ES2226792T3 - El uso de derivados de 4-h-1-benzopiran-4-ona como inhibidores de la proliferacion de miocitos lisos. - Google Patents
El uso de derivados de 4-h-1-benzopiran-4-ona como inhibidores de la proliferacion de miocitos lisos.Info
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Abstract
El uso de un compuesto de **fórmula** donde R1 es hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, aril-alquiloC1-C4; alquiloC1-C6 sustituido con halógeno, hidroxi o carboxi; cicloalquiloC3-C6, piridilo, tienilo, cicloalquilC3-C6-alquiloC1-C4, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, fenilo; fenilo, mono- o polisustituido con halógeno, alquiloC1-C4, alcoxiC1-C4, hidroxi, carboxi, COO-alquilo, CONH2, CONH-alquilo, CON(alquilo)2, nitro, trifluorometilo, amino, alquilC1-C4-amino, di-alquilC1-C4-amino, o fenilo; naftilo, carboxilo, -CHO, COO-alquiloC1-C4, un amino primario, alquilamino, aralquilamino, dialquilamino, amido, arilamino, diarilamino, o -CH2O-alquilo C1-C4; R2 es hidrógeno, alquilo con 1 a 6 átomos de carbono, arilo, nitro, amino, di-alquilC1-C4-amino, un halógeno, hidroxi, alcoxi, -COOH, -COO-alquiloC1-C4, -CHO, -CH2OH o -CH2O-alquiloC1-C4, o una de sus sales de adición de ácido farmacológicamente aceptables para la producción de un producto farmacéutico para la inhibición de la proliferación de músculo liso, donde la dosificación del compuesto de fórmula 1 es menos del 70%, preferiblemente menos del 60%, en particular menos del 50% de la dosificación que sería necesaria para controlar el crecimiento celular.
Description
El uso de derivados de
4-H-1-benzopiran-4-ona
como inhibidores de la proliferación de miocitos lisos.
La presente invención se refiere al uso de
derivados de
4-H-1-benzopiran-4-ona
como inhibidores de la proliferación de miocitos lisos (SMC, por
sus siglas en inglés "smooth muscle cell"), a
dosificaciones que son menores que 70% de la dosificaciones que
serían necesarias para reprimir el crecimiento tumoral.
La presente invención se hizo con subvenciones de
los Institutos Nacionales de la Salud, núms. HL03658 y AG15234.
Las respuestas celulares al daño vascular -
disfunción, activación, desdiferenciación, proliferación y
migración celular - culminan en episodios clínicos tales como
restenosis, que ocurre tras la angioplastia con globo y colocación
de una endoprótesis vascular ("stent") para el
tratamiento de la enfermedad aterosclerótica humana^{1}. La
proliferación de miocitos lisos (SMC) es una característica común,
y quizá unificadora, de los modelos de daño vascular, y los SMC son
el principal componente celular de las lesiones en la neoíntima
^{2, \ 3}. El uso creciente de las endoprótesis vasculares para el
tratamiento de la enfermedad coronaria va asociado a un interés
renovado por la inhibición de la proliferación de SMC, ya que la
restenosis en la endoprótesis es casi enteramente dependiente de la
formación de neoíntima y de la hiperplasia de los SMC ^{4}. Se
estima que, sólo en el año 1997, del orden de 100.000 pacientes con
restenosis en la endoprótesis necesitaron tratamiento ^{5}; por
tanto, un inhibidor eficaz de la hiperplasia de SMC, de fácil
administración, tendría profundas ramificaciones clínicas y
económicas^{6}.
Los esfuerzos por inhibir la proliferación de los
SMC en modelos de daño vascular, ya sea por modulación de
mediadores celulares de la respuesta proliferativa o por
interferencia directa con la maquinaria del ciclo celular, han
aportado importantes conocimientos acerca de la formación de
neoíntima. La progresión del ciclo celular es un episodio
estrictamente controlado, regulado positivamente por las cinasas
dependientes de ciclina (Cdks) y sus subunidades reguladoras de
ciclina ^{7}, y negativamente por los inhibidores de Cdks y los
genes supresores de tumores tales como la proteína del
retinoblastoma ^{8}. La sobreexpresión, mediada por adenovirus,
de inhibidores de Cdks endógenos p21 y p27^{kip1} o de una forma
constituyentemente activa de Rb bloquea la formación de neoíntima
en el modelo de daño en carótida de rata ^{9-11};
de modo similar, la inhibición de la actividad del factor de
transcripción E2F por sobreexpresión competitiva de ADN cognado
también inhibe la proliferación de SMC y la formación de neoíntima
^{12}. Estos estudios avalan la hipótesis general de que la
inhibición del ciclo celular es una diana atractiva para la
intervención en la formación de lesiones vasculares.
Si bien las intervenciones genéticas han ayudado
en la disección de los mecanismos que regulan la formación de
neoíntima, adolecen del inconveniente de no ser, ahora mismo,
clínicamente adecuadas para el tratamiento de la enfermedad
vascular en los seres humanos. Un compuesto de bajo peso molecular,
soluble en agua, con efectos reguladores específicos del ciclo
celular, particularmente uno que tuviera actividad por vía oral,
tendría una amplia aplicabilidad tanto del punto de vista
experimental, como potencialmente clínico. La flavona identificada
recientemente, flavopiridol, es un inhibidor de Cdks que bloquea
potencialmente la actividad de Cdk_{2}, Cdc_{2}, y
Cdk_{4}^{13-16}. A diferencia de otros
inhibidores farmacológicos de Cdks, el flavopiridol es digno de
mención por su especificidad hacia cinasas, su disponibilidad oral y
su potencia, siendo eficaz en concentraciones nanomolares ^{16}.
Estas características únicas dan como resultado un perfil de
efectos secundarios que ha conducido al ensayo de flavopiridol en
la fase 1 de estudios clínicos para el tratamiento de neoplasmas
resistentes al tratamiento^{17}. Dadas estas propiedades, ahora
se ha examinado la capacidad del flavopiridol para inhibir la
proliferación de SMC in vitro y después del daño por un globo
en la arteria carótida de la rata. Se demuestra que el flavopiridol
es un inhibidor potente y selectivo de la progresión del ciclo
celular y que detiene la proliferación de SMC tanto in vivo
como in vitro; además, la formación de neoíntima es
bloqueada eficazmente por dosis orales de flavopiridol menores que
aquéllas en las se han reconocido efectos tóxicos para los seres
humanos.
Ahora se ha encontrado sorprendentemente que los
derivados de
4-H-1-benzopiran-4-ona
son adecuados como inhibidores de la proliferación de SMC. Se sabe
que los derivados de
4-H-1-benzopiran-4-ona
son adecuados para reprimir tumores. Sin embargo, es sorprendente
que los derivados de
4-H-1-benzopiran-4-ona
de acuerdo con la presente invención actúen eficazmente como
inhibidores de la proliferación de SMC a niveles de dosificación
menores que los niveles de dosificación que han sido utilizados en
la represión del crecimiento tumoral.
Por consiguiente, un objeto de la presente
invención es el uso de derivados de
4-H-1-benzopiran-4-ona
como inhibidores de la proliferación de miocitos lisos.
Figura 1. Efecto de flavopiridol sobre la
síntesis de ADN de HASMC. A. Se trataron HASMC estables en
ausencia (-) o presencia (+) de bFGF (10 ng/ml) y con las
concentraciones indicadas de flavopiridol (nmol/l) durante 24 h. La
incorporación de BrdU como medida de la proliferación se determinó
por un ensayo basado en ELISA y se expresó como porcentaje de
incorporación en ausencia de tratamiento con bFGF. *p<0,05,
comparado con células no tratadas. \daggerp<0,05, comparado
con tratamiento con bFGF en ausencia de flavopiridol. B. Se
trataron HASMC con bFGF (10 ng/ml), trombina (2 U/ml) o vehículo en
presencia o ausencia de flavopiridol (75 nmol/L) y se midió la
incorporación de BrdU. *p<0,05, comparado con células no
tratadas. **p<0,05, comparado con tratamiento con bFGF a solas.
p<0,05, comparado con tratamiento con trombina a solas.
Figura 2. Efecto de flavopiridol sobre la
proliferación de HASMC. Se trataron HASMC estables con bFGF (10
ng/ml) a solas (\bullet), bFGF y flavopiridol (75 nmol/L)
(\bullet) o vehículo (\bullet) durante los tiempos indicados y
se determinó el número de células después de cada tratamiento. Los
resultados se expresan como las cuentas de células por pocillo
(X10^{3}).
Figura 3. Efecto de flavopiridol sobre la
actividad de cinasa dependiente de ciclina en HASMC. Se
trataron HASMC estables con bFGF (10 ng/ml), trombina (2 U/ml) o
vehículo en presencia o ausencia de flavopiridol (75 nmol/L), y se
cuantificó la fosforilación de histona H1 como medida de actividad
Cdk y se expresó como el porcentaje de actividad Cdk en ausencia de
tratamiento con bFGF. \text{*}p<0,05, comparado con
células no tratadas. **p<0,05, comparado con tratamiento con
bFGF a solas. p<0,05, comparado con tratamiento con trombina a
solas.
Figura 4. Regulación con flavopiridol de las
proteínas relacionadas con el ciclo celular. Se trataron HASMC
estables en presencia (+) o ausencia (-) de bFGF (10 ng/ml),
trombina (2 U/ml), y/o flavopiridol (75 nmol/L) durante 24 h. Se
realizó una inmunotransferencia de lisados celulares con anticuerpos
específicos que reconocen ciclina D_{1} (panel superior),
PCNA (panel central), y Rb fosforilado (pRb) e
hiperfosforilado (panel inferior).
Figura 5. Efectos de flavopiridol sobre la
actividad de MAP cinasa en HASMC. Se trataron HASMC estables
en presencia (+) o ausencia (-) de bFGF (10 ng/ml), trombina (2
U/ml), PD98059 (30 \mumol/L) y/o flavopiridol (75 nmol/L) durante
30 min. Se midieron los niveles de Erk1 (pErk1) y Erk2 (pErk2)
fosforilados por inmunotransferencia con un anticuerpo específico
para fosforilación que reconoce ambas proteínas (panel
superior). Se midió la actividad MAP cinasa con un ensayo de
cinasa en gel, utilizando la proteína básica de mielina como
sustrato (panel
inferior).
inferior).
Figura 6. Viabilidad de HASMC después del
tratamiento con flavopiridol. Se trataron HASMC estables con
flavopiridol (75 nmol/L), TNF-\Upsilon (50 ng/ml),
o vehículo las veces indicadas. Se estimó la viabilidad celular por
exclusión del azul tripano. Los resultados se expresan como el
porcentaje de células viables a células totales contadas.
Figura 7. Inhibición de la formación de
neoíntima en la arteria carótida de ratas por flavopiridol después
del daño por un globo. Se midieron las relaciones
neoíntima/media en cortes histológicos de arterias carótidas de
ratas tratadas con o sin flavopiridol (5 mg/kg) durante 5 días
después del daño. Las arterias se examinaron 7 (n = 12) y 14 (n =
12) días después del daño. También se da el porcentaje de núcleos
positivos en PCNA (\pm SEM, expresado como un porcentaje de
núcleos contados) en la neoíntima de las arterias a partir de cada
punto de tiempo y cada grupo de tratamiento. *p<0,05, comparado
con tratamiento con vehículo.
Figura 8. Cortes histológicos de arterias
carótidas de ratas. Los cortes son de arterias 7 (paneles
A y B) y 14 (paneles C y D) días después
del daño. Las arterias indicadas en los paneles A y C son de ratas
tratadas con flavopiridol (5 mg/kg) por sonda gástrica; las
arterias de los paneles B y D eran de ratas tratadas
con vehículo a solas. Ampliación original, 100 aumentos.
Figura 9. Expresión de Cdk2 después del daño
por un globo en arterias carótidas de ratas. Los cortes son de
arterias 7 (paneles A y B) y 14 (paneles C y
D) días después del daño. Las arterias indicadas en los
paneles A y C son de ratas tratadas con flavopiridol (5 mg/kg) por
sonda gástrica; las arterias de los paneles B y D
eran de ratas tratadas con vehículo a solas. Los núcleos positivos
en Cdk2, localizados predominantemente en la neoíntima, se tiñen
con azul Vector por el método de la fosfatasa alcalina. Ampliación
original, 100 aumentos.
Los
4-H-1-benzopiranos
adecuados son compuestos de fórmula
donde
R_{1} es hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de
carbono,
aril-alquiloC_{1}-C_{4};
alquiloC_{1}-C_{6} sustituido con halógeno,
hidroxi o carboxi; cicloalquiloC_{3}-C_{6},
piridilo, tienilo,
cicloalquilC_{3}-C_{6}-alquiloC_{1}-C_{4},
alquenilo C_{2}-C_{6}, alquinilo
C_{2}-C_{6}, fenilo; fenilo, mono- o
polisustituido con halógeno,
alquiloC_{1}-C_{4},
alcoxiC_{1}-C_{4}, hidroxi, carboxi,
COO-alquilo, CONH_{2},
CONH-alquilo, CON(alquilo)_{2},
nitro, trifluorometilo, amino,
alquilC_{1}-C_{4}-amino,
di-alquilC_{1}-C_{4}-amino,
o fenilo; naftilo, carboxilo, -CHO,
COO-alquiloC_{1}-C_{4}, un amino
primario, alquilamino, aralquilamino, dialquilamino, amido,
arilamino, diarilamino, o -CH_{2}O-alquilo
C_{1}-C_{4};
R_{2} es hidrógeno, alquilo con 1 a 6 átomos de
carbono, arilo, nitro, amino,
di-alquilC_{1}-C_{4}-amino,
un halógeno, hidroxi, alcoxi, -COOH,
-COO-alquiloC_{1}-C_{4}, -CHO,
-CH_{2}OH o
-CH_{2}O-alquiloC_{1}-C_{4};
R_{3} es hidrógeno,
alquiloC_{1}-C_{4};
alquiloC_{1}-C_{4} sustituido con halógeno,
hidroxi o carboxi; hidroxi, carboxi, nitro, amino,
alquilC_{1}-C_{4}-amino,
di-alquilC_{1}-C_{4}-amino,
halógeno,
-O-alquil-C(O)-alquilo,
-CHO, -CH_{2}OH,
-CH_{2}O-alquiloC_{1}-C_{4} o
R_{2}N-C(O)-O-, donde R es
H, alquiloC_{1}-C_{6}, cicloalquilo; u
-O-alquil-C(O)-alquilo
o arilo;
R_{4} es hidrógeno, hidroxi;
alcoxiC_{1}-C_{4},
alcanoilC_{1}-C_{4}-oxi,
alcoxiC_{1}-C_{4}-carbonilo,
ariloxi, amino,
alquilC_{1}-C_{4}-amino,
di-alquilC_{1}-C_{4-}amino, o
R'_{2}-N-C(O)-O-
donde R' es H, alquiloC_{1}-C_{6}, cicloalquilo
o arilo;
R_{5} es hidrógeno,
alquiloC_{1}-C_{6},
aril-alquiloC_{1}-C_{4},
cicloalquiloC_{3}-C_{6},
cicloalquilC_{3}-C_{6}-alquiloC_{1}-C_{4},
alquilamino, alcanoíloC_{1}-C_{4},
-C(O)-O-alquiloC_{1}-C_{4}
o aroílo, donde el grupo arilo en R_{1}, R_{2}, R_{3},
R_{4}, y R_{5} es fenilo sin sustituir o fenilo que está mono o
polisustituido con halógeno,
alquiloC_{1}-C_{4},
alcoxiC_{1}-C_{4}, hidroxi, carboxi,
COO-alquilo, CONH_{2},
CONH-alquilo, CON(alquilo)_{2},
nitro, trifluorometilo, amino,
alquilC_{1}-C_{4}-amino,
di-alquilC_{1}-C_{4}-amino
o fenilo;
m es un número entero entre 0 y 3 y n es 1, o una
de sus sales de adición de ácido farmacológicamente aceptables.
Los compuestos de acuerdo con la invención tienen
dos centros de asimetría, uno en el que el anillo heterocíclico que
contiene nitrógeno está condensado al resto de benzopirano
(C-4'), y el otro en el átomo de carbono sustituido
con R_{4} (C-3'), lo que significa que son
posibles dos pares de isómeros ópticos. La definición de los
compuestos de acuerdo con la invención abarca todos los posibles
estereoisómeros y sus mezclas. De manera muy particular, abarca las
formas racémicas y los isómeros ópticos aislados que tienen la
actividad especificada. Los dos racematos se pueden resolver por
métodos físicos tales como, por ejemplo, cristalización
fraccionada. Los isómeros ópticos individuales se pueden obtener a
partir de los racematos por métodos convencionales, tales como, por
ejemplo, formación de la sal con un ácido ópticamente activo seguida
de cristalización.
Ejemplos de grupos alquilo que son adecuados para
R_{1} a R_{5} son radicales de cadena lineal o ramificada que
tienen hasta 6, preferiblemente hasta 5 átomos de carbono, por
ejemplo los grupos metilo, propilo, isopropilo,
t-butilo, pentilo o ispopentilo.
Ejemplos de grupos alquilo sustituidos que son
adecuados para R_{1} a R_{5} son haloalquilo tal como
trifluorometilo, hidroxialquilo tal como hidroxietilo, o
carboxialquilo, tal como carboxietilo.
Ejemplos adecuados de un grupo cicloalquilo que
tiene 3 a 6 átomos de carbono y se representa por R_{1} a R_{5}
son ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo o ciclohexilo. El
ciclopropilmetilo es un ejemplo de cicloalquilalquilo.
Un ejemplo de un grupo aralquilo que se
representa por R_{1} a R_{5} es un grupo fenilalquilo en el que
el grupo fenilo está sin sustituir o monosustituido o
polisustituido con sustituyentes tales como halógeno,
alquiloC_{1}-C_{4},
alcoxiC_{1}-C_{4} o nitro o con un grupo
trifluorometilo, grupo amino y grupo amino sustituido.
Un ejemplo de un grupo arilo que se representa
por R_{1} a R_{5} es un grupo fenilo que está sin sustituir o
monosustituido o polisustituido con sustituyentes tales como
halógeno, alquiloC_{1}-C_{4},
alcoxiC_{1}-C_{4}; hidroxi, carboxi,
COO-alquilo, CONH_{2},
CONH-alquilo, CON(alquilo)_{2},
nitro o trifluorometilo, amino,
alquilC_{1}-C_{4}-amino,
di-alquilC_{1}-C_{4}-amino,
grupos heterocíclicos aromáticos tales como grupos piridilo y
radicales aromáticos policíclicos, tales como grupos naftilo.
Un ejemplo adecuado de un grupo alquilamino que
se representa por R_{1} a R_{5} es
(CH_{2})_{n}-NR_{6}R_{7}, donde n es
1 a 3 y R_{6} y R_{7} son alquilo y son como se han definido
anteriormente en el caso de R_{1} a R_{5}; además, R_{6} y
R_{7} junto con el átomo de nitrógeno al que están unidos pueden
formar juntos un anillo heterocíclico que contiene uno o más
heteroátomos. Ejemplos adecuados de anillos heterocíclicos que se
forman con R_{6} y R_{7} junto con el nitrógeno al que están
unidos son piperidina, pirrolidina, morfolina, piperazina o
imidazol, todos lo cuales pueden estar sin sustituir o sustituidos
en una o más posiciones con alquiloC_{1}-C_{4},
alcoxiC_{1}-C_{4}o arilo o con un grupo
hidroxilo o amino.
Ejemplos adecuados de sales de los compuestos
según la invención con ácidos inorgánicos u orgánicos son el
hidrocloruro, hidrobromuro, sulfato, fosfato, acetato, oxalato,
tartrato, citrato, maleato o fumarato.
Se prefieren los compuestos de fórmula la
en la que R_{1} es hidrógeno,
alquiloC_{1}-C_{3}, naftilo, fenilo; fenilo,
mono- o polisustituido con halógeno,
alquiloC_{1}-C_{4},
alcoxiC_{1}-C_{4}, hidroxi, carboxi,
COO-alquilo, CONH_{2},
CONH-alquilo, CON(alquilo)_{2},
nitro, trifluorometilo, amino,
alquilC_{1}-C_{4}-amino,
di-alquilC_{1}-C_{4}-amino,
o fenilo; piridilo o
tienilo;
R_{2} es hidrógeno o
alquiloC_{1}-C_{3};
R_{5} es
cicloalquiloC_{1}-C_{3},
cicloalquiloC_{3}-C_{5}, o
cicloalquilC_{3}-C_{5}-alquiloC_{1}-C_{4}.
Se prefieren en particular los compuestos de
fórmula Ia en que R_{1} es fenilo, tienilo, piridilo,
clorofenilo, diclorofenilo, metilfenilo, aminofenilo, bromofenilo,
hidroxifenilo o naftilo;
R_{2} es hidrógeno y
R_{5} es metilo.
Un compuesto de especial importancia es
(-)-cis-5,7-dihidroxi-2-(2-clorofenil)-8-[4-(3-hidroxi-1-metil)-piperidinil]
-4H-benzopiran-4-ona
(Flavopiridol), particularmente en forma de hidrocloruro.
Los compuestos según la presente invención se
pueden preparar de acuerdo con la descripción de la patente de
EE.UU. núms. 4.900.727 y 5.284.856. Los ejemplos de dichas patentes
de EE.UU. también son de relevancia para la presente solicitud.
Los compuestos según la presente invención
inhiben la proliferación de miocitos lisos. Por lo tanto, también
son materia objeto de la invención los productos farmacéuticos para
la inhibición de la proliferación de los miocitos lisos, que
contienen al menos un compuesto de la fórmula I, definida
anteriormente, o al menos una de sus sales de adición de ácido
farmacológicamente aceptables, y el uso de un compuesto de fórmula
I, definida anteriormente, para la preparación de un producto
farmacéutico que tiene una acción inhibidora de la proliferación de
los miocitos lisos. Las áreas de aplicación típicas para los
compuestos según la presente invención son
enfermedades/trastornos/daños que van acompañados de lesiones
vasculares ricas en miocitos lisos. Un ejemplo muy importante en
relación con esto son las lesiones que aparecen después del daño por
un globo. Otra área de aplicación importante es la prevención de
restenosis después de la implantación de una endoprótesis
vascular.
Los derivados de
4H-1-benzopiran-4-ona
se utilizan de acuerdo con la invención de la manera conocida
generalmente, que es conocida por el experto en la técnica. Para
los productos farmacéuticos, se emplea una cantidad eficaz de la
sustancia activa mencionada ya sea a solas o, preferiblemente, en
combinación con agentes auxiliares farmacéuticos adecuados en forma
de comprimidos, comprimidos recubiertos, cápsulas, supositorios,
emulsiones, suspensiones o soluciones, llegando a ser el contenido
del compuesto activo hasta aproximadamente 95%, preferiblemente
entre 10 y 75%.
Los expertos sabrán cuales son los agentes
auxiliares adecuados para la formulación deseada del producto
farmacéutico debido a sus conocimientos en la materia. Además de
agentes auxiliares para comprimidos, o disolventes, formadores de
gel, bases para supositorios y otros excipientes para la sustancia
activa, es posible utilizar, por ejemplo, antioxidantes,
dispersantes, emulsionantes, desespumantes, correctores del sabor,
conservantes, solubilizantes o colorantes.
La sustancia activa se puede administrar por vía
oral, parenteral, intravenosa o rectal, prefiriéndose la
administración oral. Para una forma de administración oral, la
sustancia activa se puede mezclar con otros compuestos junto con los
aditivos que son adecuados para este propósito, tales como
excipientes, estabilizantes o diluyentes inertes, y se pueden
utilizar métodos convencionales para introducirlos en formas de
administración adecuadas, tales como comprimidos, comprimidos
recubiertos, cápsulas de gelatina dura y soluciones o suspensiones
hidroalcohólicas u oleosas. Ejemplos de excipientes inertes que se
pueden usar son goma arábiga, magnesia, lactosa, glucosa o almidón,
en particular el almidón de maíz. En este contexto, la formulación
se puede preparar en forma de un granulado seco o húmedo. Ejemplos
de excipientes o disolventes oleosos adecuados son los aceites
vegetales o animales, tales como el aceite de girasol o el aceite
de hígado de bacalao.
Para administración subcutánea o intravenosa, se
forma una solución, suspensión o emulsión de la sustancia activa,
si es apropiado utilizando sustancias que son convencionales para
este propósito, tales como solubilizantes, emulsionantes u otros
agentes auxiliares. Ejemplos de disolventes adecuados son agua,
solución fisiológica de cloruro de sodio o alcoholes, por ejemplo,
etanol, propanol o glicerol, y también soluciones de azúcares,
tales como los soluciones de glucosa o las soluciones de manitol, o
una mezcla de los diversos disolventes que se han mencionado.
Los derivados de
4H-1-benzopiran-4-ona
se administrarán a una dosis que es menor que 70%, preferiblemente
menor que 60%, en particular menor que 50% de la dosificación que
se utiliza para reprimir el crecimiento tumoral en el mamífero
respectivo. Un ejemplo sería - en el modelo de xenoinjerto en
ratones desprovistos de sistema inmune - una dosis de
aproximadamente 5 mg/kg de peso corporal administrados oralmente
una vez al día. Esto es la mitad de la dosis que inhibe el
crecimiento tumoral en el mismo modelo animal (Drees et al.
Clin. Cancer Res. 1997; 3: 273-279).
Las propiedades farmacocinéticas de los derivados
de
4H-1-benzopiran-4-ona
podrían obligar a administrar dicho compuesto varias veces al día o
elegir formulaciones de liberación lenta.
Se empleó el modelo bien establecido de daño en
carótida de rata, en el que la formación de una lesión en la
neoíntima después del daño inducido por un catéter es críticamente
dependiente de la proliferación de SMC (Clowes et al. Lab.
Invest. 1983; 49:327-333, Clowes et al. Circ.
Res. 1985; 56:139-145) para examinar si el
Flavopiridol induce la parada del crecimiento de SMC in vivo,
igual que lo hace in vitro. Se administró flavopiridol
oralmente a una dosis de 5 mg/kg una vez al día, empezando el día
del daño y durante cuatro días después, ya que este período de
tiempo abarca la inducción inicial de Cdk2 y la primera onda de
proliferación de SMC en este modelo (Circ. Res. 1995;
77:445-465, Circ. Res. 1997;
80:418-426). Se cuantificaron las áreas promediadas
de la íntima y de la media 7 y 14 días después del daño, y el tamaño
de la lesión en la neoíntima se expresó como la relación del área
de la neoíntima al área de la media. Tanto el grupo tratado como el
no tratado estaban compuestos por doce animales. La relación en 7
días fue 1,00+/-0,05 en arterias de ratas tratadas con vehículo y
0,65+/-0,04 en arterias de ratas tratadas con Flavopiridol, una
reducción del 35%. La relación neoíntima/media en 14 días fue
1,08+/-0,04 en ratas tratadas con vehículo y 0,66+/-0,03 en ratas
tratadas con Flavopiridol, una reducción del 38,9%. Estos efectos
fueron estadísticamente significativos en los dos puntos de tiempo
(P < 0,05).
Materiales - El Flavopiridol,
(L86-8275, (-)-cis
-5,7-dihidroxi-2-(2-clorofenil)-8-[4-(3-hidroxi-1-metil)piperidinil]
-4H-benzopiran-4-ona),
fue proporcionado por Hoechst Marion Roussel, Inc., y se disolvió
en dimetilsulfóxido como una solución madre de 50 mmol/L para
experimentos con cultivos celulares o en agua para experimentos
in vivo. El factor de crecimiento de fibroblastos básico
(bFGF) fue comprado a Collaborative Biochemical y la trombina a
Sigma. El inhibidor de MEK1, PD98059, se obtuvo de New England
Biolabs.
Cultivo de células - Los miocitos de
aortas humanas (HASMC) se obtuvieron de Clonetics y se cultivaron
como se ha descrito anteriormente ^{18}. Las células se
utilizaron en los pases 5-9. Antes de realizar los
experimentos, se paró el crecimiento celular a 80% de confluencia
durante 48 h con medio que contenía 0,2% de suero bovino fetal.
Proliferación celular ELISA - La
proliferación celular se midió por ELISA (Amersham Life Science).
Los HASMC se cultivaron en placas de 96 pocillos recubiertos de
gelatina y se hicieron estables. Las células se trataron con 10
ng/ml de bFGF, 2 U/ml de trombina, o vehículo durante 24 h. El
flavopiridol (75 nmol/L) se administró 1 h antes del tratamiento
con el factor de crecimiento. Se añadió
5-bromo-2'-desoxiuridina
(BrdU) a una concentración final de 10 \mumol/L durante las 2
últimas horas del tratamiento. La incorporación de BrdU se midió
como se ha descrito ^{19}. Los resultados se expresan como valor
medio \pm ETM para 12 muestras por condición a partir de dos
experimentos independientes.
Recuentos de células - Los HASMC cuyo
crecimiento se paró en 50% de confluencia en placas de 6 pocillos
se trataron con o sin flavopiridol (75 nmol/L) o bFGF (10 ng/ml). A
intervalos después del tratamiento, las células se tripsinaron y
se determinaron los números de células utilizando un
hemocitómetro.
Análisis por transferencia Western - Los
HASMC estables se trataron en presencia o ausencia de factores de
crecimiento y/o flavopiridol como se indica. El análisis por
transferencia Western se realizó como se ha descrito previamente
^{18}. Los anticuerpos primarios fueron: un anticuerpo policlonal
anti-ciclina D1 humana (M-20, Santa
Cruz), un anticuerpo monoclonal anti-antígeno
nuclear expresado en células humanas en proliferación (PC10,
Sigma), un anticuerpo monoclonal MAP-cinasa
(Erk1/Erk2) p44/42 fosfoespecífico (New England Biolabs), y un
anticuerpo monoclonal anti-Rb
(G3-245, Pharmigen), que reconoce a la especie Rb
fosforilada (pRb) y altamente fosforilada (ppRb). Para estudios de
inmunotransferencia, los experimentos se repitieron al menos tres
veces.
Actividad Cdk - Se trataron HASMC estables
con agonistas e inhibidores durante 24 h y se prepararon lisados
celulares totales como se describe para la transferencia Western.
El ensayo de cinasa se realizó con un kit de ensayo de histona
H_{1}-cinasa (Upstate Biotechnology) siguiendo las
instrucciones del fabricante. Dicho brevemente, se mezclaron en un
tubo de centrífuga 10 \mul de inhibidores peptídicos para la
proteína cinasa C (2 \mumol/L) y la proteína cinasa A (2
\mumol/L), 100 \mug de lisado de células, 10 \mul de tampón de
ensayo y 10 \mul de una mezcla que contenía 75 \mumol/L de
cloruro de magnesio, 500 \mumol/L de ATP y 1 \muCi/ml
[\gamma-^{32}P]ATP. Después de incubar a
30ºC durante 10 min, se pipetearon alícuotas sobre papeles de
fosfocelulosa. Los papeles se lavaron en ácido fosfórico al 0,75% y
seguidamente se midió la cantidad de cpm en un contador de
centelleo (Beckman). Los resultados se expresan como la media \pm
ETM para tres muestras y son representativos de tres experimentos
independientes.
Ensayo de cinasa en el gel - Se trataron
HASMC estables con factores de crecimiento durante 30 min y se
prepararon lisados celulares totales como se describe para la
transferencia Western. En algunos experimentos, los HASMC se
trataron previamente durante 60 min con 30 \mumol/L de PD98059,
flavopiridol, o vehículo. Se resolvieron cantidades iguales de
proteínas (50 \mug/calle) en un gel de poliacrilamida que se
copolimerizó con 350 \mug/ml de proteína básica de mielina. El
gel se trató con [\gamma-^{32}P]ATP y se
realizó una autorradiografía como está descrito ^{19}.
Exclusión del azul tripano - Se hicieron
crecer HASMC en placas de 5 cm hasta baja confluencia y se paró el
crecimiento como se ha descrito. Las células se trataron con
flavopiridol (75 nmol/L) o con factor de necrosis
tumoral-\Upsilon (TNF-\Upsilon;
50 ng/ml) el número indicado de veces. Tras la separación del
medio, se añadió azul tripano al 0,4% en solución salina tamponada
con fosfato a las placas. Después de 5 minutos, las células de las
placas se contaron al microscopio. Las células azules se contaron
como células no viables.
Modelo de daño en carótida de rata - El
daño en arteria carótida de la rata se hizo esencialmente como está
descrito ^{2}. Se anestesiaron machos adultos de ratas
Sprague-Dawley (400-500 g,
Zivic-Miller) con una inyección intraperitoneal de
cetamina (2 mg/ kg) y xilazina (4 mg/kg). Después se canuló la
carótida interna izquierda con un catéter de emoloctomía 2F. El
globo se infló con solución salina y se arrastró a través de la
arteria tres veces para provocarle daño distendiéndola y
desnudándola. La arteria carótida derecha no se dañó y sirvió como
control para cada animal. Inmediatamente después de recuperarse de
la anestesia y durante cuatro días más, se administró a las ratas
flavopiridol (5 mg/kg en agua) o agua por sonda gástrica siguiendo
un método ciego. Todas las ratas sobrevivieron a la cirugía y no
hubo signos manifiestos de toxicidad relacionada con la
administración del fármaco a las dosis utilizadas. En puntos
específicos de tiempo después del daño en la carótida, las ratas se
anestesiaron como antes y se perfundieron sistémicamente con 4% de
paraformaldehído en solución salina tamponada con fosfato. Se
extirparon las arterias carótidas izquierda y derecha y se
distendieron por inyección de paraformaldehído al 4% a través de la
luz, y seguidamente se deshidrataron y almacenaron en etanol al 70%
a 4ºC. La inmunohistoquímica se efectuó como se ha descrito
previamente^{18}, utilizando el anticuerpo monoclonal PCNA y el
anticuerpo policlonal anti-Cdk2 humana
(M2-G, Santa Cruz).
Análisis por imagen - Se separaron las
regiones distal y proximal extremas de cada arteria (aprox. 500
\mum). Se analizaron diez cortes intermedios de cada arteria (8
\mum cada uno) distanciados 500 \mum. Los cortes se fijaron y
tiñeron con hematoxilina y eosina como se ha descrito previamente
^{18}. Utilizando un microscopio Nikon Diaphot 300 y un objetivo
de 4 aumentos se capturó cada corte como una imagen digital
utilizando una videocámara Hamamatsu C5985 y TCPro 2.41 (Coreco,
Inc.). Se determinaron las áreas de la media y la neoíntima
utilizando el programa informático NIH Image. Los límites entre la
media y la neoíntima fueron determinados por un primer revisor del
corte (A.M) y verificado siguiendo un método ciego por un segundo
revisor (C. P.). El tamaño de la lesión se expresó como la relación
neoíntima/media. Los resultados para cada grupo se expresaron como
valor medio \pm ETM. En cada grupo eran interpretables 92% o más
de las imágenes; las restantes adolecían de artefactos de fijación
y no se analizaron.
Análisis estadístico - En los casos
adecuados, los resultados de los estudios cuantitativos se
expresaron como el valor medio \pm ETM. Para los grupos de
tratamiento múltiple, se aplicó un ANOVA factorial seguido por el
ensayo de diferencia significativa mínima de Fisher. El significado
estadístico fue aceptado a p < 0,05.
El flavopiridol inhibe la proliferación de
HASMC - Basándose en la capacidad del flavopiridol para inhibir
la proliferación de diversas líneas de células tumorales, se ensayó
la hipótesis de que su uso bloquearía el crecimiento de SMC humanos
de cultivos primarios. Los HASMC con su crecimiento parado se
trataron con el mitógeno bFGF (10 ng/ml) de SMC durante 24 h en
presencia de concentraciones crecientes de flavopiridol y se midió
la proliferación por un ensayo basado en ELISA. En comparación con
las células no tratadas, la proliferación de células tratadas con
bFGF creció 5,4 veces (Figura 1A). El pretratamiento durante 1 h
con tan sólo 50 nmol/L de flavopiridol disminuyó
significativamente la proliferación de HASMC (a 3,9 veces, p <
0,05), un efecto que fue casi máximo a concentraciones de 75
nmol/L. Se obtuvieron resultados similares utilizando la captación
de timidina como una medida independiente de síntesis de ADN (no
indicados).
Para ensayar la generalidad de los efectos del
flavopiridol sobre la proliferación de SMC, se examinó su efecto
sobre la mitogénesis incitada por trombina (2 U/ml), que actúa a
través de un receptor acoplado a las proteínas G, en comparación
con bFGF, que estimula a un miembro de la familia de las
tirosina-cinasas receptoras. El flavopiridol (75
nmol/L) inhibe de forma significativa y potente tanto la
proliferación de HASMC inducida por bFGF como la inducida por
trombina (5,4 veces frente a 1,8 veces y 2,4 veces frente a 0,7
veces, respectivamente, p < 0,05, Figura 1 B). Se realizaron
recuentos de células para confirmar que el efecto del flavopiridol
sobre la progresión del ciclo celular en HASMC realmente reflejaba
los cambios en la proliferación. bFGF (10 ng/ml) indujo un
incremento del triple en el número de células después de tres días
de tratamiento (Figura 2). De forma similar a lo que muestran los
resultados de los ensayos basados en ELISA, el flavopiridol (75
nmol/L) bloqueó eficientemente la proliferación inducida por
bFGF.
El flavopiridol inhibe la actividad Cdk y la
expresión génica relacionada con el ciclo celular en HASMC -
Para evaluar el efecto específico del flavopiridol sobre la
maquinaria del ciclo celular, se mido la actividad de histona
H1-cinasa en lisados celulares de HASMC estimulados
con factor de crecimiento. La fosforilación de histona H1 refleja
las actividades de Cdc_{2} y Cdk_{2}^{20}. El tratamiento de
HASMC con bFGF y trombina dio como resultado incrementos de 4,4 y
3,6 veces, respectivamente, en la actividad de histona
H1-cinasa (Figura 3). Estos incrementos en la
actividad de cinasa dependiente de ciclina fueron bloqueados
íntegramente por pretratamiento con flavopiridol (75 nmol/L).
También se utilizó el análisis por transferencia
Western para ver si el flavopiridol influía en la regulación
inducida por factor de crecimiento de las proteínas relacionadas
con el ciclo celular en HASMC. La ciclina D_{1} es una ciclina en
fase G_{1} que es regulada en ascenso por estimulación del factor
de crecimiento y es degradada rápidamente durante su privación en el
ciclo celular^{21}. Los niveles de proteína ciclina D1 son
regulados en ascenso 6,3 veces y 3,2 veces, respectivamente, en
respuesta al tratamiento con bFGF y trombina durante 24 h (Figura
4), un efecto que podría ser bloqueado completamente por
pretratamiento con flavopiridol. De modo similar, el aumento en la
expresión de PCNA, que se sintetiza predominantemente durante la
fase S conjuntamente con el ADN de replicación ^{22}, también fue
bloqueada por el pretratamiento con flavopiridol. Como medida final
de las proteínas relacionadas con el ciclo celular, se examinó la
fosforilación de Rb en respuesta a la expresión del factor de
crecimiento utilizando un anticuerpo que reconoce Rb fosforilado.
Rb es un regulador del ciclo celular que se une al factor E2F
inactivándolo cuando Rb está en el estado no fosforilado ^{23} y
que induce la parada in vivo del crecimiento de SMC^{11}.
La fosforilación inactiva Rb y permite que transcurra la progresión
a través de la fase S. El análisis de la fosforilación de Rb es
particularmente relevante ya que Rb es una diana para Cdk_{2} y
Cdk_{4} in vivo. Tanto la trombina como el bFGF indujeron
la hiperfosforilación de Rb, un efecto que fue inhibido por
flavopiridol. Tomados juntos, estos resultados indican que el
flavopiridol influye en la expresión y actividad de los elementos
de control del ciclo celular relacionados con las fases G_{1} y S
en HASMC en asociación con sus efectos inhibidores del
crecimiento.
El flavopiridol no tiene ningún efecto sobre
la actividad o fosforilación de MAP-cinasa -
Para garantizar que el flavopiridol estaba actuando específicamente
a nivel del ciclo celular, en vez de hacerlo inespecíficamente
sobre rutas de cinasas curso arriba, se ha medido la fosforilación y
la actividad de Erkl (p44 MAP cinasa) y Erk2 (p42 MAP cinasa), dos
miembros de la familia de las MAP-cinasas. Se han
elegido estas cinasas porque están inmediatamente curso arriba de
episodios transcripcionales que ocurren en respuesta a estímulos de
crecimiento y curso abajo de diversas rutas señalizadoras
mitogénicas críticas ^{24}. Una respuesta intacta de
MAP-cinasas indica que las rutas mitogénicas curso
arriba están intactas también. Se ha medido el estado de
fosforilación de Erkl y Erk2 con un anticuerpo monoclonal que
reconoce específicamente las formas fosforiladas y, por tanto,
activadas. Como control en estos experimentos, se ha utilizado
PD98059, un inhibidor potente y selectivo de la activación de MAP
cinasa ^{25}. Se detectó un incremento en la cantidad de Erkl y
Erk2 después del tratamiento de HASMC con trombina y bFGF durante
30 min, en comparación con las células no tratadas (Figura 5,
panel superior). La fosforilación de Erkl y Erk2 tanto por
trombina como por bFGF se bloqueó por tratamiento con PD98059, pero
no con flavopiridol. Para confirmar estos hallazgos, se midió la
actividad de Erkl y Erk2 por un ensayo de cinasa en el gel (Figura
5, panel inferior). De nuevo, se encontró que las
actividades de Erk1 y Erk2 crecieron en respuesta a trombina y
bFGF, un efecto que era inhibible por PD98059 pero no por
flavopiridol. Estos experimentos, conjuntamente con los presentados
en las Figuras 3 y 4, aportan pruebas de que los efectos del
flavopiridol sobre la proliferación de HASCM son debidos a una
parada específica de la maquinaria del ciclo celular al bloquear la
actividad Cdk sin afectar a los episodios señalizadores curso
arriba.
El flavopiridol no disminuye la viabilidad de
HASMC - Informes previos de actividad de flavopiridol en otros
tipos de células han demostrado que, dependiendo de la línea
celular, el flavopiridol puede o bien inducir la parada del
crecimiento sin afectar a la viabilidad, o producir apoptosis
^{16,26-29}. Por lo tanto, se estimó si el
flavopiridol disminuía la viabilidad de HASMC midiendo la exclusión
del azul tripano en diversos puntos de tiempo después del
tratamiento. HASMC estables fueron tratados con flavopiridol (75
nmol/L), vehículo o TNF-\Upsilon (50 ng/mi), una
citocina que se sabe que induce apoptosis en este tipo de células
^{30}. Si bien TNF-\Upsilon disminuye
potentemente la viabilidad de HASMC, dando como resultado la muerte
de prácticamente todas las células tratadas durante 24 h, el
flavopiridol no tuvo ese efecto (Figura 6). Se ha observado que con
concentraciones más altas e incubaciones más prolongadas, pueden
ocurrir algunos descensos de viabilidad en presencia de
flavopiridol (no mostrado). Sin embargo, en las condiciones
ensayadas, el flavopiridol induce principalmente la parada del
crecimiento, sin afectar a la viabilidad de SMC.
Flavopiridol inhibe la proliferación de
miocitos lisos y la formación de neoíntima in vivo en un
modelo de daño vascular en carótida de rata - Se utilizó el
modelo bien conocido de daño en carótida de rata, en el que la
formación de una lesión en la neoíntima después del daño inducido
con un catéter es críticamente dependiente de la proliferación de
SMC ^{2, \ 3}, para examinar si el flavopiridol induce parada del
crecimiento de SMC in vivo, igual que lo hace in
vitro. Se administró flavopiridol oralmente a una dosis de 5
mg/kg una vez al día, empezando el día del daño y durante cuatro
días después, ya que este período de tiempo abarca la inducción
inicial de Cdk2 y la primera onda de proliferación de SMC en este
modelo ^{31},^{32}. Se cuantificaron las áreas promediadas de
la íntima y de la media 7 y 14 días después del daño, y el tamaño
de la lesión en la neoíntima se expresó como la relación del área de
la neoíntima al área de la media. Tanto el grupo tratado como el no
tratado estaba compuesto por doce animales. La relación
neoíntima/media en 7 días fue 1,00 \pm 0,05 en arterias de ratas
tratadas con vehículo y 0,65 \pm 0,04 en arterias de ratas
tratadas con flavopiridol, una reducción del 35,0%. (Figura 7). La
relación neoíntima/media en 14 días fue 1,08 \pm 0,04 en ratas
tratadas con vehículo y 0.66 \pm 0,03 en ratas tratadas con
Flavopiridol, una reducción del 38,9%. Estos efectos fueron
estadísticamente significativos en los dos puntos de tiempo (P <
0,05). En la Figura 8 se muestran cortes arteriales
representativos.
Con el fin de demostrar directamente que
el flavopiridol inhibe la proliferación de miocitos lisos, se
tiñeron cortes para la expresión de PCNA en campos representativos
de cada arteria y se determinó el porcentaje de núcleos positivos
en PCNA en la neoíntima. En 7 días, 31,1 \pm 7,2% de núcleos en
arterias dañadas de las ratas no tratadas fueron positivos en PCNA,
mientras que sólo 11,8 \pm 1,5% de arterias dañadas en ratas
tratadas con flavopiridol fueron positivos en PCNA (Figura 7 p <
0,05). En 14 días, estaban presentes núcleos positivos en PCNA en
10,4 \pm 2,0% de células neoíntimas de arterias de rata dañadas
tratadas, pero sólo en 2 \pm 0,5% de células neoíntimas de
arterias de rata dañadas sin tratar (p < 0,05). (Raramente se
veían núcleos positivos en PCNA en arterias sin dañar
independientemente del tratamiento). De modo similar, las células
positivas en Cdk_{2} eran mucho menos comunes en la neoíntima de
ratas tratadas con flavopiridol (Figura 9, paneles A y C),
comparadas con arterias de ratas sin tratar (paneles B y D), tanto 7
como 14 días después del daño.
En el presente estudio, se ha examinado si el
nuevo inhibidor de Cdk, flavopiridol, el inhibidor más potente y
específico de Cdks que se conoce, es un candidato adecuado para
inhibir la proliferación de SMC in vivo, particularmente en
el marco del daño vascular. Los intentos previos de acceder
terapéuticamente a la maquinaria del ciclo celular para el
tratamiento de la enfermedad vascular han aportado un fundamento
para los presentes estudios ^{9-12}; sin embargo,
los métodos empleados para este fin se han basado en tecnologías
de transferencia de genes para inhibir la progresión del ciclo
celular. Actualmente hay grandes obstáculos que impiden la
aplicación clínica de estas
técnicas ^{33}. Durante el curso de los presentes estudios, se informó que CVT-313, un compuesto identificado recientemente que también tiene propiedades inhibidoras de Cdk pero a concentraciones micromolares, puede inhibir también la formación de neoíntima; sin embargo, se requería que CVT-313 fuera instilado en la arteria carótida en el momento del daño para producir este efecto ^{34}. En cambio, aquí se demuestra que el flavopiridinol, cuando se administra oralmente, puede inhibir potentemente la formación de neoíntima, en un grado comparable con otros agentes clínicamente
relevantes ^{11, \ 35, \ 36}. La actividad oral del flavopiridol lo hace virtualmente único entre los agentes que, a ciencia cierta, son activos en modelos animales de daño vascular. Su selectividad, potencia y facilidad de administración hacen del flavopiridol un excelente candidato para examinar los beneficios terapéuticos de la inhibición in vivo del ciclo celular en lesiones vasculares humanas.
técnicas ^{33}. Durante el curso de los presentes estudios, se informó que CVT-313, un compuesto identificado recientemente que también tiene propiedades inhibidoras de Cdk pero a concentraciones micromolares, puede inhibir también la formación de neoíntima; sin embargo, se requería que CVT-313 fuera instilado en la arteria carótida en el momento del daño para producir este efecto ^{34}. En cambio, aquí se demuestra que el flavopiridinol, cuando se administra oralmente, puede inhibir potentemente la formación de neoíntima, en un grado comparable con otros agentes clínicamente
relevantes ^{11, \ 35, \ 36}. La actividad oral del flavopiridol lo hace virtualmente único entre los agentes que, a ciencia cierta, son activos en modelos animales de daño vascular. Su selectividad, potencia y facilidad de administración hacen del flavopiridol un excelente candidato para examinar los beneficios terapéuticos de la inhibición in vivo del ciclo celular en lesiones vasculares humanas.
Según esta invención se elige administrar
flavopiridol oralmente en una concentración (5 mg/kg) que es la
mitad de la que inhibe el crecimiento tumoral en un modelo de
xenoinjerto en ratones desprovistos de sistema inmune ^{27}. Es
notable que concentraciones de flavopiridol de 75 nmol/L den como
resultado la inhibición casi completa de la proliferación de SMC en
estos estudios, si bien se obtuvo una mediana de concentraciones en
suero de 425 nmol/L a dosis inferiores al umbral tóxico en estudios
humanos en Fase 1 de carcinoma resistente al tratamiento ^{17}.
Los resultados aquí expresados sugieren que dosis mucho más bajas
de inhibidores del ciclo celular que las utilizadas para tratar
neoplasias pueden ser eficaces en el marco de las enfermedades
vasculares tales como restenosis, con el consiguiente beneficio de
tolerabilidad incrementada.
Aunque ahora se haya demostrado que el
flavopiridol induce parada del crecimiento sin afectar a la
viabilidad de HASCM en cultivo, y se haya demostrado la disminución
de la formación de neoíntima después del tratamiento con
flavopiridol in vivo, no se puede garantizar que la parada
del ciclo celular sea el único factor que reduce la formación de
neoíntima en lesiones de carótida. El flavopiridol puede inducir
parada del crecimiento induciendo o sin inducir apoptosis,
dependiendo del tipo de célula observado^{29}. Es interesante que
el flavopiridol inhibe la apoptosis en células PC12 que han sido
finalmente diferenciadas, y sin embargo induce apoptosis en células
PC12 no diferenciadas que están proliferando^{28}. Aunque los
experimentos in vitro han sido llevados a cabo en
condiciones que simularían el fenotipo de SMC antes del daño, es
posible que SMC puedan responder de forma diferente al flavopiridol
después del daño y puedan incluso experimentar apoptosis. Si bien
el papel de la apoptosis en lesiones vasculares no está claro, la
expresión del ligando Fas en SMC induce apoptosis y bloquea la
formación de neoíntima en conejos tras un daño por un globo^{37},
lo que sugiere que si el flavopiridol induce realmente la apoptosis
de SMC in vivo, como lo hace sobre células PC12
proliferantes, esto puede ser un fenómeno saludable en el contexto
de la formación de neoíntima. Otros mecanismos también pueden
contribuir a los efectos del flavopiridol sobre la formación de
lesiones. Por ejemplo, la inhibición del ciclo celular mediada por
oligodesoxinucleotidos mejora la función endotelial en injertos de
vena de conejo^{38}. Se precisarán estudios adicionales para
abordar otros mecanismos de los efectos del flavopiridol sobre SMC
in vivo, distintos de la parada del crecimiento. Dado el
papel demostrado de la proliferación de SMC en la formación de
lesiones después del daño en carótida de rata ^{2, \ 3}, es
interesante destacar que, a pesar de los profundos efectos del
flavopiridol in vitro, su capacidad de inhibir la formación
de neoíntima (aun siendo significativos) eran más modestos en las
condiciones de los experimentos in vivo. Se han considerado
varias explicaciones para esta observación. Es improbable que
ocurra una proliferación acelerada de SMC después del cese de
flavopiridol ya que las diferencias en los índices de proliferación
se mantienen hasta 14 días después del daño (Figuras 7 y 9). Es más
plausible o bien que otros componentes de formación de lesiones,
tales como la migración de SMC y la producción de matriz
extracelular, contribuyan todavía a la formación de lesiones,
incluso en ausencia de proliferación significativa de SMC, o que la
administración de flavopiridol una vez al día sea insuficiente para
parar la proliferación por completo en este modelo. Los datos
recientes que indican que la semivida biológica del flavopiridol es
de tan sólo 2,5 h sugieren que esta última hipótesis puede ser
correcta; estudios adicionales pueden ser capaces de identificar un
régimen de dosificación aún más eficaz ^{39}.
Estos resultados indican que el flavopiridol
puede inhibir la proliferación de SMC y, por tanto, la formación de
neoíntima en un modelo de enfermedad vascular en animales pequeños,
bien aceptado. Se debe indicar que la relevancia de la inhibición
de la proliferación de SMC es controvertible en lesiones vasculares
humanas, y puede diferir dependiendo de la naturaleza de la lesión y
del momento en el que se hacen observaciones de la proliferación.
El índice proliferativo de SMC en muestras de aterectomía es
marcadamente bajo^{40}, aunque es posible que estas muestras no
reflejen los cambios proliferativos en etapas anteriores, más
críticas, en el desarrollo de lesiones. Además, la remodelación
arterial independiente del crecimiento de la neoíntima puede ser
responsable de una proporción significativa de obstrucción luminal
después de realizar una angioplastia en seres humanos ^{41}. En
cambio, los índices de actividad mitótica en SCM son mucho más
altos (25% positivos en PCNA) en muestras de aterectomía de
lesiones humanas con restenosis en la endoprótesis vascular, lo que
concuerda con el papel establecido de la hiperplasia de SMC, pero
sin remodelación, en este proceso ^{4}. A medida que aumenten las
colocaciones de endoprótesis vasculares y los problemas clínicos de
la restenosis en las endoprótesis, aumentará la necesidad de un
medio eficaz para parar la hiperplasia de SMC y la formación de
neoíntima. Como el flavopiridol es un potente fármaco, disponible
para administrar por vía oral, con actividad inhibidora de Cdk
específica, y como las dosis seguras de flavopiridol son conocidas
para los seres humanos, el flavopiridol puede considerarse como un
candidato farmacológico para la prevención de restenosis en las
endoprótesis vasculares en los seres humanos.
Usando miocitos lisos aórticos humanos
cultivados, se ha encontrado que el flavopiridol a concentraciones
de tan sólo 75 nmol/L ha dado como resultado una inhibición casi
completa de la proliferación inducida por factor de crecimiento de
fibroblastos básico y por trombina. A esta dosis, el flavopiridol
inhibió la actividad de cinasa dependiente de ciclina, medida por
la fosforilación de histona H_{1}, pero no tuvo ningún efecto
sobre la activación de MAP cinasa. La inducción de las proteínas
relacionadas con el ciclo celular ciclina D_{1}, antígeno nuclear
de células en proliferación y proteína de retinoblastoma
fosforilada también fue bloqueada por flavopiridol. El flavopiridol
no tuvo efecto sobre la viabilidad celular. Para ensayar si el
flavopiridol tenía una actividad similar in vivo cuando se
administraba oralmente, se examinó la formación de neoíntima en
arterias carótidas de rata después de la lesión con globo. El
flavopiridol (5 mg/kg) administrado por sonda gástrica redujo el
área de neoíntima en un 35% y un 39% a los 7 y 14 días,
respectivamente, después del daño.
El flavopiridol inhibe el crecimiento de SMC
in vitro e in vivo. Su disponibilidad oral y su
selectividad hacia cinasas dependientes de ciclina lo convierten en
una herramienta terapéutica potencial en el tratamiento de lesiones
vasculares ricas en SMC.
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Claims (7)
1. El uso de un compuesto de fórmula I
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
donde
R_{1} es hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de
carbono,
aril-alquiloC_{1}-C_{4};
alquiloC_{1}-C_{6} sustituido con halógeno,
hidroxi o carboxi; cicloalquiloC_{3}-C_{6},
piridilo, tienilo,
cicloalquilC_{3}-C_{6}-alquiloC_{1}-C_{4},
alquenilo C_{2}-C_{6}, alquinilo
C_{2}-C_{6}, fenilo; fenilo, mono- o
polisustituido con halógeno,
alquiloC_{1}-C_{4},
alcoxiC_{1}-C_{4}, hidroxi, carboxi,
COO-alquilo, CONH_{2},
CONH-alquilo, CON(alquilo)_{2},
nitro, trifluorometilo, amino,
alquilC_{1}-C_{4}-amino,
di-alquilC_{1}-C_{4}-amino,
o fenilo; naftilo, carboxilo, -CHO,
COO-alquiloC_{1}-C_{4}, un amino
primario, alquilamino, aralquilamino, dialquilamino, amido,
arilamino, diarilamino, o -CH_{2}O-alquilo
C_{1}-C_{4};
R_{2} es hidrógeno, alquilo con 1 a 6 átomos de
carbono, arilo, nitro, amino,
di-alquilC_{1}-C_{4}-amino,
un halógeno, hidroxi, alcoxi, -COOH,
-COO-alquiloC_{1}-C_{4}, -CHO,
-CH_{2}OH o
-CH_{2}O-alquiloC_{1}-C_{4};
R_{3} es hidrógeno,
alquiloC_{1}-C_{4};
alquiloC_{1}-C_{4} sustituido con halógeno,
hidroxi o carboxi; hidroxi, carboxi, nitro, amino,
alquilC_{1}-C_{4}-amino,
di-alquilC_{1}-C_{4}-amino,
halógeno,
-O-alquil-C(O)-alquilo,
-CHO, -CH_{2}OH,
-CH_{2}O-alquiloC_{1}-C_{4} o
R_{2}N-C(O)-O-, donde R es
H, alquiloC_{1}-C_{6}, cicloalquilo; u
-O-alquil-C(O)-alquilo
o arilo;
R_{4} es hidrógeno, hidroxi;
alcoxiC_{1}-C_{4},
alcanoilC_{1}-C_{4-}oxy,
alcoxiC_{1}-C_{4}-carbonilo,
ariloxi, amino,
alquilC_{1}-C_{4}-amino,
di-alquilC_{1}-C_{4-}amino, o
R'_{2}-N-C(O)-O-
donde R' es H, alquiloC_{1}-C_{6}, cicloalquilo
o arilo;
R_{5} es hidrógeno,
alquiloC_{1}-C_{6},
aril-alquiloC_{1}-C_{4},
cicloalquiloC_{3}-C_{6},
cicloalquilC_{3}-C_{6}-alquiloC_{1}-C_{4},
alquilamino, alcanoíloC_{1}-C_{4},
-C(O)-O-alquiloC_{1}-C_{4}
o aroílo, donde el grupo arilo en R_{1}, R_{2}, R_{3},
R_{4}, y R_{5} es fenilo sin sustituir o fenilo que está mono o
polisustituido con halógeno,
alquiloC_{1}-C_{4},
alcoxiC_{1}-C_{4}, hidroxi, carboxi,
COO-alquilo, CONH_{2},
CONH-alquilo, CON(alquilo)_{2},
nitro, trifluorometilo, amino,
alquilC_{1}-C_{4}-amino,
di-alquilC_{1}-C_{4}-amino
o fenilo; m es un número entero entre 0 y 3 y n es 1,
o una de sus sales de adición de ácido
farmacológicamente aceptables para la producción de un producto
farmacéutico para la inhibición de la proliferación de músculo
liso, donde la dosificación del compuesto de fórmula 1 es menos del
70%, preferiblemente menos del 60%, en particular menos del 50% de
la dosificación que sería necesaria para controlar el crecimiento
celular.
2. El uso de la reivindicación 1, en donde el
compuesto es un compuesto de fórmula Ia
en la que R_{1} es hidrógeno,
alquiloC_{1}-C_{3}, naftilo, fenilo; fenilo,
mono- o polisustituido con halógeno,
alquiloC_{1}-C_{4},
alcoxiC_{1}-C_{4}, hidroxi, carboxi,
COO-alquilo, CONH_{2},
CONH-alquilo, CON(alquilo)_{2},
nitro, trifluorometilo, amino,
alquilC_{1}-C_{4}-amino,
di-alquilC_{1}-C_{4}-amino,
o fenilo; piridilo o
tienilo;
R_{2} es hidrógeno o
alquiloC_{1}-C_{3};
R_{5} es
cicloalquiloC_{1}-C_{3},
cicloalquiloC_{3}-C_{5}, o
cicloalquilC_{3}-C_{5}-alquiloC_{1}-C_{4}.
3. El uso de la reivindicación 2, donde los
sustituyentes en la fórmula Ia tienen los significados
siguientes:
R_{1} es fenilo, tienilo, piridilo,
clorofenilo, diclorofenilo, metilfenilo, aminofenilo, bromofenilo,
hidroxifenilo o naftilo;
R_{2} es hidrógeno y
R_{5} es metilo.
4. El uso de la reivindicación 1, donde el
compuesto es
(-)-cis-5,7-dihidroxi-2-(2-clorofenil)-8-[4-(3-hidroxi-metil)-piperidinil]
-4H-benzopiran-4-ona
(Flavopiridol).
5. El uso según una o más de las reivindicaciones
1-4, donde el producto farmacéutico es para el
tratamiento de lesiones vasculares ricas en miocitos lisos.
6. El uso según una o más de las reivindicaciones
1-4, donde el producto farmacéutico es para el
tratamiento de lesiones después del daño producido con un
globo.
7. El uso según una o más de las reivindicaciones
1-4, donde el producto farmacéutico es para el
tratamiento de pacientes después de la implantación de una
endoprótesis vascular.
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