ES2226036T3 - Uso de anexinas como control o patron de anticoagulantes de lupus en ensayos de coagulacion. - Google Patents
Uso de anexinas como control o patron de anticoagulantes de lupus en ensayos de coagulacion.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE PLASMAS PARA UTILIZARSE COMO CONTROLES O VALORES ESTANDARD EN TODOS LOS ENSAYOS FUNCIONALES DE COAGULACION, QUE SIRVE PARA DETERMINAR UN LUPUS ANTICOAGULANTE.
Description
Uso de anexinas como control o patrón de
anticoagulante de lupus en ensayos de coagulación.
La invención se refiere a un procedimiento para
la preparación de plasmas para usar como controles o estándares en
todos los ensayos de coagulación funcional que sirven para la
detección de un anticoagulante de lupus.
Los anticoagulantes de lupus son inmunoglobulinas
y pertenecen al ámbito de los auto-anticuerpos
heredados. Se distinguen por estar dirigidos contra fosfolípidos o
complejos de fosfolípidos/proteínas y por prolongar los tiempos de
coagulación en los actuales ensayos diagnósticos de la coagulación
(véase Triplett D., Hematologic Pathology 1988; 2:
121-143). Estas inmunoglobulinas se deben
diferenciar de otros auto-anticuerpos, también
dirigidos contra lípidos, en especial, de las cardiolipinas. Ambos
grupos se asignan clínicamente al síndrome
anti-fosfolipídico (APS), que se manifiesta por
trombosis y una serie de complicaciones del parto (abortos). El
mecanismo patológico de los anticoagulantes de lupus aún no se ha
explicado por completo debido a múltiples razones. En primer lugar,
la especificidad de los anticuerpos que se manifiestan y, por lo
tanto, el mecanismo de acción, es individualmente diferente de un
paciente a otro. En segundo lugar, varían las subclases de las
inmunoglobulinas (IgM, IgG, IgA) y el título de anticuerpos. En
tercer lugar, entre la determinación del anticoagulante de lupus y
la manifestación clínica se produce una paradoja: Una prolongación
del tiempo de coagulación en ensayos in vitro, como la
provocada por un anticoagulante de lupus, indica un aumento de la
tendencia a las hemorragias; por el contrario, in vivo se
manifiesta por un incremento de la tendencia a las trombosis.
Por lo tanto, el diagnóstico de un anticoagulante
de lupus se limita a una descripción fenomenológica del
comportamiento de una muestra de plasma en diferentes ensayos de
coagulación correspondientes a las recomendaciones del Comité
Internacional (Brandt, J.T. et al., Thrombosis
Haemostasis 1995; 74: 1185-1190). Dichos ensayos
son el tiempo de tromboplastina parcial activada (APTT), el tiempo
de tromboplastina diluida (dRT) y el tiempo del Veneno de Víbora de
Russell (RVVT). Sin embargo, también se obtiene una prolongación del
tiempo de coagulación en estos ensayos por un déficit de factores,
razón por la que en el llamado ensayo de intercambio de plasma se
mezcla la muestra patológica con plasma normal y se determina, por
lo general, en el APTT. Normalmente, el déficit de factores se
compensa ya con una sustitución de 50% mediante la mezcla con el
plasma normal, en tanto que en presencia de un anticoagulante de
lupus se siguen obteniendo resultados patológicos. Adicionalmente,
se debe comprobar la dependencia de fosfolípidos que se lleva a cabo
con los mismos reactivos, pero con concentraciones diferentes de
fosfolípidos. Además, se han de limitar los
auto-anticuerpos contra factores de coagulación
aislados, que tampoco se compensa por una mezcla 1+1 con plasma
normal. Por lo general, estos anticuerpos contra factores actúan,
sin embargo, en una de las dos vías del sistema de coagulación (en
especial, los llamados inhibidores del factor VIII) y se les
reconoce por la comparación de las distintas vías, es decir, por la
comparación de los ensayos anteriormente citados (APTT para la vía
intrínseca, PT para la vía extrínseca).
La sensibilidad de los reactivos de los ensayos
anteriormente mencionados sobre el anticoagulante de lupus es muy
diferente (Messmore, H. et al., Thrombosis and
Haemostasis, 1994; 20: 79-94). Adicionalmente,
los anticoagulantes de lupus no generan en todos los ensayos un
resultado patológico, por lo que se recomienda el uso de al menos
dos ensayos funcionales (por ejemplo, APTT y RVVT; véase Brandt,
J.T. et al., (1995), 74: 1185-1190). Para
comparar o intercambiar datos, por ejemplo, en estudios clínicos,
sería conveniente hacer referencia a un estándar, así como un
control regular de los resultados experimentales, aproximadamente
para realizar el seguimiento de una terapia. No obstante, el uso de
donantes de plasma individuales para la preparación de un estándar
de este tipo o de un control, no resulta adecuado para su
explotación comercial tanto por motivos éticos como por la
heterogeneidad de la especificidad, la reducida reproducibilidad y
la escasa estabilidad de los anticoagulantes de lupus. Por
consiguiente, no existe hasta la fecha una determinación fiable de
anticoagulantes de lupus, ni referencia alguna para cuantificar el
anticoagulante de lupus.
La invención tuvo, por tanto, la misión de
encontrar un procedimiento con el que simular en una muestra, por
ejemplo, plasma, de forma reproducible y cuantificable un
anticoagulante de lupus, de modo que este plasma modificado genere
en todos los ensayos de coagulación funcionales y actuales
resultados patológicos comparables con la presencia de un
anticoagulante de lupus natural, y que sea adecuado, en
consecuencia, para la cuantificación de la acción (estándar) y como
control.
Una característica esencial del anticoagulante de
lupus es la dependencia de la propiedad prolongadora de la
coagulación de la disponibilidad de fosfolípidos. Babcock y
McGlasson (documento US 4.877.741) han descrito una posibilidad de
simular este comportamiento. Utilizan un extracto de una araña
(Loxosceles reclusa), que contiene una enzima con actividad
de esfingomielinasa-D. Demostraron (McGlasson, D.L.
et al., Am. J. Clin. Pathol. 1993;
100:576-578) que este extracto conduce en el APTT,
con diversos reactivos, a una prolongación del tiempo de coagulación
y que se puede neutralizar mediante la adición de fosfolípidos. Sin
embargo, esta prolongación está sólo débilmente extendida. De esta
forma, la prolongación alcanzada alcanzó como máximo 63% del
intervalo normal superior (reactivo de APTT de Pacific Haemostasis;
Tabla 2; McGlasson, D.L. et al., Am. J. Clin. Pathol.
1993; 100:576-578). Ésta es demasiado reducida para
generar prolongaciones típicas de más de 100%, tales como las que
aparecen con elevados niveles de anticoagulante de lupus y, por lo
tanto, no es suficiente para una estandarización con un extenso
intervalo de medición.
También se ha descrito que las anexinas pueden
dar lugar, bajo circunstancias determinadas, a una prolongación del
APTT. Esta familia de proteínas intracelulares comprende, hasta la
fecha, al menos ocho proteínas caracterizadas que, de acuerdo con la
nueva nomenclatura, se designan como anexina I a VIII (Römisch, J.
et al., Biol. Chem. Hoppe Seyller 1990;
5:383-388). Estas proteínas se caracterizan por
tener una acción moduladora sobre la inflamación: se liberan a
partir de las células en presencia de una inflamación, se fijan a
las superficies de las membranas e inhiben, de esta forma, la unión
de fosfolipasa A2, un paso importante para la formación de derivados
de ácido araquidónico con acción inflamatoria. Por medio de esta
unión, dependiente del calcio, a las superficies de fosfolípidos, se
alteran también los procesos de coagulación que tienen lugar en
estas superficies, por lo que estas proteínas también se denominan
"anticoagulantes vasculares". De manera típica, la presencia de
anexinas da lugar a una prolongación del APTT, dependiente de la
concentración (Römisch et al., Thrombosis
Research 1990; 60:355-366).
No obstante, se desconocía hasta la fecha si las
anexinas podían satisfacer todos los criterios de forma comparable a
un anticoagulante de lupus. Para el diagnóstico funcional de un
anticoagulante de lupus se valoran los siguientes criterios (Brandt,
J.T. et al., Thrombosis Haemostasis 1995;
74:1185-1190):
- 1.
- Prolongación del tiempo de coagulación por encima del intervalo normal en al menos 2 ensayos, especialmente, APTT y RVVT.
- 2.
- Demostración de que esta prolongación es dependiente de los fosfolípidos y que se puede neutralizar por la adición de fosfolípidos, o por el uso de los mismos reactivos que el punto 1, tan sólo con concentraciones mayores de fosfolípidos.
- 3.
- Delimitación de un posible déficit de factores mediante ensayos de intercambio de plasma, en los que en una mezcla de 3+1, 1+1 y 1+3 con un plasma normal, en un ensayo de coagulación, preferentemente el APTT, esta prolongación se neutraliza, de manera característica, sólo con una elevada dilución (1+3), en tanto que, en presencia de un déficit de factores, ésta resulta evidente ya anteriormente.
- 4.
- Delimitación de un inhibidor heredado (auto-anticuerpo contra un factor de coagulación), en especial contra el Factor IX u VIII (hemofilia A o B hereditaria), que se distingue porque éste actúa sólo en una de las dos vías de la coagulación (vía intrínseca o extrínseca), en tanto que el anticoagulante de lupus altera, de forma inespecífica, todas las etapas de los ensayos de coagulación dependientes de fosfolípidos.
Sorprendentemente, se ha podido demostrar que
mediante el uso adecuado de la anexina V se puede elaborar una
preparación de estándar o control del anticoagulante de lupus, que
satisface todos los criterios anteriormente
descritos.
descritos.
El Ejemplo 1 muestra la prolongación de los
ensayos diagnósticos actuales de coagulación, del APTT, PT y RVVT,
por la adición de una anexina (anexina V) a una combinación de
plasma de donante de plasma normal (plasma humano estándar). Por la
adición de 125 mg de anexina V/I se obtuvieron prolongaciones de los
tiempos de coagulación de 470%, 31% y 200% por encima del intervalo
normal superior de los correspondientes reactivos. Esto demuestra
que, con respecto al estado actual de la técnica (MacGlasson D.L.
et al., Am. J. Clin. Pathol. 1993;
100:576-578), se pueden obtener prolongaciones
claramente mayores de los tiempos de coagulación, mejorando de esta
forma la posibilidad de preparar un estándar y conseguir así un
intervalo de calibración adicional. En el caso de PT, esta
prolongación no es tan marcada. Al contrario que APTT y RVVT, el PT
no se recomienda como ensayo diagnóstico para el anticoagulante de
lupus.
De esta forma, el Ejemplo 1 muestra la
cumplimentación del criterio 1 del diagnóstico de lupus, es decir,
un resultado patológico en al menos 2 ensayos de coagulación
funcionales, en especial, del APTT y del RVVT. Los dos plasmas
naturales positivos para el anticoagulante de lupus se comportan de
manera comparable.
En el Ejemplo 1 se analizó también, a modo de
ejemplo, un plasma con déficit de factores o un plasma con un
inhibidor hereditario. El déficit de Factor VIII o el inhibidor
hereditario contra el Factor VIII da lugar a resultados patológicos
únicamente en el APTT, y no como el plasma que contiene anexina o
los plasmas positivos para el anticoagulante de lupus, que los
ofrecen también en el PT o el RVVT. De esta forma, se satisface
también el criterio 4 del diagnóstico del anticoagulante de
lupus.
El Ejemplo 2 muestra los resultados del ensayo de
la dependencia de los fosfolípidos en el APTT, PT y RVVT. Se usaron
reactivos con un contenido en fosfolípidos modificado con respecto a
los reactivos empleados en el Ejemplo 1. La relación del tiempo de
coagulación con concentraciones bajas de fosfolípidos con respecto
al obtenido con altas concentraciones de fosfolípidos se encuentra
elevada en los plasmas con sospecha de anticuerpo de lupus frente a
los plasmas normales. Este comportamiento se da solamente en los
plasmas naturales o que contienen un anticoagulante de lupus
simulado en los APTT y RVVT requeridos. En este caso, también el PT
es patológico. De este modo, se satisface el criterio 2 del
diagnóstico del lupus. La combinación de plasma normal, así como el
plasma con déficit de factores, no se muestran afectados. Solamente
el plasma con un inhibidor de factor hereditario exhibe una
prolongación en el procedimiento basado en el APTT.
El Ejemplo 3 muestra los resultados del ensayo
del déficit de factores por ensayos de intercambio de plasma en el
APTT. Con una mezcla de 1+3 con la combinación de plasma normal,
todos los plasmas patológicos, así como también el plasma positivo
para el anticoagulante de lupus simulado, están prolongados. Con una
dilución de 1+1, el déficit en el plasma con déficit de factores se
ve suficientemente compensado. El tiempo de coagulación se encuentra
dentro del intervalo normal. Los plasmas que contienen anexina, los
plasmas positivos para anticoagulante de lupus natural, así como los
plasmas que contienen inhibidores de factores siguen siendo
patológicos en el ensayo. Esto demuestra que se satisface el 3º y
último criterio para el diagnóstico de un anticoagulante de lupus y,
por consiguiente, la posibilidad de utilizar anexinas para la
simulación de un anticoagulante de lupus para usar como calibrador o
control en los ensayos de coagulación funcionales.
Adicionalmente, el Ejemplo 3 pone de manifiesto
que para satisfacer el 3^{er} criterio, el ensayo de intercambio
de plasma, la concentración anticoagulante eficaz de la anexina en
un control se debe ajustar de forma que, en una dilución 1+3 con una
combinación de plasma normal, se obtenga en un APTT todavía un
resultado patológico. En estado no diluido, esto corresponde en
estos Ejemplos a una adición de al menos 7 mg/l de anexina V.
Incluso con esta cantidad mínima, se produce en el plasma no diluido
una prolongación del tiempo de coagulación por encima del intervalo
normal superior de 87% (véase el Ejemplo 1, Tabla 1, APTT menos PT).
Este requisito no ha sido posible en los procedimientos descritos
hasta la fecha (McGlasson, D.L. et al., Am. J. Clin.
Pathol. 1993; 100:576-578) y, por lo tanto, con
los plasmas preparados con los procedimientos actuales no era
posible generar un comportamiento similar al del anticoagulante de
lupus. El procedimiento según la invención es, por lo tanto,
claramente superior a los procedimientos existentes.
Además de los ensayos de coagulación funcionales
que se muestran en los Ejemplos, los plasmas de control o
calibración también se pueden utilizar en otros ensayos de
coagulación funcionales, conocidos por el experto (Messmore, H.
et al., Thrombosis Haemostasis 1994;
71:220-224; Brandt, J.T., Thrombosis
Haemostasis 1991; 66:453-458; Amout, J. et
al., Brit. J. Haematol. 1994; 87:94-99;
Rauch, J. et al., Thrombosis Haemostasis 1989;
62:892-
896).
896).
En un plasma de control, la concentración de
anexina V se selecciona de forma que, incluso con una dilución 1+3
de este plasma de control con una combinación de plasma normal, se
obtiene todavía un APTT por encima del intervalo normal. En la
adaptación de los controles a otros ensayos de coagulación, estas
concentraciones límite pueden desviarse entre sí de forma específica
para el reactivo y para el ensayo.
Para los plasmas de calibración, la concentración
de anexina V se selecciona, idealmente, de manera que los tiempos de
coagulación obtenidos con los mismos sean superiores al intervalo
normal de los respectivos ensayos y del reactivo utilizado.
A partir del uso de cantidades definidas de
anexina V para generar una prolongación del tiempo de coagulación,
surge la posibilidad de calibración de los títulos de anticuerpos de
plasmas positivos para el anticoagulante de lupus, por ejemplo, en
mg/l de equivalentes de anexina.
Los siguientes Ejemplos explican la
invención.
Mientras no se indique lo contrario, se
utilizaron en los siguientes Ejemplos reactivos y plasmas de la Cía.
Behringwerke.
Se mezcló una combinación de plasmas normales
(plasma humano estándar) con 4 hasta 500 mg/l de anexina V
recombinante (preparada según el documento EP 0 271 885), y se
determinaron los tiempos de coagulación en un dispositivo automático
de coagulación (Cía. Amelung, Alemania) en APTT (reactivo: Pathromin
SLA o Pathromin SL, con una concentración de fosfolípidos 10 veces
mayor que en Pathromin SLA), en PT (reactivo: Thromborel S) y
en RVVT (reactivo: LA Screen; fabricante: Gradipore, Australia).
La Tabla 1 muestra la prolongación de los ensayos
diagnósticos actuales de coagulación, de APTT, de PT y de RVVT por
la adición de una anexina (anexina V) a una combinación de plasma
normal. Con una adición de 125 mg de anexina V/I, los tiempos de
coagulación se prolongaron en >400%, 31% y 200% por encima del
intervalo normal de los correspondientes reactivos (APTT: 38 seg o
49 seg; PT: 13 seg; RVVT: 45 seg; según datos de los
fabricantes).
fabricantes).
Adicionalmente, se calcularon con estos ensayos
diagnósticos los tiempos de coagulación de los siguientes plasmas
patológicos:
- -
- Plasma deficitario en Factor VIII (Prod. nº OTXW), para simular un déficit de factor;
- -
- Plasma citrado de un paciente con inhibidor hereditario del Factor VIII (Cía. George King, EE.UU.);
- -
- 2 plasmas citrados de pacientes con anticoagulante de lupus demostrado (Cía. Trina, Suiza)
La Tabla 2 muestra los resultados de la
determinación de APTT, PT y RVVT en los diferentes plasmas. La
combinación de plasma normal se encuentra dentro de los límites
normales en los 3 ensayos. Por el contrario, el plasma deficitario
en Factor VIII es llamativo en APTT, al igual que el plasma con un
inhibidor hereditario del Factor VIII. Ambos plasmas son sólo
débilmente patológicos en PT y, por el contrario, no indican
anomalía alguna en RVVT. Al contrario, los dos plasmas positivos
para el anticoagulante de lupus natural son patológicos en todos los
ensayos, si bien con diferente magnitud. Esta prolongación
inespecífica de los tiempos de coagulación en los ensayos
diagnósticos de coagulación se obtiene, de igual modo, por medio de
la adición de anexina a una combinación de plasma normal (en la
Tabla 2 se obtuvieron los resultados de la Tabla 1 con una adición
de 125 mg/l o 62,5 mg/l de anexina).
Tabla
2
Comportamiento de una combinación de plasma
normal (NPP), un plasma con déficit de factor
(FBI-MP) o un inhibidor del Factor VIII
(Anti-FVIII-P), plasmas positivos
para el anticoagulante de lupus natural (LA 1; LA 2) y un
anticoagulante de lupus simulado (NPP + anexina) en ensayos
diagnósticos de la coagulación APTT, PT y RVVT. Se indica,
adicionalmente, el intervalo normal de estos ensayos con los
reactivos utilizados.
Para analizar la dependencia de los fosfolípidos,
se determinaron los APTT, PT y RVVT de los plasmas patológicos
mencionados en el Ejemplo 1, así como de la combinación de plasma
normal y de un control de anticoagulante de lupus simulado,
compuesto por combinación de plasma normal y 125 ó 63 mg/l de
anexina V, con reactivos que, con respecto al Ejemplo 1, exhiben un
contenido en fosfolípidos diferente. Para el APTT, éste fue el
reactivo Pathromin SLA, con una concentración en fosfolípidos
reducida en 90%, con respecto al Ejemplo 1, de la de Pathromin SL.
Para la determinación de PT, se diluyó Thromborel S a 1:50 con una
solución de cloruro de calcio 12,5 mM, de acuerdo con Brauer et
al. (J Clin Chem Clin Biochem 1990; 28:701). Por el
contrario, para RVVT se utilizó un reactivo sensible al lupus ya
empleado de forma rutinaria, es decir, con escasos fosfolípidos.
Para el contra-control, se utilizaron, por lo tanto,
en este Ejemplo con confirmación de LA, un reactivo con una
concentración más elevada de fosfolípidos. Los resultados se
muestran en la Tabla 3.
Tabla
3
Comportamiento de una combinación de plasma
normal (NPP), un plasma con déficit de factor
(FBI-MP) o un inhibidor contra el Factor VIII
(Anti-FVIII-P), plasmas positivos
para el anticoagulante de lupus natural (LA 1; LA 2) y un
anticoagulante de lupus simulado (NPP + anexina) en ensayos
diagnósticos de coagulación, APTT, PT y RVVT, con un contenido en
fosfolípidos (PL) modificado con respecto al Ejemplo 1.
Dado que en presencia de una cantidad elevada de
fosfolípidos, se reduce el impedimento de la coagulación causada por
el anticoagulante de lupus, se determinó a partir de los tiempos de
coagulación obtenidos en las Tablas 2 (Ejemplo 1) y 3 el cociente
del tiempo de coagulación en presencia de escasos fosfolípidos hasta
en presencia de muchos fosfolípidos (véase la Tabla 4). El
acortamiento del tiempo de coagulación debido a la neutralización
del efecto inhibitorio del anticoagulante de lupus se expresa por un
cociente elevado. Los límites máximos permitidos, calculados para
los reactivos, por debajo de los cuales no cabe la sospecha de un
anticoagulante de lupus, se representan en la Tabla 4 para los
reactivos utilizados en este caso.
Se demuestra que la combinación de plasma normal,
también en presencia de un déficit de factor, proporciona cocientes
dentro de los límites normales en todos los ensayos. El plasma con
un inhibidor específico, por el contrario, sólo sigue siendo
patológico en la relación de APTT. Para los plasmas que contienen un
anticoagulante de lupus natural, así como para el plasma con
anticoagulante de lupus simulado, según la invención, se obtuvo en
los 3 ensayos una reacción inespecífica con fosfolípidos con
cocientes claramente incrementados con respecto a los niveles
normales.
Tabla
4
Cálculo de la dependencia de los fosfolípidos de
una combinación de plasma normal (NPP), un plasma con déficit de
factor (FBI-MP) o un inhibidor contra el factor VIII
(Anti-FVIII-P), plasmas positivos
para anticoagulante de lupus (LA 1, LA 2) y un anticoagulante de
lupus simulado (NPP + anexina) en los ensayos diagnósticos de
coagulación, APTT, PT y RVVT, por medio de la determinación del
cociente del tiempo de coagulación en presencia de escasos hasta
muchos fosfolípidos. Adicionalmente, se indican los valores límites
permitidos de los cocientes, por encima de los cuales existe la
sospecha de la existencia de un anticoagulante de lupus.
El ensayo de intercambio de plasma se llevó a
cabo en el APTT utilizando Pathromin SL. Para esto, se mezclaron los
plasmas patológicos mencionados en el Ejemplo 1, así como los
plasmas positivos para el anticoagulante de lupus simulado 3+1, 1+1
y 1+3 con una combinación de plasma normal, y se determinó el APTT.
Los resultados se muestran en la Tabla 5.
Tabla
5
Comportamiento de un plasma con déficit de factor
(FBI-MP) o con un inhibidor del Factor VIII
(Anti-FVIII-P), plasmas positivos
para el anticoagulante de lupus natural (LA 1, LA 2) y un
anticoagulante de lupus simulado (NPP + anexina) en el ensayo de
intercambio de plasma. Se muestra el APTT (mediante Pathromin SLA)
en seg con diversas mezclas (3+1, 1+1, 1+3; muestra + NPP) con una
combinación de plasma normal (NPP).
Con una mezcla de 1 parte de combinación de
plasma normal con 3 partes de los plasmas ("3+1" en la Tabla 5)
reaccionan de forma patológica todos los plasmas patológicos, así
como el plasma positivo para el anticoagulante de lupus simulado.
Con una dilución de 1+1, en el plasma con déficit de factor se
compensa por completo el déficit (límite superior del intervalo
normal 50 seg). Los dos plasmas positivos para el anticoagulante de
lupus natural, los plasmas que contienen anexina y el plasma que
contiene un inhibidor del factor siguen siendo altamente patológicos
en el ensayo, incluso con una dilución más alta (1+3).
Claims (13)
1. Plasma de control y/o calibración para
utilizar en ensayos de coagulación, caracterizado porque
contiene anexina V y plasma, y porque por medio de la adición de
anexina V al plasma se inicia un anticoagulante de lupus.
2. Plasma de control y/o calibración según la
reivindicación 1, caracterizado porque la anexina utilizada
se ha aislado de fuentes naturales o es de origen recombinante.
3. Plasma según la reivindicación 1,
caracterizado porque se trata de plasma de origen humano y/o
no humano, preferentemente, de origen humano.
4. Plasma según la reivindicación 1 ó 3,
caracterizado porque se trata de plasma de animales normales
y/o donantes.
5. Plasma según una de las reivindicaciones 1, 3
ó 4, caracterizado porque estos plasmas muestran un déficit
de factores del sistema humoral que es de origen natural o que se ha
generado artificialmente.
6. Plasma según la reivindicación 5,
caracterizado porque el déficit en factores del sistema
humoral se ha generado artificialmente por cromatografía de afinidad
y/o inmunológica.
7. Plasma según una de las reivindicaciones 1 ó 3
a 6, caracterizado porque para la estabilización o para
evitar reacciones secundarias no deseadas, se agregan como aditivos
azúcares, aminoácidos, alcoholes, inhibidores naturales y sintéticos
de proteasas, así como formadores de quelatos, antioxidantes,
antibióticos y azidas.
8. Ensayo de coagulación con el uso de un plasma
de control y/o calibración, según una de las reivindicaciones 1 ó
2.
9. Ensayo de coagulación para la determinación
del anticoagulante de lupus según la reivindicación 8,
caracterizado porque se trata de un ensayo diagnóstico tal
como el tiempo de tromboplastina parcial (APTT), el tiempo de
tromboplastina (PT), el tiempo de Veneno de Víbora de Russell (RVVT)
o el tiempo de coagulación de caolín (KCT).
10. Ensayo de coagulación para la determinación
del anticoagulante de lupus según la reivindicación 8,
caracterizado porque se trata de ensayos de coagulación en
los que se produce una reacción dependiente de fosfolípidos de
factores de coagulación tales como, por ejemplo, por la adición de
factores de coagulación activados e individuales tales como los
Factores VIIa, IXa, Xa, trombina, proteína Ca.
11. Ensayo de coagulación para la determinación
del anticoagulante de lupus según al menos una de las
reivindicaciones 8 a 10, caracterizado porque la detección de
la actividad de coagulación se lleva a cabo por medio de
procedimientos tales como la detección mecánica, eléctrica u óptica
de la formación de un coágulo, o la detección de la activación de
determinadas proteasas de la coagulación por medio de la adición de
sustancias cromógenas adecuadas.
12. Procedimiento para la comprobación de la
dependencia de los fosfolípidos, utilizando el plasma de control y/o
calibración según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado
porque se agregan fosfolípidos a la mezcla de ensayo sobre el
reactivo, por adición de la muestra o adición separada, con o sin
incubación previa de la muestra con el fosfolípido.
13. Procedimiento según la reivindicación 12,
caracterizado porque como fosfolípidos se utilizan
fosfolípidos sintéticos o naturales, por ejemplo, de la placenta,
plaquetarios, extractos de plantas en organización indefinida o
definida, por ejemplo, en disposición hexagonal, uni o
multilaminar.
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