ES2224723T3

ES2224723T3 - Procedimiento y formulaciones para la separacion de macromoleculas biologicas.

Info

Publication number: ES2224723T3
Application number: ES99958855T
Authority: ES
Inventors: Marie C. Ruiz-Martinez
Original assignee: CuraGen Corp
Current assignee: CuraGen Corp
Priority date: 1998-11-10
Filing date: 1999-11-10
Publication date: 2005-03-01
Anticipated expiration: 2019-11-10
Also published as: US20020009721A1; DK1129344T3; HK1040284A1; EP1129344B1; CA2349439A1; WO2000028314A1; WO2000028314A9; DE69919568D1; DE69919568T2; AU760638B2; ATE274185T1; US6554985B2; EP1129344A1; JP2002529734A; AU1613700A

Abstract

Formulación de matriz reemplazable, que comprende: (a) una solución de poliacrilamida lineal; (b) por lo menos un desnaturalizante orgánico; en el que el desnaturalizante orgánico se selecciona de entre el grupo que comprende: 2-pirrolidinona, N¿, N¿- dimetilacetamida; y N¿, N¿-dimetilformamida; (c) un tampón; y (d) 6M urea.

Description

Procedimientos y formulaciones para la separación de macromoléculas biológicas.

Solicitudes de patentes relacionadas

La presente solicitud de patente reivindica los beneficios de la solicitud provisional estadounidense nº de serie 60/107.798, presentada el 10 de noviembre de 1998, según 35 U.S.C. & 119(e).

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general a los procedimientos y a las formulaciones para la separación de macromoléculas biológicas, y en particular, a la separación de fragmentos de ADN de cadena única según su tamaño utilizando electroforesis capilar con matrices de poliacrilamida mejoradas.

Antecedentes de la invención

La electroforesis capilar (CE) ha demostrado ventajas sobre los procedimientos con base en la electroforesis estándar en placas como un procedimiento rápido y eficaz para la separación de macromoléculas biológicas, tales como las proteínas, péptidos y ácidos nucleicos (ver p. ej. Slater et al., Electrophoresis, 19(10):1525-1541 (1998). La electroforesis en geles capilares (CGE) es el análogo-CE de la electrophoresis en tradicional en placas de gel y se utiliza frecuentemente para la separación con base en el tamaño de macromoléculas biológicas tales como los oligonucliótidos, fragmentos de restricción de ADN y proteínas. La separación se realiza rellenando el capilar con una matriz tamizante, por ejemplo, poliacrilamida entrelazada, agarosa o disoluciones de polímeros lineales. Las ventajas principales sobre la electrophoresis en placas de gel son una mayor diversidad de matrices y composiciones de geles, detección en línea, cuantificación y automoción mejoradas.

Una de las principales mejoras tecnológicas en CE para el análisis de ADN fue la introducción de disoluciones de polímero reemplazables como matrices tamizantes (ver, p. ej., Sudor et al., Electrophoresis, 12:1056-1058 (1991); Ruiz-Martínez et al., Analytical Chemistry, 65(20):2851-2858 (1993)). La utilización de disoluciones de polímeros sintéticos o naturales no entrelazados ha incrementado significativamente el número de análisis por columna capilar. La sustitución de las matrices después de cada separación crea condiciones analíticas reproducibles. Otra ventaja de los polímeros no entrelazados es que estos se pueden polimerizar en condiciones controladas en solución acuosa, caracterizar, purificar y almacenar indefinidamente como un polvo seco (ver, por ejemplo, Goetzinger et al., Electrophoresis,19(2):242-248 (1998).

Las disoluciones de polímeros se pueden entonces preparar utilizando diversos sistemas de electrolitos de fondo según las necesidades de cada aplicación en particular. La versatilidad ganada por la utilización de tales disoluciones de polímeros enredados permite la utilización de una mayor diversidad de condiciones de electroforesis, tales como temperaturas capilares elevadas, sin dañar la estructura de la matriz (ver, p. ej. Kleparnik et al., Electrophoresis, 17(12):1860-1866 (1996)). Por el contrario los polímeros entrelazados generalmente se polimerizan in situ bajo condiciones menos ideales. Típicamente, tales polímeros no están completamente caracterizados y su calidad oscila de ejecución en ejecución. Los capilares rellenos de geles entrelazados también son muy propensos a la formación de burbujas debidas al las tensiones térmicas y osmóticas. Además, su sustitución necesita una extracción ardua y un escrupuloso limpiado del material antiguo.

Las aplicaciones de separación de ADN (p.ej. secuenciación de ADN, análisis de repeticiones en tándem cortas (STR), representación visual diferencial, tradicionalmente realizadas utilizando placas de geles de poliacrilamida entrelazadas necesitan tanto una elevada capacidad de resolución (desde resoluciones de 1 base hasta 500 bases) como una fuerte capacidad de desnaturalización. Ello también se aplica a la réplica análoga utilizando CE con matrices de polímero reemplazables. Aunque la poliacrilamida lineal reemplazable se ha demostrado que proporciona eficacias de separación insuperadas (ver, p. ej., Pariat et al., Journal of Cromatography, 652(1):57-66 (1993), también muestran migración anómala dependiente de la secuencia tanto para el ADN de doble cadena como para el de cadena única (ver, pl. ej., Berka et al., Electrophoresis, 16(3):377-388 (1995) y Wenz, Nucleic Acids Research, 22(19):4002-4008 (1994). Incluso bajo condiciones desnaturalizantes (típicamente 6-8 M urea en el tampón de correr) la migración anómala de fragmentos de ssADN supone un problema serio causante de compresiones en la secuenciación del ADN y baja precisión en medida del tamaño de los fragmentos de ADN en las aplicaciones de genotipaje. Por consiguiente, la estructura secundaria de los fragmentos de ADN de cadena única puede afectar adversamente la migración de los fragmentos de ADN en las disoluciones de polímeros teniendo como consecuencia un dimensionado impreciso. En el campo de la secuenciación de ADN, las mismas interacciones secundarias de los fragmentos de ADN produce compresiones que no permiten una identificación adecuada de la secuencia del fragmento.

La patente US nº 5.503.722 se refiere a composiciones lineales de poliacrilamida útiles como medios de separación en electroforesis capilar y que contienen urea como agente desnaturalizante. Dicho documento constituye la técnica anterior más próxima.

El documento WO 93/15394 se refiere a columnas capilares para la electroforesis capilar que pueden incluir agentes desnaturalizantes.

El documento WO 95/06668 describe un procedimiento para secuenciar ácidos nucleicos en un medio de gel de polisacárido en presencia de agentes desnaturalizantes.

Sumario de la invención

La presente invención da a conocer procedimientos para la separación de macromoléculas biológicas y formulaciones para matrices de separación con polímeros lineales mostrando propiedades mejoradas para la desnaturalización del ADN para ser utilizadas en electroforesis por series de capilares. En particular, una combinación de urea con los desnaturalizantes orgánicos 2-pirrolidinona, N,N'-demetilacetamida, o N,N'-dimetilformamida produjo un ambiente químico que fuertemente desfavorece el apareamiento de las bases de los ácidos nucleicos. La separación de fragmentos de ADN de cadena única en tales matrices minimiza los efectos de las estructuras secundarias de las cadenas de ADN en la movilidad de los fragmentos, mejorando así considerablemente la separación dependiente del tamaño. Además, la presente invención da a conocer concentraciones optimizadas de electrolito de fondo y voltajes de funcionamiento para mejorar todavía más la migración dependiente del tamaño de los fragmentos de ADN, además de las incrementadas propiedades desnaturalizantes de las matrices de polímero. Las aplicaciones biológicas de la electroforesis capilar tales como la representación visual diferencial del ARNm, la huella digital dideoxi, tamaño STR, y secuenciado de ADN se beneficiarían considerablemente de la utilización de tales formulaciones.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1: Representación esquemática del dispositivo utilizado para mezclar la matriz tamizante en cantidades superiores a 30 ml. (1) Se utiliza una pinza para soportar (2) y el agitador sobrecabeza Heidolph de elevado par mecánico (4) que funcionó a 45 x rpm. La matriz se colocó en un reactor de vidrio (Pirex) (5) con un volumen entre 0,5-2,0 l. El agitador estaba provisto de una pala (3) con forma de Z que permitió el mezclado uniforme de la matriz y un adaptador al vacío para minimizar la evaporación de la matriz tamizante. El reactor se dispuso a una altura adecuada para el mezclado utilizando un elevador de laboratorio (5) adecuado. Todo el dispositivo se colocó en un refrigerador a 4ºC. Las matrices se agitaron durante 24-48 horas.

Fig. 2: Longitud aparente del fragmento de 250 bp ROX GeneScan medido en relación con la muestra de digesto por restricción de ADN de Haemophilus influenzae marcado por FAM en el instrumento MegaBace 1000 utilizando diversas matrices de separación reemplazables. Condiciones: inyección de la muestra 20s/10 kV en formamida deshionizada; corriente de la ejecución 12 kV, temperatura del capilar 44ºC, tampón de ejecución 30 mM Tris, 100 mM TAPS, 1 mM EDTA, pH 8,3.

Fig. 3: Tamaño aparente del fragmento de 250 bp ROX GeneScan medido con relación a la muestra del digesto por restricción de ADN de Haemophilus influenzae marcado con FAM en el instrumento MegaBace 1000 utilizando concentraciones crecientes de 2-pirrolidinona. Condiciones: inyección de la muestra 20s/10 kV en formamida deshionizada; voltaje de la ejecución 12 kV, temperatura del capilar 44ºC, tampón de ejecución 30 mM Tris, 100 mM TAPS, 1 mM EDTA, pH 8,3.

Fig. 4: Resolución del los picos de 75 a 500 bases ROX GeneScan 500 utilizando tres tipos de matrices de polímero reemplazable-comercialmente disponibles (i) hidroxietilcelulosa ("MegaBACE-HEC", representado por una cruz), (ii) MegaBACE Long Read Matrix ("MegaBACE-LPA", representado por una cruz) y (iii) un LPA del 2% conteniendo 20% 2-pirrolidinona ("MegaBACE-LPAPYR", representado por un rombo). Las condiciones de electroforesis fueron las mismas que en la Fig. 1.

Fig. 5: Tamaño aparente del fragmento de 340 bp ROX GenScan medido con relación a la muestra de digesto por restricción de ADN de Haemophilus influenzae marcado con FAM en el Instrumento MegaBACE 1000 utilizando diversas concentraciones de electrolito de fondo Tris/TAPS/EDTA.

Las condiciones de electroforesis fueron como en la Figura 1.

Fig. 6: Precisión después de la calibración Se incluyen datos H. influenzae i0m0, m1c0, mli0 y m0p0.

Fig. 7: Ilustración de secuenciación de M13mp18. Condiciones: 2% (peso/peso) poliacrilamida lineal; 20% 2-pirrolidinona; 6 M urea; 30 mM Tris; 100 mM TAPS; 1 mM EDTA a 44ºC, tiempo de llenado de la matriz 2 minutos, equilibrio de la matriz 15 minutos antes de correr, 5 minutos preejecución. Inyección de muestra durante 20 s a 10 kV. La separación se realizó en un campo eléctrico constante a 10 kV.

Fig. 8: Los efectos de los desnaturalizantes en la matriz sobre la resolución de la compresión CGCT en las 400 bases de la secuencia de M13mp18 (-21) utilizando 1,5% HEC, 6M urea, 10% Formamida (A); 3% LPA, 6 M urea (B); 2% LPA, 6 M urea, 20% 2-pirrolidinona (C) y 2% LPA, 6 M urea, 20% DMA (D).

Fig. 9: Gráfica mostrando los datos de precisión.

Descripción detallada de la invención

El advenimiento de los instrumentos de series de capilares automatizados utilizando disoluciones de polímeros reemplazables como matrices de separación ha incrementado la eficacia para el análisis del ADN. Existen tres requerimientos principales para las disoluciones de polímeros a ser utilizadas para tamizar los fragmentos de ADN en los sistemas de series capilares automatizados: (i) capacidad desnaturalizante incrementada, (ii) resolución adecuada y (iii) viscosidad lo suficientemente baja (para permitir la fácil sustitución de las columnas capilares). Una poliacrilamida lineal se ha demostrado proporcionar la máxima resolución observada para fragmentos de ADN de cadena única (ver, p. ej. Current Opinion in Biotechnology, 8(1):82-93 (1997).

El prerrequisito principal para una determinación de tamaño fiable y precisa de un analito desconocido es la comparación de la movilidad de cualquier fragmento desconocido dado con la movilidad de estándares internos separados en el mismo capilar. La utilización de estándares internos para el análisis del ADN ha sido facilitada por la detección de fluorescencia de múltiples colores. La precisión en la determinación del tamaño de un analito desconocido depende de la relación lineal entre el tamaño del fragmento de ADN y la movilidad electroforética. Si los picos de los estándares de tamaño o los fragmentos de ADN a ser medidos muestran movilidades electroforéticas aberrante, se producirán determinaciones de tamaño incorrectas. La movilidad anómala dependiente de la secuencia de los fragmentos de ADN de doble cadena es un fenómeno bien conocido, que refleja topologías del ADN funcionalmente importantes (ver, p. ej. Berka, et al., Electrophoresis, 16(3):377-388 (1995); Atha, Electrophoresis, 19(8- 9):1428-1435 (1998). La precisión de la medida del tamaños de los fragmentos de ADN se puede mejorar considerablemente separando los fragmentos de ADN en sus formas de cadena única bajo condiciones desnaturalizantes. Sin embargo, la migración anómala remanente de uno o más fragmentos de cadena única es generalmente atribuida a estructuras secundarias en el contexto de la secuencia tales como el emparejamiento de bases de la misma cadena (ver, p. ej. Rosenblum et al., Nucleic Acids Research, 25(19):3925-3929 (1997).

Sin embargo, las disoluciones de polímeros comercialmente disponibles no proporcionan capacidad desnaturalizante suficiente para eliminar la migración no específica del tamaño del ADN en la electroforesis capilar. En CE, dos formas de incrementar la capacidad de separación desnaturalizante son (i) añadir al tampón de ejecución productos químicos que se conoce desnaturalizan el ADN y (ii) incrementar la temperatura de la columna. Idealmente, los desnaturalizantes químicos deben ser estables, no peligrosos y no deben afectar las propiedades tamizante de la matriz polimérica. El incremento de la temperatura de la columna sobre los 40-60ºC puede producir algunas dificultades técnicas específicamente para los instrumentos con series de capilares. La ureas ha sido utilizada como el desnaturalizante más común para las separaciones de ssADN en concentraciones de hasta 8 M urea, sin embargo, no proporciona una completa desnaturalización de algunas compresiones de difícil secuenciación y la migración dependiente de tamaño de algunos estándares para la medición del tamaño del ssADN (ver, p. ej. Kleparnik supra y Rosenblum supra). La formamida se utiliza generalmente además de la urea tanto en separaciones de ssADN en placas de gel como en CE para crear condiciones fuertemente desnaturalizantes (ver, p. ej., Ruiz-Martínez, supra). Aunque hace disminuir la viscosidad de las matrices de polímero, haciéndolas por ello más fáciles de reemplazar en los capilares, la formamida es tóxica e inestable, se descompone rápidamente a temperatura elevada en especies cargadas y disminuye la vida de los recubrimientos de los capilares. La utilización del compuestos cíclicos menos dañino 2-pirrolidinona ha demostrado mejorar la precisión de las estimaciones de tamaño del estándar GenScan^{TM} 500 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA) en electroforesis capilar utilizando matrices POP (ver, p. ej., Rosenblum, et al., Nucleic Acids Research, 25(19):3925-3929 (1997).

En la presente invención se optimizaron diversos factores que afectan la desnaturalización de los fragmentos de ADN monocaternario: concentración de tampón, concentración de desnaturalizante orgánico, concentración de polímero y temperatura de la columna capilar. El instrumento de series de capilares de Molecular Dynamics MegaBACE 1000 utilizado en la presente invención es capaz de operar a un máximo de 44ºC, debido a asuntos de estabilidad óptica y de hardware. Para aliviar tales limitaciones en la capacidad desnaturalizante del medio hemos investigado combinaciones de desnaturalizantes que producirían una elevada desnaturalización del ADN, sin afectar la necesidad de utilizar temperaturas de columna sobre 45ºC. Las amidas se encuentran entre los muchos compuestos químicos que han demostrado desnaturalizar al ADN de doble cadena (ver, p. ej., Levine et al., Biochemistry, 2(1):168-175 (1963). La eficacia desnaturalizante de las amidas incrementa con el alargamiento de la cadena alquílica así como también con la sustitución de grupos metilo o etilo en el átomo de nitrógeno (ver, p. ej., Levine et al., supra). Aunque el ADN de doble cadena se desnaturaliza preferiblemente en tampones de baja fuerza iónica, la mayoría de los sistemas estándar de tampón de electroforesis están diseñados sobre concentraciones del aproximadamente 0,1 M para reducir el riesgo de sobrecalentamiento debido a generación de calor por efecto Joule. CE, debido a sus excelentes propiedades para la disipación de calor debido al efecto Joule, puede utilizar tampones con fuerza iónica reducida, mejorando de esta forma las propiedades desnaturalizantes de una matriz reemplazable/sistema desnaturalizante en particular.

Hemos basado todas las formulaciones de matrices utilizadas en la presente invención en una poliacrilamida lineal que se ha demostrado proporciona la mayor resolución observada para los fragmentos de ADN de cadena única (ver, p. ej., Quesada supra).

Formulaciones para matrices

Las formulaciones de la presente invención contienen una elevada concentración de desnaturalizantes orgánicos en una solución de poliacrilamida lineal para obtener una elevada resolución y desnaturalización incrementada del los fragmentos de ADN de cadena única. En formas de realización específicas, las formulaciones preferidas deben incluir poliacrilamida lineal (1-3% peso/peso) y aditivos orgánicos tales como, por ejemplo, (i) 2-pirrolidinona, (ii) N',N'-dimetilformamida, y (iii) N',N'-dimetilacetamida a 5-40% (peso/peso) en combinación con 6 M urea, con concentraciones de tampón entre 0,1-300 mM TAPS-Tris-EDTA. La Tabla 1 sumariza la composición de las matrices utilizadas en la presente invención.

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Preparación de las formulaciones de matrices (Fig. 1)

La Fig. 1 muestra el dibujo esquemático del dispositivo para el mezclado de matriz utilizado en la presente invención. La preparación de la formulación de matriz se describe con detalle en la sección de Ejemplos de la presente invención.

Efecto de diversos desnaturalizantes sobre las movilidades aberrantes de los picos de la escala ROX GeneScan (Fig. 2)

Los productos de la digestión con enzimas de restricción del ADN genómico H. Influenzae se utilizaron como estándares para determinar el tamaño relativo de los fragmentos de 250 bp y 340 bp de la escala GeneScan^{TM} ROX 500 (Applied Biosystems, Foster City, CA) (ver Fig. 2). Los fragmentos esperados del digesto enzimático son conocidos ya que el genoma de H. Influenzae ha sido secuenciado por completo y es una secuencia públicamente disponible (ver, p. ej., Fleischmann et al., Science, 269:496-512 (1995). Se produjo un algoritmo de conversión de bases a marcos utilizando el tamaño teórico de los picos generados por el digesto de H. Influenzae y el tiempo de migración (en marcos) de los picos en el electroforegrama. Utilizando dicha escala se determinó el tamaño de los fragmentos de GeneScan^{TM} ROX 500. Se conoce de la literatura que los fragmentos de 250 y 340 bases de longitud de la escala GeneScan^{TM} ROX 500 no muestra una relación lineal entre su movilidad electroforética y su tamaño teórico y migra de forma anómalamente rápida (ver, p.ej., Rosenblum et al., Nucleic Acids Research, 25(19):3925-3929 (1997). El tamaño aparente del fragmento de 250 bases obtenido de la calibración utilizando el digesto de H. Influenzae se utilizó como una medición de la capacidad desnaturalizante del medio. La Fig. 2 muestra el tamaño relativo determinado para el fragmento de 250 bp en diversas formulaciones de la presente invención y lo compara con las formulaciones de matrices comercialmente disponibles. El tamaño aparente del fragmento de 250 bases es de 243 bp en electroforesis con matrices de poliacrilamida lineal del 3% con solamente 6 M urea como desnaturalizante. La adición de un segundo agente desnaturalizante orgánico junto con la urea 6 M en el tampón de la matriz afecta la longitud aparente del fragmento de 250 bp de forma positiva, es decir, haciendo que su longitud aparente esté más próxima al valor teórico de 250 bp. En particular, 2-pirrolidinona a una concentración del 20% (peso/peso) corrige la movilidad anómala de dicho fragmento en 6 bp en comparación con la matriz de 3% LPA, 6 M urea. Las otras dos amidas utilizadas, N',N'-dimetilformamida y N',N'-dimetilacetamida, son también muy efectivas como desnaturalizantes, produciendo longitudes aparentes de 248,3 y 248,4 bp, respectivamente. El fragmento de 250 bp tiene un tamaño de 248 bp cuando ejecutado utilizando una matriz de hidroxietilcelulosa conteniendo 10% formamida. La formamida ha demostrado mejorar las compresiones de secuenciación de ADN a concentraciones de hasta el 30% en matrices LPA para electroforesis capilar (ver, p.ej., Ruiz-Martínez et al., Analytical Chemistry, 65(20):2851-2858 (1993), sin embargo, las matrices conteniendo formamida son muy inestables a temperatura ambiente o las temperaturas elevadas de las columnas debido a la descomposición y también a la disminución de la vida de los recubrimientos de los capilares. La comparación de matrices en la Fig. 2 también puede reflejar diferentes propiedades de los dos polímeros (HEC contra LPA) y sus concentraciones.

Efecto de la concentración de 2-pirrolidinona sobre la migración anómala de los picos de la escala ROX GeneScan 500 (Fig. 3; Fig. 4)

Se eligió 2-pirrolidinona como el desnaturalizante más efectivo para investigaciones más detalladas ya que se observó la tendencia más positiva sobre la migración de los fragmentos de 250 bp ROX. Para determinar la composición desnaturalizante óptima, se varió la concentración de 2-pirrolidinona en una matriz de separación desde el 5% hasta el 20%, a la vez que se mantuvo la concentración de urea constante a 6 M. El incremento de la concentración de urea sobre 6 M no es práctico debido a su solubilidad limitada. Por otra parte, se puede mezclar hasta el 20% (en peso) de 2-pirrolidinona en la solución inicial de 3% LPA, resultando en una concentración de 2% LPA y permitiendo una compensación del electrolito de fondo de 100 mM TAPS; 30 mM Tris; 1 mM EDTA. La gráfica en la Fig. 3 muestra una relación casi lineal entre la concentración de 2-pirrolidinona y el tamaño aparente del fragmento de 250 bp ROX. El tamaño aparente más próximo a su tamaño teórico (248,8 b) se obtuvo a una concentración del 20% 2-pirrolidinona. Concentraciones de superiores de desnaturalizante habrían diluido la concentración de LPA por debajo del 2% y habrían tenido efectos adversos sobre la resolución para los fragmentos inferiores a 100 bp. De acuerdo con los datos en la literatura, la adición de 2-pirrolidinona a la matriz de separación incrementa el tiempo de electroforesis en aproximadamente un 30% por cada 10% de desnaturalizante a la vez que se mantienen todos los demás parámetros constantes (ver, p. ej. Rosenblum et al., Nucleic Acid Research, 25(19):3925-3929 (1997). Fuimos capaces de compensar dicho efecto incrementando el voltaje de la ejecución desde 10kV a 12 kV en nuestro sistema lo que condujo a la separación de fragmentos de 500 bp de longitud en aproximadamente 65 minutos sin una pérdida significativa de resolución en dicho rango de tamaños. La Fig. 4 muestra una gráfica de resolución contra longitud de fragmento para tres matrices tamizantes incluyendo: dos comercialmente disponibles: LPA (Amhersham-Pharmacia), HEC (Amhersham-Pharmacia) y la formulación de la forma de realización (conteniendo 20% 2-pirrolidinona). De dicha figura, se puede observar que la matriz 2% LPA conteniendo 20% 2-pirrolidinona muestra una resolución superior a la matriz de LPA comercial en la región más allá de los 450 bp a la vez que mantiene una resolución > 2,0 entre 100 y 350 bases, más que suficiente para obtener lecturas de secuencia fiables o datos para el análisis de fragmentos.

Efectos de la concentración del tampón de ejecución sobre la migración anómala de los picos de la escala ROX GeneScan 500 (Fig. 5)

Aunque se conoce que el ADN de cadena doble se desnaturaliza preferiblemente en tampones de baja fuerza iónica, la mayoría de los tampones sistemas estándar para electroforesis están diseñados a aproximadamente una concentración 0,1 M para reducir el riesgo de sobrecalentamiento debido a la generación de calor por efecto Joule (ver, p. ej., Hames & Higgins, Nucleic Acids Hybridization: A Practical Approach. 1985; IRL Press, Oxford and Washington DC). La electroforesis capilar, debido a sus excelentes propiedades intrínsecas para la disipación del calor generado por efecto Joule, puede utilizar tampones con fuerza iónica reducida, mejorando de esta forma las propiedades desnaturalizantes de una matriz reemplazable/sistema de desnaturalizantes en particular. Para examinar los efectos de un tampón de electroforesis con fuerza iónica reducida sobre la migración anómala de la escala de fragmentos ROX GeneSCan 500, se prepararon matrices de separación con una concentración de electrolito de fondo 1x (30 mM Tris, 100 mM TAPS, 1 mM EDTA), 0,86 x (26 mM Tris, 86 M TAPS, 0,86 mM EDTA), 0,75 x (22,5 mM Tris, 75 mM TAPS, 0,75 mM EDTA) y 0,66 x (19,8 mM Tris, 67 mM TAPS, 0,67 mM EDTA). Con concentraciones de electrolito de fondo crecientes el fragmento ROX de 340 bp migró más cerca de su tamaño teórico, tal como se muestra en la Fig. 5. La concentración de electrolito de fondo de 0,66 x (19,8 mM Tris, 67 mM TAPS, 0,67 mM EDTA) ha sido elegida para los siguientes experimentos.

Exactitud y precisión del ADN en la determinación de tamaño de fragmento utilizando matrices con capacidad desnaturalizante mejorada (Fig. 6)

El análisis de los marcadores de repeticiones cortas en tándem (STR) es una de las aplicaciones biológicas que han llamado considerable atención en el campo de la electroforesis capilar. El perfil de los polimorfismos STR requiere separaciones con resolución de una base hasta las 400 bases, una mayor exactitud y precisión en la medición del tamaño. Los valores reportados en la literatura para la precisión en la determinación de tamaños utilizando instrumentos de electroforesis capilar se encontró que era de 0,1-0,2 bp (en la ejecución) y entre 0,2 a 0,8 bp (entre ejecuciones) (ver, p. ej. Vainer et al., Genomics, 41(1):1-9 (1997); Deforce, et al., Journal of Chromatography, 806(1):149-155 (1998); Lazaruk et al., Electrophoresis, 19(1):86:-93 (1998); Mansfield et al., Electrophoresis, 19(1):101-7 (1998); Wenz et al., Genome Research, 8(1):69-80 (1998); Dimosimonin et al., Electrophoresis, 19(2):256-261 (1998). La utilización de temperatura elevada en la columna capilar (60ºC) se encontró que mejoraba la precisión de la estimación de tamaño, aumentó la vida de los capilares, así como también redujo el tiempo de electroforesis (Isenberg et al., Electrophoresis, 19(1):94-100 (1998). Tales resultados están de acuerdo con los datos publicados anteriormente sobre la secuenciación de ADN por electroforesis capilar a elevadas temperaturas de columna (ver, p. ej., Kleparnik et al., Electrophoresis, 17(12):1860-1866 (1996). Por consiguiente es evidente que las aplicaciones de secuenciación de ADN determinación de tamaño podrían beneficiarse de las condiciones de desnaturalización severas, tales como la combinación de desnaturalizantes químicos con temperaturas por encima de 60ºC. Sin embargo, bajo tales condiciones todavía pueden existir algunas desviaciones de la dependencia entre la migración y el tamaño y serían deseables más incrementos en la capacidad de desnaturalización de las matrices de separación.

En la presente invención, se calibraron los tamaños de los picos de la escala ROX GeneScan 500 tal como se describe en los Ejemplos. La exactitud en la determinación de tamaño es el tamaño teórico menos el tamaño medido (después de la calibración) donde el tamaño medido se obtiene a partir de las trazas de separación calibradas en unidades de pares de bases utilizando digestos de H. Influenzae (HI). Los resultados de las mediciones de exactitud en las determinaciones de tamaño se muestran en la Fig. 6. De acuerdo con el análisis estadístico de dichos datos, los datos fallan una prueba de normalidad (Kolmogorov-Smirnoff) con una Dist. K-S = 0,111852 y una Prob. K-S = 0,000156. Sin embargo, podemos reportar las siguientes estadísticas. El tamaño de muestra es 143 con una media de -0,100. Los valores máximos y mínimos son 1,8 y -1,2, respectivamente mientras que los rangos de los puntos de 25% y 75% son -0,3 y 0,2 respectivamente. Los puntos de 5% y 95% están a -0,70 y 0,64 mientras que los puntos de 1% y 99% están a -1,11 y 1,24, respectivamente. La exactitud en la determinación de tamaño es mejor que 0,1 bases en 24 capilares de digesto i0m0 de H. Influenza en dos ejecuciones diferentes; se utilizaron 16 picos en cada traza.

Los datos de precisión se muestran en la Fig. 9.

Secuenciación de ADN utilizando matrices con capacidad de desnaturalización mejorada (Fig. 7; Fig. 8)

Se evaluaron cuatro formulaciones diferentes para secuenciación de ADN. Como comparación, se utilizaron las formulaciones para la matriz de lectura larga MegaBACE y para la matriz HEC^{TM} (Amesham-Pharmacia) junto con las formulaciones de la presente invención. La primera formulación contuvo 2% (peso/peso) poliacrilamida lineal (MegaBACE Matriz de lectura larga), 20% (peso/peso) 2-pirrolidinona, 6 M urea, 30 mM Tris 100 mM TAPS, 1 mM EDTA y la segunda formulación contuvo 2% (peso/peso) poliacrilamida lineal (MegaBACE Matriz de lectura larga), 20% (peso/peso) N',N'-dimetilacetamida, 6 M urea, 30 mM Tris, 100 mM TAPS: 1 mM EDTA. La Fig.7 muestra el electroforegrama completo para la separación de los fragmentos de secuenciación en el polímero lineal del 2% (peso/peso) poliacrilamida, 20% (peso/peso) 2-pirrolidinona, 6 M urea, 30 mM Tris, 100 mM TAPS, 1 mM EDTA a 44ºC, el eje X muestra el tiempo de migración en marcos de datos. La velocidad de adquisición de datos para MegaBACE fue de 1,8 Hertz. En la Fig. 7 la secuencia de fragmentos visitada se muestra sobre la traza. Según el software de secuenciación de MegaBACE dicha traza lee 719 bases con una exactitud del 99,1% contra la secuencia consensuada de M13mp18. Existen múltiples compresiones bien conocidas en la secuencia de M13 (ver, p. ej. Kleparnik et al., supra). La Fig. 8 muestra una parte del electoferograma de la separación de los productos de reacción de la secuenciación de M13 (aproximadamente 400 bases) utilizando HEC y tres formulaciones diferentes de poliacrilamida lineal.

En la Fig. 8 el eje X está en marcos y la velocidad de adquisición de datos de MegaBACE fue de 1,8 Hertz. El eje Y en la Fig. 8 esta en unidades arbitrarias de fluorescencia. Tal como se observa en la Fig. 8 la separación de la secuencia CGCT está afectada fuertemente por el medio de separación. Dicha región es una compresión bien conocida en la secuencia de M13 alrededor de 400 bases (ver, p. ej. Kleparnik, supra). Se puede observar claramente en la Fig. 8 que tanto las formulaciones con 2-pirrolidinona como con con N',N'-dimetilacetamida pueden resolver la compresión CGCT más fácilmente que las formulaciones comercialmente disponibles. También se puede observar que el espaciamiento entre los fragmentos en la formulación de la invención en la Fig. 8 es más uniforme que en las matrices comerciales. Dicha resolución mejorada de las secuencias comprimidas, especialmente en los moldes de ADN ricos en CG mejorará la exactitud en la denominación de las bases.

Ejemplos 1. Muestras

Se obtuvieron estándares ROX GeneScan-500 de Perkin Elmer (parte nº 401734, Perkin Elmer, Applied Biosystems Division, Foster City, CA) y se utilizaron en diluciones que oscilan entre 1:20 y 1:100 tanto en formamida desionizada como en agua nanopura para la inyección electrocinética en los capilares. Se prepararon muestras de fragmentos marcados por FAM a partir de ADN genómico de Haemophilus influenzae por un procedimiento de químico QEA^{TM} tal como se describe en otra parte (ver, p. ej. la patente US nº 5.871.697). Las muestras de secuenciación fueron el estándar de secuenciación MegaBACE^{TM} (Amersham-Pharmacia) que contiene la secuencia de secuenciación de M13 de 4 colores generada con la polimerasa TermoSequenase^{TM} (Amesham-Pharmacia) y los cebadores directos de M13 (-40) (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, Vol. 1, 2 y 3. Vol. 1, 2, 3. 1989, Cold Spring Harbor, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1626) marcados con colorantes de transferencia de energía (Amersham-Pharmacia).

2. Aparato de electroforesis

En la presente invención se utilizó Sistema de Secuenciación MegaBACE 1000 (Amersham-Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA). El MegaBACE 1000 es un instrumento de serie de capilares utilizando 6 series de 16 capilares, de 100 \mum I.D., 64 cm longitud total, 44 cm longitud efectiva. El instrumento se hizo funcionar en el modo de excitación dual por láser (488 y 532 nm), las señales FAM se detectaron en el canal espectral 2 después de un filtro de paso de banda de 520/20, las señales ROX se detectaron en el canal 3 después de pasar a través de un filtro de paso largo 610 LP. Los datos se adquirieron a una velocidad de 1,8 Hz. Las condiciones de electroforesis fueron: voltaje de la ejecución 12 kV, temperatura de los capilares 44ºC, inyección de muestra 20 s/10kV.

3. Preparación de la matriz de separación (Fig. 1)

Se obtiene el peso de un recipiente de vidrio de boca ancha (>1'') (previamente limpio con agua desionizada) y se pone a cero. Se añade al recipiente suficiente Matriz de lectura larga MegaBACE^{TM} (Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ) (proporcionada en jeringas de plástico de 10 ml o en contenedores de un litro) para preparar una solución del 0,8-2,9% (peso/peso). Se registra el peso de Mtriz Tamizante de Lectura Larga^{TM} (Amersham-Pharmacia). Se añade al recipiente de vidrio una cantidad predeterminada de tampón de electroforesis concentrado hasta una concentración final entre 10 y 50 mM Tris (concentración preferida 20 mM), 10 a 300 mM TAPS (concentración preferida 67 mM), 0,1 a 10 mM EDTA (concentración preferida 0,7 mM). Se añadió también urea sólida para crear una concentración final 6 M. La concentración máxima de urea está limitada por su nivel de saturación (aproximadamente 8 M). A continuación se añadió el desnaturalizante orgánico a una concentración final de 5-40% (peso/peso). Los desnaturalizantes preferidos incluyeron 2-pirrolidinona, N',N'-dimetilacetamida y N',N'-dimetilformamida. La combinación de desnaturalizantes más preferida fue 20% 2-pirrolidinona y 6 M urea. La solución se llevó a un peso final mediante adición de agua desionizada. Se añadió a la mezcla un agitador magnético de 7/8'' y se tapó y se selló el recipiente utilizando Para-film^{TM}. Se agitó la solución a baja velocidad en un agitador magnético a temperatura ambiente durante 12-18 horas antes de su utilización. Cuando la solución estuvo completamente disuelta, la mezcla se extrajo del recipiente de boca ancha utilizando una jeringa de plástico de 10 cc. Se ajustaron puntas de pipeta a las jeringas de plástico conteniendo la solución de polímero y se dispensaron 0,75 ml de la mezcla en un recipiente de 2 ml con tapa de rosca. Se desgasificó la solución por centrifugación de los tubos (5.000 x rpm) en un concentrador SpeedVac sin vacío durante 4 minutos. Los tubos a continuación se cerraron con una tapa con arandela y se guardaron a 4ºC.

La preparación de matriz conteniendo 20% de 2-pirrolidinina también se escaló a un nivel de producción tal como se describe más adelante (ver también la Fig. 1): El procedimiento para la preparación de la matriz de separación se modificó para mezclar cantidades de hasta 1.000 g. Se obtuvo el peso de un reactor Pirex (Corning, Corning, NY, 5 en la Fig.1) de 2 litros y se puso a cero. Al reactor de Pirex se añadieron 400 g de Matriz de Lectura Larga MegaBACE (Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ), 92,0 ml de 2-pirrolidinona (Aldrich Chemical Company, Milwaukee, WI), 72,0 g de urea (Amersco, Solon, OH) y se llevó a una peso final de solución de 600 g con agua destilada. Se mezcló la solución a 4ºC en un refrigerador utilizando un agitador de sobre cabeza Heidolph a 45 x rpm durante 24-32 horas. El agitado de sobre cabeza estaba equipado con una pala en forma de Z (3 en la Fig. 1) y un adaptador para vacío (4 en la Fig. 1) para minimizar la evaporación de la solución. La pala con forma de Z proporcionó un mezclado homogéneo de la solución y minimizó la cizalla de los polímeros de elevado peso molecular (ver Fig. 1). Una vez mezclada, la matriz de separación se dispensó en cartuchos retenedores de 12 oz. (Norlico Corporation, Hampton Falls, NH). Los retenedores se colocan en un cargador de barril (Norlico Corp.) y se utilizaron para llenar jeringas de 55 cc con la matriz de separación. Las jeringas se utilizaron en un dispensador digital 2000 x L (Norlico Corp.) para dispensar 1,5 ml de matriz en viales de 2 ml con arandela y tapa de rosca. Los viales de 2 ml conteniendo la matriz de separación se guardaron a 4ºC. Los viales se centrifugaron durante 5 minutos a 5.000 x rpm antes de llenar la serie de capilares en el instrumento MegaBACE (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

4. Procedimiento para medir la longitud aparente de los picos ROX GeneScan

Se prepararon diversos digestos de restricción de H. Influenzae y se corrieron en el instrumento MegaBACE para obtener una calibración de tamaños para los fragmentos de la escala GeneScan ROX 500. Las dobles digestiones con éxito incluyeron i0m0 (BglII/BspH1), m1c0 (Mfe1/Apa L1), m1i0 (MfeI/BglII) y m0p0 (BspH1/BstY1). Se escribió un programa en Mathematica para permitir una determinación precisa de las coordenadas de los picos de interés en el marco número (X, o eje de tiempos) y la intensidad de la señal (Y, o eje de fluorescencia relativa). El número de marco del máximo del pico se utilizó para obtener los valores de tamaño para las ejecuciones MegaBACE. Los tamaños efectivos de los fragmentos GeneScan, teniendo en cuenta el desplazamiento de movilidad y la movilidad electroforética, se interpolaron a partir de un ajuste de tercer orden de H. Influenzae p0r0. Primero, se obtuvo una calibración preliminar como sigue. Se obtuvo una asociación entre el número de marco y el tamaño del fragmento de H. Influenzae i0m0. Se utilizó interpolación lineal utilizando cuatro o cinco picos de i0m0 por pico ROX para obtener una longitud efectiva de los fragmentos ROX, utilizando los números de marco de sus picos. La asignabilidad de la traza de señal de H. Influenzae p0r0 se comprobó y se encontró que los picos no se podían asignar con suficiente confianza para medir la precisión. Cuando se comprobó la calibración, p. ej., examinando los tamaños de H. Influenzae i0m0, se encontró que había tendencias erróneas observables. Por ejemplo, todos los fragmentos cortos se habían medido como demasiado cortos mientras que todos los fragmentos largos podían haberse medido como demasiado largos. Por consiguiente, para obtener una calibración de tamaños más precisa se utilizó para la calibración primaria el digesto más denso de H. Influenzae m1c0 (conteniendo 58 fragmentos con tamaños entre 21 y 591 bp). Se obtuvo una nueva asignación entre el número de marco y el tamaño de fragmento utilizando H. Influenzae/m1c0. Se utilizaron entre cuatro y once picos de m1c0 para obtener una interpolación lineal para cada tamaño ROX. El número de picos elegido para el ajuste lineal osciló y se eligió para incluir todos los picos dentro de una ventana de aproximadamente +/- 50 bases. La estimación de tamaños de H. Influenzae i0m0 m1c0 se examinó de nuevo para comprobar la precisión y ver si existían algunas tendencias. Encontramos que las bandas parecían tener tamaños bajos entre 100 y 139. La tendencia observada se confirmó, por ejemplo con H.influenzae m1i0. La comprobación de todo el digesto de mic0 reveló que los valores de la diferencia residual (teorico-medido) eran todos positivos hasta aproximadamente 250 bases y que había errores cerca de las 500 bases (y para valores extrapolados a longitudes más largas). Utilizando dicha información, se hicieron los ajustes correspondientes para la calibración, por ejemplo, añadir 0,3 a todo valor hasta 250. Se comprobó la estimación de tamaños y los valores ajustados hasta que se obtuvieron mejores valores (más cercanos a cero) para (teórico-medido). A continuación se comprobaron los valores teórico-medido para otro digesto (esta vez m0p0). En este caso la diferencia acumulada de todos los valores (teóricos-medidos) se comprobó y se encontró < 0,1 base en promedio. La precisión se determinó examinando el tamaño de fragmentos idénticos medidos múltiples veces.

5. Software

Se utilizó OGI® para visualizar los datos de todos los 96 capilares. Se utilizó GeneScape®, un sistema de bioinformática con base en Internet para el análisis de los datos. Los cálculos de los tamaños aparentes de fragmento basados en la movilidad estándar de los picos, así como también los cálculos de la resolución, eficiencia y selectividad se realizaron con un programa escrito en Mathematica 3,0 (Wolfram Research, Champaign, IL). Sigma Stat (SPSS Inc., Chigaco, IL) se utilizó par realizar el análisis estadístico de los datos experimentales.

Claims

1. Formulación de matriz reemplazable, que comprende:

(a): una solución de poliacrilamida lineal;

(b): por lo menos un desnaturalizante orgánico; en el que el desnaturalizante orgánico se selecciona de entre el grupo que comprende: 2-pirrolidinona, N',N'-dimetilacetamida; y N',N'-dimetilformamida;

(c): un tampón; y

(d): 6M urea.

2. Formulación de matriz según la reivindicación 1, en la que la concentración de poliacrilamida lineal es de por lo menos 1% (peso/peso).

3. Formulación de matriz según la reivindicación 2, en la que la concentración de poliacrilamida lineal oscila entre 1% y 3% (peso/peso).

4. Formulación de matriz según la reivindicación 1, en la que la concentración del desnaturalizante orgánico oscila entre 5% y 20% (peso/peso).

5. Formulación de matriz según la reivindicación 1, en la que el desnaturalizante orgánico es 2-pirrolidinona.

6. Procedimiento para la separación de biomacromoléculas utilizando un dispositivo de electroforesis capilar que comprende la formulación de matriz según la reivindicación 1.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el dispositivo de electroforesis se hace funcionar a un voltaje de ejecución comprendido entre 10 kV y 12 kV.

8. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el dispositivo de electroforesis se hace funcionar a un voltaje de ejecución de por lo menos 12 kV.

9. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el dispositivo de electroforesis se hace funcionar a una temperatura que oscila entre 40ºC y 60ºC.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, en el que el dispositivo de electroforesis se hace funcionar a 44ºC.

11. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que el tampón está constituido esencialmente por:

(a): EDTA, a una concentración que oscila entre 0,6 y 1,0 mM;

(b): base tris, a una concentración que oscila entre 12 y 30 mM; y

(c): TAPS, a una concentración que oscila entre 50 y 85 mM.

12. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la separación de biomacromoléculas se utiliza en la secuenciación de ácidos nucleicos.

13. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la separación de biomacromoléculas se utiliza para la determinación del tamaño molecular de una biomacromolécula.

14. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la separación de biomacromoléculas se utiliza para la representación visual diferencial de ARNm.

15. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la separación de biomacromoléculas se utiliza en la técnica de "dideoxyfingerprinting".

16. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que la separación de biomacromoléculas se utiliza para el análisis de STR.