PL197693B1 - Zastosowanie pochodnych 4-H-1 benzopiran-4-onu - Google Patents

Abstract

1. Zastosowanie pochodnych 4-H-1-benzopiran-4-onu o wzorze I Wzór I w którym R 1 oznacza wodór, alkil zawieraj acy 1 do 6 atomów w egla, arylo-C 1 -C 4 -alkil; C 1 -C 6 -alkil podstawiony przez halogen, hydroksyl lub karboksyl; C 3 -C 6 -cykloalkil, pirydyl, tienyl, C 3 -C 6 - cykloalkilo-C 1 -C 4 -alkil, C 2 -C 6 -alkenyl, C 2 -C 6 -alkinyl, fenyl; fenyl mono- lub wielopodstawiony przez halogen, C 1 -C 4 -alkil, C 1 -C 4 -alkoksyl, hydroksyl, karboksyl, COO-alkil, CONH 2 , CONH-alkil, CON(alkil) 2 , grup e nitrow a, trifluorometyl, grup e aminow a, grup e C 1 -C 4 -alkiloaminow a di-C 1 -C 4 -alkiloaminow a lub fenyl; naftyl, kar- boksyl, -CHO, COO-C 1 -C 4 -alkil, pierwszorz edow a grup e aminow a, grup e alkiloaminow a, aralkiloaminow a, dialki- loaminow a, amidow a, aryloaminow a, diaryloaminow a lub -CH 2 O-C 1 -C 4 -alkil; R 2 oznacza wodór, alkil zawieraj acy 1 do 6 atomów w egla, aryl, grup e nitrow a, grup e aminow a, di-C 1 -C 4 - -alkiloaminow a, halogen, hydroksyl, alkoksyl, -COOH, -COO-C 1 -C 4 -alkil, -CHO, -CH 2 OH lub -CH 2 O-C 1 -C 4 -alkil; R 3 oznacza wodór, C 1 -C 4 -alkil, C 1 -C 4 -alkil podstawiony przez halogen, hydroksyl lub karboksyl;………… PL PL PL PL PL PL PL

Description

(12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) 197693 (21) Numer zgłoszenia: 350735 ^¹³^ ⁽22) D^at^{a zg}ł^oszeni^a: 18.01.2000 ⁽⁵⁾ )^lntCL

A61K 31/453 (2006.01) (86) Date ⁱ numer z^głoszema m^iędz^ynaro^dowe^go: A⁶61f³^/10(⁰⁰⁶^.0⁾)

18.01.2000, PCT/US00/01104 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

03.08.2000, WO00/44362 PCT Gazette nr 31/00 (54)

Zastosowanie pochodnych 4-H-1-benzopiran-4-onu

	(73) Uprawniony z patentu:
(30) Pierwszeństwo:	AVENTIS PHARMACEUTICALS INC., Bridgewater,US
01.02.1999,US,09/243,380	BOARD OF REGENTS, UNIVERSITY OF
21.12.1999,US,09/468,665	TEXAS SYSTEM,Austin,US
(43) Zgłoszenie ogłoszono:	(72) Twórca(y) wynalazku:
27.01.2003 BUP 02/03	Winston Campbell Patterson,Galveston,US Jennifer A. Dumont,Groton,US
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.04.2008 WUP 04/08	(74) Pełnomocnik: Gugała Barbara, PATPOL Sp. z o.o.

(57) 1 .Zastosowanie pochodnych 4-H-1-benzopiran-4-onuowzorze I

Wzór I w którym

R1 oznacza wodór, alkil zawierający 1 do 6 atomów węgla, arylo-C1-C4-alkil; C1-C6-alkil podstawiony przez halogen, hydroksyl lub karboksyl; C3-C6-cykloalkil, pirydyl, tienyl,

C3-C6- cykloalkilo-C1-C4-alkil, C2-C6-alkenyl, C2-C6-alkinyl, fenyl; fenyl mono- lub wielopodstawiony przez halogen, C1-C4-alkil, C_rC4-alkoksyl, hydroksyl, karboksyl, COO-alkil, CONH2, CONH-alkil, CON(alkil)2, grupę nitrową, trifluorometyl, grupę aminową, grupę C1-C4-alkiloaminową di-C1-C4-alkiloaminową lub fenyl; naftyl, karboksyl, -CHO, COO-C1-C4-alkil, pierwszorzędową grupę aminową, grupę alkiloaminową, aralkiloaminową, dialkiloaminową, amidową, aryloaminową, diaryloaminową lub -CH2O-C1-C4-alkil;

R2 oznacza wodór, alkil zawierający 1 do 6 atomów węgla, aryl, grupę nitrową, grupę aminową, di-C1-C4-alkiloaminową, halogen, hydroksyl, alkoksyl, -COOH, -COO-C1-C4-alkil, -ChO, -CH2OH lub -CH2O-C1-C4-alkil;

R3 oznacza wodór, Ci-Cą-alkil, Ci-Cą-alkil podstawiony przez halogen, hydroksyl lub karboksyl;............

PL 197 693 B1

Opis wynalazku

Zakres wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy zastosowania pochodnych 4-H-1-benzopiran-4-onu do wytwarzania środka farmaceutycznego do hamowania proliferacji komórek mięśni gładkich (SMC).

Podstawa wynalazku

Komórkowe odpowiedzi na uszkodzenie naczyń - zaburzenie funkcjonowania komórkowego, aktywacja, różnicowanie i migracja - kumulują się w takich stanach klinicznych jak restenoza występująca po angioplastyce balonowej i założeniu stentu w leczeniu choroby miażdżycy u ludzi¹. Proliferacja komórek mięśni gładkich jest częstą i występującą we wszystkich przypadkach cechą modeli uszkodzeń naczyniowych i SMC są głównym składnikiem komórkowym uszkodzeń nowotworzenia śródbłonkowego^2,3.Ponowne zainteresowanie hamowaniem proliferacji SMC towarzyszy zwiększonemu stosowaniu stentów (protez wewnątrznaczyniowych) w leczeniu choroby wieńcowej, ponieważ restenoza wewnątrz stentu jest niemal całkowicie zależna od nowotworzenia śródbłonkowego i przerostu SMC⁴. Jak to zostało ocenione tylko w roku 1997 ok. 100 000 pacjentów z restenozą w stencie wymagało leczenia⁵; tak więc łatwy w podawaniu skuteczny inhibitor przerostu SMC mógłby mieć głębokie uzasadnienie kliniczne i ekonomiczne⁶.

Udowodniono, że usiłowanie zahamowania proliferacji SMC w modelach uszkodzeń naczyniowych, zarówno przez wpływanie na mediatory komórkowe odpowiedzi proliferacyjnej, jak i przez bezpośrednią ingerencję w mechanizm cyklu komórkowego jest istotnym podejściem do nowotworzenia śródbłonkowego. Postęp cyklu komórkowego jest ściśle kontrolowanym dodatnio zjawiskiem przez kinazy zależne od cykliny (Cdk) i ich podjednostki regulacyjne cykliny⁷, a ujemnie przez inhibitory Cdk i geny supresorowe nowotworu takie jak białko retinoblastomy (Rb) i p53⁸. Nadekspresja, w której pośredniczą endogenne inhibitory Cdk p21 i p27^kip1 albo konstytutywnie aktywne postaci Rb blokują nowotworzenie śródbłonkowego w szczurzym modelu uszkodzenia tętnicy szyjnej⁹”; podobnie zahamowanie aktywności czynnika transkrypcyjnego E2F przez kompetycyjne nadekspresjonowane miejsca wiążące pokrewne DNA również hamują proliferację SMC i nowotworzenie śródbłonkowe^. Takie badania potwierdzają ogólną hipotezę, że zahamowanie cyklu komórkowego jest atrakcyjnym celem ingerencji w tworzenie uszkodzeń naczyniowych.

Pomimo, że interwencje genetyczne pomagają w rozbiciu mechanizmów regulujących nowotworzenie śródbłonkowe są niestety obecnie przydatne klinicznie w leczeniu chorób naczyniowych u ludzi. Rozpuszczalne w wodzie, czynniki o małym ciężarze cząsteczkowym o swoistych oddziaływaniach na cykl komórkowy, szczególnie te wykazujące aktywność przy podawaniu doustnym będą miały szerokie zastosowanie zarówno doświadczalnie, jak i w przyszłości kliniczne. Ostatnio zidentyfikowany flawon, flawopirydol jest inhibitorem Cdk silnie blokującym aktywność Cdk2, Cdc2 i Cdk413”6. W przeciwieństwie do innych farmakologiczne inhibitory Cdk, flawopirydol jest znany ze swej specyficzności kinazowej, dostępności po podaniu doustnym i jego siły działania w nanomolarnych stężeniach^. Te unikalne cechy powodują korzystny profil objawów ubocznych, który doprowadził do badania flawopirydolu w badaniach klinicznych I fazy w leczeniu nawracających nowotworów 7 Znając te właściwości, badano zdolność flawopirydolu do hamowania proliferacji SMC in vitro i po uszkodzeniu przez balon w szczurzej tętnicy szyjnej. Wykazano, że flawopirydol jest silnym i wybiórczym inhibitorem postępu cyklu komórkowego i, że hamuje proliferację SMC zarówno in vitro, jak i in vivo; ponadto nowotworzenie śródbłonkowe jest skutecznie blokowane przez takie doustne dawki flawopirydolu, które są niższe niż te znane ze swego toksycznego wpływu na ludzi. Z publikacji W09716447 i WO 9813344 znane jest zastosowanie pochodnych 4-H-1-benzopiran-4-onu do leczenia chorób związanych z nadmierną lub nieprawidłową proliferacją komórek. W publikacji WO 9716447 wskazano, że substancję leczniczą stosuje się na ogół w ilości 0,0001 do 100 mg/kg ciała pacjenta, na dzień. Wiadomo również, że pochodne 4-H-1-benzopiran-4-onu są przydatne w kontrolowaniu nowotworów. Jednakże nieoczekiwanie stwierdzono, że pochodne 4-H-1-benzopiran-4-onu stosowane według niniejszego wynalazku skutecznie działają jako inhibitory proliferacji SMC przy poziomach dawkowania, które były stosowane w kontrolowaniu wzrostu nowotworu, przy czym wskazania terapeutyczne jak również dawki substancji leczniczych w odniesieniu do tych zastosowań są dla związków stosowanych według wynalazku zupełnie różne od tych wskazanych w w/w publikacjach.

Zgodnie z tym, celem niniejszego wynalazku jest zastosowanie pochodnych 4-H-1-benzopiran-4-onu do wytwarzania środka farmaceutycznego do hamowania proliferacji komórek mięśni gładkich, przy poziomie dawkowania znacznie niższym niż stosuje się do kontrolowania wzrostu guza.

PL 197 693 B1

Figura 1

Wpływ flawopirydolu na syntezę HASMC DNA

A. Spoczynkowe HASMC leczono przy braku (-) lub w obecności (+) bFGF (10 ng/ml) i z wskazanymi stężeniami flawopirydolu (nmol/ml) przez 24 godz. Włączanie BrdU jako znacznika proliferacji określano testem opartym na teście ELISA i wyrażano jako procent włączania pod nieobecność leczenia b-FGF. *p<0,05 w porównaniu do komórek nieleczonych. f p<0,05 w porównaniu do leczenia bFGF przy braku flawopirydolu. B. HASMC traktowano bFGF (10 ng/ml), trombiną (2U/ml) albo nośnikiem w obecności albo przy braku flawopirydolu (75 nmol/L) i mierzono włączanie BrdU. *p<0,05 w porównaniu do komórek nieleczonych. **p<0,05 w porównaniu do leczenia samym bFGF. f p<0,05 w porównaniu do leczenia samą trombiną.

Figura 2

Wpływ flawopirydolu na proliferację HASMC

Spoczynkowe HASMC leczono samym bFGF (10 ng/ml)(D), bFGF i flawopirydolem (75 nmol/L)(D), albo nośnikiem (□) przez wskazany czas i oceniano liczby komórek po leczeniu. Wyniki pokazano jako ilości komórek na studzienkę (x10³).

Figura 3

Wpływ flawopirydolu na aktywność zależnej od cykliny kinazy na HASMC

Spoczynkowe HASMC leczono bFGF (10 ng/ml), trombiną (2 U/ml), albo nośnikiem w obecności i przy braku flawopirydolu (75 nmol/L) i liczono fosforylację histonów H1 jako znacznika aktywności Cdk i wyrażano to jako procent aktywności Cdk przy braku leczenia bFGF. *p<0,05 w porównaniu do komórek nieleczonych. **p<0,05 w porównaniu do leczenia samym bFGF. f p<0,05 w porównaniu do leczenia sama trombiną.

Figura 4

Regulacja komórkowych białek cyklozależnych przez flawopirydol

Spoczynkowe HASMC leczono przy braku (-) lub w obecności (+) bFGF (10 ng/ml), trombiną (2 U/ml), i/lub flawopirydolem (75 nmol/L) przez 24 godziny. Przeprowadzono test immunoblot lizatów komórkowych ze swoistymi przeciwciałami rozpoznającymi cyklinę D1 (górny panel), PCNA (środkowy panel) i fosforylowane (pRb) i hiperfosforylowane (ppRb) Rb (najniższy panel).

Figura 5

Wpływ flawopirydolu na aktywność kinazy MAP na HASMC

Spoczynkowe HASMC leczono przy braku (-) lub w obecności (+) bFGF (10 ng/ml), trombiną (2 U/ml), PD98059 (uMOL/l) i/lub flawopirydolem (75 nmol/L) przez 30 minut. Poziomy fosforylowanej Erk1 (pErk1) i Erk2 (pErk2) mierzono testem immunoblot z fosforyloswoistymi przeciwciałami rozpoznającymi oba białka (górny panel). Aktywność kinazy MAP mierzono testem żelowym kinazy wykorzystując podstawowe białka mielinowe jako substrat (środkowy panel).

Figura 6

Żywotność HASMC po leczeniu flawopirydolem

Spoczynkowe HASMC leczono flawopirydolem (75 nmol/L), TNF-α (50 mg/ml) albo nośnikiem przez wskazany czas. Żywotność komórkową oceniano przez wyłączanie błękitem trypanu. Wyniki są przedstawione jako procent żywych komórek do całkowitej liczby komórek.

Figura 7

Zahamowanie nowotworzenia śródbłonkowego szczurzej tętnicy szyjnej przez flawopirydol po uszkodzeniu balonem

Stosunek nowotworzony śródbłonek/błona wewnętrzna mierzono w skrawkach histologicznych szczurzych tętnic szyjnych leczonych lub nieleczonych pirydolem (5 mg/kg) przez 5 dni po uszkodzeniu. Tętnice badano (n=12) 7 dni i (n=12) 14 dni po uszkodzeniu. Podano również procent jąder PCNAdodatnich (±SEM, wyrażane jako procent policzonych jąder) w nowotworzonym śródbłonku tętniczym w każdym punkcie czasu i z każdej leczonej grupy. *p<0.05 w porównaniu z leczeniem nośnikiem.

Figura 8

Histologiczne skrawki szczurzej tętnicy szyjnej

Skrawki z tętnic badanych w 7 dniu (panele A i B) i 14 dniu (panele C i D) po uszkodzeniu. Tętnice pokazane w panelach A i C pochodzą od szczurów leczonych flawopirydolem (5 mg/kg); tętnice pokazane w panelach B i D pochodzą od szczurów leczonych samym nośnikiem. Oryginalne powiększenie x100.

Figura 9

Ekspresja Cdk2 po uszkodzeniu balonem szczurzych tętnic szyjnych

PL 197 693 B1

Skrawki z tętnic badanych w 7 dniu (panele A i B) i 14 dniu (panele C i D) po uszkodzeniu. Tętnice pokazane w panelach A i C pochodzą od szczurów leczonych flawopirydolem (5 mg/kg); tętnice pokazane w panelach B i D pochodzą od szczurów leczonych samym nośnikiem. Jądra Cdk-2-dodatnie zlokalizowane przeważnie w nowotworzonym śródbłonku barwiono błękitem Vector stosując fosfatazę zasadową. Oryginalne powiększenie x100.

Przedmiotem wynalazku jest więc zastosowanie pochodnych 4-H-1-benzopiran-4-onu o wzorze I

w którym

R1 oznacza wodór, alkil zawierający 1 do 6 atomów węgla, arylo-C1-C4-alkil; C1-C₆-alkil podstawiony przez halogen, hydroksyl lub karboksyl; C2-C6-cykloalkil, pirydyl, tienyl,

C3-C6-cykloalkilo-C1-C4-alkil, C2-C6-alkenyl, C2-C6-alkinyl, fenyl; fenyl mono- lub wielopodstawiony przez halogen, C1-C4-alkil, C_rC4-alkoksyl, hydroksyl, karboksyl, COO-alkil, CONH2,

CONH-alkil, CON(alkil)2, grupę nitrową, trifluorometyl, grupę aminową, grupę C1-C4-alkiloaminową di-C1-C4-alkiloaminową lub fenyl; naftyl, karboksyl, -CHO, COO-C_rC4-alkil, pierwszorzędową grupę aminową, grupę alkiloaminową, aralkiloaminową, dialkiloaminową, amidową, aryloaminową, diaryloaminową lub -CH2O-C_rC4-alkil;

R2 oznacza wodór, alkil zawierający 1 do 6 atomów węgla, aryl, grupę nitrową, grupę aminową, di-C1-C4-alkiloaminową, halogen, hydroksyl, alkoksyl, -COOH, -COO-C_rC4-alkil, -CHO, -CH2OH lub -CH2O-C1-C4-alkil;

R3 oznacza wodór, C_rC4-alkil, C_rC4-alkil podstawiony przez halogen, hydroksyl lub karboksyl; hydroksyl, karboksyl, grupę nitrową, grupę aminową, C1-C4-alkiloaminową, di-C1-C4-alkiloaminową, halogen, -O-alkilo-C(O)-alkil, -CHO, -CH2OH, -CH2O-C_rC4-alkil lub grupę R2N-C(O)-O-, w której R oznacza H, C_rC6-alkil, cykloalkil; albo -O-alkilo-C(O)-alkil lub aryl;

R4 oznacza wodór, hydroksyl, C_rC4-alkoksyl, C_rC4-alkanoiloksyl, C_rC4-alkoksykarbonyl, aryloksyl, grupę aminową, C1-C4-alkiloaminową, di-C1-C4-alkiloaminową lub R'2-N-C(O)-O-, w której R' oznacza H, C_rC6-alkil, cykloalkil lub aryl;

R5 oznacza wodór, C_rC6-alkil, arylo-C1-C4-alkil, C3-C6-cykloalkil, C3-C6-cykloalkilo-C1-C4-alkil, grupę alkiloaminową, C_rC4-alkanoil, -C(O)-O-C_rC4-alkil lub aroil, przy czym grupę arylową w R_1f R2, R3, R4 i R5 stanowi niepodstawiony fenyl lub fenyl, który jest mono- lub wielopodstawiony przez halogen, C1-C4-alkil, C_rC4-alkoksyl, hydroksyl, karboksyl, COO-alkil, CONH2, CONH-alkil, CON(alkil)₂, grupę nitrową, trifluorometyl, grupę aminową, C1-C4-alkiloaminową, di-C1-C4-alkiloaminową lub fenyl; m oznacza liczbę całkowitą od 0 do 3, a n oznacza 1, lub ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli addycyjnych z kwasami do wytwarzania środka farmaceutycznego do hamowania proliferacji komórek mięśni gładkich (SMC) w przypadku leczenia zmian po urazie wskutek balonowania oraz leczenia po protezie śródnaczyniowej, przy czym dawka związku o wzorze I wynosi mniej niż 70%, korzystnie mniej niż 60% a zwłaszcza mniej niż 50% dawki, która byłaby wymagana do zahamowania wzrostu nowotworu.

Związki stosowane według wynalazku zawierają dwa centra asymetryczne, z których jedno znajduje się w miejscu skondensowania pierścienia heterocyklicznego zawierającego azot z resztą benzopiranową (C-4'), a drugie przy atomie węgla podstawionym w pozycji R4 (C-3'), co oznacza, że możliwe są dwie pary izomerów optycznych. Zakresem związków stosowanych według wynalazku objęto wszystkie możliwe stereoizomery oraz ich mieszaniny. W zakres wynalazku wchodzą zwłaszcza postaci racemiczne oraz wyodrębnione izomery optyczne o określonej aktywności. Dwa racematy

PL 197 693 B1 można rozdzielić sposobami fizycznymi, takimi jak, na przykład, krystalizacja frakcyjna. Z racematów tych można otrzymać pojedyncze izomery optyczne, stosując konwencjonalne sposoby, takie jak, na przykład, wytworzenie soli z optycznie aktywnym kwasem, a następnie krystalizacja.

Przykładami odpowiednich dla R₁ do R₅ grup alkilowych są prostołańcuchowe lub rozgałęzione rodniki, zawierające do 6, a korzystnie do 5, atomów węgla, takie jak na przykład grupa metylowa, etylowa, propylowa, izopropylowa, t-butylowa, pentylowa lub izopentylowa.

Przykładami odpowiednich dla R1 do R5 podstawionych grup alkilowych są halogenoalkil, taki jak trifluorometyl, hydroksyalkil, taki jak hydroksyetyl lub karboksyalkil, taki jak karboksyetyl.

Odpowiednimi przykładami grup cykloalkilowych, które za wierają 3 do 6 atomów węgla i są określone przez R1 do R5, są cyklopropyl, cyklobutyl, cyklopentyl lub cykloheksyl. Przykładem grupy cykloalkiloalkilowej jest cyklopropylometyl.

Przykładem określonej przez R1 do R5 grupy aralkilowej jest grupa fenyloalkilowa, w której grupa fenylowa jest niepodstawiona lub jest monopodstawiona albo wielopodstawiona podstawnikami takimi jak halogen, C1-C₄-alkil, C1-C₄-alkoksyl lub grupa nitrowa, albo grupa trifluorometylowa, grupa aminowa lub podstawiona grupa aminowa.

Przykładem określonej przez R1 do R5 grupy arylowej jest grupa fenylowa, która jest niepodstawiona lub jest monopodstawiona albo wielopodstawiona podstawnikami takimi jak halogen, C1-C4alkil, C1-C4-alkoksyl, hydroksyl, karboksyl, COO-alkil, CONH2, CONH-alkil, CON(alkil>2, grupa nitrowa lub trifluorometylowa, grupa aminowa, C1-C4-alkiloaminowa, di-C1-C4-alkiloaminowa, aromatyczne grupy heterocykliczne, takie jak grupy pirydylowe oraz policykliczne rodniki aromatyczne, takie jak grupy naftylowe.

Odpowiednim przykładem określonej przez R1 do R5 grupy alkiloaminowej jest grupa (CH2)n-NR6R7, w której n oznacza 1 do 3, a R6 i R7 oznaczają alkil, jak określony powyżej przy definicji alkilu dla podstawników R1 do R5; a ponadto R6 i R7 razem z atomem azotu, z którym są związane, mogą tworzyć pierścień heterocykliczny zawierający jeden lub więcej heteroatomów. Odpowiednimi przykładami pierścieni heterocyklicznych utworzonych przez R6 i R7 oraz atom azotu, z którym są one związane, są piperydyna, pirolidyna, morfolina, piperazyna lub imidazol, przy czym każdy z tych pierścieni może być niepodstawiony lub podstawione w jednej lub kilku pozycjach przez CrCą-alkil, C1-C4alkoksyl lub aryl, albo przez hydroksyl lub grupę aminową.

Odpowiednimi przykładami soli związków stosowanych według wynalazku z nieorganicznymi lub organicznymi kwasami są chlorowodorek, bromowodorek, siarczan, fosforan, octan, szczawian, winian, cytrynian, maleinian lub fumaran.

Korzystnie stosowane są związki o wzorze la

Wzór la w którym R1 oznacza wodór, C₁-C3-alkil, naftyl, fenyl, fenyl mono- lub wielopodstawiony przez halogen, C_rC4-alkil, C_rC4-alkoksyl, hydroksyl, karboksyl, COO-alkil, CONH2,

CONH-alkil, CON(alkil)2, grupę nitrową, trifluorometyl, grupę aminową, grupę C1-C4-alkiloaminową di-C1-C4-alkiloaminową lub fenyl; pirydyl lub tienyl;

R2 oznacza wodór lub C_rC3-alkil;

R5 oznacza C₁-C3-alkil, C3-C5-cykloalkil lub C3-C5-cykloalkilo-C1-C4-alkil.

Szczególnie korzystne są związki o wzorze la, w którym R1 oznacza fenyl, tienyl, pirydyl, chlorofenyl, dichlorofenyl, metylofenyl, aminofenyl, bromofenyl, hydroksyfenyl lub naftyl;

R2 oznacza wodór, a R5 oznacza metyl.

PL 197 693 B1

Szczególnie ważnym związkiem stosowanym zgodnie z wynalazkiem jest (-)-cis,-5,7-dihydroksy-2-)(2-chlorofenylo)-8-[4-(3-hydroksy-1-metylo)-piperydynylo]-4H-benzopiran-4-on (Flawopirydol), zwłaszcza w postaci chlorowodorku.

Związki stosowane według niniejszego wynalazku można wytworzyć zgodnie z ujawnieniem w opisach patentowych USA nr nr 4,900,727 i 5,284,856, które wprowadzono tutaj jako stan techniki. Dla niniejszego zgłoszenia istotne są również zawarte w tych opisach przykłady.

Związki stosowane według wynalazku hamują proliferację komórek mięśni gładkich, przy czym obszary stosowania związków zgodnie z wynalazkiem obejmują choroby/zaburzenia/urazy, którym towarzyszą zmiany naczyń bogatych w mięśniówkę gładką takie jak zmiany po urazie wskutek balotowania oraz zapobieganie restenozie po wszczepieniu protezy wewnątrznaczyniowej.

Pochodne 4H-1-benzopirano-4-onu stosuje się, według wynalazku, w sposób ogólnie znany specjalistom. W przypadku leków, skuteczną ilość wymienionej substancji czynnej stosuje się albo per se albo korzystnie w połączeniu z odpowiednimi farmaceutycznymi substancjami pomocniczymi w postaci tabletek, tabletek powlekanych, kapsułek, czopków, emulsji, zawiesin albo roztworów, przy czym zawartość składnika czynnego wynosi do około 95%, korzystnie od 10% do 75%.

Specjalista będzie wiedział, które substancje pomocnicze są przydatne dla pożądanej formulacji leku, w oparciu o swoją wiedzę. Oprócz substancji pomocniczych dla tabletek albo roztworów, substancji żelujących, podłoży dla czopków i innych zaróbek dla substancji czynnej, możliwe jest zastosowanie, przykładowo, przeciwutleniaczy, dyspersantów, emulgatorów, substancji przeciwpieniących, substancji zapachowych, konserwantów, ułatwiających rozpuszczanie albo barwników.

Substancję czynną można podawać doustnie, pozajelitowo, dożylnie albo doodbytniczo, przy czym podawanie doustne jest korzystne.

Do postaci do podawania doustnego substancję czynną można mieszać z innymi składnikami wraz z dodatkami, które są przydatne do tego celu, takimi jak zaróbki, stabilizatory albo obojętne rozpuszczalniki, zaś zwyczajowe sposoby można zastosować w celu przeprowadzenia ich w odpowiednie postaci do podawania, takie jak tabletki, tabletki powlekane, kapsułki z twardej żelatyny i wodne alkoholowe albo olejowe zawiesiny albo roztwory.

Przykłady obojętnych zaróbek, które można zastosować, obejmują gumę arabską, magnezję, laktozę, glukozę albo skrobię, w szczególności skrobię kukurydzianą. W tym kontekście, formulacje można wytworzyć jako granulki suche albo wilgotne.

Przykładami odpowiednich olejowych zaróbek albo rozpuszczalników są oleje roślinne albo zwierzęce, takie jak olej słonecznikowy albo olej z wątroby dorsza.

Do podawania podskórnego albo dożylnego, roztwór, zawiesinę albo emulsję substancji czynnej wytwarza się, jeżeli to konieczne, przy użyciu substancji, które są konwencjonalnie stosowane do tego celu, takie jak substancje ułatwiające rozpuszczanie, emulgatory albo inne substancje pomocnicze.

Przykładami odpowiednich rozpuszczalników są: woda, fizjologiczny roztwór chlorku sodu albo alkohole, przykładowo, etanol, propanol albo gliceryna, jak również roztwory cukru, takie jak roztwór glukozy albo mannitolu, albo mieszanina różnych wymienionych rozpuszczalników.

Dawka pochodnych 4H-1-benzopirano-4-onu podawana codziennie jest tak dobrana, aby wywołała pożądany efekt. Pochodne 4H-1-benzopirano-4-onu można podawać w dawce mniejszej niż 70%, korzystnie, mniejszej niż 60% w szczególności, mniejszej niż 50% dawki, którą stosuje się do kontrolowania wzrostu guza u odpowiedniego ssaka. Przykładem może być, na modelu przeszczepu xenologicznego na myszach nagich, dawka około 5 mg/kg ciężaru ciała podawana doustnie raz dziennie. Stanowi to połowę dawki, która hamuje wzrost nowotworu na tym samym modelu zwierzęcym (Drees i in., Clin. Cancer Res., 1997, 3:273-279).

Właściwości farmakokinetyczne pochodnych 4H-1-benzopirano-4-onu mogą powodować konieczność podawania związku kilka razy dziennie albo wyboru formulacji do przedłużonego uwalniania.

P r z y k ł a d y

1. Flawopirydol hamuje proliferację komórek mięśni gładkich zaś tworzenie nowej błony wewnętrznej u szczurów in vivo w modelu uszkodzenia naczyń szyjnych szczura.

Dobrze zbadany model urazu naczyń szyjnych szczura, w którym tworzenie zmian nowej błony środkowej po urazie wywołanym cewnikiem jest kluczono zależne od proliferacji SMC (Clowes i in., Lab. Invest. 1983, 49:327-333; Clowes i in., Circ. Res., 1985, 56:139-145) w celu zbadania, czy flawopirydol wywołuje zatrzymanie wzrostu SMC in vivo, tak jak czyni to in vitro. Flawopirydol podawano

PL 197 693 B1 doustnie w dawce 5 mg/kg raz dziennie, począwszy od dnia urazu i przez cztery kolejne dni, ponieważ czas ten odpowiada początkowej indukcji Cdk2 i pierwszej fali proliferacji SMC w tym modelu (Circ. Res. 1995, 77:445-465; Circ. Res. 1997, 80:418-426). Średnią pola powierzchni błony wewnętrznej i środkowej obliczono 7 i 14 dni po urazie, zaś wielkość zmian nowej błony wewnętrznej wyrażono jako stosunek powierzchni nowej błony wewnętrznej do błony środkowej. W grupie badanej i niebadanej było po 12 zwierząt. Stosunek po 7 dniach wynosił 1,00±0,05 w tętnicach szczurów leczonych nośnikiem oraz 0,65±0,04 w tętnicach leczonych flawopirydolem, dając zmniejszenie o 35%. Po 14 dniach, stosunek nowej błony wewnętrznej do środkowej wynosił 1,08±0,04 u szczurów leczonych samym nośnikiem i 0,66±0,03 u szczurów leczonych flawopirydolem, zaś redukcja wynosiła 38,9%. Działanie to było istotne statystycznie w obu punktach czasu (P<0,05).

Metody

Materiały. Flawopirydol (L86-28275, (-)-cis, 5,7-dihydroksy-2-(2-chlorofenylo)-8-[4-(3-hydroksy1metylo)piperydynylo]-4H-benzopirano-4-on) dostarczany jest przez firmę Hoechst Marion Roussel, Inc. i został rozpuszczony w dimetylosulfotlenku jako roztwór wyjściowy 50 mmol/l do doświadczeń hodowlanych albo w wodzie do doświadczeń in vivo. Zasadowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF) zakupiono w Collaborative Biochemical, zaś trombinę z Sigma. Inhibitor MEK1, PD98059 uzyskano z New England Biolabs.

Hodowla komórkowa. Ludzkie komórki mięśni gładkich aorty (HASMC) uzyskano z Clonetics i hodowano jak to opisano uprzednio¹⁸. Komórki zastosowano w pasażu 5-9. Przed przeprowadzeniem doświadczenia, wzrost komórek zatrzymano w fazie 80% zlewności przez 48 godzin, z pożywką zawierającą 0,2% surowicy płodowej bydlęcej.

ELISA na proliferację komórek. Proliferację komórek mierzono testem ELISA (Amersham Life Science). HASMC hodowano w powleczonych żelatyną płytkach 96-studzienkowych i powodowano ich przejście w stan spoczynkowy. Komórki traktowano 10 ng/ml bFGF, 2 U/ml trombiny albo nośnikiem przez 24 godziny. Flawopirydol (75 nmol/l) podawano 1 godzinę przed traktowaniem czynnikiem wzrostowym. 5-bromo-2'-dezoksyurydynę (BrdU) dodano w stężeniu końcowym 10 umol/l w ciągu 2 ostatnich godzin traktowania. Włączanie BrdU mierzono w opisany sposób . Wyniki wyrażono jako średnią ± SEM z 12 próbek na dane warunki z dwóch niezależnych doświadczeń.

Liczba komórek. HASMC o zatrzymanym wzroście hodowano do 50% zlewności w płytkach 6studzienkowych i traktowano albo nie flawopirydolem (75 nmol/l) albo bFGF (10 ng/ml). W okresach czasu po traktowaniu, komórki trypsynizowano i określano liczbę komórek stosując hemocytometr.

Analiza Western blot. Spoczynkowe HASMC traktowano w obecności albo pod nieobecność czynników wzrostowych i/lub flawopirydolu, jak zaznaczono. Analiza Western blot została przeprowadzona w opisano wcześniej¹⁸/ Pierwotnymi przeciwciałami były: poliklonalne przeciwciała ludzkiej cyklinie D1 (M-20, Santa Cruz), monoklonalne przeciwciało przeciwko ludzkiemu antygenowi jądrowemu komórek proliferujących (PCNA) (PC10, Sigma), przeciwciało monoklonalne swoiste wobec fosforylowanej p44/42 (Erk1/Erk2) kinazie MAP (New England Biolabs) oraz monoklonalne przeciwciało przeciwko Rb (G3-245, Pharmingen), które rozpoznaje fosforylowaną (pRb) i silnie fosforylowaną (ppRb) odmianę Rb. Do badań immunoblot, doświadczenie powtarzano trzykrotnie.

Aktywność Cdk. Spoczynkowe HASMC traktowano agonistami i inhibitorami przez 24 godziny, a następnie wytwarzano lizaty całych komórek, jak to opisano do badania Western blot. Test kinazowy przeprowadzono stosując zestaw kinazowy histonu H1 (Upstate Biotechnology) według instrukcji producenta. Pokrótce, w probówce do mikrowirówki zmieszano 1 ul inhibitorów peptydowych dla kinazy białkowej C (2 umol/l) i kinazy białkowej A (2 umol/l), 100 ug lizatu białka, 10 ul buforu i 10 ul mieszaniny zawierającej 75 umol/l chlorku magnezu, 500 umol/l ATP i 1 uCi/ml [y-³²P]ATP. Po inkubacji w 30°C przez 10 minut, porcje pipetowano na papier fosfocelulozowy. Papier płukano w 0,75% kwasie fosforowym, a następnie mierzono cpm w liczniku scyntylacyjnym (Beckman). Wyniki wyrażano jako średnią ± SEM dla trzech próbek i są reprezentatywne dla trzech niezależnych doświadczeń.

Test kinazowy w żelu. Spoczynkowe HASMC traktowano agonistami i inhibitorami przez 24 godziny, a następnie wytwarzano lizaty całych komórek, jak to opisano do badania Western blot. W niektórych doświadczeniach, HASMC traktowano uprzednio przez 60 minut 30 umol/l PD98059, flawopirydolem albo nośnikiem. Równe ilości białek (50 (ug/ścieżkę) rozdzielano na żelu poliakryloamidowym, który kopolimeryzowano z 350 ug/ml zasadowego białka mieliny. Żel traktowano [y-3²P]ATP i przeprowadzano autoradiografię w opisany sposób¹⁹.

Badanie błękitem trypanu. HASMC hodowano w 5-cm szalkach w niskiej zlewności i zatrzymywano ich wzrost w opisany sposób. Komórki traktowano flawopirydolem (75 nmol/l) albo czynnikiem

PL 197 693 B1 martwicy nowotworu-α (TNF-α, 50 ng/ml) przez określony czas. Po usunięciu pożywki, do szalek dodawano 0,4% błękit trypanu w buforowanym fosforanem roztworze soli. Po 5 minutach, komórki w szalkach liczono pod mikroskopem. Komórki niebieskie uznawano za nieżywe.

Model urazu naczyń szyjnych szczura. Uraz tętnicy szyjnej szczura przeprowadzono zasadniczo jako opisano². Dorosłe szczury Sprague-Dawley (400-500 g, Zivic-Miller) znieczulano przez dootrzewnowe wstrzyknięcie ketaminy (2 mg/kg) i ksylazyny (4 mg/kg). Następnie lewą tętnicę szyjną wewnętrzną cewnikowano cewnikiem 2F do embolektomii. Balon napełniano roztworem soli i przeciągano wzdłuż tętnicy trzykrotnie powodując uraz rozciągający i odsłaniający. Prawa tętnica szyjna pozostawała bez urazu i służyła jako kontrola. Bezpośrednio po wybudzeniu się ze znieczulenia oraz przez cztery kolejne dni, szczurom podawano flawopirydol (5 mg/kg w wodzie) albo wodę zgłębnikiem dożołądkowym w sposób zakodowany. Wszystkie szczury przeżyły zabieg i nie wykazywały objawów toksyczności spowodowanej lekiem w zastosowanych dawkach. W określonych punktach czasu po urazie tętnicy szyjnej, szczury znieczulano w opisany wyżej sposób i utrwalano przez perfuzję ogólnoustrojową 4% paraformaldehydem w roztworze soli buforowanym fosforanem. Prawą i lewą tętnicę szyjną pobierano i rozciągano przez wstrzyknięcie 4% paraformaldehydu do światła, po czym odwadniano i przechowywano w 70% etanolu w 4°C. Badanie immunohistochemiczne przeprowadzono w opisany sposób¹⁸, stosując przeciwciało monoklonalne przeciwko PCNA i przeciwciało poliklonalne przeciwko ludzkiej Cdk2 (M2-G, Santa Cruz).

Analiza obrazu. Koniec bliższy i dalszy każdej z tętnic (około 500 ąm) usuwano. Z każdej tętnicy analizowano 10 skrawków poprzecznych (8 ąm grubości) pobranych co 500 ąm. Skrawki utrwalano i barwiono hematoksyliną i eozyną w opisany sposób^. Stosując mikroskop Nikon Diaphot 300 i obiektyw 4X, wykonywano zdjęcie każdego ze skrawków jako obraz cyfrowy stosując kamerę video Hamamatsu C5985 i TCPro 2.41 (Coreco, Inc.). Obszary błony wewnętrznej i nowej środkowej określano stosując oprogramowanie NIH Image. Granice błony wewnętrznej i nowej środkowej określał jeden obserwator (A.M.), zaś wynik ten był losowo weryfikowany w sposób zakodowany przez drugiego obserwatora (C.P.). Wielkość zmiany wyrażano jako stosunek błony nowej środkowej do wewnętrznej. Wyniki dla każdej z grup wyrażano jako średnią ± SEM. 92% albo więcej obrazów nadawało się do interpretacji w każdej grupie; pozostałe wykazywały artefakty spowodowane utrwalaniem i nie były analizowane.

Analiza statystyczna. Jeżeli to odpowiednie, dane z badań ilościowych wyrażano jako średnią ± SEM. Dla grup leczonych wielolekowo, zastosowano test ANOVA, a następnie test Fishera różnicy istotnej statystycznie. Istotność statystyczną przyjęto dla p<0,05.

Wyniki

Flawopirydol hamuje proliferację HASMC. Na podstawie zdolności flawopirydolu do hamowania proliferacji różnych linii komórek nowotworowych, zbadano hipotezę, że zastosowanie go może blokować wzrost pierwotnej hodowli ludzkich SMC. HASMC z zatrzymanym wzrostem traktowano mitogenem SMC, bFGF (10 ng/ml) przez 24 godziny w obecności rosnących stężeń flawopirydolu i mierzono proliferację testem ELISA. W porównaniu z komórkami nie traktowanymi, proliferacja komórek traktowanych bFGF była zwiększona 5,4-krotnie (Fig. 1A). Uprzednie traktowanie przez godzinę nawet 50 nmol/l flawopirydolu w istotny sposób zmniejszało proliferację HASMC (do 3,9-krotnie, p<0,05), zaś efekt stawał się niemal maksymalny przy stężeniu 75 nmol/l. Podobne wyniki uzyskano stosując test wychwytu tymidyny jako niezależny wskaźnik syntezy DNA (niepokazane).

W celu zbadania uniwersalności działania flawopirydolu na proliferację SMC, zbadano działanie na mitogenezę wywołaną trombiną (2U/ml), która działa przez receptor sprzęgnięty z białkiem G, w porównaniu z bFGF, który pobudza przedstawiciela rodziny receptorów kinazy tyrozynowej. Flawopirydol (75 nmol/l) istotnie i silnie hamował zarówno proliferację HASMC wywołaną b FGF, jak i trombiną (odpowiednio, 5,4-krotnie wobec 1,8-krotnie i 2,4-krotnie wobec 0,7-krotnie, p<0,05, Fig. 1B). Przeprowadzono liczenie komórek w celu potwierdzenia, że wpływ flawopirydolu na postęp cyklu komórkowego rzeczywiście odzwierciedla te zmiany proliferacji. BFGF (10 ng/ml wywoływał 3-krotny wzrost liczby komórek po trzech dniach traktowania (Fig. 2). Podobnie do wyników obserwowanych w teście opartym na ELISA, flawopirydol (75 nmol/l) skutecznie blokował proliferację wywołaną bFGF.

Flawopirydol blokuje aktywność Cdk i ekspresję genów związanych z cyklem komórkowym w HASMC. W celu oceny swoistego działania flawopirydolu na mechanizm cyklu komórkowego, zmierzono aktywność kinazy histonu H1 w lizatach komórkowych z HASMC pobudzonych czynnikiem wzrostowym. Fosforylacja histonu H1 odzwierciedla aktywności Cdc2 i Cdk220 Traktowanie HASMC przy użyciu bFGF i trombiny powodowało, odpowiednio, 4,4-krotny i 3,6-krotny wzrost aktywności

PL 197 693 B1 kinazy histonu H1 (Fig. 3). Ten wzrost aktywności kinazy zależnej od cykliny był całkowicie zablokowany przez uprzednie traktowanie flawopirydolem (75 nmol/l).

Przez analizę Western blot zbadano również, czy flawopirydol wpływa na wywołaną czynnikiem wzrostowym regulację białek zależnych od cyklu komórkowego w HASMC. Cyklina D1 jest cykliną zależną od fazy G1, która ulega dodatniej regulacji przez pobudzenie czynnikiem wzrostowym i ulega gwałtownemu rozkładowi podczas wychodzenia z cyklu komórkowego²¹. Poziom cykliny D1 ulegał dodatniej regulacji, odpowiednio, 6,3-krotnie i 3,2-krotnie, w reakcji na traktowanie bFGF i trombiną przez 24 godziny (Fig. 4), zaś działanie to można było całkowicie zablokować przez uprzednie traktowanie flawopirydolem. Podobnie, zwiększona ekspresja PCNA, który jest syntetyzowany głównie podczas fazy S w połączeniu z replikacją DNA22, również była zablokowana przez traktowanie flawopirydolem. Jako końcowy pomiar białek związanych z cyklem komórkowym, zbadano fosforylację Rb w reakcji na ekspresję czynnika wzrostowego, stosując przeciwciało, które rozpoznaje fosforylowane Rb. Rb jest regulatorem cyklu komórkowego, który wiąże się z, oraz inaktywuje czynnik transkrypcyjny E2F, gdy Rb jest w stanie niefosforylowanym^³ i wywołuje zatrzymanie wzrostu SMC in vivo^u. Fosforylacja inaktywuje Rb i umożliwia postęp cyklu komórkowego przez fazę S. Analiza fosforylacji Rb jest szczególnie istotna, ponieważ Rb stanowi cel Cdk2 i Cdc2 in vivo. Zarówno trombina, jak i bFGF wywołują hiperfosforylację Rb, które to działanie jest hamowane przez flawopirydol. Podsumowując, wyniki te wskazują, że flawopirydol wpływa na ekspresję i aktywność zależną od fazy G1 i S elementów kontrolujących cykl komórkowy w HASMC w połączeniu z działaniami hamującymi wzrost.

Flawopirydol nie wykazuje działania wobec aktywności albo fosforylacji kinazy MAP. W celu upewnienia się, że flawopirydol działał wybiórczo na poziomie cyklu komórkowego, a nie nieswoiście na leżące powyżej szlaki kinazy, zmierzono fosforylację i aktywność Erk1 (p44 kinaza MAP) i Erk2 (p42 kinaza MAP), dwóch przedstawicieli rodziny kinazy MAP. Wybrano te kinazy, ponieważ leżą one bezpośrednio powyżej zjawisk transkrypcyjnych następujących w reakcji na bodźce wzrostu i poniżej wielu kluczowych szlaków sygnalizacji mitogennej2⁴. Kompletna reakcja kinazy MAP wskazuje, że zachowane są również szlaki mitogenne powyżej. Zmierzono stan fosforylacji Erk1 i Erk2, stosując przeciwciało monoklonalne, które swoiście rozpoznaje postaci fosforylowane, a więc aktywne. Jako kontroli, zastosowano w tym doświadczeniu PD98059, silnego i wybiórczego inhibitora aktywacji kinazy MAP2⁵. Zwiększone ilości fosforylowanego Erk1 i Erk2 wykrywano po traktowaniu HASMC trombiną i bFGF przez 30 minut, w porównaniu z komórkami nietraktowanymi (Fig. 5, górny panel). Fosforylacja Erk1 i Erk2 przez trombinę i bFGF była blokowana przez traktowanie PD98059, ale nie przez flawopirydol. W celu potwierdzenia tych wyników, zmierzono aktywność Erk1 i Erk2 w teście kinazowym w żelu (Fig. 5, dolny panel). Ponownie stwierdzono, że aktywności Erk1 i Erk2 nie były zwiększone w reakcji na trombinę i bFGF, działanie które można było zahamować PD98059, ale nie flawopirydolem. Doświadczenia te w połączeniu z przedstawionymi na Fig. 3 i 4 dostarczają dowodów, że działanie flawopirydolu na proliferację HASMC spowodowane jest swoistym zatrzymaniem mechanizmu cyklu komórkowego przez zablokowanie aktywności Cdk bez wpływu na zjawiska sygnalizacji powyżej.

Flawopirydol nie zmniejsza żywotności HASMC. Uprzednie doniesienia o aktywności flawopirydolu na inne rodzaje komórek wykazywały, że zależnie od linii komórkowej, flawopirydol może wywoływać zatrzymanie wzrostu bez wpływu na żywotność, albo może spowodować apoptozę¹⁶^⁹. Stąd, oceniano czy flawopirydol zmniejsza żywotność HASMC przez pomiar wykluczania błękitem trypanu w różnych punktach czasu po traktowaniu. Spoczynkowe HASMC traktowano flawopirydolem (75 nmol/l), nośnikiem albo TNF-α (50 ng/ml), cytokiną, o której wiadomo, że wywołuje apoptozę w tym rodzaju komórek30 O ile TNF-α silnie zmniejsza żywotność HASMC, powodując śmierć zasadniczo wszystkich traktowanych komórek w ciągu 24 godzin, flawopirydol nie wykazuje takiego działania (Fig. 6). Zaobserwowano, że ze wzrostem stężenia i czasu inkubacji, może nastąpić zmniejszenie żywotności w obecności flawopirydolu (niepokazane). Jednakże, w badanych warunkach, flawopirydol wywoływał głównie zatrzymanie wzrostu, bez wpływu na żywotność SMC.

Flawopirydol hamuje proliferację komórek mięśni gładkich i nowotworzenia śródbłonka in vivo w modelu urazu tętnicy szyjnej szczura. Wykorzystano dobrze ustalony model urazu tętnicy szyjnej szczura, w którym tworzenie zmiany po urazie wywołanym cewnikiem w kluczowy sposób zależy od proliferacji SMC2'3, w celu zbadania, czy flawopirydol wywołuje zatrzymanie wzrostu SMC in vivo, podobnie jak to czyni in vitro. Podawano flawopirydol doustnie w dawce 5 mg/kg raz dziennie, począwszy od dnia urazu i przez cztery dni potem, ponieważ ten okres czasu pokrywa się z początkową indukcją Cdk₂ i pierwszą falą proliferacji SMC w tym modelu31'32. Średnie pola powierzchni błony we10

PL 197 693 B1 wnętrznej i środkowej obliczano 7 i 14 dnia po urazie, zaś zmiany nowotworzenia śródbłonka wyrażano jako stosunek obszaru nowotworzenia do obszaru błony środkowej. W grupie leczonej, jak i nieleczonej było po 12 zwierząt. Stosunek nowotworzenia do błony środkowej w dniu 7 wynosił 1,00 ± 0,05 w tętnicach szczurów traktowanych nośnikiem i 0,65 ± 0,04 w tętnicach szczurów traktowanych flawopirydolem, czyli redukcja wynosiła 35,0% (Fig. 7). W 14 dniu, stosunek nowego śródbłonka do błony środkowej wynosił 1,08 ±0,04 u szczurów leczonych nośnikiem, zaś 0,66 ± 0,03 u szczurów leczonych flawopirydolem, co daje redukcję 38,9%. Działanie to było istotne statystycznie w obu punktach czasu (p<0,05). Reprezentatywne skrawki tętnic pokazano na Fig. 8.

W celu wykazania, że flawopirydol hamuje proliferację komórek mięśni gładkich, zabarwiono skrawki na ekspresję PCNA w reprezentatywnych polach z każdej z tętnic i określono odsetek jąder PCNA-pozytywnych w nowotworzonym śródbłonku. W dniu 7, 31,1 ± 7,2% jąder uszkodzonych tętnic szczurów nieleczonych było PCNA-pozytywnych, podczas gdy jedynie 11,8 ± 1,5% jąder uszkodzonych tętnic szczurów leczonych flawopirydolem było PCNA-pozytywnych (Fig. 7, p<0,05). W dniu 14, jądra PCNA-pozytywne występowały w 10,4 ± 2,0% komórek nowotworzonego śródbłonka u szczurów leczonych, zaś tylko w 4,2 ± 0,5% komórek szczurów nieleczonych (p<0,05) (PCNA-pozytywne jądra są rzadko obserwowane w tętnicach nieuszkodzonych, niezależnie od leczenia). Podobnie, komórki Cdk2-pozytywne były rzadsze w nowotworzonym śródbłonku szczurów leczonych flawo-pirydolem (Fig. 9, panele A i C) w porównaniu z tętnicami szczurów nieleczonych (panele B i D), zarówno w 7, jak i w 14 dniu po urazie.

Dyskusja

W niniejszym badaniu zbadano, czy nowy inhibitor Cdk, flawopirydol, najsilniejszy znany i swoisty inhibitor Cdk, jest przydatnym kandydatem do hamowania proliferacji SMC in vivo, szczególnie w zastosowaniu w urazie naczyń. Uprzednie próby kierowania do mechanizmu cyklu komórkowego do leczenia choroby naczyń dostarczyły przesłanek dla niniejszego badania^{9 12}; jednakże, sposoby zastosowania do tej pory polegały na przeniesieniu genu w celu hamowania postępu cyklu komórkowego. Obecnie, istnieją niezwykłe przeszkody uniemożliwiające zastosowanie kliniczne tych technik . W trakcie badań, doniesiono że CVT-313, niedawno zidentyfikowany związek, który również wykazuje właściwości hamujące Cdk ale w stężeniach mikromolarnych, może również hamować nowotworzenie błony wewnętrznej, jednakże, konieczne jest wprowadzanie CVT-313 do tętnicy szyjnej w momencie urazu aby wywołać ten efekt³⁴. W przeciwieństwie, wykazano niniejszym, że flawopirydol po podaniu doustnym może silnie hamować nowotworzenie błony wewnętrznej, w stopniu porównywalnym z innymi czynnikami istotnymi klinicznie1'3^5,3⁶. Aktywność doustna flawopirydolu czyni go unikalnym wśród czynników, których aktywność wykazano na modelach zwierzęcych uszkodzenia naczyń. Jego wybiórczość, siła i łatwość podawania czyni flawopirydol doskonałym kandydatem do zastosowań terapeutycznych w zahamowaniu cyklu komórkowego in vivo w zmianach naczyniowych u ludzi.

Wybrano podawanie flawopirydolu doustnie w stężeniu (5 mg/kg) wynoszącym połowę stężenia hamującego wzrost nowotworu na myszach nagich w modelu xenogenicznym2⁷. Wartym zauważenia jest fakt, że stężenie flawopirydolu 75 nmol/l powoduje niemal całkowite zahamowanie proliferacji SMC w niniejszym badaniu, podczas gdy osiągnięto medianę stężenia w surowicy rzędu 425 nmol/l w dawkach poniżej progu toksyczności w badaniach fazy I na ludziach z nowotworami nawrotowymi 7 Wyniki te wskazują, że znacznie niższe dawki inhibitorów cyklu komórkowego niż zastosowane dla nowotworów, mogą być skuteczne w zastosowaniach w chorobach naczyń takich jak restenoza, z równoczesną zaletą zwiększonej tolerancji.

Podczas gdy niniejszym wykazano, że flawopirydol wywołuje zatrzymanie wzrostu bez wpływu na żywotność hodowli HASMC i wykazuje zmniejszone nowotworzenie błony wewnętrznej po leczeniu flawopirydolem in vivo, nie można mieć pewności, że zatrzymanie cyklu jest jedynym czynnikiem zmniejszającym tworzenie nowego śródbłonka w zmianach w tętnicy szyjnej. Flawopirydol może wywołać zatrzymanie wzrostu z albo bez wywołania apoptozy, zależnie od rodzaju komórek . Co ciekawe, flawopirydol hamuje apoptozę w komórkach PC12, które uległy końcowemu różnicowaniu, wywołując apoptozę w niezróżnicowanych, proliferujących komórkach PC122⁸. Jakkolwiek niniejsze doświadczenia in vitro przeprowadzono w warunkach, które naśladują fenotyp SMC przed urazem, możliwe jest, że SMC mogą reagować różnicowaniem na flawopirydol po urazie oraz mogą nawet ulegać apoptozie. Podczas gdy rola apoptozy w zmianach naczyniowych pozostaje niejasna, ekspresja ligandu Fas w SMC wywołuje apoptozę i blokuje nowotworzenie śródbłonka u królików po urazie balonem3^?, co sugeruje, że flawopirydol rzeczywiście wywołuje apoptozę SMC in vivo, podobnie jak w proliferujących komórkach PC12, może to być zjawisko lecznicze w kontekście nowotworzePL 197 693 B1 nia błony wewnętrznej. Inne mechanizmy mogą również przyczyniać się do działania flawopirydolu na tworzenie zmian. Przykładowo, zahamowanie cyklu komórkowego za pośrednictwem oligodezoksynukleotydów antysensownych. poprawia funkcje śródbłonka w przeszczepie żyły królika³⁸. Dalsze badania konieczne będą dla wyjaśnienia mechanizmów działania flawopirydolu na SMC in vivo, innych niż zatrzymanie wzrostu.

Biorąc pod uwagę wykazaną rolę proliferacji SMC w tworzeniu zmian po urazie tętnicy szyjnej szczura²'3, ciekawa jest obserwacja, że mimo nasilonych działań flawopirydolu in vitro, jego zdolność do hamowania nowotworzenia śródbłonka (mimo iż istotna) była bardziej umiarkowana w warunkach doświadczenia in vivo. Uwzględniono kilka możliwych wyjaśnień tej obserwacji. Mało możliwe jest, aby przyspieszona proliferacja SMC nastąpiła po przerwaniu podawania flawopirydolu, ponieważ różnice we wskaźnikach proliferacyjnych utrzymują się nawet do 14 dni po urazie (Fig. 7 i 9). Jest bardziej możliwe, że inne składowe tworzenia zmiany, takie jak migracja SMC i wytwarzanie macierzy zewnątrzkomórkowej wciąż przyczyniają się do tworzenia zmiany, nawet gdy nie występuje istotna proliferacja SMC, albo że dostarczanie flawopirydolu raz dziennie jest wystarczające do całkowitego zatrzymania proliferacji w tym modelu. Ostatnie dane wskazujące, że okres półtrwania flawopirydolu wynosi tylko 2,5 godziny sugerują, że ta ostatnia hipoteza może być prawidłowa, dalsze badania być może pozwolą zidentyfikować jeszcze więcej skutecznych schematów dawkowania3⁹.

Niniejsze wyniki wskazują, że flawopirydol może zahamować proliferację SMC, i w ten sposób nowotworzenie błony wewnętrznej w dobrze zbadanym modelu chorób naczyń na niedużych zwierzętach. Należy zaznaczyć, że istotność zahamowania proliferacji SMC jest kontrowersyjna w ludzkich zmianach naczyniowych, oraz może być zależna od natury zmiany i czasu, w którym dokonano obserwacji proliferacji. Wskaźnik proliferacyjny SMC w ludzkich próbkach miażdżycy jest wyraźnie niski⁴⁰, jakkolwiek te próbki mogą nie odzwierciedlać zmian proliferacyjnych na wcześniejszych, być może kluczowych etapach rozwoju zmian. Oprócz tego, przebudowa naczyń tętniczych, niezależna od wzrostu nowej błony wewnętrznej może przyczyniać się do istotnej proporcji zamknięcia światła naczynia po angioplastyce u człowieka4¹. W przeciwieństwie, wskaźniki aktywności mitotycznej w SMC są znacznie wyższe (25% PCNA-pozytywnych) w próbkach miażdżycy ze zmian pochodzących od ludzi z restenozą w protezie wewnątrznaczyniowej, co jest zgodne z ustaloną rolą hiperplazji SMC, ale nie przebudowy w tym procesie4. Ponieważ umieszczenie protezy wewnątrznaczyniowej i problem kliniczny restenozy w protezie zwiększa się, stąd konieczność skutecznych sposobów zatrzymania hiperplazji SMC i nowotworzenia błony wewnętrznej. Ponieważ flawopirydol jest silnym, dostępnym po podaniu doustnym lekiem o swoistej aktywności hamującej Cdk, oraz że znane są dawki flawopirydolu u ludzi, flawopirydol może być uznany za kandydata na lek do zapobiegania restenozie w protezie we wnątrznaczyniowej u ludzi.

Metody i wyniki: Stosując hodowane ludzkie komórki mięśni gładkich aorty stwierdzono, że flawopirydol w stężeniach już 75 nmol/l powoduje niemal całkowite zahamowanie proliferacji wywołanej zasadowym czynnikiem wzrostu fibroblastów i trombiną. W tej dawce, flawopirydol hamował aktywność kinazy zależnej od cykliny, co zmierzono przez fosforylację histonu H1, ale nie wykazywał działania wobec aktywacji kinazy MAP. Indukcja zależnych od cyklu białek cykliny D1, antygenu jądrowego komórek proliferujących oraz fosforylowanych białek retinoblastoma była również zablokowana przez flawopirydol. Flawopirydol nie wykazywał aktywności wobec żywotności komórek. W celu zbadania, czy flawopirydol wykazuje podobną aktywność in vivo po podaniu doustnym, zbadano nowotworzenia błony wewnętrznej w tętnicach szyjnych szczura po urazie balonem. Flawopirydol (5 mg/kg) podawany zgłębnikiem dożołądkowym zmniejszał obszar nowotworzenia błony wewnętrznej o 35% i 39% w, odpowiednio, 7 i 14 dni po urazie.

Wnioski: Flawopirydol hamuje wzrost SMC in vitro i in vivo. Dostępność po podaniu doustnym i wybiórczość wobec kinaz zależnych od cyklin czyni z niego potencjalne narzędzie terapeutyczne do leczenia zmian naczyniowych bogatych w SMC.

Odnośniki

1. Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s. Nature 1993; 362:801-9.

2. Clowes MN, Reidy MA, Clowes MM. Kinetics of cellular prollferation after arterial injury. Lab. Invest. 1983; 49:327-333.

3. Clowes A, Schwartz S. Significance of smodh muscle migrafion in the i nu red rat carotid artery. Circ. Res. 1985; 56:139-145.

PL 197 693 B1

4. Kearney M, Pieczek A, Haley L, Losordo DW, Andres V, Schainfeld R, Rosenfield K, Isner JM. Histopathology of instent restenosis in patients with peripheral artery disease. Circulation 1997;95:1998-2002.

5. Minnz GS, Hoffmann R, Mehran R, Pichard AD, Kern KM, Satlee LF, Popma JJ, Leon MB. Instent restenosis: the Washington Hospital Center experience. Am. J. Cardiol. 1998; 81:7E-13E.

6. Califf RM. Restenosis: the cost to society. Am. Heart J.1995;130:680-684.

7. Sherr CJ. Mammalian G1 cyclins. Cell 1993; 73:1059-1065.

8. Hunter T. Braking the cycle. Cell 1993; 75:839-841.

9. Chen D, Krasiński D, Chen D, Sslveetee A, Chen J, Nisen PD, Andree V. Downfeeglatlon oo cyclin-dependent kinase 2 activity and cyclin A promoter activity in vascular smooth muscle cells by p27r^|P1, an inhibitor of neointima formation in the rat carotid artery. J. Clin. Invest. 1997; 99:2334-2341.

10. Chang MW. Barr E, Lu MM, Barton K, Leiden JM. Adenovirus-mediated oo the cyclinlcyclin-dependent kinase inhibitor, p21 inhibits vascular smooth muscle celi proliferation and neointima formation in the rat carotid artery model of balloon angioplasty. J. Clin. Invest. 1995; 96:2260-2268.

11. Chang MW. Barr E, Seltzee J, Jiang Y-Q, Nabel EG, Parmacek MS, Leiden JM. Cytostarlc gene therapy for vascular proliferative disorders with a constitutively active form of the retinoblastoma gene product. Science 1995; 267:518-522.

12. Mcoishita R, GibbonsGH, Henichi M, Eilison KE, NakkjimaM, Zhang J, KanceldY, Og^am T, Dzau VJ. A gene therapy strategy using a transcription factor decoy of the E2F binding site inhibits smooth muscle proliferation in vivo. Proc. iatl. Acad. Sci. USA 1995; 92:5855-5859.

13. LosiowiSz MD, Carśson BA, Kaur G, Sausviile EA, Wodand PJ. Pełenn inhibidon of Cdc2 kinase activity by the flavanoid, L86-8275. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994; 201:589-595.

14. Cadson BA, Dubay MM, SausvHle EA, Bozzie^ L, Wc^^i£^nd PJ. F,aνορϊπόοΙ Inducee G₁ ap rest with inhibition of cyclin-dependent kinase (C,e) 2 and C,,4 in human breast carcinoma cells. Canc. Res.1996; 56:2973-2978.

15. dd Azzeeeo\WF MycllsrtDisehmann H-J, Schncz-GanmanU, Worisnd PJ. E, Kim

S-H. Structural basis for specificity and potency of a flavanoid inhibitor of human Cdk2, a cell cycle kinase. Proc. iatl. Acad. Sci. USA 1996; 93:2735-2740.

16. Kam G, StarlertStaeendon M, Sebere S, WorisndP, Seeiaace H, MyyesC, Czzcc J, Naii R, Sausville E. Growth inhibition with reversible cell cycle arrest of carcinoma cells by flavone L86-8275. J. iatl. Canc. Inst.1992; 84:1736-1740.

17. Senderowicz A,, Headlee ,, Stinson S, Lush ,,, Figg W,, Pluda J, Sausville EA. A Phase I trial of flavopiridol (FLA), a novel cyclin-dependent kinase inhibitor, in patients with refractory neoplasm. Proc. Am. Soc. Clin. Oncol.1997; 16:226a. Abstract.

18. Ruee J, Hu ZY, Yin L-Y, Wu Y, SR, Kelly AB, Harkee LA, Rao GN, Runge MS, Pal· terson C. Induction of vascular endothelial growth factor in balloon injured baboon arteries. Circ. Res.1997; 81:24-33.

19. Ruee J, Rao GN, L, F, BoOd C, Pattarson C, ΒΙίθΟιοοιο A, Run(:jgMS. I nductisnorrat aortlc smooth muscle cell growth by the lipid peroxidation product 4- hydroxy-2-nonenal. Circulation 1998; 97:1071-1078.

20. Swank IPA, Th n JP, Guo XW, Valdez J, Bradbu E, Gurle L,. Four distinct cyclindependent kinases phosphorylate histone H1 at all of its growth related phosphorylation sites. Biochemistry 1997; 36:13761-13768.

21. Matsushime H, Roussel MF. A^s^r^Ln RA, Sherr CJ. CoΙony-stlmιUatlng faccm 1 regiuates novel cyclins during the G1 phase of the cell cycle. Cell 1991; 65:701-713. 22. Bravo ,. Synthesis of the nuclear protein (PCiA) and its relation-ships with ,iA repfication. Bxp. Cell Res.1986; 163:287-293.

23. Ewen ME, Slus HK, Sheer CC, Matauchime H, Kato JY, LMnosson DM. Functional I nferaction of the retinoblastoma protein with mammalian D-type cyclins. Cell 1993; 7:487-497.

24. Hunnel T. ProOeln tonanel and phosphatanee: The ym and yang oO proOeln phosphorylθtion and signaling. Cell 1995; 80:225-236.

25. Payne DM, Rossomando AJ, Martlno P, Erśckson AK, Her J-H, Shabanowrtz J, Hunn DF. Weber ,J, Sturgill TW. Identyfication of the regulatory phosphofylation sites in pp42/mitogen-activated protein kinase (MAP kinase). ,,ΒΟ J.1991;10:885-892.

PL 197 693 B1

26. Konig A, Schwartz GK, Mohammad RM, Af-Katib A, Gabrilove JL. The novel cycfindependent kinase inhibitor flavopiridol downregulates Bc1-2 and induces growth arrest and apoptosis in chronic B-cell leukemia lines. Blood 1997; 90:4307-4312.

27. Drees M, Dengler WA. Roth T, Labonte H, Mayo J, Malspeis L, Grever M, Sausviile EA, Fieberg HH. Flavopiridol (L86-8275): Selective antitumor activity in vitro and activity in vivo for prostate carcinoma cells. Clin. Cancer Res.1997; 3:273-279.

28. Park DS, R£^r^ir^^ell SE, Greene LA. Inhibitoos d cyclln-dependent kinases promcoe surrvval of post-mitotic neuronally differentiated PC12 cells and sympathetic neurons. J. Biol. Chem.1996; 271:8161-8169.

29. Parker BW. Kaur G, Nieves-Niera W, Taimi M, Kohhhagen G, Shimizu T, Losiewicz MD, Pommier Y, Sausville EA, Senderowicz AM. Early induction of apoptosis in hematopoietic cell lines after exposure to flavopiridol. Blood 1998; 91:458-465.

30. Geng YJ, Wu Q, Muszzński M, Hansson GK, LibbbP- Apoprosis d vascufaa smoom muscle cells induced by in vitro stimulation with interferon-gamma, tumor necrosis factor-alpha, and interleukin-1 beta. Arterioscler. Thromb. Biol. 1996;16:19-27.

31. Schwartz SM, deBlois D, 0'Brien ERM. The Ιηύιτηθ: soii for atherosderosis and restenosis. Circ. Res. 1995; 77:445-465.

32. Wei GL. Krasinkski K, Kearney M, Isnee JM, Walsh K, Andres V. Temper-ally and spafally coordinated expression of cell cycle regulatory factors after angioplasty. Circ. Res. 1997; 80:418-426.

33. de Young MB, Dichek DA. Gene therapy for restenosis. Circ. Res. 1997; 82:306-313.

34. EE, NS, Joly A, Kerwar SS, Lum R, Mackman RL, Norman TC, Rosete J, Rowe M, Schow SR, Schultz TG, Wang X, Wick MM, Shiffman D. CVT313, a specific and potent inhibitor of CDK2 thaf prevents neointimal formation. J.Biol. Chem.1997; 272:299207-29911.

35. Sirois MG, Simonn M, EEeimmn ER. ΑΓ^Ηί^^η^^ silggnnsleeriddInhibitiorn sO PDGFR-b ceccptor subunit expression directs suppression of intimal thickening. Circulation 1997; 95:669-676.

36. Rade JJ. Schuiick AH, C/iimani R, Dichek DA. Local adenoviral-mediated er^f^r^^^^it^n d recombinant hirudin reduces neointima formation after arterial injury. Nature Med.1996; 2:293-298.

37. Sala Μ, Ρ^--γ^^πΗ, MuruveDA, S^ee Μ, I kebeM, LibermηnnTA, Oettggn P, Walsh K. Fal ligand gene transfer to the vessel wall inhibits neointima formation and overrides the adenovirusmediated T cell response. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1998; 95:1213-1217.

38. Mann MJ, Gibbons GH, Tsao PS, von der Leyen HE, Cooke JP, ΒυϋΓ390 R, Kernoff R, Dzau VJ. Cell cycle inhibition preserves endotheiial function in genetically engineered rabbit vein graffs. J. Clin. lnvest-1997; 99:1295-1301.

39. Arrguello F, Alexandee M, Sterry JA, Kidoo G, SmiNi EM, Kalavar NT, Greene JF, Koss W, Morgan CD, Stinson SF, Siford TJ, Aivord WG, Kiabansky RL, Sausville EA. Flavopiridol induces apoptosis of normal lymphoid cells, causes immunosuppression, and has potent antitumor activity in vivo against human leukemia and lymphoma xenogra1^:ts. Blood 1998; 91:2482-2490.

40. 0'Brien ER, AlpeTS CE, Stewart DK, Ρβίϋυεοη M, Tran N, Θο^οη D, Benditt EP, Hinohara T, Simpson JB, Schwartz SM. Proliferation in primary and restenotic coronary atherectomy tissue: implications for anti-proliferative therapy. Circ. Res. 1993; 73:223-231.

41. Minnz GS, Popma JJ, Pichard AD, Kenn KM, Satter LR, Wong SC, Hong MD, Kovach JA, Leon MB. Arterial remodeling after coronary angioplasty: a serial intravascular ultrasound study. Circulation 1996; 94:35-43.

PL 197 693 B1

Claims (5)

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie pochodnych4-H-1-benzopiran-4-onuo wzorzel

Wzór I w którym

Ri szusczs wodór, alkil zawierający 1 do 6 atomów węgla, srcls-C1-C₄-slkil; Oi-O6-alkil podotawisuc przez Oalsgnu, hydroksyl lub karecktyl; 03-06-ccklsalkil, oirydyl, tieuyl,

2. aaotooowauie według zaotrz. i, znamienne tym, że otoouje oię związek o wzorze la, w którym

PL 197 693 B1

Wzór la w którym R₁ oznacza wodór, C₁-C3-alkil, naftyl, fenyl, fenyl mono- lub wielopodstawiony przez halogen, C1-C₄-alkil, C_rC₄-alkoksyl, hydroksyl, karboksyl, COO-alkil, CONH2, CONH-alkil, CON(alkil>2, grupę nitrową, trifluorometyl, grupę aminową, grupę C1-C4-alkiloaminową di-C1-C4-alkiloaminową lub fenyl; pirydyl lub tienyl;

R2 oznacza wodór lub C1-C3-alkil;

R5 oznacza C1-C3-alkil, C3-C₅-cykloalkil lub C3-C₅-cykloalkilo-C1-C4-alkil.

3. Zastosswanieweeług zastrz. 2,znamiennetym, że ppodtawnikiwewzzrzzlamająnastęęujące znaczenia

R1 oznacza fenyl, tienyl, pirydyl, chlorofenyl, dichlorofenyl, metylofenyl, aminofenyl, bromofenyl, hydroksyfenyl lub naftyl;

R2 oznacza wodór, a

R5 oznacza metyl.

03-06-ccklsalkils-0i-0₄-alkil, 02-06-alknuyl, 02-06-alkiuyl, fnuyl; fnuyl mouo- lub wielopodotawiouy przez Oalognu, Oi-04-alkil, Oi-04-alkokoyl, hydroksyl, karboktyl, OOO-alkil, OONH2, OONH-alkil, 0ON(alkil)2, grupę uitrową, trifluoromntyl, grupę amiuową, grupę Oi-04-alkiloamiuową di-Oi-04-alkiloamiuową lub fnuyl; uaftyl, karboktyl, -OHO, OOO-Oi-04-alkil, pinrwozorzędową grupę amiuową, grupę alkiloamiuową, aralkiloamiuową, dialkiloamiuową, amidową, arcloamiuową, diarcloamiuową lub -OH2O-Oi-O4-alkil;

R2 ozuacza wodór, alkil zawierający i do 6 atomów węgla, aryl, grupę uitrową, grupę amiuową, di-Oi-04-alkiloamiuową, Oalogeu, Oydrokoyl, alkokoyl, -OOOH, -OOO-Oi-04-alkil, -OHO, -OH2OH lub -OH2O-Oi-O4-alkil;

R3 ozuacza wodór, Oi-04-alkil, Oi-04-alkil podotawiouy przez Oalogeu, Oydrokoyl lub karbokoyl; Oydrokoyl, karbokoyl, grupę uitrową, grupę amiuową, Oi-04-alkiloamiuową, di-Oi-04-alkiloamiuową, Oalogeu, -O-alkilo-O(O)-alkil, -OHO, -OH2OH, -OH2O-Oi-O4-alkil lub grupę R2N-O(O)-O-, w której R ozuacza H, Oi-O6-alkil, cykloalkil; albo -O-alkilo-O(O)-alkil lub aryl;

R4 ozuacza wodór, Oydrokoyl, Oi-04-alkokoyl, Oi-04-alkauoilokoyl, Oi-04-alkokoykarbouyl, arylokoyl, grupę amiuową, Oi-04-alkiloamiuową, di-Oi-04-alkiloamiuową lub grupę R'2-N-O(O)-O-, w której R' ozuacza H, O₁-O₆-alkil, cykloalkil lub aryl;

R5 ozuacza wodór, Oi-O6-alkil, arylo-Oi-04-alkil, O3-O6-cykloalkil, O3-O6-cykloalkilo-Oi-O4-alkil, grupę alkiloamiuową, Oi-04-alkauoil, -O(O)-O-Oi-O4-alkil lub aroil, przy czym grupę arylową w Ri, R2, R3, R4 i R5 otauowi uiepodotawiouy feuyl lub feuyl, który jeot mouo- lub wielopodotawiouy przez Oalogeu, Oi-04-alkil, Oi-04-alkokoyl, Oydrokoyl, karbokoyl, OOO-alkil, OONH2, OONH-alkil, OON(alkil)2, grupę uitrową, trifluorometyl, grupę amiuową, Oi-04-alkiloamiuową, di-Oi-04-alkiloamiuową lub feuyl;

m ozuacza liczbę całkowitą od 0 do 3, a u ozuacza i, lub icO farmaceutyczuie dopuozczaluycO ooli addycyjuycO z kwaoami do wytwarzana środka farmaceutyczuego do Oamowauia proliferacji komórek mięśui gładkicO w przypadku leczeuia zmiau po urazie wokutek balouowauia oraz leczeuia po protezie śróduaczyuiowej, przy czym dawka związku o wzorze I wyuooi muiej uiż 70%, korzyotuie muiej uiż 60% a zwłaozcza muiej uiż 50% dawki, która byłaby wymagaua do zaOamowauia wzrootu uowotworu.

4. Zastosswenieweeługzzstrz. 1, znamiennetym. że stoss-ąsięzwiązzki którym jąss (-)-cis.

-5,7-dihydroksy-2-)(2-chlorofenylo)-8-[4-(3-hydroksy-1-metylo)-piperydynylo]-4H-benzopiran-4-on (Flawopirydol).