ES2228536T3 - Soporte macromolecular a base de dextrano para un farmaco y suministro de un agente de diagnosotico. - Google Patents

Abstract

Una molécula soporte. Específicamente, es un objeto de la invención el proporcionar un sistema de suministro nuevo o perfeccionado de una macromolécula para agentes de cualquier tipo, diagnósticos, terapéuticos o de otra clase. Otro objeto de la invención es el de proporcionar una macromolécula relativamente no tóxica que posea una alta densidad de sitios de unión con respecto a la anteriormente descrita en la técnica. Otro objeto de la invención es el de mejorar el éxito en el suministro y reducir los volúmenes de administración en las técnicas que emplean las estructuras macromoleculares como vehículos de suministro. Todavía, otro objeto de la invención es el de proporcionar una macromolécula que sea altamente disponible, relativamente económica y de valor demostrable en la investigación científica y en medicina. Otro objeto de la invención es el de describir la síntesis química y el producto de los nuevos ligandos de unión química que tienen una flexibilidad adecuada.

Description

Soporte macromolecular a base de dextrano para un fármaco y suministro de un agente de diagnóstico.

Antecedentes de la invención

El campo de la invención se refiere a productos terapéuticos y de diagnóstico que emplean macromoléculas como agentes de suministro.

El empleo o hipotético empleo de ciertas macromoléculas como agentes de suministro para fármacos adjuntos diana y agentes de diagnóstico, es ya conocido, pero habitualmente no sin severas limitaciones. Las tentativas con productos terapéuticos han logrado solamente éxitos clínicos limitados debido a la falta de estructuras moleculares que no sean caras ni tóxicas, a las cuales puedan unirse los fármacos y los substratos diana de suficiente carga. Problemas similares entorpecen las técnicas cardiovasculares habituales y de obtención de imágenes de tumores, que emplean agentes adjuntos para la obtención de imágenes de resonancia magnética (MRI) y tomografía computerizada
(CT).

El interés se ha centrado por lo tanto sobre las estructuras moleculares de agentes de suministro, cuya función es servir de soporte a fármacos, substratos, y moléculas para la obtención de imágenes y otras moléculas de diagnóstico para el suministro a tejidos celulares específicos. Las estructuras empleadas más habitualmente hasta la fecha son el dextrano, polilisina, copolímeros sintéticos, dendrímeros "descarga de estrellas", y albúmina de suero humano.

El dextrano, un polímero de glucosa ramificado, ha sido ampliamente experimentado en humanos, y posee el ratio más alto de sitios de unión por peso molecular. Es también muy hidrofílico, lo cual permite un volumen bajo de inyección. Aunque el dextrano es relativamente económico, tiene la desventaja de tener una insuficiente flexibilidad química en sus habituales sitios de unión y una alta incidencia de reticulación no deseada que resulta de los medios estándar de unión.

La polilisina en cambio, es extremadamente cara y tiene una muy limitada experiencia en humanos. A pesar de ello, la polilisina tiene la ventaja de estar disponible en varias longitudes de cadena y la ventaja adicional de que sus cadenas laterales son fácilmente dóciles a la unión química de los fármacos y los substratos de receptor. En consecuencia, la polilisina se emplea frecuentemente para ensayar prospectivamente sistemas de suministro de fármacos en animales.

Los copolímeros sintéticos, p. ej., como describe Krinick et al., en Makromol. Chem. 191:839-856 (1990), poseen una linealidad y una carga neta neutra las cuales aumentan la difusión. Los copolímeros sintéticos ofrecen la ventaja adicional de que pueden ser sintetizados en grandes cantidades. Sin embargo, su síntesis requiere muchos pasos que si bien no son complejos, consumen en cambio mucho tiempo, son caros, y por lo tanto ineficaces. Además, existe una limitada experiencia de su empleo en humanos en los antecedentes de los copolímeros sintéticos.

Los dendrímeros "estallido de estrellas" (ver Tomalia et al., (1985) en Polymer J. 17:117-132) son ventajosos en que proporcionan menos heterogeneidad de pesos moleculares, y por lo tanto proporcionan mas reproducibilidad y capacidad de predicción. Sin embargo, tienen las desventajas de que (1) presentan un bajo e inadecuado números de sitios de unión por estructura, y (2) tienen una limitada experiencia de empleo en humanos. Similares desventajas caracterizan el empleo de la albúmina de suero humano.

A la luz de lo anterior, es muy necesario poder disponer de un vehículo que suministre una estructura molecular económica y no tóxica, que tenga una gran capacidad de uniones de alta densidad molecular.

Resumen de la invención

Es objeto de la invención el solventar o mejorar uno o más de los problemas citados más arriba en el campo de la especialidad, y proporcionar alternativas útiles.

Específicamente, es un objeto de la invención el proporcionar un sistema de suministro nuevo o perfeccionado de una macromolécula para agentes de cualquier tipo, diagnósticos, terapéuticos o de otra clase.

Otro objeto de la invención es el de proporcionar una macromolécula relativamente no tóxica que posea una alta densidad de sitios de unión con respecto a la anteriormente descrita en la técnica.

Otro objeto de la invención es el de mejorar el éxito en el suministro y reducir los volúmenes de administración en las técnicas que emplean las estructuras macromoleculares como vehículos de suministro.

Todavía, otro objeto de la invención es el de proporcionar una macromolécula que sea altamente disponible, relativamente económica y de valor demostrable en la investigación científica y en medicina.

Otro objeto de la invención es el de describir la síntesis química y el producto de los nuevos ligandos de unión química que tienen una flexibilidad adecuada.

De acuerdo con uno o más de estos objetivos, en un primer aspecto, la invención presenta una molécula soporte que comprende una estructura, teniendo esta estructura fijados a la misma una pluralidad de grupos ligandos que tienen la estructura O(CH_{2})_{3}S(CH_{2})_{2}NH_{2}.

En las versiones preferidas, la estructura deriva de un polisacárido, de preferencia el dextrano, y las estructuras de ligandos se obtienen mediante la reacción de un grupo alilo con aminoetanotiol. Cuando se emplea el dextrano, éste puede seleccionarse de cualquier peso molecular apropiado para el empleo final de la molécula, sus ligandos y conjugados. Las diferentes aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas necesitarán dextranos con diferentes PM, como ya conoce toda persona experta en esta técnica.

En muchas versiones ventajosas, se prefiere que por lo menos un grupo químico esté conjugado a la estructura mediante grupos amino de los ligandos. Estos grupos químicos pueden seleccionarse entre uno cualquiera de una variedad de compuestos que tienen empleos terapéuticos o diagnósticos útiles, incluyendo pero sin limitarse a: quelatos, ligandos receptores, lectinas, substratos enzimáticos, ácidos nucleicos, péptidos, polisacáridos, monosacáridos, radiosensibilizadores, radioprotectores, y colorantes. Los grupos no necesitan ser directamente útiles, pero pueden ser indirectamente útiles permitiendo la detección selectiva de dianas de una célula dada o un tipo de tejido de tal forma que otro grupo funcional unido a la estructura pueda desarrollar la función afirmativa o negativa deseada.

La alta carga y densidad de los ligandos por estructura no tóxica, constituye un importante aspecto de la invención debido a las importantes ventajas cinéticas que se obtienen para la unión y suministro. Así, pueden suministrarse moléculas relativamente más terapéuticas o diagnósticas para cumplir su finalidad. Esto puede incluir el caso muy simple en el cual los ligandos de alta densidad pueden unirse simplemente a la molécula estructural de tal forma que los mismos bloquean más efectivamente ciertos receptores cuando son administrados o contactados a los mismos o con los mismos. Los receptores cumplen una función bioquímica celular. El bloqueo de esta función puede tener un valor terapéutico de utilidad para una indicación y contexto dados. Así, se contemplan los antagonistas capaces de una inhibición competitiva o no competitiva, con agentes biológicos normales y anormales.

Los agonistas pueden emplearse también para obtener el efecto deseado en el que pueden señalizar o estimular la endocitosis del grupo estructural y agentes al cual están unidos, o pueden señalizar una cascada intracelular. Los expertos en la técnica reconocerán el amplio margen de aplicaciones e implicaciones para las muchas versiones de la invención.

En versiones especialmente preferidas, la estructura lleva un ligando que tiene una afinidad específica para un tejido o célula tipo dado, y una molécula de quelante. El quelante tiene normalmente grupos de nitrógeno que poseen electrones libres que se adhieren fuertemente a los átomos y iones metálicos cargados positivamente. Los quelantes preferidos para emplear con la invención incluyen el DOTA, MAG3 y el DTPA. El DOTA se prefiere especialmente debido a que su geometría se acomoda convenientemente y fuertemente al átomo de gadolinio, el cual puede ser empleado tanto para la tomografía computerizada (CT) como para la formación de imágenes por resonancia magnética (MRI). El quelante MAG3 se prefiere para la formación de complejos con el radioelemento tecnecio-99m (Tc-99m) el cual tiene una vida mitad relativamente corta de 6 horas. Esta vida mitad es compatible con procesos biológicos y protocolos clínicos, es de suficiente duración para la detección de los nódulos centinela para permitir a un cirujano evaluar la precisa situación y extensión de p. ej., el crecimiento de un tumor o metástasis y eliminarlo. Esta particular combinación tiene así una excelente aplicación en medicina nuclear.

En otras versiones, no necesariamente mutuamente exclusivas, el quelante puede combinarse con un isótopo o un elemento no radiactivo, p. ej., un elemento absorbente (alta densidad) o un átomo paramagnético, teniendo cada uno una especial aplicación, respectivamente, en tomografía computerizada y en procedimientos de formación de imágenes por resonancia magnética nuclear o magnética. Estos son procedimientos de diagnóstico que permiten la formación de una imagen de varias estructuras fisiológicas o anatómicas que tienen características de alta densidad o átomos paramagnéticos introducidos. Estos procedimientos de diagnóstico pueden ser o pueden no ser empleados como preludio de procedimientos terapéuticos.

Es posible también, empleando versiones de la invención, realizar procedimientos tanto diagnósticos como terapéuticos a la vez, p. ej., cuando algunos de los ligandos de la estructura están conjugados con un agente de diagnóstico, y otros ligandos están conjugados con un agente terapéutico.

Con respecto a la detección de nódulos centinela, este procedimiento particular de diagnóstico es más ventajoso debido a su alta estabilidad, no toxicidad, y alta carga y afinidad suministrada por la invención para mejorar la diferenciación, aislamiento, y extirpación. Este procedimiento empleará habitualmente un quelante unido a un ligando de la invención, al cual puede unirse además un átomo radiactivo tal como el tecnecio 99m. Otras posibilidades para la invención incluyen el empleo del gadolinio, disprosio, yterbio, indio y otros elementos que poseen propiedades útiles.

Para lograr selectivamente los requisitos anteriores es necesario el empleo adicional y utilización de un substrato receptor, p. ej., manosa, galactosa, péptidos, etc. El empleo del término substrato no implica necesariamente la capacidad de actuar sobre una enzima, pero puede, y de preferencia es así, referirse a una simple unión ligando-receptor. Así, el término "ligando" puede tomar varias formas y significados, y puede ser empleado como sinónimo de "substrato receptor" como se usa en el presente escrito. La selección de un ligando o substrato receptor deseado para seleccionar un receptor dado está dentro del nivel del experto en la técnica. Se conocen literalmente miles de interacciones, las cuales pueden aprovecharse para una aplicación dada. Además, el receptor seleccionado puede ser de origen vírico, bacteriano, protozoario, fúngico, vegetal, insecto y no necesariamente animal o mamífero.

En términos del grado de alilación, la unión de ligandos y la conjugación puede ser cualquiera de 1 a 100%, con preferencia, de 100%. Sin embargo, cuando no todos los ligandos están conjugados al final, otras versiones pueden contemplar la adición de moléculas "de bloqueo" sin carga, p. ej., un grupo metilo, alquilo o arilo, al terminal o terminales amino libre de tal forma que el conjunto de moléculas está menos cargado. En muchas aplicaciones, es mejor una carga más pequeña, como conoce bien la persona experta en la técnica.

En un segundo aspecto, la invención se refiere además de los productos y aplicaciones del primer aspecto, a métodos de producción de moléculas soporte exentas substancialmente de reticulación, que tienen una pluralidad de ligandos con terminales amino. Por "substancialmente exentas de reticulación" se entiende, reticulaciones introducidas por el hombre entre moléculas del mismo tipo, p. ej., unidades de glucosa en la misma molécula de dextrano. El término no significa que abarca la conjugación específica propuesta de heteromoléculas como se describe en la presente invención para los ligandos de la estructura. Se tiene en cuenta además, que las estructuras p. ej., los polisacáridos, pueden empezar por vía natural a reticularse; el término "exento substancialmente de reticulación", excluye específicamente este fenómeno.

El término "substancialmente" se emplea para dar a entender que todavía puede sin embargo tener lugar una cierta reticulación mínima aberrante, p. ej., debido a la presencia de contaminantes o al empleo de condiciones de unión inferiores a las óptimas, pero este tipo de reticulación limitada es tolerable. A este respecto, el término se emplea para indicar que el principal objetivo de la invención (para impedir, controlar o minimizar los fenómenos de reticulación provocados por el hombre, asociados con la introducción de ligandos convencionales a una estructura) no está significativamente comprometido. Como se ha indicado, los procedimientos convencionales han sido invalidados a este respecto, y la invención rectifica significativamente esto mediante el empleo p. ej., de grupos bifuncionales tales como los empleados en la versión preferida como es el caso del aminoetanotiol. Con anterioridad a la invención, era difícil si no imposible, controlar estas "reacciones laterales" no deseadas, el resultado de las cuales era el incremento del peso molecular hacia arriba y de una inferior solubilidad hacia abajo, de los limites tolerables y útiles.

Una versión preferida del método comprende de preferencia una molécula estructural que tiene una pluralidad de grupos hidroxilo, alilando por lo menos una parte de dichos grupos hidroxilo de dicha molécula estructural para producir un derivado alílico de dicha estructura, haciendo reaccionar dichos grupos alílicos de dichos derivados alílicos con un compuesto que contiene un terminal amino, y un segundo terminal siendo dicho segundo terminal específicamente reactivo con dichos grupos alilo de dicho derivado alílico; y haciendo reaccionar dichos derivados alílicos con dicho compuesto para producir una molécula soporte substancialmente libre de reticulado, que tiene una pluralidad de ligandos terminales amino.

En versiones preferidas, la estructura es, de nuevo otra vez, un polisacárido, de preferencia dextrano. De preferencia, aunque no necesariamente, el compuesto empleado para crear y fijar los ligandos a la molécula estructural de los derivados alílicos es el aminoetanotiol.

En otras versiones del método, la conjugación se contempla como se ha descrito en el primer aspecto, p. ej., empleando por lo menos un miembro seleccionado del grupo que consiste en quelantes, ligandos receptores, substratos enzimáticos, ácidos nucleicos, péptidos, polisacáridos, mono-sacáridos, radiosensibilizadores, radioprotectores y colorantes. Los colorantes pueden ser fluorescentes o bien pueden distinguirse empleando medios visibles y/o medios auxiliares de uso corriente en la técnica.

Otras versiones del método siguen la senda de aquellas ya indicadas en el primer aspecto.

Todavía, otros aspectos de la invención son productos más específicos y productos-en-proceso. Por ejemplo un agente de MRI sintetizado a partir de la molécula del primer aspecto, se reivindica como un agente de MRI obtenido de acuerdo con los métodos del segundo aspecto. También se reivindica un agente de CT sintetizado a partir de, o de acuerdo con, uno cualquiera de los dos primeros aspectos. Finalmente, se reivindican agentes de obtención de imágenes de nódulos centinelas, que presentan o emplean el primero o segundo aspecto, y cualquier combinación factible de estas versiones específicas de aspectos.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 muestra una versión de la secuencia para efectuar el copulado covalente de sitios de unión a una estructura macromolecular.

La figura 2 muestra una versión de la invención, que es un agente de CT de sangre venosa acumulada que contiene una estructura (dextrano), un quelante (DTPA), y un átomo paramagnético (disprosio).

La figura 3 muestra una versión de la secuencia para la copulación del DTPA a los sitios de unión.

La figura 4 muestra una versión de la secuencia para la copulación de DOTA a los sitios de unión.

La figura 5 muestra una versión de la secuencia de copulación del MAG3 a los sitios de unión.

La figura 6 muestra una versión de un agente MRI de un nódulo linfático que contiene un substrato receptor (manosa), una estructura (dextrano), un quelante (DOTA), y un informador de MRI (gadolinio).

La figura 7 muestra la fórmula para una versión de un agente de detección de un nódulo centinela que contiene un substrato receptor (manosa) una estructura (dextrano), un quelante (DTPA) y un átomo radiactivo (Tc-99).

La figura 8 muestra una versión del procedimiento para la copulación de manosa a los sitios de unión.

La figura 9 muestra la fórmula de una versión de un agente de detección de un nódulo centinela, que contiene un substrato receptor (manosa), una estructura (dextrano), un quelante (MAG3) y un átomo radiactivo (Tc-99m).

La figura 10 es una gráfica del tanto por ciento de la dosis inyectada en función del tiempo mostrando la absorción del nódulo centinela de TcMAG3-manosil-dextrano (símbolos en negro) y de Tc-azufre coloidal (símbolos en blanco).

La figura 11 es una gráfica del tanto por ciento del logaritmo de la dosis inyectada en función del tiempo mostrando el aclaramiento del TcMAG3-manosil-dextrano (símbolos en negro) y Tc-azufre coloidal (símbolos en blanco).

La figura 12 muestra imágenes de los nódulos linfáticos axilares del conejo (indicados con flechas), obtenidas 15 minutos después de la administración subcutánea de TcMAG3-manosil-dextrano (planta del pié derecho) y TcSC (planta del pié izquierdo). Los sitios de inyección están en la parte superior de la imagen. Hay un par de estándares en cada lado del conejo. Además de los nódulos centinela bilaterales, un foco central de actividad adyacente al nódulo centinela izquierdo representa la actividad TcSC en un nódulo distal.

La figura 13a muestra la fórmula de una versión de un agente de obtención de imágenes MR de dianas selectivas de hepacitos que contiene un substrato receptor (galactosa), una estructura (dextrano) un quelante (DOTA) y un átomo paramagnético (Gd).

La figura 13b muestra la fórmula de una versión de un agente para la obtención de imágenes nucleares de dianas selectivas de hepatocitos, que contiene un substrato receptor (galactosa), una estructura (dextrano) un quelante (MAG3) y un átomo radiactivo (Tc-99m).

La figura 14a muestra la progresión en el curso del tiempo, en la vena cava inferior, el hígado, y el tumor, después de la inyección de un agente CT para obtención de imágenes de una acumulación de sangre, empleando una versión de la invención DyDTPA-dextrano.

La figura 14b muestra la progresión en el curso del tiempo en el córtex renal, médula renal, y bazo, después de una inyección de un agente CT para obtención de imágenes de una acumulación de sangre, empleando una versión de la invención DyDTPA-dextrano.

La figura 14c muestra el progreso en el curso del tiempo, en la vena cava inferior e hígado después de una inyección de un agente de contraste CT comercialmente disponible, Opitray-320.

La figura 14d muestra el progreso en el curso del tiempo, en el córtex renal y médula renal después de una inyección de un agente de contraste CT comercialmente disponible, Opitray-320.

La figura 15a muestra la distribución de tamaños de la albúmina de suero humano medida mediante FPLC. El volumen vacío (Vo) y el volumen total (Vt) de la columna están indicados.

La figura 15b muestra la distribución de tamaños de una versión del Dy-DTPA-dextrano de la invención medida mediante FPLC. El volumen vacío (Vo) y el volumen total (Vt) de la columna están indicados.

Las figuras 16a y 16b son ejemplos de obtención de imágenes MR de una acumulación de sangre mostrando imágenes de un conejo portador de un tumor (figura 16a) y una hora después (figura 16b) de la inyección de GdDTPA-dextrano.

Las figuras 17a-e son ejemplos de imágenes CT de una acumulación de sangre de un conejo portador de un tumor antes de la inyección y a 2, 5, 30 y 37 minutos después de la inyección de [Dy]DTPA-T40, respectivamente.

Las figuras 18a, 18b, 18c y 18d son imágenes CT de una acumulación de sangre, mostrando una serie de tiempos de secciones transversales del hígado antes (figura 18a) y 2 minutos (figura 18b), 5 minutos (figura 18c), y 10 minutos (figura 18d), después de una inyección de Optiray-320 a un conejo sano.

Las figuras 19a-b son ejemplos de empleo de imágenes MR de una acumulación de sangre y la versión de la invención en donde la figura 19a es una imagen de proyección de intensidad máxima de un conejo sano obtenida 15 minutos después de una inyección de GdDTPA-dextrano (PM = 398.000 g/moles, 515 Gd por dextrano), y la figura 19b es una imagen similar del mismo animal obtenida tres horas después de la inyección.

La presente invención será mejor comprendida a partir de la descripción detallada de las versiones de ejemplos de la invención.

Descripción detallada

La invención se refiere a la detección selectiva de dianas mediante fármacos y agentes de diagnóstico en tejidos específicos empleando un vehículo macromolecular de suministro. Con anterioridad, se había logrado solamente un limitado éxito clínico para esta clase de vehículos debido a la falta de estructuras moleculares económicas y no tóxicas a las cuales pudieran unirse fármacos y substratos diana. La invención propone una solución, proporcionando nuevas macromoléculas producidas por nuevos procedimientos que suprimen reticulaciones innecesarias a la vez que preserva la no toxicidad, y optimizando ligandos y la capacidad de carga por tamaño de la estructura.

Aunque es de utilidad cuando se combina o conjuga con agentes terapéuticos, la invención es especialmente útil para la obtención de imágenes cardiovasculares y/o tumores. Un agente de contraste cardiovascular y tumores para obtención de satisfactorias imágenes de resonancia magnética (MRI) o tomografía computerizada (CT) debería poseer una estructura molecular económica y no tóxica capaz de ser portadora de un alto número de substratos de contraste. Antes de la invención, esto no ocurría.

Una versión de la invención presenta un esquema químico para la obtención de una macromolécula económica con un gran número de sitios de unión denominados "ligandos". Un número alto (centenares) de ligandos por molécula estructural permite la unión de una alta densidad de substratos, fármacos, y/o otras entidades moleculares.

Una característica adicional de utilidad puede encontrarse en una versión preferida en la cual la estructura de la macromolécula es el dextrano. El dextrano tiene unos excelentes antecedentes de seguridad como dilatador del volumen vascular. El muy difundido uso del dextrano en humanos aumenta la probabilidad de que el fármaco suministrado o el agente de diagnóstico tampoco será tóxico.

Existen muchos usos potenciales para la invención, p. ej., como producto farmacéutico (es decir, terapéutico) y como agente de diagnóstico (es decir, sondas). En teoría, casi todas las drogas puede emplearse con la invención, siendo los siguientes empleos los más especialmente previstos: unión con radioprotectores, tales como WR2721 (Rasey JS et al. Specific protection of different normal tissues. ("Protección específica de diferentes tejidos normales"). Pharmac Ther 39:33-43, 1988), quimioprotectores, tales como la Amifostine (etiol) (Capizzi RL. Protection of normal tissues from the cytotoxic effects of chemotherapy by amifostine (ethyol): clinical experiences ("Protección de los tejidos normales de los efectos citotóxicos de la quimioterapia mediante la amifostina (etiol): experiencias clínicas"). Semin Oncol 21 (S11):8-15 (1994)), y moléculas radiosensibles, tales como el Misonidazol (Phillips TL. Sensitizers and protectors in clinical oncology ("Sensibilizadores y protectores en oncología clínica") Semin Oncol 8:67-82, 1881) y substratos receptores apropiados para la protección o sensibilización específica del tejido; unión de fármacos antivíricos y substratos de receptores apropiados para terapia antivírica específica de tejidos, p. ej., para el tratamiento de la hepatitis; unión de inmunomoduladores y substratos de receptores apropiados o ligandos para la inmunoterapia específica de tejidos; unión del ADN y substratos de receptor apropiados para la terapia génica específica de tejidos, p. ej., dirigiendo selectivamente a dianas el p52 ó genes suicidas al interior de las células cancerígenas para inducir la apoptosis, dirección selectiva inmunológica a dianas, etc.; y unión de péptidos y mono o polisacáridos para la dirección selectiva a receptores específicos. Ver p. ej., Molteni L (1979), Dextrans as drug carriers ("Dextranos como soportes de fármacos"). En: Gregoriadis G, ed. Drug Carriers in Biology and Medicine ("Soportes de fármacos en Biología y Medicina"). San Diego, Academic Press; 107-125.

Con respecto a su empleo como productos para diagnóstico, se contemplan especialmente los siguientes empleos: unión de complejos de gadolinio para obtención de imágenes de resonancia magnética (MRI) de los vasos cardiovasculares y/o tumores; unión de moléculas yodadas para la formación de imágenes en tomografía computerizada (CT) de los vasos cardiovasculares y/o tumores; unión del yterbio, disprosio u otros complejos de metales pesados para la obtención de imágenes por tomografía computerizada (CT) de vasos cardiovasculares y/o tumores; unión de complejos de tecnecio-99m para la formación de imágenes por escintigrafía de los vasos cardiovasculares y/o tumores; unión de complejos de gadolinio y substratos de receptor apropiados para la obtención de imágenes específicas del tejido del hígado, nódulos linfáticos, médula espinal y/o otros tejidos; unión de moléculas yodadas y substratos de receptor apropiados para la formación de imágenes CT específicas de tejidos; unión del yterbio, disprosio u otros complejos de metales pesados y substratos de receptor apropiados para la formación de imágenes CT específicas de tejidos: unión de complejos de tecnecio-99m y substratos de receptor apropiados para la escintigrafía de tejidos específicos; y unión de colorantes y agentes fluorescentes para formación de imágenes ópticas.

De nuevo, los empleos precedentes son solamente ilustrativos de las muchas aplicaciones posibles para las cuales puede emplearse la invención. A continuación siguen ejemplos específicos para algunas de estas aplicaciones; otras aplicaciones son fácilmente deducibles y podrán ser llevadas a la práctica por una persona normalmente experta en la técnica a la vista de la aplicación.

Ejemplo 1 Unión de ligandos a la estructura molecular

El dextrano, una versión preferida para la estructura molecular de la invención, posee como muchos polisacáridos y polisacáridos ramificados, una plétora de grupos hidroxilo reactivos en los cuales pueden efectuarse uniones químicas. El dextrano es un producto natural derivado de las bacterias. Se aisla en una forma de alto peso molecular y puede ser hidrolizado y purificado de forma controlada en varias formas de peso molecular más pequeño, p. ej., peso molecular ("PM") 1.000, 10.000, 40.000, 70.000, 110.000, 150.000 y 500.000 (Amersham Pharmacia Biotech, USA). Cada una de las especies de PM de la relación anterior pueden emplearse con la invención y cada una puede tener un efecto más o menos apropiado para una aplicación dada. Por ejemplo, para la formación de imágenes tumorales se seleccionaría un dextrano con un tamaño que después de la conjugación de los ligandos y grupos informativos daría un peso molecular final en el margen de 50 a 70 kilodaltons (kD). Esto permitiría la difusión selectiva en los tumores, los cuales tienen una permeabilidad mayor que el tejido normal (ver Seymour LW. Passive tumor targeting of soluble macromolecules and drug conjugates. Critical Reviews of Therapeutic Drug Carrier Systems ("Detección de tumores pasivos por macromoléculas solubles y conjugados de fármacos. Revisión crítica de sistemas soporte de fármacos terapéuticos") 9:135-187 (1992)). La formación de imágenes de estructuras cardiovasculares requerirá conjugados con pesos moleculares en el margen de 70 a 100 kD. El límite inferior se ajusta según se desee minimizar la filtración renal. El límite superior se ajusta por el aumento de viscosidad de las macromoléculas de alto peso molecular, lo cual crea problemas en la administración.

Como se ha mencionado anteriormente, se dispone de muchos datos farmacológicos para el dextrano, basados en su amplio uso como dilatador del volumen del plasma, en donde ha demostrado persistir durante varias semanas después de la infusión en pacientes y durante cuyo tiempo se ha oxidado gradualmente en formas más pequeñas y eliminado mediante los riñones. Ver Goodman y Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics ("Bases farmacológicas de los productos terapéuticos"), octava edición, págs. 690-91, Pergamon Press, Nueva York, (1990).

La unión a los ligandos fue un proceso de dos pasos como se muestra en la figura 1. El primer paso es la activación de las unidades hidroxilo del dextrano con bromuro de alilo (Holmberg, 1993; Gedda, 1996). Esta activación con bromuro de alilo y subsiguiente reacción con cisteamina es similar a las reacciones empleadas para la generación de resina de sefarosa para las separaciones cromatográficas (ver por ejemplo la patente WO97/25139). Esta reacción emplea 10 gramos de PM10 en 75 ml de agua desionizada y se efectúa a 50ºC y pH 11 (mantenido mediante la adición gota a gota de NaOH 2,5 N), en presencia de hidróxido de sodio (2,5 gramos) y borohidruro de sodio (0,2 gramos). Después de 3 horas la solución se neutraliza con ácido acético (2,5 M), la reacción se coloca en una nevera a 5ºC durante 2 horas y se decanta la capa orgánica de arriba. Después de la adición de 100 ml de agua desionizada, la solución resultante se filtra a continuación (5 mm) en una célula de ultrafiltración (MWCO = 3.000), y se dializa con 10 volúmenes de agua desionizada de intercambio. El producto, alil-dextrano, se concentra, se liofiliza y se almacena a -80ºC. El diámetro molecular medio se mide por difusión con luz láser (Honeywell Micro Trac UPA 150).

El número medio de grupos alilo por dextrano se calcula de la siguiente manera. El alil-dextrano liofilizado se disuelve en solución salina y la concentración de glucosa de la muestra se mide mediante el método del ácido sulfúrico (Du-bios, 1956) empleando dextrano liofilizado como estándar. La densidad del alilo se calcula restando la cantidad de glucosa de la muestra, del peso total de la muestra. El resultado se asume que es la cantidad de hidrocarburo alílico de la muestra. La concentración de alilo se divide a continuación por la concentración de glucosa y a continuación se multiplica por el número medio de unidades de glucosa por dextrano.

En el segundo paso, los grupos alilo reaccionan con 7,5 gramos de aminoetanotiol (cisteamina) en DMSO (30 ml) para producir ligandos con terminales amino. Esta reacción se inicia con persulfato de amonio (99,99%, 1,0 g) y se efectúa en atmósfera de nitrógeno. Después de 3 horas, el volumen de reacción se dobla con agua desionizada y la solución se ajusta a pH 4 con hidróxido de sodio (2,5 N). Después de la adición de 140 ml de tampón de acetato de sodio (0,02 M, pH 4), el producto se filtra (5 mm) en una célula de ultra-filtración y se dializa con cinco volúmenes de tampón de acetato de intercambio (0,02 M, pH 4) seguido de cinco volúmenes de agua desionizada de intercambio. Después de concentrar, se liofiliza a continuación el dextrano con terminales amino. A continuación se analiza una muestra para determinar el número medio de grupos amino por dextrano, el cual se define como la densidad amino. Este producto liofilizado se almacena a -80ºC. El diámetro molecular medio se mide por difusión con luz
láser.

Empleando estos métodos, se determinaron niveles de substitución de 516 grupos amino por molécula, para un amino-dextrano T70, el cual contiene un promedio de 388 radicales de glucosa unidos por enlaces á-1,6 y 1,4 glucosídico. El diámetro medio de esta preparación de amino-dextrano T70 en solución salina al 0,9% fue de 10,8 nanometros; el diámetro medio del dextrano T70 en solución salina fue de 10,6 nanometros. Empleando T500, el cual contiene un promedio de 2881 unidades de glucosa, se encontraron substituidos un promedio de 2900 ligandos amino.

El número promedio de grupos amino por dextrano se calcula de la siguiente manera. El conjugado de dextrano liofilizado se disuelve en solución salina y la concentración de amina se mide mediante el ensayo TNBS (Fields, 1972) empleando hexilamina como estándar. La concentración de glucosa de la misma muestra se mide también mediante el método del ácido sulfúrico (Dubios, 1956). La densidad amino se calcula dividiendo la concentración de amina por la concentración de glucosa seguido de la multiplicación por el número promedio de unidades de glucosa por dextrano. A continuación, se exponen ejemplos de cómo el amino-dextrano, como se ha formulado más arriba, puede conjugarse con otros compuestos para sintetizar varios agentes de diagnóstico.

Ejemplo 2 Unión de un quelante (DTPA) para la obtención de imágenes de una acumulación de sangre por medio de la resonancia magnética o tomografía computerizada

Unión del ácido dietilentriamina pentaacético (DTPA) con amino-dextrano-DTPA obtenido, que a su vez pueden estar marcados con gadolinio o disprosio (ver figura 2A) para producir un agente de contraste para una acumulación de sangre para la formación de imágenes de resonancia magnética o tomografía computerizada. Se emplea el método del anhídrido mixto de Krejcarek et al. (1977), Biochem. Biophys. Res. Commun. 77:581-583. Este se emplea, además de la nueva química, para establecer en primer lugar los ligandos. Este procedimiento no provocará el reticulado del dextrano si se emplea un exceso de DTPA (comparado con el reactivo activado, IBCF).

El método mixto del anhídrido (Krejcarek, 1977) se empleó para conjugar el DTPA a la estructura del dextrano. La síntesis empieza con la activación del DTPA (ácido dietilen-triamina pentaacético) (20 g) con cloroformiato de isobutilo (IBCF) (3,1 ml). Esto se efectuó en acetonitrilo (83 ml) a -30ºC. El DTPA activado se añade lentamente al dextrano con terminales amino (2 g) en tampón de bicarbonato (0,1 M, pH 9) a 4ºC (ver figura 3). Esta solución se agita durante la noche a temperatura ambiente. Después de una extensa diafiltración, del producto con cinco volúmenes de tampón de bicarbonato (0,1 M, pH 9) de intercambio, seguido de cinco volúmenes de agua desionizada de intercambio, se concentró el retenido y se liofilizó. A continuación se analizó una muestra para determinar el DTPA y las densidades amino. Este producto liofilizado se almacenó a -80ºC. El diámetro medio molecular se mide por difusión con luz láser.

El número promedio de unidades DTPA por dextrano se calcula de la siguiente manera. Se disuelve el DTPA-dextrano liofilizado en 0,1 mmoles/litro de trietanolamina HCl (pH 6,0). Añadimos 1,5 (moles/moles con respecto al DTPA) de exceso de gadolinio a una solución 66 mM (filtrada, 0,2 micras) de HCl 0,1 N y a continuación se ajusta a pH 6 con NaOH 2,5 N. Después de agitar durante 24 horas a 37ºC la solución se transfiere a un sistema de ultrafiltración AMICON para la diafiltración con un corte de separación a un peso molecular de 3.000 Da. Después de 10 volúmenes de agua desionizada de intercambio, seguido de otros 10 volúmenes de tampón de acetato (0,2 M, pH 4) de intercambio, el retenido se concentró y analizó para detectar la concentración de gadolinio mediante espectrometría ICP (Vera, 1995). La concentración de glucosa de la misma muestra se midió también mediante el método del ácido sulfúrico (Dubios, 1956). La densidad del DTPA se calcula dividiendo la concentración de gadolinio por la concentración de glucosa seguido de la multiplicación por el número promedio de unidades de glucosa por dextrano.

Procedimientos para la copulación de otros quelantes, incluyendo el DOTA y MAG3, a los sitios de unión, están mostrados en las figuras 4 y 5, respectivamente.

Ejemplo 3 Unión de la manosa para la formación de imágenes de nódulos linfáticos e hígado

La presencia de manosa adjunta a la estructura de dextrano dirigirá el compuesto a la diana, en función del modo de administración, a un receptor (proteína de unión a la manosa) que reside en el hígado, bazo, pulmones, médula espinal y nódulos linfáticos. Steer CJ, Ashwell G (1990). Receptor-mediated endocitosis: Mechanisms, biologic function and molecular properties. In: Hepatology. A textbook of liver Disease ("Endocitosis inducida por el receptor: Mecanismos, función biológica y propiedades moleculares. En: Hepatología. Un libro de texto de enfermedades del hígado") (2ª edición), Zakim D. Boyer TD, eds. W.B. Saunders, Filadelfia. Si el compuesto se administra subcutáneamente, el dextrano con terminales manosa entrará en el sistema linfático y se unirá a receptores dentro de los nódulos linfáticos; si se administra intravenosamente, la unión tendrá lugar en el hígado, bazo, pulmones y médula espinal. Es sabido además que la proteína de unión a la manosa presenta una mayor afinidad a los grupos glucósidos, p. ej., la manosa y compuestos derivados de la manosa.

Si la estructura de dextrano se ha obtenido también para llevar un agente quelante tal como el DTPA ó DOTA (Sieving et al., (1990), Bioconj. Chem. 1:65-71), la combinación resultante puede además marcarse con gadolinio, tecnecio-99m, o yterbio. El gadolinio (ver p. ej., la figura 6) permite la detección de tumores del hígado o nódulos linfáticos por medio de imágenes de resonancia magnética. La marca radiactiva de tecnecio-99m (ver p. ej., la figura 7) permite la formación de imágenes del hígado o nódulos linfáticos mediante escintigrafía. El yterbio, como el gadolinio y el disprosio, permite la formación de imágenes mediante la tomografía computerizada.

La unión química de la manosa con el amino-dextrano puede efectuarse mediante una variedad de métodos, p. ej., el descrito para la unión a la albúmina de suero humano (Vera et al., (1985) J. Nucl. Med. 26:1157-1167) y el descrito para la unión a la polilisina (Vera et al., (1995) Acad. Radiol. 2:497-596). Ver p. ej., la figura 8. Esta unión puede llevarse a cabo como se ha descrito más arriba para la galactosa.

La conjugación del DTPA-dextrano con la manosa se efectúa por alquilación reductora (Vera, 1997). El reactivo de copulación, manosilo, a saber, cianometil 2,3,4,6-tetra-O-acetil-1-tio-\beta-D-manosido (CNM-tiomanosa), se sintetiza mediante la siguiente ruta. El bromuro de tetra-O-acetil-\alpha-D-manopiranosilo se obtiene (este hidrato de carbono no está comercialmente disponible), mediante una reacción de dos pasos en cloroformo (Lee, 1994). Después de evaporar en un evaporador rotativo hasta obtener un jarabe, el producto se hace reaccionar inmediatamente con tiourea para obtener el hidrobromuro de 2-S-(2,3,4,6-tetra-O-acetil-\beta-D-manopirano-sil)-2-peusdotiourea (Chipowsky, 1973), el cual se recristaliza en acetona. Inmediatamente antes de la conjugación con manosilo, este producto se desacetila con metóxido de sodio (0,05 mg/ml) en metanol anhidro recientemente destilado (250 ml) empleando una concentración de CNM-tiomanosa de 0,04 gramos por ml de metanol. Después de eliminar el metanol por evaporación rotativa, la reacción de copulación se efectuó mediante la adición de una cantidad apropiada de DTPA-dextrano (0,5 gramos) en una solución 20 mg/ml de tampón de bicarbonato (0,2 M, pH 9,0). La reacción se efectuó a temperatura ambiente durante 2 horas (figura 8). Después de la diafiltración del producto con cinco volúmenes de tampón de bicarbonato (0,1 M, pH 9) de intercambio, seguido de otros cinco volúmenes de agua desionizada de intercambio, se concentró el retenido y se liofilizó. A continuación, se analizó una muestra para detectar la manosa, DTPA y las densidades de amina. Este producto liofilizado se almacena a 80ºC. El diámetro molecular medio medido por difusión con luz láser, es de 7,6 nm.

El número medio de grupos de manosa por dextrano se calcula de la siguiente manera. El conjugado de dextrano liofilizado se disuelve en trietanolamina y se marca con gadolinio como se ha descrito más arriba. Después de la diafiltración y medición de la concentración de DTPA, la concentración de manosa de la misma muestra se mide también mediante el método del ácido sulfúrico (Dubios, 1956). La densidad de la manosa se calcula dividiendo la concentración de la manosa por la concentración del dextrano, la cual se calcula en base a la densidad DTPA conocida del conjugado DTPA-dextrano.

Se sintetizó un agente DTPA-manosil-dextrano para la obtención de imágenes de nódulos centinelas, empleando un dextrano de calidad farmacéutica, PM10. Ver p. ej., la figura 7. Esta preparación tuvo un diámetro medio de 7,6 nanometros, una densidad de manosa de 44 unidades por dextrano, una densidad de amina de 23 unidades por dextrano, y una densidad de DTPA de 8 unidades por dextrano. El peso molecular fue de 36.288 gramos por mol.

Ejemplo 4 Unión de la galactosa para la formación de imágenes del hígado

La presencia del substrato galactosa puede suministrar el dextrano a un receptor que reside exclusivamente en el hígado. Si el dextrano lleva también DTPA, éste puede marcarse con gadolinio o tecnecio-99m. El empleo del gadolinio permite la detección del cáncer de hígado mediante la formación de imágenes por resonancia magnética. La marca radiactiva tecnecio-99m permite la formación de imágenes del hígado por escintigrafía.

La unión química de la galactosa con el amino-dextrano puede efectuarse mediante una variedad de métodos, p. ej., como se ha descrito para la unión con la albúmina de suero humano (Vera et al., (1985) J. Nucl. Med. 26: 1157-1167) y polilisina (Vera et al., (1995) Acad. Radiol. 2:497-596). La reacción de copulación para la unión de la galactosa al dextrano con terminales amino es la misma que la unión (ver más adelante) de la manosa. Las figuras 13A y 13B son ejemplos de un agente para la obtención de imágenes del hígado por MR y un agente de formación de imágenes de medicina nuclear, empleando ambos una versión de la invención.

Ejemplo 5 Unión del quelante MAG3 para la formación de imágenes nucleares

La conjugación del dextrano con terminales amino comienza con la activación de la mercaptoacetilglicilglicil-glicina (MAG3) (Fritzberg, 1986) con tetrafluorfenol (TFP). Esta se efectúa con una cantidad equivalente de 1,3 dici-clohexilcarbodiimida (DCC) en N,N-dimetilformamida (DMF) a temperatura ambiente. Esta solución se evapora rotativamente, se disuelve en cloroformo y se filtra. Esta solución resultante se evapora rotativamente, se disuelve en cloroformo, y se filtra. Esta solución resultante se evapora rotativamente y el producto de la solución TFP-MAG3 se almacena en la nevera. Finalmente, el dextrano con terminales amino en una solución DNSO/agua (1:10) se combina con TFP-MAG3 en una solución similar. Esta solución se agita durante la noche a temperatura ambiente. Después de una extensa diafiltración con agua, el producto se concentra y se liofiliza.

Formación de imágenes de nódulos centinela: Perspectivas para el diagnóstico perfeccionado y tratamiento de cánceres, p. ej., cáncer de mama, melanoma y cáncer colorrectal

En un esfuerzo para reducir la morbosidad y los costes de detección de las metástasis de los nódulos linfáticos, los cirujanos oncologistas han desarrollado un método por el cual el nódulo linfático centinela (el primer nódulo de la cuenca de drenado) es identificado intraoperativamente y extirpado (Morton et al., (1992) Arch. Surg. 127:292-299). Esta técnica, denominada biopsia del nódulo centinela tiene valores predictivos negativos extremadamente altos para las metástasis del melanoma y del cáncer de mama (Giuliano et al., (1994) Arch. Surg. 220:391-401); la proporción de falsos negativos oscila de cero a un 9% para ambos cánceres. Aumenta también la evidencia de que la biopsia del nódulo centinela tendrá un significativo impacto en la dirección del cáncer colorrectal (Saha et al., (1998) J. Surg. Oncol. 69:183).

Como se ha mencionado, la formación de imágenes del nódulo centinela es un examen médico nuclear que identifica para el cirujano el primer nódulo linfático que recibe el flujo linfático a partir del sitio del tumor primario. Este nódulo se extirpa y se envía para el análisis de la sección congelada para la detección de las células malignas. Mediante la identificación del nódulo centinela antes de la cirugía, puede emplearse una pequeña incisión para extirpar el nódulo y puede efectuarse un pequeña disección. El valor predictivo negativo extremadamente alto de la técnica parece proporcionar un procedimiento exacto para averiguar el estadio del cáncer y puede ahorrar a los pacientes que son negativos al nódulo centinela, la morbosidad de una disección completa de los nódulos linfáticos. En consecuencia, la valoración del estadio del cáncer mediante la formación de imágenes del nódulo centinela puede ser equivalente a la disección de los nódulos axilares sin la consiguiente morbosidad post quirúrgica.

Cuando se efectúa la biopsia del nódulo centinela, el agente para la obtención de imágenes se inyecta alrededor del sitio del tumor y se emplea una sonda gamma sostenida con la mano para encontrar y eliminar el nódulo centinela. A menudo sin embargo, la actividad nuclear o bien se vierte dentro de la cuenca nodular haciendo difícil la diferenciación entre el nódulo y el tumor, o bien se disemina en los múltiples nódulos, lo cual ocasiona que se eliminen más nódulos de los necesarios.

Un agente ideal para la producción de imágenes del nódulo centinela debería tener un rápido aclaramiento desde el sitio de inyección, una alta retención dentro del canal linfático, una rápida, completa y continuada absorción por el nódulo linfático centinela, y una baja absorción por los nódulos linfáticos restantes. En los casos de cáncer de mama no se encuentra algunas veces el nódulo centinela debido a que el sitio del tumor está tan cerca del nódulo centinela que no se puede discernir la radiactividad entre los dos sitios. Las características estándar de una baja absorción de la radiación, una alta seguridad biológica, un conveniente, rápido y estable marcado con tecnecio-99m, y una pureza bioquímica, son también determinantes.

Los coloides filtrados presentan un pobre aclaramiento desde el sitio de la inyección. Los tiempos mitad para el coloide Tc-albúmina y coloide Tc-azufre filtrados, son de 5,5 horas y 10,5 horas respectivamente (Glass, 1995). Esto se traduce aproximadamente en un 65% y 85% de la dosis en el sitio de la inyección a las 3 horas después de la inyección, el tiempo óptimo para la investigación intraoperativa para el nódulo centinela (Uren, 1995). En cambio, las macromoléculas marcadas, tales como el Tc-dextrano y el Tc-HSA (T_{1/2} = 2,8 horas), tienen el más rápido aclaramiento (Henze, 1982; Glass, 1995).

Los procedimientos descritos para la presente invención, perfeccionan la combinación del MAG3-manosil-dextrano marcado con tecnecio-99m. Esta agente ya se ha demostrado efectivo incluso cuando se prepara empleando procedimientos sub-óptimos, propensos a la reticulación de la técnica anterior. El MAG3-manosil-dextrano marcado con tecnecio-99m, como se ha descrito anteriormente es una molécula de 10 kilodaltons de dextrano, a la cual están unidas múltiples unidades de manosa y MAG3. Esta molécula tiene un diámetro medio de 5,5 nanometros (nm) el cual es substancialmente menor que el trisulfuro de antimonio Tc-99m (10 nm), el coloide de azufre Tc-99m filtrado (50 nm) y el coloide de azufre Tc-99m sin filtrar (650 nm), que habían sido anteriormente los estándares predominantes. El empleo de manosa actúa como un substrato para el receptor de proteína unido a la manosa, y el MAG3 actúa como un agente quelante para el marcado con tecnecio-99m (figura 9). El conjugado radioactivamente marcado resultante, se aclara rápidamente en el sitio de inyección y se une al nódulo linfático centinela. Este estudio previo se reproduce más adelante; el empleo de la química perfeccionada descrita aquí garantiza solamente el potenciar el éxito ya obtenido.

Ejemplo 6 Demostración de la formación de imágenes del nódulo centinela en conejos

Después de la anestesia con una inyección intramuscular de quetamina y xilacina, se inyectaron 0,5 ml de TcMAG3-manosil-dextrano (19.000 g/mol) en las plantas de los pies delantero derecho (0,42 mCi) y trasero derecho (0,43 mCi) y 0,5 moles del coloide Tc-azufre filtrado en las plantas de los pies delantero izquierdo (0,41 mCi) y trasero izquierdo (0,42 mCi). El conejo se hidrató con 10 cc de solución salina infundida en el cuello cada 60 minutos. Después de la inyección de cada substancia farmacéutica radiactiva, las plantas de los pies se masajearon durante 5 minutos. Se obtuvieron imágenes estáticas periódicas (1.000 kcts, 256 x 256 x 16) con una cámara gamma de un gran campo de visión (alta resolución, colimador de baja energía) a 15, 45, 100 y 135 minutos con las patas delanteras y los nódulos axilares a la vista, y a 21, 53, 109 y 154 minutos con las patas traseras y los nódulos poplíteos a la vista. Se hizo hacer ejercicio con las patas durante 15 minutos antes de cada imagen. Estándares de imagen (10xdilución) de ambos TcMAG3-manosil-dextrano y el TcSC se colocaron también dentro del campo de visión. Aproximadamente 150 minutos después de la inyección se sacrificó el conejo. Se extirpó cada nódulo centinela y se analizó para detectar la radiactividad con muestras diluidas (2 veces) de dosis de TcMAG3-manosil-dextrano y TcSC. Estos valores fueron normalizados mediante cada estándar de imagen para dar el %ID del nódulo centinela, y a continuación se representaron en una gráfica como función del tiempo (figura 10). Para cada imagen de la serie se dibujaron las regiones-de-interés (ROIs) alrededor del sitio de inyección, nódulo centinela y estándares de imagen. Se calcularon las cuentas totales dentro de cada ROI empleando un programa estándar de medicina nuclear. A continuación las cuentas absolutas de los ROI en el sitio de inyección se dividieron por las cuentas del estándar y se calculó la fracción de la dosis inyectada. Estos valores se representaron en una gráfica a escala logarítmica, mostrada en la figura 11.

Los datos obtenidos demuestran que las propiedades de la imagen del Tc99m-MAG3-manosil-dextrano son superiores al coloide de azufre Tc99m filtrado. El tanto por ciento de dosis inyectada, representado gráficamente en la figura 10, demostró una mayor absorción del nódulo linfático del TcMAG3-manosil- dextrano tanto en el nódulo centinela axilar como en el nódulo centinela poplíteo durante un período de 150 minutos. Además, el TcMAG3-manosil-dextrano presentó un aclaramiento significativamente más rápido desde el sitio de inyección, indicado por la curva más baja de la figura 11.

Las imágenes obtenidas de los nódulos linfáticos axilares 15 minutos después de la administración de TcMAG3-manosil-dextrano y TcSC aparecieron como se muestra en la figura 12. Los sitios de inyección figuran en la parte superior de la imagen (TcMAG3-manosil-dextrano en el lado izquierdo y TcSC filtrado en el lado derecho). Existen un par de estándares en cada uno de los lados del conejo. Además de los nódulos centinelas bilaterales, un foco de actividad adyacente al nódulo centinela de la izquierda, puede representar la actividad TcSC en un nódulo distal, correspondiente al comportamiento del TcSC observado frecuentemente en imágenes retrasadas. Esta actividad, sin embargo, puede representar un nódulo linfático mediastinal compartido por ambos lados de la cadena linfática axilar, en cuyo caso este hallazgo no tiene mucho significado.

El rápido aclaramiento del sitio de inyección del TcMAG3-manosil-dextrano puede tener explicación por el pequeño tamaño de la partícula (5,5 nanometros), que le permite también difundirse en los capilares sanguíneos.

La absorción del nódulo linfático del TcMAG3-manosil-dextrano en los tres estudios con conejos osciló de 1,2 al 2,5 por ciento de la dosis inyectada. La proporción del coloide Tcazufre filtrado fue del 1,5 - 4,9 por ciento.

Ejemplo 7 Demostración de la formación de imágenes de resonancia magnética de una acumulación de sangre, en conejos

Se efectuó la obtención de imágenes de resonancia magnética con GdDTPA-dextrano empleando tanto un conejo sano como un conejo portador de un tumor, que pesaban 3,0 y 2,7 kg, respectivamente. Cada conejo fue anestesiado con una mezcla de 50 mg/kg de quetamina y 8,8 mg/kg de xilazina. Después de la administración de la anestesia, cada conejo fue intubado a continuación con un tubo traqueal de 3 mm y colocado dentro del campo de escaneado. Cada conejo fue ventilado a 60 bpm con un volumen por impulso de aire de 25 cc, lo cual procuró un ciclo respiratorio. Ambos conejos recibieron una dosis de 0,17 mmoles de gadolinio por kilogramo (0,13 gramos de GdDTPA-Dx/kg) de GdDTPA-dextrano (PM = 398.000 g/moles, 515 Gd por dextrano). Las imágenes fueron obtenidas empleando un aparato GE Sigma^{TM} 1.5T para obtención de imágenes de resonancia magnética (programa versión 4.83) (GE Medical Systems, Milwaukee, WI) con cada conejo colocado en posición arrodillada. Exploramos un número de parámetros de adquisición; el más satisfactorio fue una secuencia de tiempo 3D de vuelo (TOF) de un eco escalonado rápidamente deteriorado (FSPGR): TR = 15,1 mseg, TE = 4,2 mseg, ángulo de impacto = 30ºC, matriz de 256 x 192, FOV de 16 cm, 80 cortes de 1,5 mm de grueso. Las imágenes del conejo sano (3 kg) se efectuaron antes de la inyección (2,0 ml) y a 15, 28, 33, 46 minutos, y 3 horas después de la inyección. Con la excepción del escaneado a los 28 minutos, el cual fue en el plano coronal, todos los escaneados se efectuaron en la proyección axial. Las intensidades de la señal sin corregir, dentro de la aorta a nivel del riñón derecho fueron: preinyección, 193; 28 minutos, 552; 33 minutos, 516; y 46 minutos, 472. La figura 19a es una imagen de proyección de máxima intensidad del conejo sano efectuada 15 minutos después de la inyección. La figura 19b es una imagen similar del mismo animal efectuada tres horas después de la inyección.

Las figura 16a y 16b son imágenes de resonancia magnética del conejo portador del tumor (2,7 kg). El tumor es un carcinoma VX2 en la pata trasera derecha. Los vasos del tumor no son visibles en la figura 16a obtenida antes de la inyección de GdDTPA-dextrano (1,8 ml, 0,17 mmoles de Gd/kg). Una hora después de la administración de GdDTPA-dextrano, los vasos del tumor eran fácilmente visibles (figura 16b). Basándonos en las imágenes axiales 3D FSPGR (TR = 15,1 mseg, TE = 4,2 mseg), calculamos el ratio entre contraste y ruido CNR midiendo la intensidad media de la señal dentro de la región-de-interés (ROI) del tumor, restando la intensidad media de la señal desde el músculo, y dividiendo el resultado por la desviación estándar de un ROI tomado desde una región exterior al cuerpo. El CNR para una región dentro del centro del tumor fue de 0,63 antes de la inyección, y de 9,6 cincuenticuatro minutos después de la administración de GdDTPA-dextrano. El CNR para los vasos sanguíneos en el interior del tumor fue de -21,4 antes de la inyección y 120 después de la inyección. El número negativo es el resultado de una señal más alta para el músculo que para los vasos del tumor no aumentado.

Nuestro CNR de 120 a los 54 minutos, es aproximadamente tres veces mayor que los valores típicos (CNR = 42) registrados (Grist TM et al., Radiology ("Radiología") 207: 539-544) en la aorta humana empleando MS-325, el agente de detección selectiva con albúmina, en un tiempo similar de postinyección.

Ejemplo 8 Demostración de la tomografía computerizada de una acumulación de sangre, en conejos

Se escanearon dos conejos en un escáner G.E. 9800 Quick^{TM} CT. Se tomaron las imágenes de un conejo (2,6 kg) portador de un gran tumor VX2, usando DyDTPA-T40 (PM = 101,537 g/moles, 95 Dy por T40) y las imágenes de un segundo conejo sano (3 kg) usando Optiray-320 (PM 807 g/mol). Cada conejo se anestesió con una mezcla de 50 mg/kg de cetamina y 8,8 mg/kg de xilacina. Después de administrar la anestesia se intubó cada conejo con un tubo traqueal de 3 mm colocado dentro del campo de escaneado. Cada conejo se ventiló a 60 bpm con un impulso de aire de 25 cc de volumen para permitir el mantenimiento de la respiración durante cada imagen. A continuación se obtuvo una imagen de localización para discernir la situación del corazón, tumor, lóbulo derecho del hígado, riñón y bazo. Todas las imágenes en cuestión se obtuvieron empleando 120 KV, 200 mA, 3 mm de grueso del corte, 2 segundos de tiempo de escaneado, matriz de 512, y FOV de 16 cm. Las imágenes en serie, distanciadas de 3 mm, se tomaron desde el centro del corazón hasta el centro del riñón izquierdo. A partir de estas series de imágenes se seleccionaron posiciones axiales del corazón, hígado, tumor, riñón y bazo. Después de tres imágenes en cada posición, inyectamos [Dy]DTPA-T40 (5 ml, 190 mg Dy/kg, 37 mmoles de Dy/kg) durante un período de 120 segundos y se obtuvieron imágenes a los 2, 5, 7, 15, 30 y 37 minutos después de la inyección. Imágenes de conejo portador del tumor tomadas antes de la inyección y a 2, 5, 30 y 37 minutos después de la inyección están mostradas en las figuras 17a-e, respectivamente. Inyectamos el Optiray-320 (640 mg l/kg, 5,0 mmoles l/kg) durante un período de 60 segundos y se obtuvieron las imágenes desde los 2 a los 10 minutos a intervalos de 1 minuto y 20 minutos después de la inyección.

Las figuras 18a, 18b, 18c y 18d son una serie de tiempos de secciones transversales del hígado antes y 2, 5 y 10 minutos después de una inyección de Optiray-320 en un conejo sano. Solamente la imagen a los cinco minutos muestra la aorta, la IVC y la vena portal con una intensidad mayor que en el hígado. Las imágenes a los dos y cinco minutos (figuras 18b y 18c, respectivamente) en las series de tiempo DyDTPA-T40 muestran estos vasos, así como también los vasos intrahepáticos con una intensidad mayor que el hígado circundante. La IVC y las curvas del hígado corregidas con la línea de base (figuras 14a-d) para ambos agentes son consecuentes con las imágenes. Lo más importante es que la curva IVC para el DyDPTA-Y40 persiste por lo menos diez minutos, mientras que la curva IVC para el Optiray-320 disminuye rápidamente con un tiempo mitad de aproximadamente dos minutos. El eje de las y de las curvas de las figuras 14a-d se calculó mediante la substracción del CT# del IVC ROI del CT# del hígado. Nuestro propósito era eliminar la línea de base y preservar la diferencia entre las señales de los vasos y del hígado. También es significativo la falta de absorción del DyDTPA-Dx por el bazo y el córtex renal, como indica la figura 14b. La intensidad de la médula renal indica la filtración de cualquier macromolécula intacta, Dy disociado del quelato, o y el producto Dy-metabólico.

Para comprobar la evidencia del reticulado del dextrano resultante de nuestra química de unión de ligandos, cromatografiamos un conjugado (NT10) con terminales amino-T10, empleando Sephacryl S-300HR (27 x 1 cm) y solución salina 0,9% como fase móvil (30 ml/hora). Monitorizamos la elución a 226 nm. Pharmacia indica el margen de fraccionamiento útil para el dextrano en 2 x 10^{3} - 1 x 10^{5} Da. La figura 15a es un cromatograma de albúmina de suero humano; el volumen vacío es Vo y el volumen total es Vt. La figura 15b es un cromatograma del conjugado T-10 con terminales amino, el cual tiene 105 ligandos; esta es una densidad de ligandos de 1,8 grupos amino por unidad de glucosa. La evidencia de un reticulado tendría lugar con el volumen vacío, cuando se alcanzara inmediatamente el perfil de absorbancia en respuesta a la presencia de dextrano de alto peso molecular. El diámetro medio de este conjugado, medido por difusión dinámica con luz láser (Honeywell Microtrac^{TM} UPA150) fue de 0,043 micras con una desviación estándar de 0,0010 micras. La albúmina se midió y dio 0,0092 -/+ 0,0011 micras, el cual es ligeramente mayor que el diámetro publicado de 0,0072 micras.

Discusión

Las ventajas y contribuciones útiles del esquema de dos pasos de unión por ligandos descrito en la presente invención son: un alto rendimiento de unión, una baja reticulación y la falta de carga en el sitio de unión. La estructura del dextrano tiene además un coste económico y una extensa experiencia en el uso en humanos. La existencia de un gran número de ligandos (es decir, grupos amino) por molécula de dextrano permite también la unión de una alta densidad de substratos y/o fármacos a cada estructura de dextrano.

Loa métodos anteriores a la invención producían el reticulado no deseado de la estructura molecular. Ver p. ej., Rebizak et al., (1997), Bioconj. Chem. 8:605-610; Rebizak et al., (1998), Bioconj. Chem. 9:94-99 (que describe la reacción de la etilendiamina con el ácido dextran-carboxílico en presencia de 2-etoxi-1-(etoxicarbonil)-1,2-dihidroquinolina (EEDQ)). La reticulación es un serio problema debido a que aumenta el peso molecular de la estructura y en consecuencia disminuye la solubilidad del producto. Además, puede inducir la toxicidad mediante la desestabilización de la constante de formación del complejo entre el radiotrazador altamente tóxico (p. ej., Gd^{3+}) y el grupo quelante en dichas estructuras macromoleculares. Como resultado, estos esquemas convencionales de reacción pueden ser solamente empleados para unir una baja densidad de ligando por molécula de dextrano; en consecuencia, los procedimientos convencionales permiten que la molécula de dextrano lleve solamente unos pocos substratos y/o fármacos, requiriendo con ello dosis más altas de dextrano para alcanzar el diagnóstico deseado o el efecto del fármaco. Esto aumenta el coste y disminuye la seguridad, así como también presenta problemas de solubilidad (el aumento de reticulación provoca la disminución de la solubilidad). La cantidad de tejido receptor limita también el número de moléculas de dextrano que pueden unirse al receptor y entrar en las células. La baja densidad resultante del fármaco o del agente de diagnóstico no puede suministrar la cantidad adecuada para producir el efecto
deseado.

La invención resuelve estos problemas proporcionando una molécula soporte con una suficiente alta densidad de "ligandos" a los sitios de unión.

La invención resuelve también el defecto de la baja flexibilidad de unión que proporcionan otros esquemas, p. ej., Gedda et al., (1996), Bioconj. Chem. 7:584-591, y Holmberg et al., (1993), Bioconj. Chem. 4:570-573, que describen sistemas de ligandos sin terminales amino. La falta de flexibilidad dentro de las anteriores técnicas de la especialidad, limita el margen de posibles aplicaciones. La invención evita tales limitaciones proporcionando un margen más amplio de aplicaciones.

Referencias

Albertini JJ, Lyman GH, Cox C, Yeatman T, Balducci L, Ku N, Shivers S, Berman C, Well K, Rapaport D, Shons A, Horton J, Greenberg H, Nicosia S, Clark R, Cantor A, Reintgen DS. Lymphatic mapping and sentinel node biopsy in the patient with breast cancer. JAMA 276:1818-1822 (1996).

Armitage FE, Richardson DE, Li KCP. Polymeric contrast agents for magnetic resonance imaging: Synthesis and characterization of gadolinium diethylenetriamine-pentaacetic acid conjugated to polysaccharides. Bioconj. Chem. 1:365-374 (1990).

Capizzi RL. Protection of normal tissues from the cytotoxic effects of chemotherapy by amifostine (ethyol): clincial experiences. Semin Oncol 21(S11):8-1), 5 (1994).

De Cicco C, Cremonesi M, Luini A, Bartolmei M, Grana C, Gennaro P, Galimberti V, Calza P, Viale G, Veronesi U, Paganelli G. Lymphoscintigaphy and radioguided biopsy of fhe sentinel axillary node in breast cancer. J. Nucl. Med. 39-2080-2084 (1998)

Douay L, Hu C, Giarratana -C, Gorin N-C. Comparative effects of amifostine (ethyol) on normal hematopoietic stem celis versus human leukemic cells during ex vivo purging in autobgous bone marrow transplants. Semin Oncol 21(S11):16-20 (1994).

Dubois M. Colorimetric method for determination of sugars and related substances. Anal. Chem. 28:350-356 (1956).

Fields RC. The rapid determination of amino groups with TNBS, Meth. Enzymol. 25; 464-468 (1972).

Glass EC, Essner R, Giuliano A, Morton DL. Comparative efficacy of three lymphoscintigraphic agents. J Nucl Med 36:199P (1995).

Guiliano AE, Kirgan DM, Guenther JM, Morton DL. Lymphatic mapping and sentinel lymphadenectomy for breast cancer. Ann. Surg. 220:391-401 (1994).

Guiliano A-E. Axillary node mapping for breast cancer. Presented at the 48th Annual Symposium of the Society of Surgical Oncology, March 23-25, Boston, MA (1995).

Gedda L, Olsson P, Ponten J, Carlsson J. Development and in vitro studies of epidermal growth factor-dextran conjugates for neutron capture therapy. Bioconj Chem 7:584-591 (1996).

Grist TM, Korosec FR, Peters DC, Witte S, Walovitch RC, Dolan RP, Bridson WE, Yucel EK, Mistretta CA. Steady-state and dynamic MR angiography with MS-35: initial experience in humans. Radiology 207:539-544.

Henze E, Schelbert HR, Collins JD, Najafi A, Barrio JR, Bennett LR. Lymphoscintigraphy with Tc-99m-labeled dextran. J. NucL Med 23:923-929 (1982).

Holmberg A, Meurling L. Preparation of sulfhydrylborane-dextran conjugates for boron neutron capture therapy. Bioconjugate Chem 4:570-573 (1993).

Krag DN, Weaver JC, Alex JC, Fairbank JT. Surgical resection and radiolocalization of the sentinel lymph node in breast cancer using a gamma probe. J. Surg. Oncol 2:335-340 (1993).

Krag, DN. Gamma-probe-guided resection of axillary sentinel nodes. Presented at the 48th annual symposium of the Society of Surgical Oncology, March 23-25, Boston, MA (1995).

Krag, DN, Weaver D, Ashikaga T, Moffat F, Klimberg VS, Shriver C, Feidman S, Kusminsky R, Gadd M, Kuhn J, Harlow S, Beitsch P. The sentinel node in breast cancer-a multicenter validation study. N Eng. J. Med. 339:941-946 (1998).

Krejcarek., GE, Tucker KL. Covalent attachment of chelating groups to macromolecules. Biochem. Biophys. Res. Commun. 77:581-583 (1977).

Krinick NL, Rihova B, Lnbrich K, Strohalm J, Kopecek J., Synthesis of N-(2-hydroxypropyl)methacrylamide copolymer-anti-Thy 1.2 antibody-chlorin e6 conjugates and a preliminary study of their photodynamic effect on mouse splenocytes in vitro. Makromol. Chem. 191:839-856 (1990).

\newpage

Lee YC. Neoglycoconjugates: General Considerations, In Neoglycoconjugates: Preparation and applications. Lee YC and Lee RT Eds. Academic Press, San Diego (1994).

Molteni L, Dextrans as drug carriers. In: Gregoriadis G, ed. Drug carriers in biology and medicine. San Diego, Academic Press; 107-125 (1979).

Morton DL, Wen D-R, Wong JH, Economou JS, Cagle LA, Storm K, Foshag LJ, Cochran AJ. Technical details of intraoperative lymphatic mapping for early stage melanoma. Arch Surg 127:392-299 (1992).

Phillips TL. Sensitizers and protectors in clinical oncology. Semin Oncol 8:67-82, (1881).

Rasey JS, Spence AM, Badger CC, Krohn KA, Vera DR, Livesey JC. Specific protection of different normal tissues. Phamnac Ther 39:33-43, (1988).

Rebizak R, Schaefer M, Dellacherie T., Polymeric conjugates of Gd 31 Diethylenetriaminepentaactic acid and dextran. 1. Synthesis, characterization, and paramagnetic properties. Bioconj Chem 8:605-610.

Rebizak R (1998), Schaefer M, Dellacherie P. Polymeric conjugates of Gd-Diethylenetriaminepentaactic acid and dextran. 2. Influence of spacer arm length and conjugate molecular mass on the paramagnetic properties and some biological parameters. Bioconj. Chem. 9:94-99 (1997).

Saha S (1998), Nora D, Espinosa M, Gauthier J, Morrison A, Rohatgi C, Dorman S, Jones T, Singh T, Arora M, Ganatra BK, Desa D. Diagnostic and therapeutic implications of sentinel node mapping in colorectal cancer: a Prospective study. J Surg Onco 169:183.

Seymour LW. Passive tumor targeting of soluble macromolecules and drug conjugates. Critical Reviews of Therapeutic Drug Carrier Systems 9:135-187 (1992).

Sieving PF, Watson AD, Rocklage SM. Preparation and characterization of paramagnetic polychelates and their conjugates. Bioconj. Chem. 1:65-71, (1990).

Slingluff CL, Stidham KR, Ricci WM, Stanley WE, Seigler HF. Surgical management of regional lyrnph nodes in patients with melanoma: experience with 4682 patients. Ann Surg 219:120-130 (1994).

Snyder WS (1975), Ford MR, Wamer GG et al. "S" Absorbed Dose per Unit Cumulative Activity for Selected Radionuclides and Organs, MIRD Pamphlet No. 11. New York Society of Nuclear Medicine, 1975.

Stadalnik RC, Vera DR, Woodle ES. Trudeau WL, Porter BA, Ward RE, Krohn KA, O'Grady LF. Technet-99m NGA functional imaging: preliminary clinical experience. J. Nucl. Med 26:1233-1242 (1985).

Steer CJ, Ashwell G. Receptor-mediated endocytosis: Mechanisms, biologic function, and molecular properties. In: Hepatology. A Textbook of liver Disease. (2nd Ed.) Zakim D, Boyer TD, eds. W.B. Saunders, Philadelphia (1990).

Tomalia DA, Baker H, Deward J, et al. A new class of polymers: starburst-dendritic macromolecules. Polymer J 17:117-13 2 (1985).

Uren RF, Howman-Giles RB, Thompson JF, Malouf D, Ramsey-Stewart G, Niesche FW, Renwick, SB. Mammary lymphoscintigraphy in breast cancer. J. Nucl. Med. 1995 36:1775-1780 (1995).

Vera DR, Stadalnik RC, Krohn KA. Technetium-99m galactosyl-neoglycoalbumin: preparation and preclinical studies. J. Nucl. Med 26:1157-1167 (1985).

Vera DR, Buonocore MIH, Wisner ER, Katzberg RW, Stadalnik RC. A molecular receptor-binding contrast agent for magnetic resonance imaging of the liver. Acad. Radiol. 2:497-596 (1995).

Vera DR, Wisner ER, Stadalnik RC. Sentinel node imaging via a nonparticulate receptor-binding radiotracer. J. Nucl. Med 38:530-535 (1997).

Veronesi U, Paganelli G, Galimberti V, Vate G, Zurrida S, Bedoni M, Costa A, de Cicco C, Geraghty JG, Luini A, Sacchini V, Veronesi P. Sentinel-node biopsy to avoid axillary dissection in breast with clinically negative lymphnodes. Lancet 349:1864-1867 (1997).

All of the preceding references are herein incorporated by reference.

Claims (28)

1. Una molécula soporte que comprende:

una estructura, en donde dicha estructura es el dextrano;

dicha estructura tiene unida a la misma una pluralidad de grupos que tienen la estructura -O(CH_{2})_{3}S(CH_{2})_{2}NH_{2}.

2. La molécula de la reivindicación 1, obtenida por la reacción de un grupo alilo con aminoetanotiol.

3. La molécula de la reivindicación 1, que comprende además por lo menos un grupo químico adicional conjugado con el grupo amino de por lo menos uno de dichos grupos que tiene la estructura -O(CH_{2})_{3}S(CH_{2})_{2}NH_{2}.

4. La molécula de la reivindicación 3, en donde por lo menos dicho grupo químico adicional se selecciona del grupo formado por quelantes, ligandos receptores, substratos enzimáticos, ácidos nucleicos, péptidos, polisacáridos, radio-sensibilizadores, radioprotectores y colorantes.

5. La molécula de la reivindicación 4, en donde por lo menos dicho grupo adicional es un quelante capaz de unirse a un átomo seleccionado del grupo formado por átomos radiactivos, elementos absorbedores y átomos paramagnéticos.

6. La molécula de la reivindicación 4, en donde por lo menos dicho grupo adicional es un quelante seleccionado del grupo que consiste en DOTA, MAG3 y DTPA.

7. La molécula de la reivindicación 5, en donde dicha molécula es útil para la formación de imágenes del nódulo centinela.

8. La molécula de la reivindicación 5, en donde dicho quelante está unido al gadolinio.

9. La molécula de la reivindicación 5, en donde dicho quelante está unido al yterbio.

10. La molécula de la reivindicación 5, en donde dicho quelante está unido al Tc-99m.

11. La molécula de la reivindicación 5, en donde dicho quelante está unido al indio.

12. La molécula de la reivindicación 4, en donde por lo menos dicho grupo adicional es un substrato para un receptor seleccionado del grupo formado por la manosa, galactosa, monosacáridos y péptidos.

13. Un agente MRI sintetizado a partir de la molécula de la reivindicación 1.

14. Un agente CT sintetizado a partir de la molécula de la reivindicación 1.

15. Un método para producir una molécula soporte substancialmente libre de reticulación, que tiene una pluralidad de ligandos con terminales amino, el cual método comprende:

provisión de una molécula estructural, en donde dicha estructura es dextrano con una pluralidad de grupos hidroxilo,

alilación de por lo menos una parte de dichos grupos hidroxilo de dicha molécula estructural para producir un derivado alílico de dicha estructura; y

haciendo reaccionar dichos grupos alilo de dicho derivado alílico con un compuesto que contiene un terminal amino y un segundo terminal, siendo dicho segundo terminal reactivo con dichos grupos alilo de dicho derivado alílico;

para producir una molécula soporte substancialmente libre de reticulación, la cual tiene una pluralidad de ligandos con terminales amino.

16. El método de la reivindicación 15, en donde dicho compuesto es el aminoetanotiol.

17. El método de la reivindicación 16, que comprende además la conjugación de dichos ligandos con terminales amino con por lo menos un miembro seleccionado del grupo formado por quelantes, ligandos receptores, substratos enzimáticos, ácidos nucleicos, péptidos, polisacáridos, monosacáridos, radiosensibilizadores, radioprotectores, y colorantes.

18. El método de la reivindicación 17, que comprende además la adición de un átomo que tiene una afinidad para los quelantes, seleccionándose dicho átomo del grupo formado por átomos radiactivos, elementos absorbedores, y átomos para-magnéticos.

19. El método de la reivindicación 17, en donde por lo menos dicho miembro es un quelante seleccionado del grupo formado por DOTA, MAG3 y DTPA, y en donde dicho substrato para un receptor se selecciona del grupo formado por manosa, galactosa, y péptidos.

20. Un empleo de la molécula sintetizada por el método de la reivindicación 19, que comprende el empleo de dicha molécula soporte conjugada substancialmente exenta de reticulación, en la obtención de un agente para emplear en un procedimiento de diagnóstico.

21. Un empleo de la molécula sintetizada por el método de la reivindicación 20, en donde dicho procedimiento de diagnóstico consiste en la obtención de imágenes del nódulo centinela.

22. Un empleo de la molécula sintetizada empleando el método de la reivindicación 17, que comprende el empleo de dicha molécula soporte conjugada substancialmente exenta de reticulación, en una aplicación terapéutica.

23. Un agente MRI sintetizado empleando el método de la reivindicación 15.

24. Un agente CT sintetizado empleando el método de la reivindicación 15.

25. Un agente de detección del nódulo centinela obtenido de acuerdo con el método de la reivindicación 15, comprendiendo además un substrato receptor, un quelante y un átomo radiactivo.

26. El agente de detección del nodo centinela de la reivindicación 25, en donde dicho quelante es MAG3.

27. El agente de detección del nódulo centinela de la reivindicación 25, en donde dicho substrato receptor es la manosa.

28. El agente de detección del nódulo centinela de la reivindicación 27, en donde dicho átomo radiactivo es el Tc-99m y dicho quelante es el DOTA.