ES2224739T3

ES2224739T3 - Saponinas antiprotozoarias.

Info

Publication number: ES2224739T3
Application number: ES99965511T
Authority: ES
Inventors: Louis Jules Roger Marie Maes; Nils Albert Gilbert Germonprez; Luc Emiel Mathilde Van Puyvelde; Mai National Center Science and Technol. VAN TRI; Tran National Center Science and Tech. NGOC NINH; Norbert G. M. De Kimpe
Original assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Current assignee: Janssen Pharmaceutica NV
Priority date: 1998-12-22
Filing date: 1999-12-15
Publication date: 2005-03-01
Anticipated expiration: 2019-12-15
Also published as: AU2100200A; ATE269097T1; US6872713B1; BR9916422A; WO2000038700A1; OA11739A; IL143831A0; CN1331601A; CO5140124A1; AU768712B2; AP2001002208A0; MA25271A1; DE69918166D1; IL143831A; AR029878A1; AP1606A; EP1140127A1; CN1250235C; JP2003521463A; TWI237028B

Abstract

Una saponina triterpénica que se puede obtener mediante un proceso para el aislamiento de saponinas triterpénicas que se encuentran en la familia Myrsinaceae donde las saponinas se aislan de la planta de la especie Maesa balansae y donde dicho proceso comprende los pasos de (a) extracción de las partes de la planta seca con un alcohol y concentración del extracto, (b) eliminación de la fracción apolar del extracto mediante extracción líquido-líquido con un disolvente apolar, (c) purificación posterior de las saponinas del extracto alcohólico mediante extracción líquido-líquido, filtración y cromatografía, y (d) la cromatografía comprende una cromatografía de fase inversa con sistema de elución por gradiente que utiliza A: acetato de amonio en agua al 0, 5 % B: metanol C: acetonitrilo donde a t = 0, (A:B:C) = (60:20:20) y a t = fin, (A:B:C) = (0:50:50), y donde dicha saponina tiene las características siguientes: Compuesto 1: PM = 1.532, ëmáx = 228, 6 nm, ëmáx2= 273, 3 nm; Compuesto 2: PM = 1.510, ëmáx = 223, 9 nm, ëmáx2= 274, 5 nm; Compuesto 3: PM = 1.532, ëmáx = 279, 2 nm, ëmáx2= 223, 9 nm; Compuesto 4: PM = 1.510, ëmáx = 280, 4 nm, ëmáx2= 222, 7 nm; Compuesto 5: PM = 1.574, ëmáx = 276, 8 nm, ëmáx2= 225, 0 nm; o Compuesto 6: PM = 1.552, ëmáx = 279, 2 nm, ëmáx2= 223, 9 nm;

Description

Saponinas antiprotozoarias.

La invención actual se ocupa de un proceso para el aislamiento de saponinas antiprotozoarias de plantas que pertenecen a la familia Myrsinaceae y del uso de dichas saponinas para la preparación de un medicamento para tratar huéspedes, tanto humanos como animales, infestados por protozoarios parásitos del género Leishmania, y para aliviar las manifestaciones clínicas y curar los trastornos conocidos como leishmaniosis en dichos huéspedes.

Las leishmaniosis presentan una gran diversidad de manifestaciones de enfermedad que difieren marcadamente en su gravedad e impacto sanitario. Principalmente, las leishmaniosis son afecciones debilitantes causadas por cualquiera de las varias especies de Leishmania y son transmitidas por varios mosquitos flebotominos. Las leishmaniosis parecen ser mucho más abundantes y de mayor importancia en la salud pública que lo que se ha reconocido previamente. El control de las leishmaniosis es complicado debido a que muchas especies de mosquitos son vectores potenciales, debido a que muchos animales pueden actuar como huéspedes reservorio y debido a que no siempre es posible aplicar procedimientos de diagnóstico (clínicos, serológicos, parasitológicos) o su valor diagnóstico es restringido.

Las manifestaciones pueden ser viscerales, mucocutáneas y/o cutáneas y la cepa del organismo infestante así como el estado inmunológico del huésped pueden influir en las manifestaciones clínicas y en el desenlace de las parasitosis. El tratamiento de las leishmaniosis es complejo y es imprescindible el tratamiento sistémico prolongado. Los objetivos del tratamiento son curar al paciente humano o animal de una parasitosis intracelular, prevenir una recidiva, evitar la aparición de resistencia y mantener los costos totales del tratamiento y la hospitalización al mínimo. Para alcanzar estos objetivos, los fármacos adecuados se deben administrar a una dosis y con una frecuencia apropiadas durante un período adecuado. A pesar de la vasta investigación en busca de fármacos antileishmaniosis eficaces y que sean bien tolerados, sólo se han encontrado unos pocos agentes que estén disponibles para el paciente. En la actualidad, se usan comúnmente como medicamentos de primera línea dos compuestos de antimonio pentavalente que deben administrarse mediante inyección intramuscular profunda: antimoniato de meglumina (Glucantim™, Farmitalia) stibogluconato de sodio (Pentostam™, Wellcome). Los medicamentos de segunda línea son anfotericina-B (en particular las formulaciones liposomales), pentamidina y alopurinol. Los tratamientos de los que se dispone en la actualidad no son suficientemente eficaces y causan efectos colaterales tóxicos al paciente. Además, su espectro de actividad no es suficientemente amplio. Por estas razones, sigue siendo muy grande la necesidad de nuevos medicamentos. La identificación actual de nuevos principios activos se podrá usar en el tratamiento de los trastornos causados por los protozoarios parásitos que pertenecen al género Leishmania.

Phytochemistry, 41 (1), 1996, páginas 269-277 y Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 18 (4,5), 1998, páginas 737-743 describen saponinas triterpénicas aisladas de las hojas de Maesa lanceolata. Journal of Natural products 61 (5), 1998, páginas 585-590 divulga la evaluación de las actividades biológicas de las saponinas triterpénicas de Maesa lanceolata mediante ensayos viricidas, antifúngicos y moluscicidas.

Inesperadamente, se han aislado de la planta Maesa balansae una especie de la familia Myrsinaceae, género Maesa, saponinas triterpénicas que tienen una actividad profiláctica así como terapéutica muy potentes contra el género Leishmania.

La invención también está dirigida a un proceso alternativo para el aislamiento de saponinas triterpénicas de plantas que pertenecen a la familia Myrsinaceae, el cual se caracteriza por comprender los pasos de

(a): extracción de las partes de la planta seca con un alcohol y concentración del extracto,

(b): eliminación de la fracción apolar del extracto mediante extracción líquido-líquido con un disolvente apolar, y

(c): purificación posterior de las saponinas del extracto alcohólico mediante extracción líquido-líquido, filtración y cromatografía.

En particular, el alcohol es metanol, etanol, isopropanol o butanol, cada uno opcionalmente mezclado con agua, preferentemente una mezcla de etanol : agua (70 : 30); el disolvente apolar es un hidrocarburo, p. ej. hexano.

Cuando se aislan las saponinas de la planta del género Maesa, la cromatografía puede incluir una cromatografía líquida de fase inversa con sistema de elución por gradiente que utiliza

A: acetato de amonio en agua al 0,5%

B: metanol

C: acetonitrilo

donde a t = 0, (A:B:C) = (60:20:20) y a t = fin, (A:B:C) = (0:50:50), o una cromatografía líquida de fase normal sobre gel de sílice.

Estos procesos producen una mezcla que consiste fundamentalmente en saponinas. En muchos experimentos farmacológicos descritos en la parte experimental, se utilizó esta mezcla de saponinas. A los efectos de la elucidación de la estructura, esta mezcla se separó en sus constituyentes mediante HPLC, como se describe en la parte experimental.

La invención actual también tiene relación por consiguiente con una o más saponinas triterpénicas que se pueden obtener mediante los procesos descritos en ésta, ya sea como una mezcla o como productos aislados.

En particular, la invención se ocupa de saponinas triterpénicas que se pueden obtener de la planta del género Maesa, mediante cromatografía que comprende cromatografía de líquidos en fase reversa con un sistema de elución por gradiente que utiliza

A: acetato de amonio en agua al 0,5%

B: metanol

C: acetonitrilo

donde a t = 0, (A:B:C) = (60:20:20) y a t = fin, (A:B:C) = (0:50:50), y donde dicha saponina tiene las características siguientes:

Compuesto 1: PM = 1.532, \lambda_{máx} = 228,6 nm, \lambda_{máx2} = 273,3 nm; t_{R} = 8,97

Compuesto 2: PM = 1.510, \lambda_{máx} = 223,9 nm, \lambda_{máx2} = 274,5 nm; t_{R} = 9,39

Compuesto 3: PM = 1.532, \lambda_{máx} = 279,2 nm, \lambda_{máx2} = 223,9 nm; t_{R} = 9,68

Compuesto 4: PM = 1.510, \lambda_{máx} = 280,4 nm, \lambda_{máx2} = 222,7 nm; t_{R}= 10,09

Compuesto 5: PM = 1.574, \lambda_{máx} = 276,8 nm, \lambda_{máx2} = 225,0 nm; t_{R} = 10,87 y

Compuesto 6: PM = 1.552, \lambda_{máx} = 279,2 nm, \lambda_{máx2} = 223,9 nm; t_{R} = 11,37

El tiempo de retención relativo t_{R} es el valor promedio de 10 mediciones frente al tiempo de retención del uracilo en una columna Hypersil BDS C-18, 3 \mum, 100 x 4 mm.

Específicamente, la invención actual se ocupa de saponinas triterpénicas que tienen la fórmula

1

donde R_{2} es -O(C=O)C_{6}H_{5} o -O(C=O)C(CH_{3})=CHCH_{3},

R_{3} es (E) o (Z)-O(C=O)CH=CH-C_{6}H_{5}, y

R_{4} es hidrógeno o -(C=O)CH_{3};

más particularmente,

en el compuesto 1,

: R_{2} es -(C=O)C_{6}H_{5},

: R_{3} es (Z)-O(C=O)CH=CH-C_{6}H_{5},

: R_{4} es hidrógeno;

en el compuesto 2,

: R_{2} es -O(C=O)C(CH_{3})=CHCH_{3},

: R_{3} es (Z)-O(C=O)CH=CH-C_{6}H_{5},

: R_{4} es hidrógeno;

en el compuesto 3,

: R_{2} es -O(C=O)C_{6}H_{5},

: R_{3} es (E)-O(C=O)CH=CH-C_{6}H_{5},

: R_{4} es hidrógeno;

en el compuesto 4,

: R_{2} es -O(C=O)C(CH_{3})=CHCH_{3},

: R_{3} es (E)-O(C=O)CH=CH-C_{6}H_{5},

: R_{4} es hidrógeno;

en el compuesto 5,

: R_{2} es -O(C=O)C_{6}H_{5},

: R_{3} es (E)-O(C=O)CH=CH-C_{6}H_{5},

: R_{4} es -(C=O)CH_{3};

en el compuesto 6,

: R_{2} es -O(C=O)C(CH_{3})=CHCH_{3},

: R_{3} es (E)-O(C=O)CH=CH-C_{6}H_{5},

: R_{4} es -O(C=O)CH_{3};

Los compuestos preferidos para utilizar en las preparaciones farmacéuticas y los métodos de tratamiento de la invención actual son los compuestos 3 y 4, en particular el compuesto 3.

Específicamente, la invención actual se ocupa del uso de una o más saponinas triterpénicas para la elaboración de una preparación farmacéutica para tratar la leishmaniosis en huéspedes infestados por especies de Leishmania; dichas saponinas se caracterizan por tener la fórmula (I)

2

un estereoisómero de ésta o una sal de adición aceptable desde el punto de vista farmacéutico de éstas, donde

R_{1}: es hidrógeno, -(C=O)C_{1-5}alquilo, -(C=O)C_{2-5}alquenilo, -(C=O)C_{2-5}alquenilo sustituido con fenilo, un grupo monosacárido o un grupo oligosacárido;

R_{2}: es hidrógeno, hidroxi, -O(C=O)C_{1-5}alquilo, -O(C=O)C_{2-5}alquenilo, -O(C=O)C_{6}H_{5}, o -O(C=O)C_{2-5}alquenilo sustituido con fenilo;

R_{3}: es hidrógeno, hidroxi, -O(C=O)C_{1-5}alquilo, -O(C=O)C_{2-5}alquenilo, -O(C=O)C_{6}H_{5}, o -O(C=O)C_{2-5}alquenilo sustituido con fenilo;

R_{4}: es hidrógeno, C_{1-6}alquilo, -(C=O)C_{1}-_{5}alquilo, -(C=O)C_{2-5}alquenilo, -(C=O)C_{6}H_{5}, o -(C=O)C_{2-5}alquenilo sustituidos con fenilo;

R_{5}: es CH_{3}, CH_{2}OH, CH_{2}OCH_{3}, CH_{2}O-C(=O)CH_{3}, CHO, COOH; o

R_{5} y R_{2} forman un radical divalente de fórmula -C(=O)-O-;

R_{6} y R_{7} son hidrógeno; o tomados juntos forman un enlace; o

R_{5} y R_{6} forman un radical divalente de fórmula

\quad: -CH_{2}O- \hskip2cm (a),

\quad: -CH(OR_{13})-O- \hskip1,05cm (b),

\quad: -C(=O)-O- \hskip1,59cm (c),

\quad: donde R_{13} es hidrógeno, C_{1-6}alquilo o -(C=O)C_{1-5}alquilo;

R_{8\alpha} y R_{8\beta} cada uno representa independientemente CH_{3}, CH_{2}OH, CH_{2}OCH_{3}, CH_{2}O-C(=O)C_{1-5}alquilo, CHO, CH(OCH_{3})_{2}, CH=NOH, COOH; o

R_{8\beta} y R_{3} forman un radical divalente de fórmula -C(=O)-O-; o

R_{8\beta} y R_{5} forman un radical divalente de fórmula -CH_{2}O-CHOH-;

R_{9}: es CH_{3}, CH_{2}OH, CH_{2}OCH_{3}, CH_{2}O-C(=O)C_{1-5}alquilo, CHO, COOH;

R_{10}: es CH_{3}, CH_{2}OH, CH_{2}OCH_{3}, CH_{2}O-C(=O)C_{1-5}alquilo, CHO, COOH;

R_{11}: es hidrógeno, hidroxi o O-C(=O)C_{1-5}alquilo; o R_{10} y R_{11} forman un radical divalente de fórmula -CH_{2}O-; y

R_{12}: es CH_{3}, CH_{2}OH, CH_{2}OCH_{3}, CH_{2}O-C(=O)CH_{3}, CHO, CH=NOH o COOH.

Se prefieren los compuestos de fórmula (I) donde

R_{1}: es hidrógeno, -(C=O)C_{1-5}alquilo, o un grupo oligosacárido;

R_{3}: es hidrógeno, hidroxi, -O(C=O)C_{1-5}alquilo, -O(C=O)C_{2-5}alquenilo, -O(C=O)C_{2-5}alquenilo sustituido con fenilo;

R_{4}: es hidrógeno, C_{1-6}alquilo, -(C=O)C_{1-5}alquilo, -(C=O)C_{2-5}alquenilo;

R_{5}: es CH_{2}OH, CH_{2}O-C(=O)CH_{3}, CHO; y

R_{6} y R_{7} tomados juntos forman un enlace o

R_{5} y R_{6} forman un radical divalente de fórmula

\quad: -CH_{2}-O- \hskip1,9cm (a),

\quad: -CH(OR_{13})-O- \hskip1,05cm (b),

\quad: -C(=O)-O- \hskip1,59cm (c),

\quad: donde R_{13} es hidrógeno, C_{1-6}alquilo o -(C=O)C_{1-5}alquilo; y

R_{7} es hidrógeno;

R_{8\alpha} representa CH_{3};

R_{8\beta} representa CH_{3}, CH_{2}OH, CHO, CH(OCH_{3})_{2}, CH=NOH, COOH; o

R_{8\beta} y R_{3} forman un radical divalente de fórmula -C(=O)-O-; o

R_{8\beta} y R_{5} forman un radical divalente de fórmula -CH_{2}O-CHOH-;

R_{10} es CH_{3}, CH_{2}OH;

R_{11} es hidrógeno, hidroxi o O-C(=O)C_{1-5}alquilo; o

R_{10} y R_{11} forman un radical divalente de fórmula -CH_{2}O-; y

R_{12} es CH_{3}, CH_{2}OH, CH_{2}O-C(=O)CH_{3}, CHO, CH=NOH.

Se prefieren especialmente aquellos compuestos de fórmula (I) donde

R_{1}: es hidrógeno o un grupo oligosacárido;

R_{2}: es hidrógeno, hidroxi, -O(C=O)C_{1-5}alquilo, -O(C=O)C_{2-5}alquenilo, -O(C=O)C_{6}H_{5} o -O(C=O)C_{2-5}alquenilo sustituido con fenilo;

R_{4}: es hidrógeno, C_{1-6}alquilo, -(C=O)C_{1-5}alquilo, -(C=O)C_{2-5}alquenilo, -(C=O)C_{2-5}alquenilo sustituido con fenilo;

R_{5}: es CH_{2}OH, CH_{2}OCH_{3}, CH_{2}O-C(=O)CH_{3}, CHO, COOH; y

R_{6} y R_{7} tomados juntos forman un enlace; o

R_{5} y R_{6} forman un radical divalente de fórmula

\quad: -CH_{2}-O- \hskip1,9cm (a),

\quad: -CH(OR_{13})-O- \hskip1,05cm (b),

\quad: -C(=O)-O- \hskip1,59cm (c),

\quad: donde R_{13} es hidrógeno; y

R_{7} es hidrógeno;

R_{8\alpha} y R_{8\beta} ambos representan CH_{3};

R_{9} es CH_{3};

R_{10} es CH_{3};

R_{11} es hidrógeno; y

R_{12} es CH_{3}.

Los compuestos de fórmula (I) también se pueden convertir uno en el otro a través de procesos conocidos por los técnicos de la profesión. Son procesos particularmente interesantes la saponificación en medio básico, la transesterificación en medio ácido y la degradación enzimática de la porción oligosacárida de modo de producir agliconas, es decir compuestos de fórmula (I) donde R_{1} es hidrógeno.

A los efectos de tratar la leishmaniosis, los compuestos de fórmula (I) se pueden administrar en forma oral, tópica, parenteral, mediante inhalación de un aerosol o rectalmente, en formulaciones con unidades de dosificación que contienen vehículos, adyuvantes y excipientes no tóxicos tradicionales, aceptables desde el punto de vista farmacéutico. El término parenteral como se utiliza aquí incluye la inyección subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraesternal, intraarticular, o técnicas de infusión, en sujetos susceptibles a la infestación por el organismo leishmania.

Las preparaciones farmacéuticas que contienen el principio activo pueden estar en una forma adecuada para uso oral, como por ejemplo comprimidos, trociscos, pastillas, soluciones o suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos para dispersión, emulsiones, cápsulas duras o blandas, o jarabes o elixires. Las preparaciones de uso oral se pueden elaborar de acuerdo con cualquier método conocido para la fabricación de preparaciones farmacéuticas y dichas preparaciones pueden contener uno o más agentes seleccionados entre un grupo compuesto por agentes edulcorantes, saborizantes, colorantes y conservantes con el fin de proporcionar una preparación agradable al paladar y elegante desde el punto de vista farmacéutico. Los comprimidos contienen el principio activo mezclado con excipientes no tóxicos aceptables desde el punto de vista farmacéutico que son adecuados para la fabricación de comprimidos incluidos entre otros diluyentes inertes, granulantes, desintegrantes y lubricantes. Los comprimidos pueden ser sin recubrimiento o ser recubiertos mediante técnicas conocidas para demorar la desintegración y la adsorción en el tubo digestivo proporcionando de este modo una acción sostenida durante un período más prolongado; para enmascarar un sabor o una sensación bucal desagradables; o para mejorar el aspecto y la posibilidad de reconocerlos.

Las suspensiones acuosas contienen los principios activos mezclados con excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. Dichos excipientes son agentes de suspensión, dispersantes o humectantes. Las antedichas suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservantes y las suspensiones oleosas se pueden formular suspendiendo el principio activo en un aceite vegetal adecuado o en un aceite mineral como vaselina líquida. Las suspensiones oleosas pueden contener espesantes, edulcorantes y saborizantes para proporcionar una preparación oral agradable. Estas preparaciones se pueden conservar mediante el agregado de un antioxidante aceptable.

Los polvos y gránulos para dispersión que son adecuados para la preparación de suspensiones acuosas mediante el agregado de agua proporcionan el principio activo mezclado con un agente dispersante o humectante, un agente de suspensión y uno o más conservantes.

Las preparaciones farmacéuticas de la invención actual también pueden estar en forma de emulsiones de aceite en agua (o/w) o de agua en aceite (w/o). La fase oleosa puede ser un aceite vegetal aceptable desde el punto de vista farmacéutico, aceites de cacahuete o un aceite mineral, con emulsionantes y antioxidantes apropiados. La fase acuosa puede contener emulsionantes, espesantes y conservantes. Las emulsiones también pueden contener edulcorantes, colorantes y saborizantes.

Los jarabes y elixires se pueden formular con edulcorantes. Estas preparaciones también pueden contener un emoliente, un conservante y saborizantes y colorantes.

Las preparaciones farmacéuticas pueden estar en forma de preparación inyectable estéril, por ejemplo como una solución o suspensión acuosa u oleaginosa estéril inyectable en un diluyente o disolvente parenteralmente aceptable no tóxico. Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden emplear se encuentran el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, tradicionalmente se emplean aceites fijos, estériles, como un disolvente o medio de suspensión. Con este fin se puede emplear cualquier aceite fijo insípido incluidos mono o diglicéridos sintéticos, ácidos grasos y otros aditivos para inyectables adecuados. Las suspensiones se pueden formular de acuerdo con las técnicas conocidas utilizando agentes de dispersión o humectantes y de suspensión adecuados.

Los compuestos de fórmula (I) también se pueden administrar en forma de supositorios u otras formulaciones como soluciones o suspensiones para la administración rectal del fármaco. Los supositorios se pueden preparar mezclando el fármaco con un excipiente no irritante adecuado que sea sólido a temperaturas corrientes pero líquido a la temperatura rectal para liberar el fármaco.

La dosis diaria de los compuestos de fórmula (I) puede variar en un amplio intervalo, p. ej. entre 1,0 y 2.000 mg. Preferentemente, el compuesto de fórmula (I) se administra con un excipiente en una preparación farmacéutica, en dosis subdivididas que contengan 5, 10, 25, 50, 100, 150, 250 ó 500 mg del principio activo para la adecuada dosificación del paciente a ser tratado. Una cantidad eficaz del fármaco se suministra corrientemente a una dosis entre aproximadamente 0,01 mg y 50 mg/kg de peso corporal. Preferentemente, el intervalo es entre aproximadamente 0,1 mg y 7 mg/kg de peso corporal.

Sin embargo, se comprenderá que el nivel de dosificación específico para cualquier paciente en particular, dependerá de una diversidad de factores incluidos la actividad del compuesto específico empleado, la edad, el peso corporal, el estado general de salud, el sexo, la dieta, el momento de la administración, la vía de administración, la velocidad de excreción, la combinación de fármacos y la gravedad de la enfermedad y los órganos afectados y que necesitan tratamiento.

Parte experimental Aislamiento de saponinas triterpénicas de Maesa balansae

Las hojas de Maesa balansae pulverizadas y secadas al aire (3 kg) se extrajeron con cloroformo para eliminar el material apolar y después con metanol : agua (9 : 1). El extracto alcohólico se evaporó a presión reducida y el residuo se repartió entre n-butanol (saturado con agua) y agua. La capa orgánica se evaporó hasta sequedad y el residuo se lavó con acetona y se filtró La parte de acetona insoluble que contenía las saponinas (10 g) se purificó mediante HPLC de fase inversa (fase estacionaria RP-18 HS BDS Hyperprep 100 \ring{A}, 8 \mum; 200g, \diameter de columna 5 cm) con un sistema de elución por gradiente utilizando:

A: acetato de amonio en agua al 0,5%,

B: metanol y

C: acetonitrilo

a una velocidad de flujo de 80 ml/min con detección UV a 235 nm. Utilizando el sistema de elución por gradiente (t = 0 min) A:B:C (60:20:20) a (t = 50 min) A:B:C (0:50:50) se obtuvo una mezcla sólo de saponinas (5 g) que comprendía seis compuestos.

El aislamiento de cada una de las seis saponinas se realizó en la misma columna en las mismas condiciones utilizando el sistema de solventes por gradiente descrito antes. Se obtuvieron los compuestos siguientes por orden de elución:

Compuesto 1:: PM = 1.532, \lambda_{máx} = 223,3 nm; se purificó posteriormente usando el sistema isocrático de solventes A:B:C (33:64:03); rendimiento 230 mg.

Compuesto 2:: PM = 1.510, \lambda_{máx} = 209,2 nm; sistema de elución por gradiente: (t = 0 min) A:B:C (42:29:29) a (t = fin) A:B:C (24:38:38); rendimiento 110 mg.

Compuesto 3:: PM = 1.532, \lambda_{máx} = 222,1 nm; sistema isocrático de solventes: A:B:C (40:30:30); rendimiento 1.000 mg.

Compuesto 4:: PM = 1.510, \lambda_{máx} = 202,2 nm; sistema isocrático de solventes: A:B:C (59:00:41); rendimiento 1.000 mg.

Compuesto 5:: PM = 1.574, \lambda_{máx} = 203,4 nm; y sistema isocrático de solventes: A:B:C (32:34:34); rendimiento 220 mg.

Compuesto 6:: PM = 1.552, \lambda_{máx} = 216,3 nm; sistema isocrático de solventes: A:B:C (32:34:34) con reciclado (4 veces); rendimiento 230 mg.

Evaluación de la actividad antileishmanial

El fármaco de prueba PX utilizado en los ejemplos siguientes comprende la mezcla de saponinas aisladas de Maesa balansae.

1. Actividad antileishmanial in vitro

Los métodos para el crecimiento in vitro de los organismos del género Leishmania y la metodología de análisis están bien documentados en la bibliografía internacional. Los protocolos de análisis son flexibles y se pueden adaptar de acuerdo con los objetivos específicos y las características de los compuestos de prueba. En resumen, se ha utilizado la siguiente metodología in vitro:

Se sembraron macrófagos peritoneales primarios derivados de roedores de laboratorio o líneas celulares de macrófagos en placas para cultivo tisular multiwell y se les permitió adherirse durante aproximadamente 24 horas. Se agregaron amastigotes de especies de Leishmania (obtenidos de los tejidos blanco de un animal donante infestado o de cultivos tisulares infestados por amastigotes) o promastigotes de especies de Leishmania en una relación de infestación adecuada junto con concentraciones variables diluidas serialmente del fármaco o del compuesto de prueba. El fármaco de prueba se solubilizó en un disolvente adecuado que fue tolerado en el sistema de prueba in vitro (DMSO; agua, alcoholes y similares funcionan todos igualmente bien) y se agregó al medio para cultivo tisular. Los cultivos se incubaron a 37ºC en 5% de CO_{2} durante 5-15 días.

Así mismo se incluyó el tratamiento de cultivos de control sin infestar a fin de determinar un índice de selectividad. Se incluyeron también los cultivos tratados con el fármaco de referencia para determinar la potencia relativa del fármaco de prueba. Se determinó la actividad del fármaco en preparaciones teñidas, como la reducción porcentual de la cantidad total de parásitos o de la cantidad de macrófagos infestados en comparación con los cultivos sin tratar. La lectura se realizó microscópicamente y se determinaron los valores de EC_{50} (la concentración efectiva que produce una inhibición del 50%). La reducción porcentual y el valor de EC_{50} sirven como una indicación de la actividad antileishmanial in vitro y proporcionan adelantos significativos sobre los agentes clínicamente útiles.

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2. Actividad antileishmanial in vivo

Los métodos para el mantenimiento in vivo de los organismos del género Leishmania y los modelos animales están bien documentados en la bibliografía internacional. Los ratones Balb-C y los hámsters dorados son las especies de animales de laboratorio preferidas para el aislamiento primario, el mantenimiento y el uso en modelos de infestación artificial. Los protocolos de análisis son flexibles y se pueden adaptar de acuerdo con los objetivos específicos y las características de los compuestos de prueba. En resumen, se han utilizado las siguientes metodologías in vivo:

Para especies que provocan Leishmoniasis visceral: Se infestaron por vía intravenosa ratones Balb-C o hámsters jóvenes con aproximadamente 10^{6} a 10^{7} amastigotes derivados de los órganos blanco (generalmente bazo) de un animal donante infestado o de un cultivo in vitro de formas parasitarias. Estos animales fueron tratados con diferentes dosis del compuesto de prueba (intervalo de dosis: 0,1 a 80 mg/kg en 100% de DMSO o cualquier otro vehículo aceptable), utilizando distintas vías de administración y programas de tratamiento. La iniciación del tratamiento fue o bien en diferentes momentos después de la infestación (curativo), o concomitante con la infestación (profiláctico) o antes de la infestación (actividad residual). En el diseño del estudio profiláctico, la primera administración del fármaco de prueba se hizo inmediatamente antes o junto con la infestación artificial con las especies de Leishmania. En el diseño del estudio curativo, la primera administración del fármaco de prueba se hizo varias semanas después de la infestación artificial con las especies de Leishmania (curativo precoz = cuando aparecen los primeros signos clínicos; curativo tardío = cuando los síntomas clínicos están bien establecidos o se vuelven crónicos). Se evaluó la actividad del fármaco mediante la determinación de la cantidad total de parásitos en el hígado o en cualquier otro tejido u órgano blanco importante, en comparación con la cantidad de parásitos en el tejido u órgano de animales de control sin tratar. El número promedio de amastigotes se enumeró cuantitativamente o semi cuantitativamente en frotis o portaobjetos obtenidos por impresión, teñidos. La reducción porcentual sirve como indicador de la actividad antileishmanial y proporciona adelantos significativos sobre agentes clínicamente útiles. La mínima dosis activa (LAD) se define como la mínima dosis que reduce la cantidad de parásitos en el tejido u órgano blanco primario en al menos un 80%.

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TABLA II Actividad antileishmanial in vivo en ratones y hámsters contra especies que provocan Leishmaniosis visceral

4

5

Para especies de Leishmania que provocan afecciones cutáneas y mucocutáneas: Se infestaron por vía intradérmica o subcutánea ratones Balb-C o hámsters jóvenes con aproximadamente 10^{6} a 10^{7} amastigotes derivados de los órganos blanco (generalmente lesiones cutáneas) de un animal donante infestado o de un cultivo in vitro de formas parasitarias. Los animales fueron tratados con diferentes dosis del compuesto de prueba (mg/kg en 100% de DMSO o cualquier otro vehículo aceptable), utilizando distintas vías de administración y programas de tratamiento. La iniciación del tratamiento fue o bien antes de la infestación (profiláctico) o en distintos momentos después de la infestación (curativo). En el diseño del estudio profiláctico, la primera administración del fármaco de prueba se hizo inmediatamente antes o junto con la infestación artificial con las especies de Leishmania. En el diseño del estudio curativo, la primera administración del fármaco de prueba se hizo varias semanas después de la infestación artificial con las especies de Leishmania (curativo precoz = cuando aparecen las primeras lesiones cutáneas; curativo tardío = cuando las lesiones cutáneas están bien establecidas o se vuelven crónicas). Se evaluó la actividad del fármaco ya sea mediante la determinación de la gravedad de la lesión en el tejido u órgano blanco (parámetro primario) o de la cantidad de parásitos en el tejido u órgano blanco (parámetro secundario), en comparación con los animales de control sin tratar. Se evaluó cuantitativamente el tamaño de la lesión usando el método de J. El-On y A.D. Hamburger [Trans. Roy. Soc. Trop, Med. Hyg., 81,734-737 (1987)]. La reducción porcentual sirve como indicador de la actividad antileishmanial y proporciona adelantos significativos sobre agentes clínicamente útiles. La mínima dosis activa (LAD) se define como la mínima dosis que previene la aparición de las lesiones, detiene su evolución o induce la cura clínica de éstas en el tejido u órgano blanco.

Tabla IV

Actividad antileishmanial in vivo en ratones y hámsters contra especies que provocan Leishmaniosis cutánea y mucocutánea.

A. Tratamiento profiláctico

En el diseño del estudio profiláctico, la primera administración del fármaco de prueba se hizo inmediatamente antes de la infestación artificial con las especies de Leishmania.

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6

7

8

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Claims

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```
1. Una saponina triterpénica que se puede obtener mediante un proceso para el aislamiento de saponinas triterpénicas que se encuentran en la familia Myrsinaceae donde las saponinas se aislan de la planta de la especie Maesa balansae y donde dicho proceso comprende los pasos de

(a)

extracción de las partes de la planta seca con un alcohol y concentración del extracto,

(b)

eliminación de la fracción apolar del extracto mediante extracción líquido-líquido con un disolvente apolar,

(c)

purificación posterior de las saponinas del extracto alcohólico mediante extracción líquido-líquido, filtración y cromatografía, y

(d)

la cromatografía comprende una cromatografía de fase inversa con sistema de elución por gradiente que utiliza

A:

acetato de amonio en agua al 0,5%

B:

metanol

C:

acetonitrilo

donde a t = 0, (A:B:C) = (60:20:20) y a t = fin, (A:B:C) = (0:50:50), y donde dicha saponina tiene las características siguientes:

Compuesto 1: PM = 1.532, \lambda_{máx} = 228,6 nm, \lambda_{máx2}= 273,3 nm;

Compuesto 2: PM = 1.510, \lambda_{máx} = 223,9 nm, \lambda_{máx2}= 274,5 nm;

Compuesto 3: PM = 1.532, \lambda_{máx} = 279,2 nm, \lambda_{máx2}= 223,9 nm;

Compuesto 4: PM = 1.510, \lambda_{máx} = 280,4 nm, \lambda_{máx2}= 222,7 nm;

Compuesto 5: PM = 1.574, \lambda_{máx} = 276,8 nm, \lambda_{máx2}= 225,0 nm; o

Compuesto 6: PM = 1.552, \lambda_{máx} = 279,2 nm, \lambda_{máx2}= 223,9 nm.
2. Una saponina triterpénica que tiene la fórmula

14

donde R_{2} es -O(C=O)C_{6}H_{5} o -O(C=O)C(CH_{3})=CHCH_{3},

R_{3} es (E) o (Z)-O(C=O)CH=CH-C_{6}H_{5}, y

R_{4} es hidrógeno o -(C=O)CH_{3}.
3. Un compuesto de acuerdo con la reivindicación 2 donde

en el compuesto 1,

R_{2} es -(C=O)C_{6}H_{5},

R_{3} es (Z)-O(C=O)CH=CH-C_{6}H_{5},

R_{4} es hidrógeno;

en el compuesto 2,

R_{2} es -O(C=O)C(CH_{3})=CHCH_{3},

R_{3} es (Z)-O(C=O)CH=CH-C_{6}H_{5},

R_{4} es hidrógeno;

en el compuesto 3,

R_{2} es -O(C=O)C_{6}H_{5},

R_{3} es (E)-O(C=O)CH=CH-C_{6}H_{5},

R_{4} es hidrógeno;

en el compuesto 4,

R_{2} es -O(C=O)C(CH_{3})=CHCH_{3},

R_{3} es (E)-O(C=O)CH=CH-C_{6}H_{5},

R_{4} es hidrógeno;

en el compuesto 5,

R_{2} es -O(C=O)C_{6}H_{5},

R_{3} es (E)-O(C=O)CH=CH-C_{6}H_{5},

R_{4} es -(C=O)CH_{3};

en el compuesto 6,

R_{2} es -O(C=O)C(CH_{3})=CHCH_{3},

R_{3} es (E)-O(C=O)CH=CH-C_{6}H_{5},

R_{4} es -O(C=O)CH_{3}.
4. Una preparación farmacéutica que comprende un excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico y como principio activo una saponina triterpénica como se la definió en las reivindicaciones 1, 2 ó 3.
5. Una preparación de acuerdo con la reivindicación 4 adaptada para la administración parenteral.
6. El uso de una o más saponinas triterpénicas para la elaboración de una preparación farmacéutica para tratar la leishmaniosis en huéspedes infestados por especies de Leishmania, dichas saponinas se caracterizan por tener la fórmula

15

un estereoisómero de ésta o una sal de adición aceptable desde el punto de vista farmacéutico de éstas, donde

R_{1}

es hidrógeno, -(C=O)C_{1-5}alquilo, -(C=O)C_{2-5}alquenilo, -(C=O)C_{2-5}alquenilo sustituido con fenilo, un grupo monosacárido o un grupo oligosacárido;

R_{2}

es hidrógeno, hidroxi, -O(C=O)C_{1-5}alquilo, -O(C=O)C_{2-5}alquenilo, -O(C=O)C_{6}H_{5}, o -O(C=O)C_{2-5}alquenilo sustituido con fenilo;

R_{3}

es hidrógeno, hidroxi, -O(C=O)C_{1-5}alquilo, -O(C=O)C_{2-5}alquenilo, -O(C=O)C_{6}H_{5}, o -O(C=O)C_{2-5}alquenilo sustituido con fenilo;

R_{4}

es hidrógeno, C_{1-6}alquilo, -(C=O)C_{1-5}alquilo, -(C=O)C_{2-5}alquenilo, -(C=O)C_{6}H_{5}, o -(C=O)C_{2-5}alquenilo sustituido con fenilo;

R_{5}

es CH_{3}, CH_{2}OH, CH_{2}OCH_{3}, CH_{2}O-C(=O)CH_{3}, CHO, COOH; o

R_{5} y R_{2} forman un radical divalente de fórmula -C(=O)-O-;

R_{6} y R_{7} son hidrógeno; o tomados juntos forman un enlace; o

R_{5} y R_{6} forman un radical divalente de fórmula

\quad

-CH_{2}O- \hskip2cm (a),

\quad

-CH(OR_{13})-O- \hskip1,05cm (b),

\quad

-C(=O)-O- \hskip1,59cm (c),

\quad

donde R_{13} es hidrógeno, C_{1-6}alquilo o -(C=O)C_{1-5}alquilo;

R_{8\alpha} y R_{8\beta} cada uno representa independientemente CH_{3}, CH_{2}OH, CH_{2}OCH_{3}, CH_{2}O-C(=O)C_{1-5}alquilo, CHO, CH(OCH_{3})_{2}, CH=NOH, COOH;

R_{8\beta} y R_{3} forman un radical divalente de fórmula -C(=O)-O-;

R_{8\beta} y R_{5} forman un radical divalente de fórmula -CH_{2}O-CHOH-;

R_{9}

es CH_{3}, CH_{2}OH, CH_{2}OCH_{3}, CH_{2}O-C(=O)C_{1-5}alquilo, CHO, COOH;

R_{10}

es CH_{3}, CH_{2}OH, CH_{2}OCH_{3}, CH_{2}O-C(=O)C_{1-5}alquilo, CHO, COOH;

R_{11}

es hidrógeno, hidroxi o O-C(=O)C_{1-5}alquilo; o R_{10} y R_{11} forman un radical divalente de fórmula -CH_{2}O-; y

R_{12}

es CH_{3}, CH_{2}OH, CH_{2}OCH_{3}, CH_{2}O-C(=O)CH_{3}, CHO, CH=NOH o COOH.
7. El uso de acuerdo con la reivindicación 6 donde R_{1} es hidrógeno, -(C=O)C_{1}-C_{5}alquilo, o un grupo oligosacárido;

R_{3}

es hidrógeno, hidroxi, -O(C=O)C_{1-5}alquilo, -O(C=O)C_{2-5}alquenilo, -O(C=O)C_{2-5}alquenilo sustituido con fenilo;

R_{4}

es hidrógeno, C_{1-6}alquilo, -(C=O)C_{1-5}alquilo, -(C=O)C_{2-5}alquenilo,

R_{5}

es CH_{2}OH, CH_{2}O-C(=O)CH_{3}, CHO;

y

R_{6} y R_{7} tomados juntos forman un enlace; o

R_{5} y R_{6} forman un radical divalente de fórmula

\quad

-CH_{2}-O- \hskip1,9cm (a),

\quad

-CH(OR_{13})-O- \hskip1,05cm (b),

\quad

-C(=O)-O- \hskip1,59cm (c),

donde R_{13} es hidrógeno, C_{1-6}alquilo o -(C=O)C_{1-5}alquilo; y

R_{7} es hidrógeno;

R_{8\beta} representa CH_{3}, CH_{2}OH, CHO, CH(OCH_{3})_{2}, CH=NOH, COOH;

R_{8\alpha} representa CH_{3};

R_{8\beta} y R_{3} forman un radical divalente de fórmula -C(=O)-O-; o

R_{8\beta} y R_{5} forman un radical divalente de fórmula -CH_{2}O-CHOH-;

R_{10} es CH_{3}, CH_{2}OH;

R_{11} es hidrógeno, hidroxi o O-C(=O)C_{1-5}alquilo; o

R_{10} y R_{11} forman un radical divalente de fórmula -CH_{2}O-; y

R_{12} es CH_{3}, CH_{2}OH, CH_{2}O-C(=O)CH_{3}, CHO, CH=NOH.
8. El uso de acuerdo con la reivindicación 7 donde

R_{1}

es hidrógeno o un grupo oligosacárido;

R_{2}

es hidrógeno, hidroxi, -O(C=O)C_{1-5}alquilo, -O(C=O)C_{2-5}alquenilo, -O(C=O)C_{6}H_{5} o -O(C=O)C_{2-5}alquenilo sustituido con fenilo;

R_{3}

es hidrógeno, hidroxi, -O(C=O)C_{1-5}alquilo, -O(C=O)C_{2-5}alquenilo, -O(C=O)C_{2-5}alquenilo sustituido con fenilo;

R_{4}

es hidrógeno, C_{1-6}alquilo, -(C=O)C_{1-5}alquilo, -(C=O)C_{2-5}alquenilo, -(C=O)C_{2-5}alquenilo sustituido con fenilo;

R_{5}

es CH_{2}OH, CH_{2}OCH_{3}, CH_{2}O-C(=O)CH_{3}, CHO, COOH; y

R_{6} y R_{7} tomados juntos forman un enlace; o

R_{5} y R_{6} forman un radical divalente de fórmula

\quad

-CH_{2}-O- \hskip1,9cm (a),

\quad

-CH(OR_{13})-O- \hskip1,05cm (b),

\quad

-C(=O)-O- \hskip1,59cm (c),

donde R_{13} es hidrógeno; y

R_{7} es hidrógeno;

R_{8\alpha} y R_{8\beta} ambos representan CH_{3};

R_{9} es CH_{3};

R_{10} es CH_{3};

R_{11} es hidrógeno; y

R_{12} es CH_{3}.