener actividad antiangiogénesis.

Además se estableció la especificidad de meisoíndigo y NATURA sobre las actividades de cdk mediante el examen de los efectos de los compuestos sobre las actividades de la proteína cinasa C (PKC) y proteína cinasa 2 regulada por señales extracelulares (ERK2, obsérvese que el anticuerpo tuvo reacción cruzada en cierto grado frente a ERK1 tal como indicaba el proveedor). Un ejemplo típico se muestra en la figura 10, paneles A&B. No se observó ningún efecto inhibidor de NATURA sobre la actividad de PKC y ERK2 tras el tratamiento

de células LNCaP con tanto como 15 �M del agente durante 24 horas. Se verificó este experimento mediante el tratamiento de las células con un inhibidor de ERK específico, PD98058 en la misma línea celular. Exposición de células LNCaP a diferentes concentraciones de PD98058 durante 15 min., se observó un

efecto inhibidor dependiente de la concentración de PD98059 sobre ERK2 tal como se muestra en la figura 2, panel C, que concordaba con las notificaciones anteriores [28].

La inhibición directa de NATURA sobre la actividad de cdk2 in vitro se muestra en la figura 11. Cuando se hizo reaccionar cdk2 inmunopurificada de células LNCaP con histona H1 en presencia de diferentes concentraciones de NATURA-� y �[32P]-ATP (2,5 �Ci/20 �M), se disminuyó la actividad enzimática de una manera dependiente de la concentración. Se encontró que CI50 de NATURA para cdk2 era de 1,6 � 0,2 �M que se comparaba con la actividad observada anteriormente. Como control positivo, genisteína a concentración de 50 �M logró aproximadamente el 56% de inhibición sobre la actividad de cdk2 en las mismas condiciones experimentales, que concordaba con la notificación anterior [29].

Los ensayos de competición por ATP in vitro mostraron

que 10 �M de NATURA lograban más del 50% de efecto inhibidor sobre la cdk2 inmunopurificada a concentración de ATP de tanto como 100 �M, lo que indica que NATURA-� tiene afinidad superior que la de ATP por la enzima.

Meisoíndigo y NATURA también inhiben significativamente la expresión de ciclina D1 en células HUVEC. Se expusieron células HUVEC en crecimiento exponencial a 5,0 y 15 �M de meisoíndigo y NATURA., 24 horas tras las exposiciones, se recogieron las células, se lavaron, y se extrajeron las proteínas totales para el análisis de inmunotransferencia de tipo Western [13] usando un anticuerpo monoclonal específico frente a ciclina D1 (Dako). Tal como se muestra en la figura 12, tanto meisoíndigo como NATURA inhiben fuertemente la expresión de ciclina D1 en estas líneas celulares. La proteína ciclina D1 casi se perdió completamente cuando se expusieron

las células a 15 �M de o bien meisoíndigo o bien de NATURA. Como resultado, se disminuyó (datos no mostrados) la

fosforilación de una proteína Rb supresora de tumores, un sustrato nativo de las cdk mediadas por ciclina D1.

Inducción de la apoptosis: Tal como se mencionó anteriormente las células cancerosas probablemente tienen dos opciones tras detenerse en fase la G1, es decir diferenciación

o apoptosis. Estudios anteriores han demostrado que aproximadamente el 48% de células ML-1 se diferencian morfológicamente 5 días tras la exposición a meisoíndigo. También se observó que algunas células L1210 de leucemia pasaron a ser apoptóticas mediante citometría de flujo (FCM), lo que sugiere que Meisoíndigo también tiene una capacidad de inducir apoptosis celular. Para confirmar la hipótesis y observaciones anteriores, se midió la degradación de poli(ADPribosa) polimerasa (PARP) y la formación de fragmentación de ADN (escalera de ADN fragmentado), indicadores de la apoptosis celular [30, 31], tanto en células LNCaP de próstata como en N2A de neuroblastoma. Se expusieron células LNCaP y N2A de neuroblastoma en fase de crecimiento exponencial a concentraciones indicadas de meisoíndigo o NATURA o Taxol (20 nM, como un control positivo) durante 2 días. Se recogieron las células, se lavaron y se extrajo el ADN. Se sometieron

aproximadamente 2 �g por carril de ADN a electroforesis en gel de agarosa al 2%. Tal como se muestra en la figura 8, tanto meisoíndigo como NATURA indujeron una fragmentación del ADN

significativa en células LNCaP a concentración de 15 �M. Se

encontró que esta acción era más potente en células N2A de neuroblastoma en las que 5 �M de o bien meisoíndigo o bien NATURA eran suficiente para inducir significativamente escaleras de ADN fragmentado (panel B) lo que concordaba con los datos de MTT, lo que indica que células N2A de neuroblastoma son más sensibles a o bien Meisoíndigo o bien a NATURA.

De acuerdo con la formación de escaleras de ADN fragmentado, se observó una fuerte inducción de la degradación de la proteína PARP cuando se expusieron células N2A a o bien Meisoíndigo o bien NATURA (fig. 13). Por tanto, los datos 5 demuestran que tanto meisoíndigo como NATURA inducen significativamente la apoptosis de células cancerosas humanas.

Comparación de actividades de NATURA y sus derivados: Tabla 10, CI50 de NATURA y sus derivados en células LNCaP

R1

o R2 (grupo sustituido) CI50 (�M)

Xyl-Ac* (NATURA)

1,72

Xyl

17,5

Glu-Ac

2,38

Glu

> 20,0

Ara-Ac

2,1

Ara

> 20,0

Manno-Ac

2,52

Manno

>20,0

Ribo-Ac

1,62

Ribo

18,9

Xyl: xilosa, Glu: glucosa, Ara: arabinosa, Manno: manosa, Ribo: ribosa, Ac: triacetilada en las mismas posiciones que NATURA.

10 Todos los derivados que contenían un grupo de azúcar no acetilado mostraron una actividad mucho más débil contra células LNCaP, posiblemente debido a que las moléculas tenían una baja capacidad de difusión de membrana debido a la alta

15 polaridad. Se determina si una molécula puede o no pasar a través de la membrana celular mediante su razón de o/w (aceite/agua). Si la polaridad es demasiado alta (soluble en agua) o demasiado baja (soluble en aceite), será difícil que la molécula pase la membrana mediante difusión simple.

20 Sorprendentemente, los inventores encontraron que las

acetilaciones (grupo triacetilado) reducen la polaridad de la molécula de azúcar-isoíndigo a una razón o/w adecuada aumentando la capacidad de difusión de la membrana y la biodisponibilidad.

La figura 9 muestra los efectos de Nature sobre cdk2 y cdk4 en una línea celular de cáncer de próstata dependiente de andrógenos LNCaP. Se expusieron las células LNCaP que crecieron de manera exponencial a diferentes concentraciones de NATURA durante 24 hrs. Se recogieron las células, se lavaron, y se extrajeron las proteínas totales para ensayos de actividades de cdk tal como se describió en los materiales y métodos. Los paneles superiores (A & B) son imágenes de las películas de SDS-PAGE, y los paneles inferiores representan la densidad medida mediante un densitómetro de imágenes de las mismas películas (expresada como porcentaje de control).

La figura 10 muestra los efectos de NATURA sobre la actividad de PKC y ERK1/2 en células LNCaP. Se expusieron las células LNCaP en fase de crecimiento exponencial a diferentes concentraciones de NATURA (panel A & B) durante 24 h, o a PD98059 (panel C) durante 15 min. Se recogieron las células, se lavaron, y se extrajeron las proteínas totales. Se inmunoprecipitaron cien mg de los extractos proteicos con anticuerpo frente a PCK (panel A) y ERK1/2 (panel B & C) durante la noche para ensayos de cinasa tal como se describe en los “materiales y métodos”. Los paneles superiores son las imágenes de películas de rayos X de SDS-PAGE y los paneles inferiores representan las densidades de cada banda de las películas determinadas mediante un densitómetro de imágenes de las mismas películas (expresada como el porcentaje de control).

La figura 11 muestra la inhibición directa de NATURA sobre la actividad de cdk2 inmunopurificada. Se inmunoprecipitaron doscientos mg de extractos proteicos totales con anticuerpo frente a cdk2 durante la noche a 4ºC. Tras 4 lavados con PBSTDS, y uno con tampón para ensayo de

cinasas, se hizo reaccionar entonces la enzima inmunopurificada durante 10 min. con 10 mg de histona H1 en presencia de diferentes concentraciones de NATURA o 50 mM de

genisteína (como control positivo) y �-[32P]-ATP (2,5 �Ci/10 mM). Se detectó la histona fosforilada H1 (que refleja actividad de cdk2) o bien mediante SDS-PAGE (panel superior) o bien mediante recuento de centelleo radioactivo (panel inferior, tras eliminar �-[32P]-ATP libre).

La figura 12 muestra el efecto de meisoíndigo y NATURA sobre el nivel proteico de ciclina D1. Se trataron las células HUVEC que crecieron de manera exponencial durante 24 h con 5 y

15 �M de meisoíndigo y NATURA. Se recogieron las células, se lavaron, y se extrajeron las proteínas totales para análisis de inmunotransferencia de tipo Western tal como se describió anteriormente [1] usando anticuerpos específicamente frente a ciclina D1 (panel A), y b-actina (control de carga igual, panel B), y se detectaron mediante el kit de detección ECL (Amersham). Se cuantificaron los niveles de ciclina D1 del panel A mediante un densitómetro de imágenes y se normalizaron mediante b-acción (panel C).

La figura 13 muestra la degradación de poli(ADP-ribosa) polimerasa en células N2A de neuroblastoma. Se trataron las células N2A que crecieron de manera exponencial con diferentes concentraciones de meisoíndigo o NATURA durante 24 horas. Se recogieron las células, se lavaron y se extrajeron las proteínas totales para la determinación de la degradación de PARP mediante inmunotransferencia de tipo Western tal como se describió anteriormente [1]. Los paneles superiores (A & B) son imágenes de películas ECL y los paneles inferiores (A’ & B’) son densidades de las bandas correspondientes medidas mediante un densitómetro de imágenes (expresado como el porcentaje de control).

Bibliografía

1.

Morgan, D.O., Principles of CDK regulation. Nature, 1995. 374(6518): p. 131-4.

2.

Buolamwini, J.K., Cell cycle molecular targets in novel anticancer drug discovery. Curr Pharm Des, 2000. 6(4):

p. 379-92.

3.

Senderowicz, A.M., Development of cyclin-dependent kinase modulators as novel therapeutic approaches for hematological malignancies. Leukemia, 2001. 15(1): p. 1

9.

4.

Buchdunger, E., A. Matter, y B.J. Druker, Bcr-Abl inhibition as a modality of CML therapeutics. Biochim Biophys Acta, 2001. 1551(1): p. M11-8.

5.

Druker, B.J., et al., Activity of a specific inhibitor of the BCR-ABL tyrosine kinase in the blast crisis of chronic myeloid leukemia and acute lymphoblastic leukemia with the Philadelphia chromosome. N Engl J Med, 2001. 344 (14): p. 1038-42.

6.

Han, J., Traditional Chinese medicine and the search for new antineoplastic drugs. J Ethnopharmacol, 1988. 24(1):

p. 1-17.

7.

DiPaola, R.S., et al., Clinical and biologic activity of an estrogenic herbal combination (PGSPES) in prostate cancer. N Engl J Med, 1998. 339(12): p. 785-91.

8.

Li, X.K., et al., Huanglian, A chinese herbal extract, inhibits cell growth by suppressing the expression of cyclin B1 and inhibiting CDC2 kinase activity in human cancer cells. Mol Pharmacol, 2000. 58(6): p. 1287-93.

9.

Damiens, E., et al., Anti-mitotic properties of indirubin-3’-monoxime, a CDK/GSK-3 inhibitor: induction of endoreplication following prophase arrest. Oncogene, 2001. 20(29): p. 3786-97.

10.

Ji, X.J., et al., Pharmacological studies of meisoindigo: absorption and mechanism of action. Biomed

Environ Sci, 1991. 4(3): p. 332-7.

11.

Liu, X.M., et al., Induction of differentiation and down-regulation of c-myb gene expression in ML-1 human myeloblastic leukemia cells by the clinically effective anti-leukemia agent meisoindigo. Biochem Pharmacol, 1996. 51(11): p. 1545-51.

12.

Marko, D., et al., Inhibition of cyclin-dependent kinase 1 (CDK1) by indirubin derivatives in human tumour cells. Br J Cancer, 2001. 84(2): p. 283-9.

13.

Wang, L.G., et al., Down-regulation of prostate-specific antigen expression by finasteride through inhibition of complex formation between androgen receptor and steroid receptor-binding consensus in the promoter of the PSA gene in cells LNCaP. Cancer Res, 1997. 57(4): p. 714-9.

14.

Wang, L.G., et al., Activation of casein kinase II in ML-1 human myeloblastic leukemia cells requires IGF-I and transferrin. J Leukoc Biol, 1995. 57(2): p. 332-4.

15.

Kong, M., et al., Cyclin F regulates the nuclear localization of cyclin B1 through a cyclin-cyclin interaction. Embo J, 2000. 19(6): p. 1378-88.

16.

Kreis, W., D.R. Budman, y A. Calabro, Unique synergism or antagonism of combinations of chemotherapeutic and hormonal agents in human prostate cancer cell lines. Br J Urol, 1997. 79(2): p. 196-202.

17.

Yamaura, T., et al., Model for mediastinal lymph node metastasis produced by orthotopic intrapulmonary implantation of lung cancer cells in mice. Hum Cell, 1999. 12(4): p. 197-204.

18.

Mitani, N., et al., Inhibitory effect of berberine on the mediastinal lymph node metastasis produced by orthotopic implantation of Lewis lung carcinoma. Cancer Lett, 2001. 165(1): p. 35-42.

19.

Freitas, J.J., et al., Walker-256 tumor growth causes oxidative stress in rat brain. J Neurochem, 2001. 77(2):

p. 655-63.

20.

Wicki, A. y V. Niggli, The RholRho-kinase and the phosphatidylinositol 3-kinase pathways are essential for spontaneous locomotion of Walker 256 carcinosarcoma cells. Int J Cancer, 2001. 91(6): p. 763-71.

21.

Gianni, L., et al., Nonlinear pharmacokinetics and metabolism of paclitaxel and its pharmacokinetic/pharmacodynamic relationships in humans. J Clin Oncol, 1995. 13(1): p. 180-90.

22.

Ohtsu, T., et al., Clinical pharmacokinetics and pharmacodynamics of paclitaxel: a 3-hour infusion versus a 24-hour infusion. Clin Cancer Res, 1995. 1(6): p. 599

606.

23.

Huizing, M.T., et al., Pharmacokinetics of paclitaxel and metabolites in a randomized comparative study in platinum-pretreated ovarian cancer patients. J Clin Oncol, 1993. 11(11): p. 2127-35.

24.

Kreis, W., D.R. Budman, y A. Calabro, Unique synergism or antagonism of combinations of chemotherapeutic and hormonal agents in human prostate cancer cell lines. Br J Urol, 1997. 79(2): p. 196-202.

25.

Steinman, R.A., Cell cycle regulators and hematopoiesis. Oncogene, 2002. 21(21): p. 3403-13.

26.

Sharifi, N. y R.A. Steinman, Targeted chemotherapy: chronic myelogenous leukemia as a model. J Mol Med, 2002. 80(4): p. 219-32.

27.

Furukawa, Y., Cell cycle control genes ad hematopoietic cell differentiation. Leuk Lymphoma, 2002. 43(2): p. 225-31.

28.

Alessi, D.R., et al., PD 098059 is a specific inhibitor of the activation of mitogen-activated protein kinase cinasa in vitro and in vivo. J Biol Chem, 1995. 270(46):

p. 27489-94.

29.

Frey, R.S., J. Li, y K.W. Singletary, Effects of genistein on cell proliferation and cell cycle arrest in nonneoplastic human mammary epithelial cells:

involvement of Cdc2, p21(waf/cip1), p27(kip1), and Cdc25C expression. Biochem Pharmacol, 2001. 61(8): p. 979-89.

30.

Boehrer, S., et al., In lymphatic cells par-4 sensitizes

5 to apoptosis by down-regulating bcl-2 and promoting disruption of mitochondrial membrane potential and caspase activation. Cancer Res, 2002. 62(6): p. 1768-75.

31. Wu-Wong, J.R., et al., Identification and

characterization of A-105972, an antineoplastic agent. 10 Cancer Res, 2001. 61(4): p. 1486-92.

Claims (13)

1. 
   
   55

   1. Compuesto de fórmula (I), (II) o (III)

   imagen1

   FÓRMULA (I)

   imagen1

   FÓRMULA (II)

   imagen1

   FÓRMULA (III) en las que R1 o R2 son independientemente un 10 monosacárido acetilado; y

   R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9 o R10 son independientemente un hidrógeno, un monosacárido, un disacárido, un halógeno, un grupo hidrocarbilo o un grupo hidrocarbilo funcional no sustituido o sustituido

   15 con uno o más restos hidroxilo, restos carboxilo, restos nitroxilo, monosacáridos, disacáridos, aminas, amidas, tioles, sulfato, sulfonato, sulfonamida o halógenos, en

   el que el hidrocarbilo tiene de 1 a 12 átomos de carbono.

2. 2.

   Compuesto según la reivindicación 1, en el que R1 o R2, es una arabinosa, glucosa, manosa, ribosa o xilosa acetilada.

3. 3.

   Compuesto según la reivindicación 2, siendo el compuesto

   imagen1

   FÓRMULA (IV)
4. 4. Composición farmacéutica para el tratamiento del cáncer

   10 en un animal, que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto según la reivindicación 1 y un portador farmacéuticamente aceptable.
5. 5. Composición farmacéutica según la reivindicación 4, que

   15 comprende un agente adicional seleccionado del grupo que consiste en agentes radioterápicos, agentes de terapia hormonal, agentes inmunoterápicos, agentes quimioterápicos, agentes crioterápicos y agentes de terapia génica.

   20 6. Composición farmacéutica según la reivindicación 4, en la que se formula el compuesto para su administración oral.
6. 7. Compuesto según la reivindicación 1 para su uso en el

   tratamiento del cáncer, comprendiendo dicho tratamiento 25 administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la

   composición farmacéutica según la reivindicación 4 a un animal.

7. 8.

   Compuesto según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento del cáncer, comprendiendo dicho tratamiento administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de la composición farmacéutica según la reivindicación 4 a un ser humano, y en el que el compuesto se administra en combinación con un agente adicional seleccionado del grupo que consiste en agentes radioterápicos, agentes de terapia hormonal, agentes inmunoterápicos, agentes quimioterápicos, agentes crioterápicos y agentes de terapia génica.

8. 9.

   Compuesto según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento del cáncer, comprendiendo dicho tratamiento administrar a un animal con cáncer una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto.

9. 10.

   Compuesto según la reivindicación 2 para su uso en el tratamiento del cáncer, comprendiendo dicho tratamiento administrar a un animal con cáncer una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto.

10. 11.

    Compuesto según la reivindicación 3 para su uso en el tratamiento del cáncer, comprendiendo dicho tratamiento administrar a un animal con cáncer una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto.

11. 12.

    Compuesto según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento del cáncer, comprendiendo dicho tratamiento administrar a un animal con cáncer una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, en el que dicho animal es un ser humano y la composición se administra por vía oral.

12. 13.

    Compuesto según la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento del cáncer, comprendiendo dicho tratamiento administrar a un animal con cáncer una cantidad terapéuticamente eficaz del compuesto, en el que el compuesto se administra en combinación con un agente

    adicional seleccionado del grupo que consiste en agentes

    radioterápicos,

    agentes de terapia hormonal, agentes

    inmunoterápicos,

    agentes quimioterápicos, agentes

    crioterápicos y agentes de terapia génica.

    5

    14. Compuesto según la reivindicación 1 para su uso en el

    tratamiento del cáncer, comprendiendo dicho tratamiento

    administrar

    a un animal con cáncer una cantidad

    terapéuticamente

    eficaz del compuesto, en el que el

    cáncer de tumor sólido que está tratándose es cáncer de

    10

    colon, cáncer de próstata dependiente o independiente de

    hormonas, cáncer de mama o cáncer de pulmón.

13. 15.

    Compuesto según la reivindicación 14 para su uso en el

    tratamiento del cáncer, comprendiendo dicho tratamiento

    administrar

    a un animal con cáncer una cantidad

    15

    terapéuticamente eficaz del compuesto, en el que el

    cáncer de tumor sólido es cáncer de próstata dependiente

    o independiente de hormonas.