ES2228018T3

ES2228018T3 - Cepa de bacterias lactobacillus.

Info

Publication number: ES2228018T3
Application number: ES99909452T
Authority: ES
Inventors: Eva Grahn Hakansson; Ulla Forsgren-Brusk; Rolf Andersson; Stig E. Holm; Stellan Hakansson
Original assignee: SCA Hygiene Products AB
Current assignee: Essity Hygiene and Health AB
Priority date: 1998-03-06
Filing date: 1999-03-05
Publication date: 2005-04-01
Anticipated expiration: 2019-03-05
Also published as: JP2002505099A; US6761885B1; SE9801951L; SK13262000A3; NZ506156A; JP4267822B2; ATE274051T1; TNSN99033A1; EP1060240A1; AU2864899A; DE69919518T2; DE69919518D1; EP1060240B1; SE9801951D0; WO1999045099A1; BR9908437A; PL195089B1; AU754042B2; SE519648C2; TR200002590T2

Abstract

La presente invención se refiere a una nueva cepa de Lactobacillus plantarum, denominada LB931 (DSM11918). Esta cepa bacteriana es útil para prevenir y/o tratar infecciones urogenitales ya que inhibe el crecimiento de un gran número de microorganismos patógenos. La cepa es tolerable y sobrevive fácilmente a largos periodos de almacenamiento a temperatura ambiente. Por consiguiente, los productos que contienen LB931 tienen un largo periodo de validez. La cepa puede transferirse fácilmente a la piel humana y al epitelio vaginal. La LB931 es resistente a concentraciones terapéuticas de algunas sustancias antiobióticas y compuestos espermicidas. Se han investigado las características de inhibición de LB931. Algunos ejemplos de bacterias que se inhibieron de forma satisfactoria son Escherichia, Klebsiella, Proteus, Staphylococcus y Streptococcus del grupo B. Por tanto, la LB931 es útil para prevenir y/o tratar infecciones causadas por estos microorganismos.

Description

Cepa de bacterias lactobacillus.

La presente invención se refiere a una nueva cepa de Lactobacillus, que posee valiosas características farmacéuticas. La invención también se refiere a composiciones farmacéuticas y a productos para la higiene personal que comprenden la cepa, así como al uso de la cepa para la prevención de infecciones urogenitales.

Antecedentes técnicos

(Todas las referencias de la siguiente descripción se incorporan como referencia).

La flora bacteriana normal en la región urogenital está constituida por un complejo sistema que comprende más de 50 especies de bacterias distintas. (Hill y col., Scand. J. Urol. Nephrol. 1984;86 (supl.):23-29). La flora normal está dominada por bacterias que pertenecen al género Lactobacillus (LB) que son bacilos Gram positivos adaptados al entorno de la vagina en mujeres fértiles. Estas bacterias también contribuyen al mantenimiento del medio específico y al equilibrio ecológico en la vagina.

Además del complejo patrón de interacción de la variada flora bacteriana de la vagina y el resto de la zona urogenital, es necesario considerar la variación de condiciones físicas que pueden influir en el crecimiento bacteriano y en las propiedades de adhesión. Algunas cepas de LVS inhiben el crecimiento de bacterias potencialmente patógenas mediante distintos mecanismos. El metabolismo de los LB tiene como resultado la formación de ácidos orgánicos, sobre todo ácido láctico y ácido acético que contribuyen al bajo pH del líquido vaginal, lo que es desfavorable para muchas otras especies. Los LB también pueden producir sustancias solubles que inhiben directamente el crecimiento de bacterias y hongos potencialmente patógenos. También pueden producir peróxido de hidrógeno que es tóxico en bacterias que carecen de la enzima catalasa tales como bacilos anaeróbicos gram negativos y Enterobacterias. Estas características de inhibición pueden variar considerablemente entre distintas cepas de LB (Hooton y col., JAMA 1990; 265: 64-69).

La debilidad del sistema natural de defensa puede permitir que microorganismos potencialmente patógenos provoquen infecciones clínicas, por ejemplo, en relación con medicación, poca higiene personal o cambios en la microflora de la piel o de las membranas mucosas. La flora normal de la vagina está dominada por LB y el pH es menor de 4,5. Las levaduras y las enterobacterias son poco frecuentes o no existen (Redondo-Lopez y col., Rev. Inf. Dis. 1987; 12:856-872). Pueden encontrarse cambios en la flora bacteriana vaginal en relación con distintas enfermedades patógenas. Hay una mayor cantidad de enterobacterias en la vagina y orificio uretral de mujeres que sufren infecciones recrudescentes en el tracto urinario y también tienen una flora urogenital carente de lactobacilos (Marcie y col. J. Clin. Microbiol. 1976, 8, 67-72). También se conoce que la frecuencia de infecciones aumenta en relación con el tratamiento antibiótico de otras infecciones (Stamey, Rev. Inf. Dis. 1987: 9(suppl. 2):195-208; Reid y col., Curr. Opin. Inf. Dis. 1991; 4:37-41). Además, se ha demostrado que las niñas que tienen un historial con frecuentes episodios de tratamiento antibiótico son más propensas a contraer infecciones en el tracto urinario (Marild y col., Ped. Inf. Dis. 1990; 22:43-47).

En la vaginosis bacteriana, la cantidad de LB se reduce y el pH aumenta. También hay una dominancia de especies Bacterioides, Gardnerella vaginalis y Mobiluncus (Redondo-Lopez, supra). La vaginitis, asociada con una mayor cantidad de enterobacterias, es a menudo un problema tangible en relación con tratamiento antibiótico. La administración oral habitual de penicilina tiene como resultado la acumulación de la sustancia en el líquido vaginal (Sjoberg y col., Obstet. Gynecol. 1990; 75:18-21) seguido de colonización por enterobacterias y hongos (Sjoberg y col., Gynecol. Obstet. Invest. 1992; 33:42-46). Las investigaciones en monos (Macaca fascicularis) han revelado que la administración de amoxicilina impide la capacidad de la flora bacteriana normal para inhibir la colonización del E. coli patógena en el tracto urinario (Herthelius y col., Infection 1988; 16:263-266).

Durante el embarazo, la composición de la flora vaginal puede influir en la morbilidad del feto y del niño. Es habitual la aparición de estreptococos del grupo B (GBS) en la flora fecal y vaginal (hasta en 30% de mujeres embarazadas). Estas bacterias no constituyen normalmente una amenaza para la salud de la mujer. Sin embargo, los GBS pueden causar infecciones graves en el niño recién nacido. En estos casos, las bacterias se transmiten verticalmente de madre a hijo antes o en relación con el parto. También pueden transmitirse de esta forma otras bacterias y causar infecciones en el niño. También existe una fuerte relación entre vaginosis bacteriana y parto prematuro (Martius y col., Arch. Gynecol. Obstet. 1990; 247:1-13). Los mecanismos detrás de este fenómeno son desconocidos. Se ha demostrado que un cambio en la flora vaginal hacia una predominancia de especies gram negativas aumenta la cantidad de enzima fosfolipasa A2, que a su vez puede iniciar la síntesis de prostaglandina partiendo de ácido araquidónico (Bejar y col., Obstet. Gynecol. 1981; 57:479-482). La flora de la vaginosis también produce grandes cantidades de endotoxinas (Sjoberg y col., Obstet. Gynecol. 1991; 77:265-266), lo que puede inducir la síntesis endógena de prostaglandina (Romero y col., Obstet. Gynecol. 1989; 73:31-34), mediada posiblemente por interleuquinas.

Las características teóricamente positivas de los LB han motivado su uso en preparaciones comerciales con el uso pretendido de suplementar y fortalecer la flora vaginal. El éxito ha sido variable y a menudo las preparaciones disponibles contienen cantidades considerablemente menores de LB de lo afirmado. También se han contaminado algunas preparaciones (Hughes y col., Obstet. Gynecol., 1990; 75(2):244-248). Para suplementar y fortalecer la flora normal bacteriana en la región urogenital añadiendo LB, es necesario seleccionar cuidadosamente las cepas bacterianas a usar. Una cepa de LB que es adecuada para este propósito debe cumplir los siguientes criterios:

1. La cepa de LB debe producir altas cantidades de sustancias solubles con capacidad de inhibición del crecimiento en enterobacterias, estreptococos del grupo B, estafilococos y levaduras.

2. La cepa de LB debe poderse transferir a la piel y superficies de la mucosa de la región urogenital.

3. La cepa de LB debe poder adherirse a las superficies epiteliales de la región urogenital.

4. La cepa de LB debe poder aguantar su almacenamiento durante un largo periodo de tiempo y debe ser posible inducir la cepa en distintos tipos de preparaciones.

5. La cepa de LB debe poder retener su viabilidad y características en un artículo o preparación después de su uso.

6. La cepa de LB no debe ser sensible a preparaciones espermicidas que contienen nonoxinol-9.

7. La cepa de LB debe aislarse del tracto urogenital de mujeres humanas.

8. La cepa de LB debe permitir la existencia de flora LB urogenital humana.

Por lo tanto, existe una demanda de cepas que cumplen estos requerimientos.

Sumario de la invención

Se ha aislado una nueva cepa de Lactobacillus plantarum, denominada LB931, que cumple los requerimientos enumerados anteriormente. La cepa se ha depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, Braunschweig, DE. Se le ha asignado el número de identificación DSM11918. Por consiguiente, la LB931 puede usarse para tratar y/o prevenir infecciones urogenitales. La LB931 puede incluirse ventajosamente en composiciones farmacéuticas y en productos de higiene personal tales como pañales y compresas.

Definiciones

Como se describe en este documento, el término "LB" se refiere a bacterias del género Lactobacillus.

Como se describe en este documento, el término "región urogenital" se refiere al perineo, uretra y vagina.

Como se describe en este documento, el término "artículo absorbente" se refiere a productos adecuados para absorber un líquido corporal, tal como sangre u orina. Algunos ejemplos de tales artículos son productos de higiene femenina, artículos contra la incontinencia y pañales.

Como se describe en este documento, el término "GBS" se refiere a Streptococcus del grupo B.

Como se describe en este documento, el término "bacterias de ácido láctico" se refiere a bacterias que producen ácido láctico tales como bacterias que pertenecen al género Lactobacillus y Lactococcus.

El término "cfu" significa unidades que forman colonia.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se refiere a una nueva cepa de Lactobacillus plantarum, denominada LB931 (DSM11918). Esta cepa bacteriana es útil para prevenir y/o tratar infecciones urogenitales ya que inhibe el crecimiento de un gran número de microorganismos patógenos. La cepa es tolerable y sobrevive fácilmente a largos periodos de almacenamiento a temperatura ambiente. Por consiguiente, los productos que contienen LB931 tienen un largo periodo de validez. La cepa puede transferirse fácilmente a la piel humana y al epitelio vaginal. La LB931 es resistente a concentraciones terapéuticas de algunas sustancias antiobióticas y compuestos espermicidas.

Se han investigado las características de inhibición de LB931. Algunos ejemplos de bacterias que se inhibieron de forma satisfactoria son Escherichia, Klebsiella, Proteus, Staphylococcus y Streptococcus del grupo B. Por tanto, la LB931 es útil para prevenir y/o tratar infecciones causadas por estos microorganismos.

Como se ha indicado anteriormente, la presente invención también proporciona una diversidad de composiciones farmacéuticas, preferiblemente adecuadas para administración tópica, que comprenden LB931 junto con vehículos farmacéuticamente aceptables, excipientes y/o diluyentes. Generalmente, tales vehículos deben ser no tóxicos para los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas. Normalmente, la preparación de tales composiciones implica la combinación del agente terapéutico con tampones, agentes espesantes o agentes para formación de gel tales como glicerina, polietilenglicol, etc. Pueden incluirse antioxidantes tales como ácido ascórbico, polipéptidos de bajo peso molecular (menos de 10 restos), proteínas, carbohidratos incluyendo glucosa, sacarosa y dextrinas y otros estabilizantes y excipientes. Algunas composiciones farmacéuticas posibles son pomadas, cremas, soluciones líquidas, supositorios o cápsulas.

La presente invención también se refiere a artículos absorbentes que comprenden LB931. Tal artículo puede incluir una lámina exterior permeable para contacto íntimo con la piel del usuario, una lámina posterior preferiblemente impermeable pretendida para estar en posición distal con la respecto al usuario y una estructura absorbente que dispuesta entre la lámina exterior y la lámina posterior. En algunos casos puede interponerse una lámina adicional en forma de material acolchado o similar entre la lámina exterior y la estructura absorbente. Los microorganismos que muestran propiedades antagonistas pueden colocarse en distintas partes del artículo absorbente, por ejemplo en la lámina exterior, en la estructura absorbente del artículo absorbente, entre dos de las capas del artículo absorbente, en un producto suelto introducido en el artículo o de de alguna otra forma.

A continuación se describirá la presente invención con referencia a las figuras adjuntas, en las cuales:

La Fig. 1 es un diagrama que muestra la estabilidad de la LB931 liofilizada a temperatura ambiente (+22ºC) y a +6ºC;

La Fig. 2 es un diagrama que muestra la estabilidad de LB931 impregnada en un artículo absorbente;

Las Figs. 3 y 4 describen la cantidad de LB931 transferida al orificio uretral y piel perineal en chicas jóvenes después de usar un salvaslip que comprende LB931.

A continuación se describirá la presente invención con referencia a los siguientes ejemplos:

Ejemplo 1 Aislamiento y clasificación de Lactobacillus plantarum, cepa LB931

Se tomaron muestras bacterianas de mujeres sanas. De estas muestras, se aislaron muestras bacterianas y se seleccionaron en base a su capacidad para inhibir el crecimiento de enterobacterias (datos no mostrados). La mejor cepa, aislada de una mujer sana, se clasificó como Lactobacillus plantarum de acuerdo con el kit de ensayo API 50 CH (API systems, BioMerieux, FR), y se denominó LB931. La cepa se clasificó posteriormente por análisis de ADN con SDS-Page a BCCMILMG (Bélgica) como Lactobacillus plantarum-pentosus-paraplantarum.

Ejemplo 2 Capacidad de Inhibición de la cepa LB931

El propósito de este experimento fue ilustrar la capacidad de la cepa LB931 para inhibir el crecimiento de otras bacterias. Se cultivó LB931 en caldo de cultivo MRS (Merck, DE) a una temperatura de 37ºC en 5% de CO_{2} durante una noche. Se añadió un mililitro que contenía 10^{8} bacterias a 25 ml de agar fundido al 2% en caldo MRS. La mezcla se vertió en la placa de Petri, se dejó cuajar y se incubó como se ha descrito anteriormente durante 24 horas. Se vertieron otros 25 ml de agar M17 (Merck, DE) sobre la primera capa y las placas se dejaron a temperatura ambiente durante 4 horas. También se prepararon placas de agar similares sin LB931 y se usaron como placas de control.

La bacteria indicadora se cultivó por separado en medio TY (Holm y col., APMIS 1967; 69, 264) a 37ºC al aire. Los cultivos se traspasaron a una bandeja Bertani de 25 compartimentos, conteniendo cada compartimento 0,25 ml (10^{6} bacterias/ ml). Las bacterias de cada una de estas bandejas se traspasó y fijó en las placas de agar que contenían los Lactobacillus, usando el replicador de horquilla de acero de Steer (Steers y col. J. Antibiot. Chemother. 1979, 9, 307). Las placas se incubaron a 37ºC durante una noche. Las placas se leyeron y se determinó si a) se habían desarrollado la bacteria indicadora; b) se había inhibido el crecimiento de la bacteria indicadora; o c) no había tenido lugar crecimiento de la bacteria indicadora. También se controló el pH de cada una de las placas.

Los resultados de los ensayos de interferencia se muestran en la Tabla I.

TABLA I

1

Los resultados muestran que la Lactobacillus plantarum, LB931 inhibe o previene el crecimiento de un gran número de cepas bacterianas y que otras cepas de Lactobacillus no se ven afectadas.

Ejemplo 3 Capacidades de supervivencia de LB931 en distintas preparaciones

a) LB931 disuelta en una suspensión de leche desnatada y NaCl al 0,9% en partes iguales

Se disolvió LB931 en leche desnatada que contenía NaCl al 0,9% NaCl. Después, la bacteria disuelta se incubó a distintas temperaturas. La cantidad de bacteria se controló continuamente por recuento celular. Los resultados se describen a continuación en la Tabla II.

TABLA II

2

Los resultados muestran que LB931 es estable en una mezcla de leche desnatada y NaCl durante un periodo de un mes a +4ºC.

b) Una preparación en leche desnatada de LB931 se liofilizó de acuerdo con métodos convencionales. El polvo obtenido se almacenó en placas de Petri a temperatura ambiente a +6ºC. El número de bacterias se determinó después de 7 y 25 días, respectivamente. Los resultados de describen a continuación en la Tabla III.

TABLA III

3

El número de bacterias en el polvo liofilizado también se controló cada cuatro semanas hasta las 68 semanas. Estos resultados se presentan en la Fig. 1. En la figura es evidente que LB931 es estable a temperatura ambiente y a +6ºC hasta 22 semanas. Después de un año a +6ºC, más de 10^{5} cfu/mg LB931 son viables.

c) Se ensayó la capacidad de LB931 para sobrevivir en orina sintética, pH 6,6. La orina sintética contiene cationes y aniones mono- y divalentes así como urea y se preparó de acuerdo con las especificaciones de Geigy, Scientific Tables, vol. 2, 8º ed. 1981 p 53. A la orina sintética estéril se le añadió medio nutriente para microorganismos. El medio nutriente se preparó de acuerdo con datos de la composición de medio Hook y FSA. A un ml de orina sintética se le añadieron 10^{3} bacterias LB931 y las muestras se incubaron durante 18 horas a 32ºC. Después de la incubación el número medio de bacterias en la muestra fue > 10^{5}/ml. LB931 puede sobrevivir y cultivarse en orina sintética.

d) Se investigó la capacidad de LB931 para sobrevivir en un artículo absorbente (salvaslip). Se añadió una suspensión de LB931 (150 \mul) al artículo absorbente y este artículo se almacenó posteriormente en un envase cerrado herméticamente hasta 9 meses. Los resultados se muestran en la fig. 2A. Un gran número de bacterias sobrevivieron durante siete meses.

e) Finalmente, se comprobaron las características de LB931 durante un periodo de cultivo y almacenamiento. Se cultivó LB931 en caldo MRS y se realizó una nueva pasada cada tres días durante tres meses. Después de eso, la muestra inicial de LB931 y la última pasada se compararon en un ensayo API, PGFE y de interferencia. Las dos muestras fueron idénticas en todos los ensayos. Esto demuestra que LB931 es muy estable después del almacenamiento y varias pasadas en medio de cultivo.

Ejemplo 4 Transferencia de LB931 a piel perineal y orificio uretral en mujeres

Para estudiar la transferencia de LB931 al perineo cuando se usa un salvaslip se realizó la siguiente investigación. Todas las personas del ensayo fueron mujeres de entre 12 y 60 años y los ensayos se realizaron entre periodos menstruales en el caso apropiado. Los productos del ensayo se fabricaron con salvaslips convencionales que comprendían una capa exterior permeable a los líquidos, una capa secundaria posterior impermeable a los líquidos y entre medias una capa absorbente de 100-200 g/m^{2} de pulpa de celulosa. Por el lado absorbente del producto del ensayo se roció una suspensión de bacterias LB931 en una cantidad de 10^{9} unidades que forman colonia por producto.

Para determinar la presencia de LB931 en el perineo de las 13 personas del ensayo se realizó la llamada prueba del algodón. Las bacterias se recogieron frotando un palo estéril con una punta de algodón que se había sumergido en una solución de cloruro sódico estéril sobre un área definida de la piel. Se determinó la presencia de LB931 y otros LB en la piel perineal y en el orificio uretral. Las personas del ensayo fueron analizadas en este orden para establecer una muestra blanco. Después, las personas del ensayo usaron el salvaslip durante 5 horas por la mañana. El salvaslip se retiró y se determinó de nuevo la presencia de nuevas bacterias de ácido láctico y bacterias naturales de ácido láctico, inmediatamente después de retirar el salvaslip. Esta muestra se denominó muestra 1. Después de 4-5 horas más se tomó otra muestra y se denominó muestra 2. La bacteria del ácido láctico se identificó usando agar Rogosa con vancomicina para LB931 placas de agar Rogosa incubadas de forma anaeróbica para otros LB. La identificación posterior se realizó por API (BioMerieux, FR) y PFGE (electroforesis de campo por pulsos). Los resultados se muestran en la Tabla IV. La LB931 podía encontrarse en la piel perineal u orificio uretral de todas las mujeres que usaban el salvaslip rociado con LB931.

4

5

Ejemplo 5 Transferencia de LB931 a piel perineal y orificio uretral en chicas

Se incluyeron en el estudio trece chicas jóvenes de entre 3 y 12 años. Se obtuvieron muestras bacterianas de la piel perineal y orificio uretral mojando primero un algodón en caldo MRS, frotando después suavemente con el palo en la piel o superficie del epitelio. Finalmente, el algodón se introdujo en un tubo de muestra que contenía caldo MRS. Las muestras se obtuvieron de acuerdo con el siguiente esquema:

Muestra 0: Se obtuvo una muestra blanco la tarde antes de comenzar el estudio que comprende la bacteria LB931. Por lo tarde, el día 1, se empezó a usar el salvaslip.

Muestra 1: Mañana, día 2. Se lleva un nuevo salvaslip durante el día.

Muestra 2: Se toma una muestra por la tarde antes de un baño opcional y antes de usar un nuevo salvaslip. Tarde, día 2;

Muestra 3: Mismo procedimiento que para la muestra 1. Mañana, día 3;

Muestra 4: Mismo procedimiento que para la muestra 2. Tarde, día 3;

Muestra 5: Mismo procedimiento que para la muestra 1. Mañana, día 4

Muestra 6: Se toma una muestra por la tarde antes de un baño opcional. No se usa salvaslip durante la noche. Tarde, día 4;

Muestra 7: Se toma una muestra por la mañana del día 5. No se usa salvaslip durante el día

Muestra 8: La última muestra se toma por la tarde el día 5.

Los resultados se presentan en la fig. 3 (orificio uretral) y fig 4 (piel perineal). Los resultados muestran que la LB931 puede trasferirse desde un artículo absorbente.

Ejemplo 6 Sensibilidad a antibióticos y agentes espermicidas

Se determinaron los valores MIC de Lactobacillus plantarum LB931 usando un ensayo E (Brown y col. J Antimicrob Chem-other 1991;27:185-190). Los resultados se describen a continuación en la Tabla V.

TABLA V

Sustancia antibiótica	MIC \mug/ml
Ampicilina	0,19
Cefotaxima	0,094
Cefuroxima	0,38
Gentamicina	0,25
Imipenem	0,016
Metronidazol	>32
Eritromicina	0,25
Vancomicina	>256
Piperacina/Tazobactam	2
Tetraciclina	2
Trimetoprim	0,016
Bencilpenicilina	0,5

La sensibilidad a sustancias antibióticas también se determinó usando el sistema SIR. En la Tabla VI que se proporciona a continuación S significa sensible y R resistente.

TABLA VI

Sustancia antibiótica	Zona (mm)	Indicación
Cefadroxil	24	S
Clindamicina	35	S
Tri/sulfametoazol	43	S
Ceftazidima	35	S
Amikacina	30	S
Aztreonam	0	R
Mecillinam	0	R
Ácido nalidíxico	0	R
Netilmicina	0	R
Nitrofuantina	36	S
Norfloxacina	0	R
Tobramicina	32	S
Mecillinam/Ampicilina	41	S
Cefipirome	47	S
Oxacilina	0	R
Cefalotina	22	S

LB931 es sensible a algunos antibióticos prescritos normalmente para infecciones del tracto urinario pero LB931 también es resistente por ejemplo a ácido nalidíxico y Norfloxacina. LB931 también es resistente a Vancomicina.

También se realizaron ensayos MIC para el agente espermicida Tergitol. Se cultivó LB931 en agar MRS en CO_{2} al 5%, a 37ºC durante 48 horas. Las bacterias se inocularon en 3 ml de caldo MRS y se incubaron durante 10 horas en las mismas condiciones que antes. Se reinoculó un 1,5% del cultivo en 3 ml de caldo MRS y se incubó en las mismas condiciones durante 18 horas. Se diluyó Tergitol NP-9 (Sigma, US) Lote 47F0002 en caldo MRS que tenía una temperatura de 37ºC (viscosidad reducida) en una solución madre del 40%. Usando esta solución madre, se prepararon soluciones de 3 ml con las siguientes concentraciones: 0 %; 5 %; 10 %; 20 %; 30 %; y 40 %. Se añadieron 10 \mul de cultivo bacteriano a cada solución. La solución blanco se mezcló y añadió a las placas de agar MRS. Las placas se cultivaron en CO_{2} al 5%, 37ºC durante 48 horas para determinar la densidad celular. El resto de soluciones se incubaron sin mezcla en CO_{2}, 37ºC, durante 18 horas. Las soluciones que contenían 30% y 40% de NP-9 se diluyeron en caldo MRS a 37% (viscosidad reducida). Todas las soluciones se mezclaron enérgicamente; se diluyeron en NaCl estéril al 0,9% y se añadieron a placas de agar MRS. Las placas se incubaron en CO_{2} al 5%, 37ºC durante 48 horas para determinar las cfu/ml.

Los resultados se describen a continuación en la tabla VII:

La cantidad inoculada de LB931 fue 1,0x10^{7} cfu

Tergitol NP-9	Cfu/ml LB931
0%	2,6x10^{9}
1%	2,5x10^{9}
5%	2,5x10^{9}
10%	1,6x10^{9}
20%	1,4x10^{9}
30%	1,0x10^{9}
40%	6,9 x 10^{7}

Los resultados muestran que LB931 puede sobrevivir hasta en Tergitol NP-9 al 40%.

Ejemplo 7 Adherencia de LB931 a células epiteliales vaginales

a) Preparación de una suspensión de LB931

Se cultivó LB931 en agar MRS (CO_{2} al 5%, 37ºC; 48 horas). El cultivo se inoculó en 3 ml de caldo (CO_{2} al 5%; 37ºC; 8 horas). El 2% del cultivo resultante se inoculó a 10 ml de caldo MRS (CO_{2} al 5%; 37ºC; 18 horas). El cultivo resultante se centrifugó durante 8 minutos a 20ºC y a 2000 rpm en un rotor oscilante (820 x g). El gránulo celular obtenido se lavó en 5 ml de tampón de ácido láctico (ácido láctico 10 mM, pH 4,5, NaCl 0,15 M). Las bacterias se diluyen en ácido láctico hasta que la OD_{500} es aproximadamente 1,0 (aproximadamente 10^{8} cfu/ml)

b) Preparación de células epiteliales vaginales:

Las células vaginales se recogieron usando un palo estéril con un algodón y las células se traspasaron a un tampón ácido o PBS en un tubo pequeño. El tubo se mezcló y se retiró el palo con el algodón. El tubo se centrifugó a 700 rpm a 20ºC durante 8 minutos en un rotor oscilante Jouan CR-12 (\sim 100 x g) y el gránulo obtenido se lavó en 3 ml de tampón de ácido láctico o PBS. Las células se contaron en un hematocitómetro y la concentración se ajustó a 10^{5}-10^{6} células/ml usando tampón de ácido láctico o PBS. Se extendieron 25 \mul de células en una placa de microscopio para controlar el procedimiento de lavado (véase a continuación).

c) Ensayos de adherencia

Se mezclaron 0,5 ml de suspensión LB931 y 0,5 ml de suspensión celular en un tubo eppendorf de 1,5 ml. Se preparó una muestra de control mezclando 0,5 ml de suspensión celular y 0,5 ml de tampón. Los tubos se centrifugaron a 20ºC y 2000 rpm (\sim 720 x g) y se incubaron posteriormente durante 1 hora a 37ºC. Después de la incubación, los tubos se centrifugaron durante 8 minutos a 20ºC a 7000 rpm (90 x g). Los gránulos se lavaron en 1 ml de tampón de ácido láctico o PBS. Finalmente, el gránulo se suspendió en 400-500 \mul de tampón de ácido láctico o PBS.

d) Análisis

Se dejaron secar al aire 25 \mul de un gránulo suspendido en una placa de microscopio seguido de fijación y pigmentación Gram. De cada muestra se analizan 50 células epiteliales. Se cuenta el número de LB931 adheridas a las células y los resultados se dividen en cinco grupos (0-10, 11-30, 31-50, 51-100, >100 bacterias/célula).

Los resultados se describen a continuación en la Tabla VIII:

TABLA VIII

Número de personas en el ensayo: 5
Momentos de muestreo: antes de menstruación (am);
ovulación (ov)
Células	LB931 adheridas / célula epitelial
epiteliales
muestras	0-10	11-30	31-50	51-100	>100
(am) incubadas con LB931, pH 4,5	17,2*	24,8	14,4	15,6	28,0
(am) células de control incubadas, pH	99,6	0,4
(Ov) incubadas con LB931, pH 4,5	8,4	22,8	19,2	20,0	29,6
(Ov) células de control incubadas, pH 4,5	98,4	1,6
* Las cifras son en porcentajes

Los resultados muestran claramente que las bacterias LB931 se adhieren bien a las células epiteliales vaginales independientemente de cuando se toman las muestras.

Claims

1. Lactobacillus plantarum, cepa LB931, que se ha depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, y se le ha asignado el número de identificación DSM 11918.

2. Lactobacillus plantarum, cepa LB931, que se ha depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen y se le ha asignado el número de identificación DSM 11918, para uso médico.

3. Una composición farmacéutica que comprende Lactobacillus plantarum, cepa LB931, que se ha depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen, y se le ha asignado el número de identificación DSM 11918, junto con un vehículo y/o diluyente farmacéuticamente aceptable.

4. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizada por que también comprende otras bacterias del ácido láctico.

5. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3 que comprende de 10^{4} a 10^{11} cfu, preferiblemente de 10^{5} a 10^{9} cfu, LB931.

6. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 3 que es una suspensión, pulverizador, gel, crema, polvo, cápsula o inserto vaginal.

7. Un producto absorbente, tal como un producto de higiene femenina, pañal, compresa, salvaslip o artículo contra la incontinencia, caracterizado porque comprende Lactobacillus plantarum, cepa LB931, que se ha depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen y se le ha asignado el número de identificación DSM 11918.

8. Un producto absorbente de acuerdo con la reivindicación 7 que comprende de 10^{4} a 10^{11} cfu, preferiblemente de 10^{5} a 10^{9} cfu, LB931.

9. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 5 en la que dicho vehículo farmacéuticamente aceptable es leche desnatada o un factor de crecimiento de lactobacilo en polvo u otra forma.

10. Uso de Lactobacillus plantarum, cepa LB931, que se ha depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen y se le ha asignado el número de identificación DSM 11918, para preparar una composición farmacéutica para prevenir y/o tratar infecciones urogenitales, tales como la colonización de enterobacterias.

11. Uso de Lactobacillus plantarum, cepa LB931, que se ha depositado en Deutsche Sammlung von Mikroorganismen y se le ha asignado el número de identificación DSM 11918, para producir un producto absorbente, tal como un pañal, compresa, salvaslip o artículo contra la incontinencia, adecuado para prevenir y/o tratar infecciones urogenitales, tales como la colonización de enterobacterias.