ES2226732T3 - Proceso para producir y recuperar eritritol de medio de cultivo que lo contiene. - Google Patents
Proceso para producir y recuperar eritritol de medio de cultivo que lo contiene.Info
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Abstract
Un proceso para producir eritritol por fermentación utilizando microorganismos y recuperar los cristales de eritritol, comprendiendo dicho proceso las siguientes etapas: a) proporcionar microorganismos de una cepa productora de eritritol negativa para polisacáridos Moniliella tomentosa var pollinis TCV 364 [número de depósito MUCL 40385], cepa que produce menos del 1% de polisacáridos basado en el contenido de eritritol, b) preparar un medio de cultivo de fermentación, c) añadir los microorganismos al medio de cultivo de fermentación, d) dejar que crezcan los microorganismos hasta que se obtengan al menos 50 g/L de eritritol en el medio de cultivo de fermentación, e) separar los microorganismos del medio de cultivo de fermentación, f) concentrar el medio de cultivo de fermentación libre de microorganismos no refinado hasta obtener una sustancia seca en más del 80% p/p, g) cristalizar eritritol, y i) recoger cristales de eritritol.
Description
Proceso para producir y recuperar eritritol de
medio de cultivo que lo contiene.
La presente invención se refiere a un proceso
para producir y recuperar cristales de eritritol, más concretamente
a un método de fermentación para la producción de eritritol sin que
se produzcan a la vez polisácaridos superiores viscosos, lo que es
ventajoso para la recuperación de cristales de eritritol por
cristalización directa a partir del caldo de cultivo fermentado no
refinado libre de microorganismos.
Las levaduras productoras de eritritol que
producen eritritol por fermentación incluyen las que pertenecen a
los géneros Moniliella, Trichonosporoides, o
Trichonosporon; especies típicamente utilizadas son
Moniliella tomentosa var. pollinis, y Trichonosporoides
megachiliensis.
Un proceso convencional para el aislamiento y la
recuperación de eritritol de un medio de cultivo obtenido al
cultivar una de las levaduras productoras de eritritol en un medio
acuoso comprende someter dicho medio de cultivo a un tratamiento
previo tal como la separación de biomasa por filtración, la
decoloración mediante el uso de carbón activo, desalinización y
decoloración del medio de cultivo con resinas de intercambio
iónico, y luego concentración y enfriamiento del mismo, con lo que
cristaliza el deseado eritritol.
Las impurezas, que afectan al aislamiento, la
cristalización y/o la recuperación de eritritol, comprenden los
siguientes componentes:
- \bullet
- polioles tal como glicerol y ribitol
- \bullet
- oligosacáridos, incluidos los disacáridos y los superiores contenidos en el hidrolizado de almidón de partida, así como los productos de reacción formados a partir de los mismos
- \bullet
- polisacáridos microbianos viscosos producidos por la levadura.
Debido a la formación de los polisacáridos, la
viscosidad del medio aumenta. Esto produce una velocidad de
transferencia de oxígeno más baja, y parte de la fuente de hidratos
de carbono se convierte en etanol por fermentación anaerobia, con lo
que se merma la producción de eritritol. Además, caldos de
fermentación altamente viscosos presentan problemas para la
separación de células por filtración y la recuperación del poliol
es muy difícil.
El documento EP 0 327 016 describe un proceso
para la recuperación de eritritol altamente puro de un medio de
cultivo que lo contiene, en el que el caldo de cultivo fermentación
libre de microorganismos se hace pasar por columnas cromatográficas
de separación cargadas de resinas de intercambio catiónico altamente
ácidas tipo metal alcalino o amonio. Se consigue la separación de
las diferentes sales, material de coloración, diferentes
oligosacáridos y polisacáridos. El proceso comprende cultivar un
microorganismo productor de eritritol en un medio acuoso bajo
condiciones aerobias; eliminar las células del medio de cultivo
resultante; hacer pasar el sobrenadante obtenido por columnas de
separación cargadas de resinas de intercambio catiónico altamente
ácidas tipo metal alcalino o amonio; eluir las mismas con agua;
recoger de las mismas fracciones que contienen eritritol como el
componente principal; y a continuación recuperar el eritritol de
estas fracciones. Este proceso requiere un consumo muy elevado de
agua y los componentes separados están muy diluidos, lo que da lugar
a costes altos de evaporación. Además, el coste de inversión para
instalaciones de separación de este tipo es alto.
El documento EP 0 908 523 se refiere a un proceso
para la producción de cristales de eritritol altamente puros. El
proceso comprende una etapa de cristalización y una etapa de
separación de cristales en la cual la concentración de la solución
acuosa que contiene eritritol se ajusta al 30-60% en
peso al principio de la etapa de cristalización. Previo a la etapa
de cristalización, el proceso comprende una etapa de separación de
microbios, y una separación por cromatografía.
El resumen de Derwent de la patente japonesa JP
10287603 describe el tratamiento ácido de caldo de fermentación
libre de microorganismos que contiene eritritol para la hidrólisis
de los polisacáridos e impurezas formados. La hidrólisis convierte
ciertas impurezas en otros productos secundarios menos viscosos pero
en principio no se aumenta la pureza global. Estos productos
secundarios se separan luego por métodos convencionales de
separación tales como tratamiento con carbón activado e intercambio
de iones.
El resumen de Derwent de la patente japonesa JP
01215293 describe la recuperación de eritritol de un caldo de
fermentación que contiene polisacáridos con membranas de
ultrafiltración. Los polisacáridos, que enturbian el caldo de
fermentación libre de microorganismos, se separan completamente por
ultrafiltración con membranas con un corte de 1.000 a 100.000
daltons, y el eritritol se recupera del medio purificado.
El documento US 4.906.569 se refiere a un proceso
para aislar y recuperar eritritol altamente puro a un rendimiento
alto de cristalización de un medio de cultivo de un microorganismo
productor de eritritol, que comprende separar y eliminar diversas
impurezas y productos secundarios tales como diversas sales,
materiales colorantes y polisacáridos. Las impurezas y los
productos secundarios se eliminan por separación cromatográfica con
el uso de una resina altamente ácida de intercambio de
cationes.
Todas las referencias mencionadas anteriormente
requieren, de un modo u otro, una etapa de purificación para
eliminar los polisacáridos formados, tal como un tratamiento con
resinas de intercambio iónico, cromatografía en columna, hidrólisis
ácida o ultrafiltración.
El documento EP 0136805 describe un proceso de
fermentación en presencia de colonias formadoras de numerosas
esporas del hongo Moniliella tomentosa var. Pollinis similar
a levadura, dando como resultado polisacáridos al
2,3-3,5% basado en el contenido de eritritol. En
presencia de colonias formadoras de pocas esporas, se forman
polisacáridos a una concentración de hasta el 16-25%
basado en el contenido de eritritol. Aunque con colonias formadoras
de numerosas esporas la cantidad de polisacáridos ya se reduce al
2,3-3,5% basado en el contenido de eritritol, se
describe que el caldo de cultivo se somete a un refinado antes de
concentrarlo hasta el 60% y hasta el 80% de sustancia seca. El
eritritol se cristaliza del mismo. Es más, se necesitan tiempos de
fermentación largos de hasta 13 días para alcanzar un rendimiento de
eritritol del 34%.
Por consiguiente, existe una necesidad de un
proceso para la producción de eritritol por fermentación y la
recuperación de cristales de eritritol sin que se purifique el
medio de fermentación libre de microorganismos. El proceso de
recuperación debería estar exenta de 1) un refinado extensivo, 2)
la generación de grandes flujos de residuos, 3) altas demandas de
energía, pero debería proporcionar una buena recuperación de
cristales altamente puros de eritritol.
La presente invención proporciona un proceso de
este tipo.
La presente invención proporciona un proceso para
la producción de eritritol por fermentación utilizando
microorganismos y la recuperación de cristales de eritritol,
comprendiendo dicho proceso las siguientes etapas:
- a)
- proporcionar microorganismos de una cepa productora de eritritol negativa para polisacáridos Moniliella tomentosa var pollinis TCV 364 [número de depósito MUCL 40385], cepa que produce menos del 1% de polisacáridos basado en el contenido de eritritol,
- b)
- preparar un medio de cultivo de fermentación,
- c)
- añadir los microorganismos al medio de cultivo de fermentación,
- d)
- dejar que crezcan los microorganismos hasta que se obtengan al menos 50 g/L de eritritol en el medio de cultivo de fermentación,
- e)
- separar los microorganismos del medio de cultivo de fermentación,
- f)
- concentrar el medio de cultivo de fermentación libre de microorganismos no refinado hasta obtener una sustancia seca en más del 80% p/p,
- g)
- cristalizar eritritol, y
- h)
- recoger cristales de eritritol.
Preferiblemente, en la etapa a), dicha cepa
productora de eritritol negativa para polisacáridos Moniliella
tomentosa var pollinis TCV 364 produce menos del 0,1% de
polisacáridos basado en el contenido de eritritol.
La presente invención se refiere a un proceso en
el cual el medio de cultivo de fermentación no refinado se
concentra hasta obtener una sustancia seca en al menos el 85% p/p,
más preferiblemente, en más del 90% p/p.
Además, la presente invención describe un proceso
en el cual los cristales de eritritol se recogen con una
recuperación de al menos el 85%.
La presente invención se refiere a un proceso en
el cual los cristales de eritritol tienen una pureza de al menos el
98% p/p, preferiblemente del 99% p/p.
La presente invención se refiere a un proceso en
el cual se permite el crecimiento del microorganismo en menos de 10
días.
La presente invención se refiere a un proceso en
el cual el medio de cultivo de fermentación se prepara en un
reactor en columna de burbujeo o un reactor de suspensión en el
aire.
La presente invención describe, además, un
proceso en el cual en la etapa a) se utiliza Moniliella
tomentosa var pollinis TCV 364.
Adicionalmente, la presente invención se refiere
a una cepa de Moniliella productora de eritritol negativa
para polisacáridos que produce menos del 1% de polisacáridos,
preferiblemente menos del 0,1% de polisacáridos, basado en el
contenido de eritritol.
La presente invención se refiere, además, a una
cepa de Moniliella productora de eritritol negativa para
polisacáridos que es una cepa de Moniliella tomentosa,
preferiblemente Moniliella tomentosa var pollinis TCV 364,
depositada de acuerdo con el Tratado de Budapest en las CCMB/MUCL
(Colecciones Coordinadas de Microorganismos Belgas/Mycothèque de
l'Université Catholique de Louvain por Eridania Béghin Say,
Vilvoorde R&D Centre, Havenstraat 84, B-1800
Vilvoorde) el 28/03/1997 con el número MUCL40385.
La presente invención describe un proceso para
producir eritritol por fermentación utilizando microorganismos y
recuperar cristales de eritritol, comprendiendo dicho proceso las
siguientes etapas:
- a)
- proporcionar microorganismos de una cepa productora de eritritol negativa para polisacáridos Moniliella tomentosa var pollinis TCV 364 [número de depósito MUCL 40385], cepa que produce menos del 1% de polisacáridos basado en el contenido de eritritol,
- b)
- preparar un medio de cultivo de fermentación,
- c)
- añadir los microorganismos al medio de cultivo de fermentación,
- d)
- dejar que crezcan los microorganismos hasta que se obtengan al menos 50 g/L de eritritol en el medio de cultivo de fermentación,
- e)
- separar los microorganismos del medio de cultivo de fermentación,
- f)
- concentrar el medio de cultivo de fermentación libre de microorganismos no refinado hasta obtener una sustancia seca en más del 80% p/p,
- g)
- cristalizar eritritol, y
- h)
- recoger cristales de eritritol.
Normalmente, debido a la presencia de cantidades
considerables de polisacáridos, la concentración del medio de
cultivo de fermentación no refinado libre de microorganismos antes
de la cristalización conlleva a un incremento rápido de la
viscosidad del medio. Como consecuencia, la velocidad de
cristalización se reduce considerablemente y es muy difícil obtener
cristales muy puros, ya que la separación de masa cristalina de la
disolución madre es muy laboriosa.
La presencia de más del 2% de polisacáridos
basado en el contenido de eritritol es incluso demasiado alta para
permitir la concentración directa hasta obtener una sustancia seca
en más del 80%.
Además, estos polisacáridos se precipitan durante
la cristalización de eritritol y los cristales de eritritol así
obtenidos se contaminan con los polisacáridos. La redisolución de
estos cristales impuros conlleva a disoluciones turbias. Por lo
tanto, no se puede evitar concentrar el medio de cultivo sólo hasta
un cierto punto, para así evitar la precipitación de polisacáridos,
pero esto rebaja de forma significativa el rendimiento de
cristalización de eritritol. El rendimiento de cristalización de
eritritol en función de la sustancia seca. En el caso de una
sustancia demasiado poco seca, el rendimiento de cristalización es
bajo y el reciclaje de la disolución madre altamente viscosa se
excluye debido a la presencia de polisacáridos.
La cepa productora de eritritol negativa para
polisacáridos se selecciona de los géneros Moniliella,
Trichonosporoides y Trichonosporon.
La cepa productora de eritritol negativa para
polisacáridos produce menos del 1% de polisacáridos,
preferiblemente menos del 0,1% de polisacáridos basado en el
contenido de eritritol. En presencia de la cepa de tipo salvaje (CBS
461.67), se recogen 10,5 g/L de polisacáridos o el 33% de
polisacáridos basado en el contenido de eritritol.
El contenido de polisacáridos se determina por la
cromatografía de líquidos de alta resolución (forma H^{+} de la
resina de intercambio catiónico Shodex KC-811,
eluida con una solución de ácido sulfúrico al 0,01%, y midiendo el
porcentaje del área de los picos eluidos). Debido a que la fracción
de polisacáridos coeluye con sales, y goma xantano, que se añaden
al medio de cultivo, el contenido real de polisacáridos formados se
determina restando el nivel cero (= fondo de sales y goma xantano en
el punto de inicio de la fermentación) del nivel final medido al
final de la fermentación, es decir después de separar la
biomasa.
Las materias de partida utilizadas para la
preparación del medio de cultivo de fermentación son hidrolizado de
almidón, que contiene más del 90% de glucosa como fuente de
carbono, y líquido de maíz macerado, extracto de levadura y/o
sulfato amónico como fuente de nitrógeno. La goma xantano y/o el
aceite de silicona se pueden añadir para suprimir la formación de
espuma.
La presente invención se refiere a un proceso en
el cual el medio de cultivo de fermentación de microorganismos no
refinado se concentra hasta una sustancia seca de al menos el 85%
p/p, preferiblemente seca hasta más del 90% p/p, y los cristales de
eritritol recogidos tienen una pureza de al menos 98% p/p,
preferiblemente del 99% p/p.
El medio de cultivo no refinado libre de
microorganismos se concentra directamente hasta por encima del 80%
p/p de sustancia seca, preferiblemente hasta una sustancia seca en
al menos el 85% p/p, más preferiblemente hasta más del 90% p/p y, a
través de un enfriamiento lento hasta el 20ºC, se obtienen cristales
de eritritol con una pureza del 98-99% p/p. La
cristalización directa con una sustancia altamente seca proporciona
un alto rendimiento de cristalización, mientras que la disolución
madre se puede reciclar hacia la parte delantera del cristalizador
debido a la ausencia de polisacáridos. El caldo de fermentación no
refinado, exento de microorganismos y sustancialmente exento de
polisacáridos, no padece por el aumento de viscosidad durante la
concentración hasta obtener una sustancia altamente seca y la
presencia de glicerol, que puede ser un producto secundario de la
fermentación, puede favorecer la concentración a tal sustancia de
más del 90% seca.
Antes de la concentración y cristalización, la
biomasa (microorganismos) se separa por técnicas comunes de
filtración conocidas, tales como centrifugación, filtración a vacío
con previo revestimiento o microfiltración. El caldo de fermentación
libre de microorganismos resultante se utiliza como tal para la
concentración y cristalización de cristales de eritritol. Una etapa
de refinado para separar impurezas, tal como el tratamiento con
carbón activo o con resinas de intercambio iónico, no se incluye en
el proceso.
La presente invención se refiere a un proceso en
el cual el microorganismo se deja crecer en menos de 10 días, pero
no obstante, se obtienen altas concentraciones de eritritol.
La presente invención se refiere a un proceso en
el cual el medio de cultivo de fermentación se prepara en un
reactor en columna de burbujeo o un reactor de suspensión en aire.
El medio de cultivo no es viscoso y la fermentación para la
producción de eritritol puede llevarse a cabo en un reactor de
fermentación tan sencillo con baja aportación de energía.
Típicamente, el proceso de la presente invención
se lleva a cabo en condiciones aerobias con una cepa seleccionada
del género Moniliella, Trichonosporoides y
Trichonosporon. Preferiblemente, se emplean cepas mutantes de
Moniliella tomentosa var. pollinis, y Trichonosporoides
megachiliensis, más preferiblemente, se emplea la cepa mutante
Moniliella tomentosa var. pollinis TCV 364. Las cepas
mutantes se pueden obtener a través de mutagénesis clásica tal como
la irradiación ultravioleta, tratamiento con ácido nítrico,
metanosulfonato de etilo (MSE), sulfato de dietilo,
N-metil-N'-nitrosoguanidina
(NTG), tratamiento con acridina y otros tratamientos parecidos. Las
cepas productoras de eritritol negativas para polisacáridos que
producen menos del 1% de polisacáridos basado en el contenido de
eritritol, se obtienen preferiblemente por mutagénesis en presencia
de
N-metil-N'-nitrosoguanidina
(NTG). Las colonias aisladas se cultivan durante 5 días y el
sobrenadante libre de células se mezcla con isopropanol y el
precipitado formado se seca y se pesa. Se seleccionan las colonias
que proporcionan la cantidad más baja de preci-
pitado.
pitado.
La fermentación con Moniliella tomentosa var.
pollinis TCV 364 proporciona un contenido de polisacárido por
debajo de 1 g/L o menor que el 1% de polisacáridos, preferiblemente
menor que el 0,1% de polisacáridos basado en el contenido de
eritritol.
La presente invención se refiere a una cepa de
Moniliella productora de eritritol negativa para
polisacáridos que produce menos del 1% de polisacáridos,
preferiblemente menos del 0,1% de polisacáridos, basado en el
contenido de eritritol.
Adicionalmente, la presente invención se refiere
a una cepa de Moniliella productora de eritritol negativa
para polisacáridos que es una cepa de Moniliella tomentosa,
preferiblemente Moniliella tomentosa var pollinis TCV 364
depositada de acuerdo con el Tratado de Budapest en las CCMB/MUCL
(Colecciones Coordinadas de Microorganismos Belgas/Mycothèque de
l'Université Catholique de Louvain por Eridania Béghin Say,
Vilvoorde R&D Centre, Havenstraat 84, B-1800
Vilvoorde) el 28/03/1997 con el número MUCL40385.
La ausencia de polisacáridos confiere ventajas
sustanciales para la fermentación, para la separación de
microorganismos, y para la cristalización:
- 1.
- El medio de cultivo no es viscoso y la fermentación para la producción de eritritol puede llevarse a cabo en un reactor sencillo de fermentación con baja aportación de energía, tal como un reactor de suspensión en el aire o un reactor en columna de burbujeo, preferiblemente en un reactor en columna de burbujeo.
- 2.
- La cepa mutante aplicada es muy estable en cuanto a la reversión.
- 3.
- Debido a la viscosidad más baja, se obtiene una mejor transferencia de oxígeno, que conlleva a una menor producción de etanol y un mayor rendimiento de eritritol. Se pueden alcanzar concentraciones de eritritol por encima de 250 g/L ó 300 g/L. Estas altas concentraciones de eritritol se obtienen en un tiempo de fermentación de menos de 10 días.
- 4.
- La ausencia de polisacáridos formados permite una mejor difusión en las células, por lo que la fermentación puede llevarse a cabo en presencia de concentraciones más altas de la fuente de nitrógeno, lo que también reduce considerablemente el tiempo de fermentación.
- 5.
- La viscosidad más baja resulta en una filtración mejor y más rápida de biomasa y el caldo de fermentación no refinado libre de microorganismos se somete directamente a concentración hasta obtener una sustancia altamente seca, cristalización y recogida de los cristales de eritritol, sin pre-tratamiento con carbón activo o resina de intercambio iónico.
- 6.
- El caldo de fermentación no refinado libre de microorganismos se concentra directamente hasta por encima del 80% p/p de sustancia seca y proporciona un rendimiento alto de cristales de eritritol.
- 7.
- Se obtiene una recuperación alta de eritritol, de al menos el 85%, y una corriente de desechos menos diluida.
- 8.
- Se obtienen los cristales con una pureza del 98-99% p/p.
Los cristales de eritritol obtenidos pueden
secarse según métodos convencionales, por ejemplo con un secador de
tipo lecho fluido.
Para aumentar la pureza hasta por encima del
99,5% p/p, los cristales de eritritol, que tienen una pureza
del
98-99% p/p (determinada por cromatografía líquida de alta resolución (resina de intercambio catiónico Shodex KC-811 en forma de H^{+}, eluida con una solución de ácido sulfúrico al 0,01% con medición del porcentaje del área de los picos eluidos) pueden disolverse de nuevo, decolorarse y desalarse mediante carbono activo y/o resinas de intercambio iónico antes de una segunda concentración y cristalización. La disolución madre puede reciclarse a la primera etapa de cristalización.
98-99% p/p (determinada por cromatografía líquida de alta resolución (resina de intercambio catiónico Shodex KC-811 en forma de H^{+}, eluida con una solución de ácido sulfúrico al 0,01% con medición del porcentaje del área de los picos eluidos) pueden disolverse de nuevo, decolorarse y desalarse mediante carbono activo y/o resinas de intercambio iónico antes de una segunda concentración y cristalización. La disolución madre puede reciclarse a la primera etapa de cristalización.
La presente invención se ilustra con los
siguientes ejemplos.
El Ejemplo 1 describe un método de mutagénesis
para obtener la cepa mutante Moniliella tomentosa var
pollinis TCV 364.
El Ejemplo 2 describe la inoculación y
fermentación con la cepa nativa CBS 461.67, y el rendimiento de
eritritol y el contenido de polisacáridos se comparan con la
fermentación con la cepa mutante Moniliella tomentosa var
pollinis TCV 364 (Ejemplo 4).
El Ejemplo 3 describe la inoculación y
fermentación con la subcepa formadora de numerosas esporas descrita
en el documento EP 0136805, y la viscosidad del caldo de
fermentación libre de microorganismos se compara con la viscosidad
del caldo de fermentación de microorganismos obtenido con la cepa
mutante Moniliella tomentosa var pollinis TCV 364 (Ejemplo
4). La viscosidad del caldo de fermentación aumenta con el
contenido de polisacáridos presentes en el caldo de
fermentación.
El Ejemplo 5 describe la fermentación con
Moniliella tomentosa var pollinis TCV 364 a escala piloto,
seguido de la recuperación de cristales de eritritol (=tratamiento
aguas abajo).
Moniliella pollinis se cultivó a 30ºC en
matraces de agitación en un medio que contenía glucosa al 30% y
extracto de levadura al 1%. Después de 2 días, 1 ml de una solución
saturada de
N-metil-N'-nitrosoguanidina
(NTG) se añadió al cultivo y se incubó durante 1 h con agitación.
Las células se centrifugaron y se lavaron 2 veces con medio de
cultivo reciente.
Las células se diluyeron en agua estéril y se
sembraron en placas de medio sólido que contenía glucosa al 20%,
extracto de levadura al 1%, y agar al 2%, y se incubaron a 30ºC
durante una semana.
Las colonias aisladas se cultivaron en medio
líquido durante 5 días.
Las células se separaron por centrifugación y el
sobrenadante libre de células se mezcló con 2 partes de
isopropanol. El precipitado se secó y pesó.
Se seleccionaron las colonias que proporcionaban
las cantidades más bajas de precipitado.
Ejemplo comparativo
2
Dextrosa cristalina (C*Dex02001) se disolvió en
50 ml de agua hasta alcanzar una concentración de 30% p/p. Se
añadió extracto de levadura (Ohly) al 1% p/v. El medio se inoculó
con unas pocas colonias de la placa de Petri. La temperatura fue de
30ºC y el medio completo se agitó durante 3 días a 100
agitaciones/min.
El volumen total de trabajo era 1,2 L y se añadió
dextrosa cristalina (C*Dex02001) al agua hasta alcanzar una
concentración del 30% p/v. Se añadió líquido de maíz macerado al 5%
p/v (C*Plus15855, 5%), que se esterilizó por separado en 200 ml de
agua, seguido del inóculo, que se preparó en el matraz Erlenmeyer, y
500 ppm de aceite de silicona (SAG) y 500 ppm de xantano. La
temperatura fue de 35ºC y el caldo se agitó a
600-11000 rpm. El tiempo total de fermentación fue
de 120 h.
El contenido de polisacáridos y de eritritol se
determinó mediante HPLC y los resultados se presentan en la Tabla
1.
Ejemplo comparativo
3
El inóculo se preparó con la aplicación de las
mismas condiciones de reacción que las descritas en el Ejemplo 2.
En lugar de la cepa nativa, se inocularon con colonias de la
sub-cepa productora de numerosas esporas descrita
en el documento EP 0136805. Las condiciones de fermentación fueron
similares a las descritas en el Ejemplo 2.
La viscosidad del caldo de fermentación libre de
microorganismos se comparó con la viscosidad del caldo de
fermentación obtenida con la cepa mutante Moniliella tomentosa
var pollinis TCV 364.
Los resultados se presenten en la Tabla 2.
El inóculo se preparó aplicando las mismas
condiciones de reacción que las descritas en el Ejemplo 2. En lugar
de utilizar la cepa nativa, se inocularon colonias de la cepa
mutante Moniliella tomentosa var pollinis TCV 364. Las
condiciones de fermentación fueron similares a las descritas en el
Ejemplo 2.
El contenido de polisacáridos y de eritritol se
determinó mediante HPLC y los resultados se presentan en la Tabla
1.
Un reactor en columna de burbujeo de
6000-L se esterilizó durante 30 minutos a 121ºC. Se
añadió agua estéril, y se añadió hidrolizado de almidón
(C*Plus02668, dextrosa al 95%, 70% d.s.) hasta que la concentración
final de la dextrosa después de inoculación (calculado sobre 3600
L) fue entre 220 y 250 g/L.
La temperatura del caldo se mantuvo constante a
35ºC. Se inyectó aire estéril en el reactor para obtener una
velocidad del gas superficial entre 5 y 15 cm/s. El volumen se
inoculó con un pre-cultivo de 3 días (con un volumen
entre 500 L y 1000 L).
Del 4,5% al 5% p/v de líquido de maíz macerado
(C*Plus15855, 50% d.s.), de 400 a 500 ppm de aceite de silicona
(SAG471), y de 400 a 500 ppm de xantano se esterilizaron durante 30
minutos a 121ºC (las concentraciones se calcularon sobre el volumen
final de 3600 L) y se añadieron al caldo de fermentación.
Después de 30 a 40 horas adicionales, la adición
de hidrolizado de almidón pasteurizado (C*Plus02668, dextrosa al
95%, 70% d.s.) se inició para mantener el nivel de dextrosa entre
20 y 100 g/L. Esta adición continuó hasta llegar a un volumen final
del caldo de 4800 L. La fermentación continuó hasta que el nivel de
dextrosa en el caldo estuviera por debajo de 2 g/L, es decir,
durante menos de 10 días.
La concentración final de eritritol fue entre 250
y 300 g/L. Se formaron 0,42% de polisacáridos (basado en el
contenido de eritritol).
La biomasa se separó del caldo de fermentación
por filtración sobre un filtro de vacío rotativo previamente
revestido. El caldo de fermentación clarificado se concentró en un
evaporador de vacío discontinuo hasta un contenido total de sólidos
secos del 90% p/p a 90ºC.
Este líquido clarificado se transfirió a un
cristalizador discontinuo de enfriamiento con agitación. Se
procedió a enfriarlo linealmente desde 90ºC hasta 20ºC durante un
periodo de tiempo de 6 horas. Los cristales de eritritol se
recuperaron por centrifugación discontinua. Los cristales se lavaron
en la centrífuga con agua fría, con una relación de agua a
cristales de 15/100. La recuperación de eritritol fue del 85% y la
pureza de los cristales fue del 99,1% p/p.
Claims (11)
1. Un proceso para producir eritritol por
fermentación utilizando microorganismos y recuperar los cristales
de eritritol, comprendiendo dicho proceso las siguientes
etapas:
- a)
- proporcionar microorganismos de una cepa productora de eritritol negativa para polisacáridos Moniliella tomentosa var pollinis TCV 364 [número de depósito MUCL 40385], cepa que produce menos del 1% de polisacáridos basado en el contenido de eritritol,
- b)
- preparar un medio de cultivo de fermentación,
- c)
- añadir los microorganismos al medio de cultivo de fermentación,
- d)
- dejar que crezcan los microorganismos hasta que se obtengan al menos 50 g/L de eritritol en el medio de cultivo de fermentación,
- e)
- separar los microorganismos del medio de cultivo de fermentación,
- f)
- concentrar el medio de cultivo de fermentación libre de microorganismos no refinado hasta obtener una sustancia seca en más del 80% p/p,
- g)
- cristalizar eritritol, y
- i)
- recoger cristales de eritritol.
2. Un proceso según la reivindicación 1,
caracterizado porque en la etapa a) dicha cepa productora de
eritritol negativa para polisacáridos Moniliella tomentosa var
pollinis TCV 364 produce menos del 0,1% de polisacáridos basado
en el contenido de eritritol.
3. Un proceso según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque el medio de cultivo de fermentación no
refinado, libre de microorganismos, se concentra hasta obtener una
sustancia seca de al menos el 85% p/p.
4. Un proceso según la reivindicación 1 ó 2,
caracterizado porque el medio de cultivo de fermentación no
refinado, libre de microorganismos, se concentra hasta obtener una
sustancia seca de más del 90% p/p.
5. Un proceso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque en la etapa h)
los cristales de eritritol se recogen con una recuperación de al
menos el 85% y tienen una pureza de al menos el 98% p/p.
6. Un proceso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque en la etapa h)
los cristales de eritritol se recogen con una recuperación de al
menos el 85% y que tienen una pureza de al menos el 99% p/p.
7. Un proceso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se permita que
el microorganismo crezca en menos de 10 días.
8. Un proceso según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque el caldo de
cultivo de fermentación se prepara en un reactor en columna de
burbujeo o un reactor con suspensión en el aire.
9. Una cepa productora de eritritol negativa para
polisacáridos Moniliella tomentosa var pollinis TCV 364
depositada el 28/03/1997 con el número MUCL 40385.
10. Una cepa según la reivindicación 9,
caracterizada porque produce menos del 1% de polisacáridos
basado en el contenido de eritritol.
11. Una cepa según la reivindicación 9 ó 10,
caracterizada porque produce menos del 0,1% de polisacáridos
basado en el contenido de eritritol.
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