ES2228540T3

ES2228540T3 - Metodo para conservar material biologicamente activo.

Info

Publication number: ES2228540T3
Application number: ES00938911T
Authority: ES
Inventors: Eric Eward Worrall
Original assignee: Anhydro Ltd
Current assignee: Anhydro Ltd
Priority date: 1999-06-22
Filing date: 2000-06-21
Publication date: 2005-04-16
Anticipated expiration: 2020-06-21
Also published as: US6841168B1; EP1187907A1; CN1168819C; EP1187907B1; WO2000078924A1; AU5413500A; DE60013821T2; DE60013821D1; CN1357037A; GB9914412D0; ATE276355T1

Abstract

Un método de conservación de material biológicamente activo, que comprende mezclar una suspensión acuosa del material biológicamente activo con una solución acuosa estéril de quitosano o una de sus sales atóxicas, para formar un coacervado del material biológicamente activo y quitosano o su sal atóxica, añadir al coacervado una solución acuosa estéril de trehalosa, someter la mezcla estéril de coacervado y trehalosa a secado a una presión inferior a la atmosférica y una temperatura, inicialmente no superior a 37ºC, que se controla posteriormente para que no descienda hasta 0ºC o inferior, para formar una matriz vítrea porosa que comprende trehalosa vítrea metaestable que contiene, en la matriz, material biológicamente activo desecado y quitosano o su sal atóxica.

Description

Método para conservar material biológicamente activo.

La presente invención se refiere a la conservación de material biológicamente activo, p.ej. virus, bacterias y biomoléculas. En particular, se refiere a un método ultrarrápido mediante el cual dicho material se puede conservar, usando quitosano y el disacárido trehalosa. Mediante este método se puede lograr una conservación a largo plazo de biomoléculas y microorganismos y, especialmente, se pueden preparar vacunas vivas atenuadas.

La conservación de materiales biodegradables mediante deshidratación y osmoconcentración es una tecnología familiar y antigua. Cuando la tarea de conservar biomoléculas sensibles se hizo necesaria, el simple secado mediante deshidratación fracasó, ya que se eliminaba el agua estructural, produciendo la desnaturalización posterior y la pérdida de actividad vital. La liofilización en nitrógeno líquido y la liofilización se han convertido en los métodos aceptados para la conservación a largo plazo de biomoléculas sensibles, usándose el último método extensivamente para la conservación de vacunas atenuadas vivas.

Se ha logrado una termotolerancia mejorada de la vacuna de la peste bovina liofilizada prolongando el ciclo de secado secundario, a fin de reducir los niveles de humedad residual (RM) hasta aproximadamente 1%-2%. Esto implica ciclos operativos largos y de elevado consumo de energía, de hasta 72 horas, como lo describieron Mariner, J.C. et al., Vet. Microbiol., 1990, 21, 195-209. Las vacunas producidas mediante este método se conocen y distinguen de la vacuna estándar por el nombre de "THERMOVAX".

Como se mencionó anteriormente, estos procesos usados actualmente son lentos e implican un elevado consumo de energía. Además, la liofilización confiere sólo un nivel modesto de termotolerancia en el producto final, y se requiere aún refrigeración para reducir el deterioro durante el almacenamiento. Este es un problema particular para vacunas vivas destinadas a usarse en climas tropicales, ya que éstas pierden actividad, con el desafortunado resultado de que los programas de vacunación realizados en el campo en países tropicales, donde el control de la "cadena de frío" es difícil, pueden conducir finalmente a la vacunación de pacientes con vacuna inferior a la estándar o, en algunos casos, inservible.

Durante la selección natural evolutiva, ciertas especies de plantas y animales adquirieron la notable y elegante capacidad de tolerar la deshidratación extrema, permaneciendo latentes en medios hostiles durante períodos muy largos de tiempo y aún capaces de adquirir una actividad vital completa una vez hidratadas nuevamente. Ejemplos incluyen la "planta de la resurrección" Selaginella lepidophyla, el camarón de mar Artemia salina (Clegg, J. J. Comp. Biochem. Physiol., 1967, 20, 801-809), la levadura Saccharomyces cerevisiae (Coutinho, E., Journal of Biotechnology, 1988, 7, 23-32) y el tardigrado Macrobiotus hufelandi (Kinchin, I M., Biologist, 1995, 42, 4). Tales organismos se denominan criptiobióticos y el procedimiento por el que sobreviven se conoce como anhidrobiosis. Todas las especies de animales y plantas que presentan esta capacidad, contienen el disacárido trehalosa (\alpha-D-glucopiranosil-\alpha-D-glucopiranósido). Su presencia, generalmente del orden de 0,2 g/g de peso celular seco en la mayoría de los criptobiontes, les permite resistir la deshidratación extrema, temperaturas elevadas, rayos X y también, en algunas especies de tardigrados, presiones de hasta 600 MPa.

Colaco et al., Biotechnology, 1992, 10, 1007-1011, describen la ventaja del secado rápido de materiales biológicos usando trehalosa. Este método se refiere sobre todo al secado de enzimas de restricción e inmunoglobulinas sobre matrices sólidas preformadas, como fibras de celulosa, o sobre las superficies de placas de plástico, para fines diagnósticos como ELISA o aplicaciones diagnósticas similares en el laboratorio. Sin embargo, surgen problemas con estas técnicas cuando se amplían a gran escala a aplicaciones industriales, como la producción de vacunas comerciales a gran escala, en la que se tienen que manejar números de unidades y volúmenes mucho mayores, usando técnicas asépticas obligatorias en viales sellados parcialmente. Para cumplir los requisitos operativos de la producción de vacunas a gran escala, en la que son típicos volúmenes unitarios de 1,0 ml o superiores y lotes de producción de 20 litros, se requiere una estrategia diferente para eliminar el volumen de agua en un tiempo económicamente aceptable. El secado a presión atmosférica, incluso a las temperaturas máximas toleradas fisiológicamente, requeriría un tiempo inaceptablemente largo para eliminar el agua lo suficientemente rápido desde viales de vacuna parcialmente taponados, y produciría inevitablemente desnaturalización y pérdida de actividad.

Nishimura K. et al., VACCINE 3 Nº 5 (1985), muestran que los coacervados de quitosano tienen una elevada afinidad por los epitelios mucosos. Se sugirió que esto podría intensificar el transporte activo de antígeno hacia las células, estimulando por la respuesta inmunitaria sistémica, tanto de IgA como de IgG.

La presente invención se refiere principalmente a un método de conservación de material biológicamente activo, usando quitosano y trehalosa en condiciones que producen la eliminación del agua, permitiendo, al mismo tiempo, mantener la integridad biológica del material.

Consecuentemente, la invención proporciona un método para conservar material biológicamente activo, que comprende mezclar una suspensión acuosa del material biológicamente activo con una solución acuosa estéril de quitosano o su sal atóxica, para formar un coacervado del material biológicamente activo y quitosano o su sal atóxica, añadir al coacervado una solución acuosa estéril de trehalosa, someter la mezcla acuosa estéril de coacervado y trehalosa a secado a una presión inferior a la atmosférica y a una temperatura, inicialmente no superior a 37ºC, que se controla para que no disminuya hasta 0ºC o inferior, para formar una matriz porosa vítrea que comprende trehalosa vítrea metaestable, que contiene, en la matriz, quitosano o su sal atóxica y material biológicamente activo desecado.

Según una realización preferida, el método de conservación de un material biológicamente activo comprende las siguientes etapas:

(i): mezclar una suspensión acuosa del material biológicamente activo con una solución acuosa estéril de quitosano o una de sus sales atóxicas, para formar un coacervado del material biológicamente activo y quitosano o su sal atóxica;

(ii): mezclar el coacervado producido en la etapa (i), con una solución acuosa estéril de trehalosa;

(iii): someter la mezcla a secado primario, durante 30 a 60 minutos, a una presión inferior a la atmosférica y una temperatura inicialmente no superior a 37ºC, y que se controla para que no descienda hasta 0ºC o inferior y que finalmente no es superior a 40ºC, para formar una matriz porosa vítrea que comprende trehalosa vítrea con un contenido de humedad residual no superior a 10%, y que contiene en la matriz quitosano o su sal atóxica y material biológicamente activo desecado; y

(iv): someter la matriz porosa vítrea de la etapa (iii) a secado secundario durante 10 a 30 horas a una presión no superior a 0,1 mbares y a una temperatura que finalmente está en el intervalo de 40 a 45ºC, para formar una matriz de trehalosa que tiene un contenido de humedad residual no superior a 2%, que contiene en la matriz, quitosano o su sal atóxica y material biológicamente activo desecado.

Usando el método de la invención es posible producir una vacuna viva con características biológicas mejoradas y ventajas comerciales distintas, comparada con los métodos del estado de la técnica previo. Las vacunas preparadas usando el método de la invención se secan mucho más rápidamente que aquéllas que usan los procedimientos de liofilización convencionales. Por ejemplo, el método de la invención se puede usar para preparar mezclas de trehalosa/quitosano/material biológicamente activo hasta un contenido de humedad residual de aproximadamente 10%, en menos de una hora. Se puede lograr una deshidratación posterior hasta un contenido de humedad residual de aproximadamente 1-2% en menos de 30 horas, por ejemplo aproximadamente 20 horas, comparado con un período de 50 horas mediante procedimientos de liofilización convencionales. Además, el daño producido por concentración de soluto se minimiza según la presente invención y, particularmente, se evita la cristalización dañina del hielo. La termoestabilidad del material biológicamente activo conservado en la matriz vítrea de trehalosa es superior a la de los materiales conservados mediante métodos del estado de la técnica previo y, por tanto, se minimiza la necesidad de la "cadena de frío", que es un condicionante grave con la vacuna liofilizada convencional. El producto de la presente invención se puede exponer a temperaturas ambientales elevadas, p.ej., hasta aproximadamente 45ºC, durante períodos prolongados de tiempo, sin pérdida grave de actividad biológica. Además de éstas y otras ventajas de la presente invención, el producto del método presenta una "solubilidad instantánea" una vez rehidratado

El método de la presente invención es adecuado para lograr la conservación a largo plazo de materiales biológicamente activos, por ejemplo, microorganismos, proteínas, biomoléculas vivas y ácidos nucleicos. En particular, se puede usar para conservar componentes víricos atenuados vivos, altamente lábiles y componentes de micoplasma que se pueden rehidratar para formar vacunas. Ejemplos de tales materiales biológicamente activos que se pueden conservar según el método de la invención incluyen:

: Familia: Paramixoviridae

: Subfamilia: Paramixovirinae

: Géneros: grupo de virus de la Parainfluenza, sarampión, peste bovina, moquillo, peste de pequeños rumiantes

: Paramixovirus: virus de la parotiditis infecciosa (paperas)

: Género: Rubivirus, rubeola (sarampión alemán)

: Género: Flavivirus, virus de la fiebre amarilla (fiebre amarilla)

: Género: Rhabdovirus, Lyssaviridae (virus de la rabia)

: Picornavirus (virus de la polio)

: Virus de la enfermedad de Newcastle

: Micoplasma: Mycoplasma mycoides (pleuroneumonía bovina contagiosa)

: Brucella abortus: vacuna de la cepa 19

Según el método de la presente invención, el material biológicamente activo a conservar se prepara en forma de suspensión en un medio acuoso apropiado. Puede darse el caso de que se necesite cultivar un virus o cepa bacteriana, por ejemplo en células Vero, en un medio de cultivo apropiado y luego recogerlas antes de ponerlas en suspensión, a fin de proporcionar una concentración de material útil. Típicamente, se ajustará el pH de la suspensión acuosa de material biológicamente activo, por ejemplo mediante la adición de un álcali, hasta un pH en el intervalo de 7,0 a 7,8, especialmente aproximadamente 7,4.

La suspensión de material biológicamente activo se mezclará a continuación con una solución acuosa estéril de quitosano o una de sus sales atóxicas. Quitosano es el nombre general dado a una clase de polisacáridos catiónicos preparados mediante la desacetilación de quitina (poli(N-acetil-glucosamina) a (poli(1,4-beta-D-glucopiranosamina). La quitina es un biopolímero natural que se encuentra abundantemente en los exoesqueletos de los crustáceos. Las cutículas de los tardigrados en el estado resistente de latencia están compuestas por quitina. El quitosano es un polieletrólito catiónico lineal que es atóxico, biodegradable y biocompatible, y es un sólido translúcido amorfo blanco o crema, que es soluble en ácidos orgánicos diluidos. El uso del quitosano en la presente invención está basado en el descubrimiento de que actúa como una cubierta biopolímera protectora alrededor del material biológicamente activo que se está conservando. Por tanto, el uso de quitosano en combinación con el método de desecación controlado descrito aquí, mejora la tolerancia térmica del material desecado. Típicamente, la concentración del quitosano en la solución acuosa estéril usada para mezcladura con la suspensión de material biológicamente activo estará en el intervalo de 0,001% a 0,02% p/v. Se han obtenido resultados excelentes usando una solución que contenía 0,01% p/v de quitosano. El quitosano se usa preferiblemente en forma de una sal de adición atóxica, p.ej., HCl de quitosano, que es más soluble que el quitosano.

La solución de quitosano y la suspensión de material biológicamente activo se mezclan típicamente en una relación de volumen de aproximadamente 1:1, a un pH de 7,4, a una temperatura de superior a 0ºC hasta 37ºC, preferiblemente menos de 20ºC y con la máxima preferencia aproximadamente 4ºC. El quitosano y el material biológicamente activo se someten preferiblemente a agitación vigorosa, p.ej., mediante agitación vorticial durante hasta 60 segundos, a una temperatura en el intervalo de 2 a 6ºC, preferiblemente aproximadamente 4ºC, para producir una mezcla homogénea. La mezcla, típicamente, se dejará reposar manteniendo la temperatura permitiendo que se forme el coacervado, es decir, un complejo de absorción del quitosano y el material biológicamente activo, en el que el material biológicamente activo queda recubierto por el quitosano. El coacervado así formado se recoge a continuación, típicamente por centrifugación. Esta precipitación del coacervado de quitosano es útil para concentrar grupos de vacunas de baja concentración y/o para reducir los volúmenes de tratamiento para secado. Preferiblemente, la etapa de centrifugación se realiza no más de una hora después de la mezcladura de la solución de quitosano y la suspensión de material biológicamente activo. Si la mezcla se almacena durante un período más largo, las partículas del precipitado de coacervado, más que ser ligeras y homogéneas, tienden a aglutinarse entre sí. La centrifugación se lleva a cabo preferiblemente en una centrífuga refrigerada, mantenida típicamente a aproximadamente 4ºC, a una velocidad típica de aproximadamente 10.000 rpm durante varios minutos. A continuación de la recogida, el coacervado preferiblemente se vuelve a poner en suspensión en un medio apropiado, p.ej. solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) o extracto de levadura y lactalbúmina de Hanks (LYE de Hanks), antes de mezclarlo con una solución estéril de trehalosa. El coacervado se volverá a poner en suspensión, en general, en un volumen de medio apropiado que es igual al volumen del líquido antes de la centrifugación, de forma que la concentración de material biológicamente activo en la suspensión de coacervado es la misma que en el líquido antes de la centrifugación. Sin embargo, el material biológicamente activo se puede concentrar, si se desea, volviendo a poner en suspensión el coacervado en un volumen de medio apropiado que es menor que el volumen del líquido antes de la centrifugación. Concentrando el material biológicamente activo de esta forma, el volumen de agua que se tiene que eliminar durante la etapa de desecación al vacío, se reduce de forma efectiva, reduciendo por tanto la cantidad de energía requerida durante la desecación evaporativa y reduciendo el período de tiempo requerido para secar el material, según el método de la invención. En el caso de que el material biológicamente activo sea un virus, puede ser a menudo beneficioso concentrar el virus, es decir, incrementar la concentración, de esta forma.

La trehalosa es uno de los disacáridos más estables y químicamente no reactivos. Tiene una energía de unión extremadamente baja, de menos de 1 Kcal/mol, haciendo la estructura del dímero muy estable. No sufre caramelización a menos que se caliente intensamente, ni sufre la reacción de Maillard con proteínas o péptidos. La estructura natural dihidratada, que contiene dos moléculas de agua, permite una flexibilidad inusual en trono a la unión disacárida, lo cual posiblemente permite una asociación más próxima con biomoléculas de estructura terciaria. No es higrocópica, aunque presenta una "solubilidad instantánea" una vez hidratada, una propiedad particularmente útil para vacunas desecadas.

La solución acuosa estéril de trehalosa usada en el método de la presente invención, tendrá típicamente una concentración de trehalosa de 0,20% a 10% p/v, aunque es posible usar soluciones de concentración superior (p.ej., 50% p/v) de trehalosa, para proporcionar la concentración final requerida de trehalosa en la mezcla que se somete a desecación. Preferiblemente, la concentración de trehalosa será de 2 a 10%, y más preferiblemente de 2,5 a 8% p/v. Dentro del intervalo de concentraciones de trehalosa, la concentración real usada dependerá, en general, del tamaño de unidad del material biológicamente activo. Se requiere menos trehalosa para partículas de virus pequeñas que para células grandes.

La mezcla de la solución estéril de trehalosa y del coacervado puesto de nuevo en suspensión, cuando se prepara, se somete a desecación al vacío. Preferiblemente, se usa un aparato de liofilización convencional (p.ej., como el fabricado por EDWARDS, CHRIST, USIFROID o SAVANT) para el procedimiento de desecación, a fin de proporcionar un medio controlado para las etapas críticas en el método. Se enfatiza, sin embargo, que si se usa tal aparato, no se emplean condiciones de liofilización y el material no se somete a liofilización. La temperatura inicial del aparato secador es tal que asegure que la temperatura de la mezcla de trehalosa/coacervado no será superior a 37ºC y será preferiblemente 37ºC, a fin de evitar cualquier pérdida de actividad biológica en esta etapa del método. A medida que se elimina agua por evaporación desde la mezcla, la temperatura de la mezcla disminuye. No obstante, la desecación se lleva a cabo para asegurar que no se produzca congelación o sublimación a partir del hielo, como ocurre normalmente en procedimientos de liofilización convencionales, es decir, la temperatura del producto durante esta etapa del proceso de secado se controla para que no disminuya hasta 0ºC o por debajo, y se controla típicamente para que no disminuya por debajo de 4ºC. La presión se reduce por debajo de la presión atmosférica, preferiblemente hasta un valor de 800 a 300 mbares.

La etapa de desecación se continúa durante un período de tiempo, típicamente entre 30 y 60 minutos, durante el cual la temperatura de la mezcla de trehalosa/coacervado se reduce inicialmente a medida que el agua se elimina por evaporación, y luego aumenta. Cuando se alcanza una temperatura (bajo la presión reducida empleada) de aproximadamente 25ºC, la trehalosa forma una matriz vítrea. El contenido de humedad de la matriz vítrea es aproximadamente 10%. La temperatura del material al final de este procedimiento de desecación se debería de controlar de forma que no exceda los 40ºC, ya que el material biológicamente activo sufrirá daño si la temperatura se deja aumentar por encima de ésta.

Se prefiere que el método de la invención utilice un procedimiento de desecación que comprenda dos etapas de desecación, una etapa de desecación primaria (como se describió anteriormente), en la que el contenido de humedad residual del material se reduce a un valor no superior a 10%, y una etapa de desecación secundaria, en la que el contenido de humedad residual del material se reduce más, hasta un valor que no exceda el 2%. La etapa de desecación secundaria, si se usa, se realiza a continuación de una etapa de desecación primaria como se describió anteriormente, preferiblemente sin eliminación del material del aparato de desecación usado para la etapa de desecación primaria. En una etapa de desecación secundaria, la matriz vítrea obtenida al final de la etapa de desecación primaria se deshidrata más a presión reducida que no exceda 0,1 mbares. Los aparatos especializados disponibles actualmente tienen la capacidad de funcionar a presiones extremadamente bajas, por ejemplo por debajo de 0,001 mbares. Sin embargo, se han obtenido resultados muy buenos según la presente invención usando presiones reducidas para la etapa de desecación secundaria, en el intervalo de 0,001 a 0,1 mbares, típicamente de 0,01 a 0,1 mbares. La etapa de desecación secundaria se continúa durante un período de tiempo total en el intervalo de 10 a 30 horas, preferiblemente de 20 a 30 horas.

Como se mencionó anteriormente, la temperatura de la matriz vítrea al final de la etapa de desecación primaria, no debería exceder los 40ºC. Durante la etapa de desecación secundaria, la temperatura de la matriz puede aumentar ligeramente hasta una temperatura final, al final del procedimiento de desecación, de 40ºC a 45ºC. La matriz de trehalosa, al final de la etapa de desecación secundaria, tendrá un contenido residual de humedad de 2% o menos, preferiblemente 1% o menos, a fin de asegurar un grado muy alto de termoestabilidad en el producto. A dichos contenidos de humedad residuales, la temperatura final en el procedimiento de desecación no debería ser superior a 45ºC, ya que el material biológicamente activo desecado en la matriz puede sufrir algún grado de destrucción por encima de 45ºC. Preferiblemente, la temperatura del producto al final de la etapa de desecación secundaria no excederá los 44ºC.

Se ha encontrado, a través de experimentación, que existe alguna ventaja en controlar la temperatura de la matriz durante la etapa de desecación secundaria, de forma que se mantenga a aproximadamente 37ºC, durante un período de 15 a 17 horas, y luego aumentarla gradualmente (por ejemplo alrededor de 0,5 a 1ºC por hora), durante el tiempo de desecación secundario restante, hasta una temperatura final en el intervalo de 40ºC a 45ºC.

La matriz de trehalosa vítrea producida según el método se puede almacenar durante largos períodos de tiempo, p.ej. varias semanas, sin ninguna pérdida sustancial de actividad, y sin necesidad de refrigeración, y se puede rehidratar muy rápidamente en un medio acuoso apropiado, típicamente agua destilada estéril, para producir una vacuna destinada a usarse en un período de tiempo muy corto.

La preparación de una vacuna y el procedimiento de funcionamiento usando un liofilizador para la desecación de material biológicamente activo, como los virus de la peste bovina, de la peste de los pequeños rumiantes y el micoplasma, sin una etapa de liofilización que implique la sublimación a partir del hielo, explota la propiedad excepcional del disacárido trehalosa para proteger las macromoléculas terciarias durante la desecación.

Comparado con procedimientos de liofilización convencionales, el método de la invención ofrece las siguientes ventajas:

-: Proporciona un nivel elevado de protección para el material biológicamente activo, empleando un procedimiento sencillo, relativamente corto. Se proporciona incluso un nivel mayor de protección usando el procedimiento de desecación en dos etapas, que puede emplear un ciclo de 25 horas.

-: El tiempo del ciclo de producción y los costes energéticos se reducen, por tanto, comparados con procedimientos de liofilización típicos.

-: Todo lo que se necesita es un equipamiento de desecación básico, aunque se pueden usar también liofilizadores sofisticados, controlados por microprocesador, pero no son estrictamente esenciales.

-: El método tolera la interrupción de la corriente, a diferencia de la liofilización, en la que incluso un corte de corriente corto puede producir la fusión del producto, conduciendo a una pérdida de virus inaceptable.

La vacunación oral con algunas cepas atenuadas de virus ha sido difícil de lograr en el pasado, debido a la pérdida de epiteliotropismo. Tanto la vacunación oral como la intranasal serían útiles y apropiadas para muchas aplicaciones porque mimetizan la vía natural de infección por gotitas, produciendo una cascada de inmunidad mucosa protectora, con una respuesta de IgA, de IgG2a humoral y de células T cooperadoras de tipo 1. Sería fácil administrar tales vías de vacunación y éstas serían aplicables en el caso de que se prepare una vacuna adecuada. El quitosano aumenta el transporte transcelular y paracelular a través del epitelio mucoso, y se cree que incrementa o restablece el epiteliotropismo disminuido, asociado normalmente con cepas de vacuna atenuadas (p.ej. virus de la peste bovina RBOK atenuado y micoplasma CBPP S1/44). Esto puede ser particularmente importante en CBPP y otras infecciones por micoplasma, en las que los mecanismos de protección son aún desconocidos, particularmente la inmunidad posvacunación tras la vacunación subcutánea. Un procedimiento de vacunación con cepas vivas atenuadas que mimetizan la vía natural de infección, induce una inmunidad celular y seromucosa más completa. Según un aspecto adicional, la presente invención proporciona un método de fabricación de una vacuna para uso oral e intranasal, que comprende preparar una matriz vítrea de trehalosa que contenga virus desecados según el método descrito anteriormente, y rehidratar la matriz vítrea con una composición acuosa apropiada. Según una realización preferida de este aspecto de la invención, la vacuna para vacunación oral o intranasal es una vacuna NMR. Debido a que la vacuna NMR pediátrica actual se prepara mediante tecnología de liofilización convencional y se inyecta en el paciente subcutáneamente, una vacuna oral o intranasal proporcionaría grandes ventajas.

Ejemplo 1 Método para la preparación de una vacuna veterinaria atenuada viva bivalente

Se cultivó la cepa RBOK del virus de la peste bovina en células Vero en medio LYE (hidrolizado de lactalbúmina y extracto de levadura) de Hanks, que contenía 0,1% de trehalosa en vez de glucosa. Se cultivaron Mycoplasma mycoides subs. mycoides S1/44 (SC) T_{1}-SR y virus de la pleuroneumonía contagiosa bovina (CBPP), en medio de Gourlay. A continuación se recogieron el grupo de virus y el grupo de CBPP. El pH de los grupos de virus y de CBPP se ajustaron con NaOH 0,1 M hasta pH 7,4.

Se preparó una solución de reserva de quitosano al 2% p/v, como sigue:

HCl de quitosano (suministrado por Pronova Seacure)	20g
Agua destilada	1000 ml

Sometido a autoclave a 121ºC durante 30 minutos.

Se preparó una solución de reserva de dihidrato de trehalosa al 50% p/v en una solución salina equilibrada de Hanks (HBSS), ajustándose el pH mediante la adición de NaOH 0,1 M hasta 7,4. La solución se esterilizó mediante tratamiento en autoclave a 121ºC durante 20 minutos.

Se preparó un volumen adecuado de resistencia de trabajo al 0,02% p/v de quitosano, añadiendo 1 ml de quitosano de reserva al 2% p/v a 99 ml de agua destilada estéril.

Se añadió un volumen de solución de quitosano al 0,02% p/v, a un volumen de fluido de virus a 4ºC, y el pH se ajustó hasta 7,4 con NaOH 0,1 M. Esta etapa se repitió separadamente para el grupo de cultivo de CBPP y el complejo de coacervación resultante de cada uno se completó mediante agitación vorticial rápida durante 30 segundos y posteriormente se almacenó a 4ºC durante 1 hora. El precipitado resultante de cada uno se recogió mediante centrifugación a 10.000 rpm en una centrífuga refrigerada, el sobrenadante se desechó y el coacervado se volvió a poner en suspensión en un volumen de solución salina equilibrada de Hanks (HBSS). Se añadió un volumen de solución de trehalosa estéril en solución salina equilibrada de Hanks (HBSS) al 50% p/v, a la suspensión de coacervado, para proporcionar una concentración de trehalosa final de 5% p/v (la actividad se controla mediante los procedimientos funcionamiento estándar de control de calidad para estos organismos)

La vacuna se secó rellenando alícuotas de 1,0 ml en viales de vacuna de 5 ml taponados parcialmente con tapones de caucho de butilo secos. Los estantes del liofilizador convencional (EDWARDS MODULYO) se calentaron hasta 37ºC y se dejó que el condensador alcanzase 40ºC bajo cero. Los viales de vacuna se colocaron en el liofilizador y la presión en la cámara de secado se ajustó hasta 800 mbares y comenzó el secado durante 30 minutos hasta que se hubo evaporado aproximadamente 75% del agua, teniendo cuidado de no permitir que la temperatura del producto descendiera por debajo de 0ºC. La presión se redujo a continuación hasta 500 mbares y el secado continuó hasta que se alcanzó la temperatura de transición vítrea de la trehalosa, a aproximadamente 25ºC, se formó una matriz porosa vítrea y la temperatura del producto se dejó aumentar hasta alcanzar la temperatura de partida inicial, próxima a la de los estantes. En esta etapa, la humedad residual (RM) era aproximadamente 10%. Un secado posterior a 0,01 mbares y 45ºC durante 17 horas, redujo ésta hasta 1-2% RM, asegurando una termoestabilidad elevada en el producto.

La presión se mantuvo a 0,01 mbares y los viales se cerraron herméticamente al vacío o a presión atmosférica, en nitrógeno seco.

Resultados

La efectividad de la presente invención se demostró midiendo las concentraciones de virus de la peste bovina y de micoplasma CBPP en sus líquidos originales respectivos, y luego en vacunas preparadas a partir del producto deshidratado obtenido según el ejemplo anterior.

Virus de la peste bovina

1.: Concentración de virus del líquido original antes del secado: 5,40 Log 10 DICT 50/ml.

2.: Concentración de virus en el producto del Ejemplo (secado con trehalosa al 2,5%): 5,45 Log 10 DICT 50/ml.

: en la que DICT 50/ml = dosis capaz de infectar al 50% de los tejidos, por ml.

Micoplasma CBPP

1.: Concentración de micoplasma vivo del líquido original antes del secado: 9,90 Log 10 organismos/ml.

2.: Concentración del producto del Ejemplo (tras secado con trehalosa al 5%): 8,05 Log 10 organismos/ml.

Ejemplo 2 Materiales y métodos Preparación de un cultivo de vacuna de PPR

Se cultivó inicialmente una cepa de peste de los pequeños rumiantes (PPRV 75/1), usando células Vero en medio de Eagles con modificación de Glasgow (GMEM), suplementado con caldo de fosfato de triptosa al 10% (TPB, Difco) y suero de ternera fetal al 10% (FCS) como sigue:

Se sembraron células Vero en matraces de plástico de 5 x 150 cm^{2} a una concentración celular de 287.000 células/ml, 60 ml por matraz. Se inocularon dos matraces con 0,5 ml de suspensión de virus PPR, a una multiplicidad de infección de 0,03 partículas virales/célula. Un matraz permaneció sin inocular como testigo.

Los matraces se incubaron a 37ºC en CO_{2} al 5%, y las células se examinaron diariamente para el desarrollo de efectos citopáticos (cpe). En el día 4, el medio GMEM se reemplazó por extracto de levadura y lactalbúmina de Hanks (LYE de Hanks), que contenía FCS al 2% y dihidrato de trehalosa al 0,1%. En el día 6, los cpe eran aproximadamente 80% y las cosechas de virus se reunieron, congelaron y almacenaron a -20ºC. El matraz testigo permaneció en la incubadora durante 10 días, y se comprobó que estaba exento de contaminación o degradación celular, sin señales obvias de agentes espontáneos.

Solución de quitosano

Se preparó una solución acuosa de reserva de quitosano (Seacure Cl 310) al 2% p/v en agua destilada y se esterilizó en un autoclave a una temperatura de 121ºC durante 30 minutos. La solución de reserva se diluyó usando agua destilada estéril, para proporcionar una solución que contenía quitosano al 0,02% p/v.

Método

El pH del fluido de virus se ajustó hasta 7,4, usando NaOH 0,1 M. A una parte del fluido de virus de pH ajustado se le añadió una parte de la solución de quitosano diluida al 0,02% p/v, y la mezcla se agitó vorticialmente durante 30 segundos. La mezcla agitada se dejó reposar durante 1 hora a 4ºC, para permitir la formación completa del complejo de coacervado.

Inmediatamente, al final del período de reposo de 1 hora, la mezcla de coacervado se centrifugó a 10.000 rpm en una centrífuga refrigerada durante 20 minutos. El sobrenadante resultante se desechó, y el complejo precipitado se recogió y se puso en suspensión en medio LYH de Hanks + FBS al 2%, a un pH de 7,4. El volumen total del medio de nueva suspensión era igual al volumen total del líquido sometido a centrifugación.

Una parte del complejo puesto nuevamente en suspensión se mezcló con una parte de una solución acuosa estéril al 5% p/v de dihidrato de trehalosa, proporcionando así una concentración de fluido de trehalosa de 2,5% p/v de trehalosa en la mezcla.

Se distribuyeron volúmenes de un ml en sendos viales de vacuna de 5 ml, y se sellaron parcialmente con insertos de caucho de butilo ventilados en seco. Esta aplicación se llevó a cabo a temperatura ambiente, en una cabina de flujo de aire laminar y tomando precauciones asépticas estrictas.

Secado primario

El procedimiento de deshidratación se llevó a cabo usando un liofilizador Supermodulyo de Edwards con un control preciso sobre la cámara de presión, presión del condensador, temperaturas de almacenamiento y de producto. El liofilizador se preparó previamente, antes de cargar la cámara de almacenamiento con los viales que contenían el producto. La temperatura de almacenamiento se incrementó hasta 40ºC y la temperatura del condensador se dejó alcanzar el límite de funcionamiento de -40ºC. Los viales se colocaron después en los estantes y los contenidos se dejaron alcanzar 35ºC. La puerta de la cámara se cerró con las válvulas de admisión de aire macroscópico y microscópico totalmente abiertas, y la bomba de vacío se encendió con la válvula de lastre a tope. La presión en la cámara se ajustó hasta 800 mbares cerrando cuidadosamente la válvula de admisión de aire macroscópico. La presión en el condensador se mantuvo a 500 mbares, a fin de producir un gradiente de presión entre la cámara y el condensador, y esto proporcionó la fuerza impulsora para inducir al vapor de agua a fluir desde la superficie del producto hasta el condensador. El cierre parcial de los viales con los tapones tenía también el efecto beneficioso de estrangular la apertura, incrementando por tanto la presión aún más en la superficie del producto. Se percibió que los viales cerrados parcialmente se secaban más rápidamente que los totalmente abiertos, que contenían termopares de registro de temperatura.

La temperatura del producto se controló principalmente cerrando cuidadosamente la válvula de admisión de aire macroscópico durante los primeros 15 minutos y, a continuación, mediante manipulación de la válvula de admisión de aire microscópico, asegurándose de no permitir que el producto se congelase. El mantenimiento de la temperatura alrededor de 1-2ºC producido mediante enfriamiento evaporativo, incrementó la velocidad de evaporación, de forma que 90% del agua se había evaporado en una hora y la temperatura del producto comenzó a aumentar para igualar la temperatura de almacenamiento. A medida que transcurría la deshidratación, se alcanzó un punto crítico después de 40 minutos, en que se producía un aumento repentino rápido hasta 25ºC, seguido en segundos por un descenso repentino de la temperatura del producto hasta 15ºC. Éste estaba acompañado por un burbujeo considerable del producto.

Secado secundario

El lote se sometió luego a un período de secado secundario, en el que la temperatura se incrementó durante un período de 17 horas adicionales, hasta una temperatura final del producto de 42,4ºC y una presión de 0,06 mbares, con la válvula de lastre totalmente cerrada. Esto producía el efecto de reducir el contenido de humedad residual del material hasta aproximadamente 0,72%.

Claims

1. Un método de conservación de material biológicamente activo, que comprende mezclar una suspensión acuosa del material biológicamente activo con una solución acuosa estéril de quitosano o una de sus sales atóxicas, para formar un coacervado del material biológicamente activo y quitosano o su sal atóxica, añadir al coacervado una solución acuosa estéril de trehalosa, someter la mezcla estéril de coacervado y trehalosa a secado a una presión inferior a la atmosférica y una temperatura, inicialmente no superior a 37ºC, que se controla posteriormente para que no descienda hasta 0ºC o inferior, para formar una matriz vítrea porosa que comprende trehalosa vítrea metaestable que contiene, en la matriz, material biológicamente activo desecado y quitosano o su sal atóxica.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que el material biológicamente activo se selecciona de virus, bacterias, proteína biológicamente activa con estructura terciaria y ácido nucleico.

3. Un método según la reivindicación 2, en el que el material biológicamente activo es al menos un virus seleccionado de virus de la peste bovina, virus de la peste de los pequeños rumiantes, sarampión, paperas, rubeola, fiebre amarilla, polio y virus de la enfermedad de Newcastle.

4. Un método según al reivindicación 2, en el que el material biológicamente activo es el micoplasma de la pleuroneumonía bovina contagiosa (CBPP).

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que la solución acuosa estéril de quitosano o su sal atóxica tiene una concentración de quitosano de 0,01% p/v.

6. Un método según la reivindicación 5, en el que la solución acuosa estéril de quitosano y la suspensión acuosa de material biológicamente activo se mezclan en una relación de volumen de 1:1 a pH 7,4.

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el coacervado de material biológicamente activo y quitosano se somete a mezcladura vorticial.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el coacervado de material biológicamente activo y quitosano se mezcla con una solución acuosa estéril de trehalosa, que tiene una concentración de trehalosa en el intervalo de 0,20 a 20% p/v.

9. Un método según la reivindicación 8, en el que la solución acuosa estéril de trehalosa tiene una concentración de trehalosa en el intervalo de 2,5 a 8% p/v.

10. Un método según la reivindicación 9, en el que la solución acuosa estéril de trehalosa tiene una concentración de trehalosa de aproximadamente 5% p/v.

11. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que la mezcla de coacervado y trehalosa se somete a secado durante 30 a 60 minutos, a una presión inferior a la atmosférica y una temperatura inicialmente no superior a 37ºC, y que se controla para que no descienda hasta 0ºC o inferior, y que, finalmente, no es superior a 40ºC, para formar una matriz vítrea porosa que comprende trehalosa vítrea con un contenido de humedad residual no superior a 10% y que contiene, en la matriz. material biológicamente activo desecado y quitosano o su sal atóxica.

12. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la etapa de secado se lleva a cabo a una presión no superior a 800 mbares.

13. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que la matriz de trehalosa resultante que contiene material biológicamente activo desecado y quitosano o su sal atóxica, se somete a un procedimiento de secado secundario durante 10 a 30 horas a presión no superior a 0,1 mbares y a una temperatura que está finalmente en el intervalo de 40 a 45ºC, para formar una matriz de trehalosa que tiene un contenido de humedad residual no superior a 2%, que contiene en la matriz material biológicamente activo desecado y quitosano o su sal atóxica.

14. Un método según la reivindicación 12, en el que el secado secundario se lleva a cabo durante 20 a 30 horas.

15. Un método según la reivindicación 13, en el que el secado secundario se realiza durante 15 a 17 horas, a una temperatura de aproximadamente 37ºC y la temperatura se incrementa a continuación gradualmente durante el tiempo de secado secundario restante, hasta una temperatura final en el intervalo de 40 a 45ºC.

16. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, en el que el contenido residual de humedad al final de la etapa de secado secundario es 1,0% o inferior.

17. Un método de fabricación de una vacuna que comprende conservar un material biológicamente activo según el método de las reivindicaciones 1 a 15, y rehidratar el producto vítreo así obtenido, en un medio acuoso apropiado.

18. Un método según la reivindicación 17, en el que la vacuna es para uso oral o intranasal.

19. Un método según la reivindicación 17, en el que la vacuna es una vacuna del sarampión, las paperas o la rubeola (NMR).

20. Una composición rehidratable que comprende trehalosa en forma de una matriz vítrea metaestable que contiene, en la matriz, material biológicamente activo desecado y quitosano o una de sus sales atóxicas.

21. Una composición rehidratable según la reivindicación 20, que tiene un contenido residual de humedad no superior a 2%.

22. Una composición rehidratable según la reivindicación 21, que tiene un contenido residual de humedad no superior a 1%.

23. Una composición rehidratable según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 22, útil para fabricar una vacuna, una vez rehidratada.

24. Una composición rehidratable según una cualquiera de las reivindicaciones 20 a 23, en la que el material biológicamente activo se selecciona de virus, bacterias, proteínas biológicamente activas con estructura terciaria y ácidos nucleicos.

25. Una composición rehidratable según la reivindicación 24, en la que el material biológicamente activo es al menos un virus seleccionado de virus de la peste bovina, virus de la peste de los pequeños rumiantes, sarampión, paperas, rubeola, fiebre amarilla, poliomielitis y virus de la enfermedad de Newcastle.

26. Una composición rehidratable según la reivindicación 24, en la que el material biológicamente activo es el micoplasma de la pleuroneumonía bovina contagiosa (CBPP).