ES2229091T3 - Procedimiento para conectar proteinas insolubles mediante filtracion por membrana vibratoria. - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para purificar una proteína insoluble que comprende la aplicación de una suspensión de proteína a un dispositivo de filtro de membrana vibratoria que comprende una membrana hidrófila y la retención de la proteína insoluble en el concentrado.

Description

Procedimiento para conectar proteínas insolubles mediante filtración por membrana vibratoria.

La presente invención se refiere a procedimientos para recolectar células de caldos fermentadores, la purificación de proteínas insolubles y la depuración de proteínas solubles. En particular los procedimientos utilizan filtración por membrana vibratoria. En particular, el procedimiento utiliza membranas hidrófilas. Los filtros de membrana vibratoria con membrana hidrófila en particular membrana de polietersulfona hidrofilizada son nuevos y forman un aspecto de la invención.

La producción de proteínas para fines diagnósticos o biomédicos como por ejemplo para aplicaciones profilácticas y terapéuticas se logra de manera económica a través de clonación y sobreexpresión en células huésped como bacterias, levaduras, células de insectos, células de mamíferos, y otros sistemas. Las células pueden ser los huéspedes naturales de expresión o especies extrañas que permiten condiciones de producción más sencillas.

Algunas proteínas son difíciles de aislar en formas solubles incluso a partir de su entorno natural porque su función es estructural, o asociada a membrana o su situación está en compartimentos celulares específicos. Además, la sobreexpresión de proteínas en huéspedes extraños conduce a menudo a productos que son insolubles y se acumulan en forma de depósitos amorfos o cuerpos de inclusión. Estos últimos están particularmente bien documentados usando E. Coli como huésped para la expresión (Guise A. D., y col., Mol Biotechnol agosto de 1996; 6(1):53-64).

Las causas de la insolubilidad de las proteínas en condiciones de sobreexpresión no se identifican siempre exactamente. La insolubilidad puede resultar como consecuencia de velocidades extremadamente elevadas de traducción, acumulaciones de concentración intracelular elevada, entorno intracelular desfavorable como por ejemplo bajo potencial redox y deficiencias en la maquinaria de plegado o en el procesamiento post-translacional del huésped. La asociación de las proteínas con orgánulos, membranas y otras estructuras de las células del huésped puede dar como resultado además la insolubilidad durante el procesamiento.

La ingeniería genética permite la creación de proteínas artificiales mediante mutaciones, supresiones o fusiones de dos secuencias polipeptídicas no relacionadas. A menudo dichas construcciones son insolubles.

Por lo tanto, el problema de insolubilidad en el aislamiento de proteínas está muy extendido. La insolubilidad puede resultar a partir de las propiedades naturales de la proteína, a partir de la expresión en huéspedes no naturales, o a partir de la modificación deliberada de la estructura natural por supresión, adición o fusión de elementos polipeptídicos.

En general el procesamiento posterior de proteínas insolubles implica (1) el fraccionamiento de los contaminantes solubles fuera del producto y (2) la posterior solubilización del producto de interés con tampones a pH extremo o que contiene agentes de solubilización como detergentes y agentes caotrópicos. Se usan frecuentemente sal de guanidina y urea como agentes caotrópicos. Los procedimientos para el procesamiento de cuerpos de inclusión representan un ejemplo muy conocido de procedimientos usados para la purificación de proteínas insolubles.

Los procedimientos clásicos toman ventaja de la insolubilidad de las proteínas para separar todos los componentes solubles de las células. Los protocolos para el procesamiento de productos insolubles se describen mediante varios artículos (Wingfield 1997, Cap. 6 en Current Protocol in Protein Sciences; Misawa S y Kumagai I. Biopolymers 1999; 51(4):297-307; Mukhopadhyay A. Adv. Biochem Eng Biotechnol 1997; 56:61-109).

La separación se puede lograr mediante varios ciclos de centrifugación y etapas de re-suspensión que permiten quitar mediante lavado la mayor parte de los contaminantes solubles (Wong HH, O'Neill BK, Middelberg AP. Bioseparation 1996; 6(6):361-72). Alternativamente, la fracción insoluble se puede separar de los contaminantes solubles usando técnicas de filtración como filtración en profundidad o micro-filtración de flujo tangencial (Batas B, Schiraldi C, Chaudhuri JB. J Biotechnol 19 de Febrero de 1999; 68(2-3):149-58).

Las técnicas actuales tienen distintos inconvenientes. La centrifugación está limitada intrínsecamente por el tamaño del flujo de los fragmentos de proteína insoluble y por la viscosidad del medio. Algunas partículas o estructuras de proteínas insolubles también muestran pocas diferencias de solubilidad con el medio. La recuperación del producto global a partir de centrifugación repetida puede ser escasa debido a las limitaciones en la capacidad técnica de las máquinas para separar los aglomerados del sobrenadante. Además, el aumento de escala es difícil de predecir. La microfiltración de los extractos que contienen proteínas insolubles y otros componentes celulares en partículas sufre de taponamiento y contaminación de las membranas.

Tras la recuperación del producto insoluble lavado, la solubilización de la proteína objetivo con detergentes o agentes caotrópicos produce un extracto túrbido que contiene material formado de partículas, que no se pueden aplicar directamente sobre columnas de cromatografía sin un taponamiento severo. Es necesario por lo tanto depurar dicho extracto mediante centrifugación y/o micro-filtración. Sin embargo estas técnicas tienen los mismos defectos que se indican anteriormente. Además incluso después de la depuración la materia suspendida sigue apareciendo en el extracto que requiere de este modo una etapa de filtración más a fondo antes de cualquier purificación posterior. Además, la contaminación de membranas de micro-filtración a menudo da como resultado una pobre transmisión de producto en el filtrado.

En intentos para mejorar la capacidad de la micro-filtración de flujo tangencial, se desarrollaron nuevos diseños. Kroner y Nissinen (J. of Membrane Science, 1998; 36:85-100), Lee y col. (Biotechnology and Bioengineering, 1995; 48:386-400), Cole y Brandley (Biopharm, 1996; 5:66-71) describen el uso de dispositivos de filtración dinámica mediante el cual el filtro funciona mecánicamente para producir elevadas velocidades de cizallamiento en la superficie de la membrana y por consiguiente mejores rendimientos de filtración en términos de flujo, transmisión de proteína y resistencia a contaminación. Sin embargo la fabricación de estos tipos de equipo para operación en gran escala se ha suspendido.

Alex y Houghney (Cap. 24 en Filtration in the Biopharmaceutical Industry 1998, Eds Meltzer T. H. y Jornitz M. W., Marcel Dekker, N. Y.) describen un nuevo dispositivo denominado Filtración por Membrana Vibratoria que permite superar algunas de las limitaciones de la micro-filtración de flujo transversal clásica. Las ventajas se presentan en términos de mejor resistencia a la contaminación, flujos mejorados y transmisión de proteínas. La referencia indica que el material de membrana usado para la mayoría de las aplicaciones farmacéuticas es una membrana de PTFE (Teflón) microporosa. Se proporcionan ejemplos para la recuperación de un producto intracelular soluble a partir de un homogenado de células. Se describe un dispositivo similar en varias publicaciones. La Patente de Estados Unidos 4.952.317 Device and Method for Filtering a Colloidal Suspension describe un dispositivo de filtración vibratorio, al igual que la Pat. de Estados Unidos 4.872.988 Method and Device for Separation of Colloidal Suspensions describe varios filtros vibratorios peculiarmente adecuados para la depuración de pequeñas muestras. La Pat. de Estados Unidos 5.014.564 describe el mecanismo de funcionamiento excéntrico que permite la operación del sistema de filtración vibratorio.

Los presentes inventores han descubierto que es posible purificar productos de proteínas insolubles al utilizar filtros de membrana vibratorios, en los que la membrana del filtro es hidrófila de modo que se puede humedecer directamente en agua. De modo que el agua puede penetrar fácilmente en los poros de las membranas. Los filtros de membrana vibratoria previos se han construido con material hidrófobo como PTFE. Dichas membranas hidrófilas se pueden producir a partir de celulosa regenerada, acetato de celulosa, material polimérico hidrofilizado como PVDF (por ejemplo comercializado con la marca registrada Durapore por Millipore), nailon modificado, pero es preferiblemente una membrana de poliétersulfona hidrofilizada (denominada en lo sucesivo PES), y más preferiblemente la membrana hidrófila "045PS10PES element" adquirida de Pall-Filtron o su membrana de 0,2 y 0,8 micrómetros equivalente.

La invención también proporciona un procedimiento para purificar una proteína insoluble que tiene las ventajas sobre los procedimientos previos de que los contaminantes filtrables (es decir restos de célula, ácidos nucleicos, lípidos y lipopolisacáridos) se eliminan pronto en el procedimiento de purificación y a una mayor eficacia de la alcanzable anteriormente con los procedimientos anteriores como con centrifugación, o filtración de flujo tangencial. Esto permite que el producto se aplique directamente tras la depuración a una columna de cromatografía. Además, las pérdidas del producto se reducen en comparación con la filtración de flujo tangencial ya que se encuentran que los sistemas son proclives al taponamiento de la membrana.

La presente invención también tiene la ventaja de que el todo el procedimiento se puede mantener como un sistema cerrado lo que facilita en gran medida las operaciones de BPF (Buenas Prácticas de Fabricación) y/o la contención de los agentes (bio)peligrosos. El procedimiento es además más rápido y de menos mano de obra intensiva. Se pueden tratar normalmente 5 litros del extracto bruto en menos de 6 horas, normalmente 3-5 horas. La amplitud de la unión del filtro de membrana vibratoria se fija normalmente entre 0,64 y 3,18 centímetros, normalmente a aproximadamente 1,91 cm. El concentrado resultante que está formado por una suspensión de proteínas insolubles se puede lavar, por ejemplo, mediante diafiltración, solubilizarse y filtrarse a través del filtro de membrana vibratoria y recogerse el filtrado que contiene la proteína, y opcionalmente, aplicarse directamente a una columna de cromatografía.

El procedimiento de la invención elimina el 80% o más de los contaminantes dejando de ese modo una preparación de proteína relativamente pura para purificar más a fondo mediante otras técnicas cromatográficas. La invención también es eficaz al eliminar endotoxinas de la mezcla; normalmente se pueden eliminar más del 90% de las endotoxinas de una muestra, antes de la purificación final mediante una columna cromatográfica. Las técnicas cromatográficas adecuadas incluyen columnas IMAC, Q-Sefarosa y similares.

Por consiguiente la presente invención proporciona un procedimiento para la purificación de una proteína presente en forma insoluble que comprende la aplicación de un extracto de célula o alternativamente un homogenado de célula, a un filtro de membrana vibratoria que comprende una membrana hidrófila, preferiblemente una membrana hidrófila de Pall-Filtron "045PS10PES element" y que retiene la proteína en el concentrado.

El tamaño del poro de la membrana está preferiblemente entre 0,1 y 1,2 micrómetros. Preferiblemente el tamaño del poro está por debajo de 0,9 \mum, a menudo aproximadamente 0,8 \mum, normalmente aproximadamente 0,65 \mum y más normalmente entre 0,15 \mum y 0,50 \mum. Normalmente los fabricantes proporcionan membranas con un tamaño de poro nominal de 0,2 ó 0,45 \mum o 0,8 \mum. Éstos son preferidos para uso en la presente invención.

El material de partida, puede ser cualquier extracto de proteína insoluble de una célula huésped. Por ejemplo los siguientes antígenos cuando se producen mediante expresión recombinante en forma insoluble: antígenos de rechazo tumoral como los de cánceres de próstata, de mama, colorrectal, de pulmón, pancreático, renal o de melanoma. Los antígenos ejemplares incluyen MAGE 1, 3 y MAGE 4 u otros antígenos MAGE como los desvelados en los documentos WO99/40188, PRAME, BAGE, Lage (también conocido como NY Eos 1) SAGE y HAGE (documento WO 99/53061) o GAGE (Robbins y Kawakami, 1996, Current Opinions in Immunology 8, pág. 628-636; Van den Eynde y col., International Journal of Clinical & Laboratory Research (presentado en 1997); Correale y col. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, pág. 293. Además estos antígenos se expresan en un gran intervalo de tipos de tumor como melanoma, carcinoma de pulmón, sarcoma y carcinoma de vejiga.

Los antígenos MAGE se pueden purificar según la presente invención y se pueden expresar como una proteína de fusión con un intensificador de expresión o un asociado de fusión inmunológico. En una realización de la presente invención, el derivado es una proteína de fusión que comprende un antígeno de la familia de proteínas MAGE unido a un asociado heterólogo preferiblemente MAGE 3. Las proteínas pueden estar químicamente conjugadas, pero se expresan preferiblemente como proteínas de fusión recombinante que permiten que se produzcan niveles aumentados en un sistema de expresión en comparación con la proteína no fusionada. De este modo el asociado de fusión puede ayudar al proporcionar epítopos auxiliares T (asociado de fusión inmunológico), preferiblemente los epítopos auxiliares T reconocidos por humanos, o ayudar en la expresión de la proteína (intensificador de expresión) con mayores rendimientos que la proteína recombinante original. Preferiblemente el asociado de fusión debe ser tanto un asociado de fusión inmunológico como un asociado intensificador de expresión.

El asociado de fusión inmunológico se puede derivar de la proteína D, una proteína de superficie de la bacteria gram-negativa, Haemophilus influenza B (documento WO91/18926). Preferiblemente el derivado de proteína D comprende aproximadamente el primer 1/3 de la proteína, en particular aproximadamente los primeros 100-110 aminoácidos N-terminales. El derivado de proteína D puede estar lipidado. Preferiblemente los primeros 109 residuos del asociado de fusión de Lipopropteína D se incluyen en el N terminal para proporcionar el antígeno candidato a la vacuna con unos epítopos de células T exógenos adicionales y aumentar el nivel de expresión en E-coli (actuando de este modo también como intensificador de expresión).

Otros asociados de fusión incluyen proteínas no estructurales del virus influenzae, NS1. Normalmente se utilizan los 81 aminoácidos N terminales, aunque se pueden usar diferentes fragmentos siempre que incluyan epítopos auxiliares T.

En otra realización el asociado de fusión inmunológico es la proteína conocida como LYTA. Se usa preferiblemente la parte C terminal de la molécula. Lyta proviene de Streptococcus pneumoniae que sintetiza N-acetil-L-alanina amidasa, amidasa LYTA, (codificada por el gen lytA {Gene, 43 (1986) página 265-272} una autolisina que degrada específicamente ciertas uniones en el eje central del peptidoglicano. El dominio C terminal de la proteína LYTA es responsable de la afinidad a la colina o a otros análogos de colina como DEAE. Esta propiedad se ha explotado para el desarrollo de plásmidos que expresan C-LYTA de E. Coli útiles para la expresión de proteínas de fusión. Se ha descrito la purificación de proteínas híbridas que contienen los fragmentos de C-LYTA en su terminal amino {Biotechnology: 10, (1992) página 795-798}. Tal como se usa en la presente memoria descriptiva una realización preferida utiliza la parte repetida de la molécula Lyta encontrada en el extremo C terminal que comienza en el residuo 178. Una forma particularmente preferida incorpora residuos 188 - 305.

Los asociados de fusión inmunológicos indicados anteriormente también resultan ventajosos al ayudar en la expresión. En particular, dichas fusiones se expresan con mayores rendimientos que las proteínas MAGE recombinantes originales. Dichas construcciones se desvelan en el documento WO99/40188.

Se pueden purificar según la invención otros antígenos específicos de tumor.

En una realización más preferida se pueden utilizar otros antígenos, más particularmente antígenos de la próstata como antígeno específico de la próstata (PSA), PAP, PSCA (PNAS 95(4) 1735 - 1740 1998), PSMA o, en una realización preferida un antígeno conocido como Prostasa.

Prostasa es una proteasa de serina específica de la próstata (similar a tripsina), de 254 aminoácidos de longitud, con una tríada H-D-S catalítica de proteasa de serina conservada y una secuencia de pre-propéptido amino terminal, que indica una función secretora potencial (P. Nelson, Lu Gan, C. Ferguson, P. Moss, R. Gelinas, L. Hood & K. Wand, "Molecular cloning and characterisation of prostase, an androgen-regulated serine protease with prostate restricted expression", en Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96, 3114-3119). Se ha descrito un sitio de glicosilación putativo. La estructura predicha es muy similar a las otras proteasas de serina conocidas, mostrando que el polipéptido maduro se pliega en un único dominio. La proteína madura es de 244 aminoácidos de longitud, mostrándose que un epítopo A2 se procesa de manera natural.

La secuencia de nucleótido de prostasa y secuencia de polipéptido deducida y homólogos se desvelan en Ferguson, y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119) y en las Solicitudes de Patente Internacional Núm. WO 98/12302 (y también las correspondiente patente de Estados Unidos concedida 5.955.306), WO 98/20117 (y las correspondientes patentes de Estados Unidos concedidas 5.840.871 y 5.786.148) (calicreína específica de próstata) y WO 00/04149 (P703P).

La presente invención proporciona un procedimiento para purificar fusiones de proteína de prostasa basadas en proteína de prostasa y fragmentos y homólogos de éstos ("derivados"). Dichos derivados son adecuados para uso en formulaciones de vacunas terapéuticas que son adecuadas para el tratamiento de tumores de la próstata.

En una realización la invención contempla la purificación de un antígeno prestos mutado en el que la mutación ocurre en el sitio activo de la proteína. El derivado de antígeno prestos o fragmentos y homólogos de éste llevan una mutación en el sitio activo de la proteína, para reducir sustancialmente o preferiblemente eliminar su actividad biológica de proteasa. Las mutaciones preferidas implican la sustitución de los residuos catalíticos de Histidina y Aspartato de la proteasa de serina. En una realización preferida, el prestos contiene una mutación de Histidina-Alanina en el sitio activo, por ejemplo en el residuo 71 de la secuencia de prostasa (Ferguson, y col. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96, 3114-3119). La mutación correspondiente en proteínas homólogas, por ejemplo como se desvela en el documento WO 00/041949 se contempla expresamente. Por ejemplo esta mutación corresponde a la posición 43 en P703P. Esta mutación puede conducir a una disminución significativa en la eficacia catalítica (expresada en actividad específica enzimática) de la proteína. Preferiblemente la reducción de la eficacia catalítica es al menos por un factor de 10^{3}, más preferiblemente al menos por un factor de 10^{6}. La proteína que ha experimentado una mutación de histidina alanina se identifica en lo sucesivo como * (estrella).

En una realización, la prostasa mutada o no mutada es parte de una proteína de fusión, que comprende la prostasa asociada al tumor o fragmento u homólogos de ésta y una proteína heteróloga o parte de una proteína que actúa como un asociado de fusión. La proteína y el asociado de fusión pueden estar químicamente conjugados, pero se expresan preferiblemente como proteínas de fusión recombinante en un sistema de expresión heterólogo.

En una realización preferida la invención contempló la purificación de una proteína de fusión prestos o fragmento u homólogo de ésta unida a un asociado de fusión inmunológico que pueden ayudar al proporcionar epítopos auxiliares T. De este modo el asociado de fusión puede actuar a través de un efecto auxiliar inespecífico unido a la secreción de señales de activación por un gran número de células T específicas a la proteína o péptido extraño, mejorando de este modo la inducción de inmunidad al componente de prostasa en comparación con la proteína no fusionada. Preferiblemente el asociado heterólogo se selecciona para ser reconocible por las células T en la mayoría de los humanos.

En otra realización, la invención proporciona un procedimiento para la purificación de una proteína de prostasa o fragmento u homólogo de ésta unido a un asociado de fusión que actúa como un intensificador de la expresión. De este modo el asociado de fusión puede ayudar en la expresión de prostasa en un sistema heterólogo, permitiendo que se produzcan niveles aumentados en un sistema de expresión en comparación con la proteína recombinante original.

Preferiblemente el asociado de fusión será un asociado de fusión inmunológico y un asociado intensificador de expresión. Por consiguiente, la presente invención proporciona proteínas de fusión que comprenden una prostasa específica de tumor mutada o un fragmento de ésta unida a un asociado de fusión. Preferiblemente la fusión actúa tanto como un asociado de fusión inmunológico y como un asociado intensificador de expresión. Por consiguiente, en una forma preferida de la invención, el asociado de fusión es la proteína no estructural del virus influenzae, NS1 (proteína no estructural 1) o un fragmento de ésta. Normalmente se utilizan los 81 aminoácidos N terminales, aunque se pueden utilizar diferentes fragmentos a condición de que incluyan epítopos auxiliares T (C. Hackett, D. Horowitz, M. Wysocka & S. Dillon, 1992, J. Gen Virology, 73, 1339 - 1343). Cuando NS1 es el asociado de fusión inmunológico tiene la ventaja adicional de que permite que se logren mayores rendimientos de expresión. En particular, tales fusiones se expresan con mayores rendimientos que las proteínas de prostasa recombinantes originales.

En una realización más preferida, la proteína de fusión comprende los 81 aminoácidos N terminales de la proteína no estructural NS1 fusionados a los aminoácidos carboxi terminales 5 a 226. Los asociados de expresión alternativos incluyen por ejemplo la proteína D y fragmentos de ésta y C-Lyta según se utiliza en el contexto de antígenos MAGE.

Un antígeno de la próstata preferido adicional que se puede purificar se conoce como P501S, ID de secuencia nº 113 del documento WO98/37814. Los fragmentos inmunogénicos y partes de éstos comprenden al menos 20, preferiblemente 50, más preferiblemente 100 aminoácidos contiguos como se desvela en la solicitud de patente anteriormente indicada. Véase por ejemplo PS108 (documento WO 98/50567).

Otros antígenos específicos de la próstata se conocen a partir de los documentos WO 98/37418, y WO/004149. Otro es STEAP PNAS 96 14523 14528 7 - 12 1999.

Otros antígenos asociados a tumor útiles en el contexto de la presente invención incluyen Plu - 1 J Biol. Chem 274 (22)-15633 - 15645, 1999, HASH - 1, HasH - 2, Cripto (Salomon y col Bioessays 199, 21 - 61 - 70, Patente de Estados Unidos 5654140) Criptin (Patente de Estados Unidos 5.981.215). Además, los antígenos particularmente relevantes para vacunas en la terapia del cáncer también comprenden tirosinasa y survivina.

Péptidos derivados de mucina como MucI véase por ejemplo documentos US 5.744.144, US 5.827.666, WO 8805054, US 4.963.484. Se contemplan específicamente péptidos derivados de Muc 1 que comprenden al menos una unidad de repetición del péptido Muc 1, preferiblemente al menos dos de dichas repeticiones y que son reconocidos por el anticuerpo SM3 (documento US 6.054.438). Otros péptidos derivados de mucina incluyen péptido de

\hbox{Muc
5.}

La presente invención también es útil para la purificación de antígenos del cáncer de mama como Her 2/Neu, mamaglobina (Patente de Estados Unidos 5668267) o los desvelados en los documentos WO/00 52165, WO99/33869, WO99/19479, WO 98/45328. Los antígenos Her 2 neu se desvelan entre otros, en la patente de Estados Unidos 5.801.005. Preferiblemente el Her 2 neu comprende el dominio extracelular completo (que comprende aproximadamente aminoácido 1 - 645) o fragmentos de éste y al menos una parte inmunogénica de éste, o todo el dominio intracelular aproximadamente (los 580 aminoácidos C terminales). En particular, la parte intracelular debe comprender el dominio de fosforilación o fragmentos de éste. Dichas construcciones se desvelan en el documento WO00/44899. Una construcción particularmente preferida se conoce como ECD PD, una segunda se conoce como ECD APD. Véase documento WO/00/44899.

El her 2 neu tal como se usa en la presente memoria descriptiva puede provenir de rata, ratón o humano.

El antígeno Her2-neu puede ser el antígeno Her2-neu completo o partes de éste. Las partes preferidas comprenden el dominio extracelular. En una realización más preferida se proporciona una proteína de fusión que comprende un dominio extracelular unido a una parte del dominio intracelular según se desvela en el documento WO 00/44899.

Los antígenos y proteínas de otras fuentes se pueden purificar según el procedimiento de la invención. Preferiblemente el procedimiento de la presente invención se utiliza para purificar un antígeno o una composición antigénica capaz de producir una respuesta inmune contra un patógeno humano, cuya composición antigénica o antígeno se deriva del grupo formado por antígenos de VIH-1 (como tat, nef, gp120 p gp160). En una realización preferida el procedimiento de la invención se aplica a la purificación de una proteína de fusión de VIH conocida como NEF-TAT y descrita en el documento WO99/16884. Otros antígenos incluyen, antígenos de virus de herpes humano, como gD o derivados de éste o proteína de expresión temprana como ICP27 de VHS1 o VHS2, citomegalovirus ((esp humana) (como gB o derivados de éste), rotavirus (incluyendo virus vivos atenuados), virus Epstein Barr (como gp350 o derivados de éste), Virus Varicella Zoster (como gpI, II e IE63), o de un virus de la hepatitis como el virus de la hepatitis B (por ejemplo antígeno de superficie de Hepatitis B o un derivado de éste), virus de la Hepatitis A, virus de la Hepatitis C y virus de la Hepatitis E, o de otros patógenos virales, como paramixovirus: virus sincital respiratorio (como proteínas F y G o derivados de éstas), virus de parainfluenza, virus del sarampión, virus de las paperas, virus de papiloma humano (por ejemplo VPH6, 11, 16, 18, ...), flavivirus (por ejemplo virus de la fiebre amarilla, virus de dengue, virus de la encefalitis transmitida por garrapatas, virus de la encefalitis japonesa) o virus influenza (virus completamente vivos o inactivados, virus influenza partidos, que crecen en huevos o células MDCK, o virosomas de la gripe al completo (según describe R. Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) o proteínas purificadas o recombinantes de éstos, como proteínas HA, NP, NA, o M, o combinaciones de éstas), o derivados de patógenos bacterianos como Neisseria spp, incluyendo proteínas que se unen a transferrina, proteínas que se unen a lactoferrina, PilC, adhesinas de N. gonorrhea y N. meningitidis); S. pyogenes (por ejemplo proteínas M o fragmentos de éstas, proteasa C5A, ácidos lipoteicoicos), S. agalactiae, S. mutans; H. ducreyi; Moraxella spp, incluyendo M catarrhalis, también conocida como Branhamella catarrhalis (por ejemplo adhesinas e invasinas de elevado y bajo peso molecular); Bordetella spp., incluyendo B. pertussis (por ejemplo pertactina, toxina pertussis o derivados de éstos, hemaglutinina filamentosa, adenilato ciclasa, fimbriae), B. parapertussis y B. bronchiseptica; Mycobacterium spp., incluyendo M. tuberculosis (por ejemplo ESAT6, Antígeno 85A, -B o -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; Legionella spp, incluyendo L. pneumophila; Escherichia spp, incluyendo E. coli enterotóxica (por ejemplo factores de colonización, toxina termo-lábil o derivados de ésta, toxina termoestable o derivados de ésta), E. coli enterohemorrágica, E. coli enteropatogénica (por ejemplo toxina similar a la toxina de shiga o derivados de ésta); Vibrio spp, incluyendo V. cholera (por ejemplo toxina del cólera o derivados de ésta); Shigella spp, incluyendo S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; Yersinia spp, incluyendo Y. enterocolitica (por ejemplo proteína Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; Campylobacter spp, incluyendo C. jejuni (por ejemplo toxinas, adhesinas e invasinas) y C. coli; Salmonella spp. incluyendo S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; Listeria spp., incluyendo L. monocytogenes; Helicobacter spp, incluyendo H. pylori (por ejemplo ureasa, catalasa, toxina vacuolante); Pseudomonas spp., incluyendo P. aeruginosa; Staphylococcus spp., incluyendo S. aureus, S. epidermidis; Enterococcus spp., incluyendo E. faecalis, E. faecium; Clostridium spp., incluyendo C. tetani (por ejemplo toxina del tétanos y derivados de ésta), C. botulinum (por ejemplo toxina botulínica y derivados de ésta), C. difficile (por ejemplo toxinas de clostridium A o B y derivados de éstas); Bacillus spp., incluyendo B. anthracis (por ejemplo toxina botulínica y derivados de ésta); Corynebacterium spp., incluyendo C. diphteriae (por ejemplo toxina diftérica y derivados de ésta); Borrelia spp., incluyendo B. burgdorferi (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpC), B. garinii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpC), B. afzelii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpC), B. andersonii (por ejemplo OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; Ehrlichia spp., incluyendo E. equi y el agente de la erhlichiosis granulocítica humana; Rickettsia spp., incluyendo R. rickettsii; Chlamydia spp., incluyendo C. trachomatis (por ejemplo MOMP, proteínas unidas a heparina), C. pneumoniae (por ejemplo MOMP, proteínas unidas a heparina),C. psittaci; Leptospira spp., incluyendo L. interrogans; Treponema spp., incluyendo T. palladium (por ejemplo las proteínas de la membrana externa raras), T. denticola, T. hyodysenteriae; o derivados de parásitos como Plasmodium spp., incluyendo P. falciparum; Toxoplasma spp., incluyendo T. gondii (por ejemplo SAG2, SAG3, Tg34); Entamoeba spp., incluyendo E. histolytica; Babesia spp., incluyendo B. microti; Tripanosoma spp., incluyendo T. Cruzi; Giardia spp., incluyendo G. lamblia; Leshmania spp., incluyendo L. major; Pneumocystis spp., incluyendo P. carinii; Trichomonas spp., incluyendo T. vaginalis; Schisostoma spp., incluyendo S. mansoni, o derivados de levadura como Candida spp., incluyendo C. albicans; Cryptococcus spp., incluyendo C. neoformans.

Otros antígenos específicos preferidos para M. tuberculosis son por ejemplo Tb Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 y hTCC1 (documento WO 99/51748). Las proteínas para M. tuberculosis también incluyen proteínas de fusión y variantes de éstas donde al menos dos, preferiblemente tres polipéptidos de M. tuberculosis se funden en una proteína más grande. Las fusiones preferidas incluyen Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (documento WO 99/51748).

Los antígenos más preferidos para Chlamydia incluyen por ejemplo Proteína de Elevado Peso Molecular (HWMP) (documento WO 99/17741, ORF3 (documento EP 366.412), y proteínas de membrana putativas (Pmps). Otros antígenos de Chlamydia de la formulación de la vacuna se pueden seleccionar del grupo descrito en el documento WO 99/28475.

Los antígenos bacterianos preferidos derivados de Streptococcus spp., incluyendo S. pneumoniae (por ejemplo, PsaA, PspA, esptreptolisina, proteínas unidas a colina) y el antígeno de proteína de pneumolisina (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins y col., Microbial Pathogenesis, 25, 337- 342), y derivados destoxificados mutantes de éstos (documentos WO 90/06951; WO 99/03884). Otras vacunas bacterianas preferidas comprenden antígenos derivados de Haemophilus spp., incluyendo H. influenzae tipo B, H. influenzae no clasificable, por ejemplo OMP26, adhesinas de elevado peso molecular, P5, P6, proteína D y lipoproteína D, y fimbrina y péptidos derivados de fimbrina (documento US 5.843.464) o variaciones de múltiple copia o proteínas de fusión de éstas.

Los derivados de antígenos de superficie de Hepatitis B son muy conocidos en la técnica e incluyen, entre otros, aquellos antígenos S PresS1, PreS2 publicados que se describen en las solicitudes de Patente europea EP-A-414.374, EP-A-0304.578, y EP 198-474.

En una realización preferida de la presente invención el procedimiento de la invención se puede aplicar a antígenos derivados del virus del papiloma humano (VPH) considerado responsable de las verrugas genitales (VPH 6 o VPH 11 y otros), y los virus VPH responsables del cáncer cervical (VPH16, VPH18 y otros). En particular las proteínas de expresión temprana E1, E2, E6 y E7 y fusiones de éstas.

Las formas más preferidas de proteínas de fusión son: L2E7 según se desvela en el documento WO 96/26277, y proteína D(1/3)-E7 desvelada en el documento GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285).

Los antígenos de VPH 16 particularmente preferidos comprenden las proteínas de expresión temprana E6 o E7 en fusión con un vehículo de proteína D para formar fusiones de proteína D - E6 o E7 a partir de VPH 16, o combinaciones de éstos; o combinaciones de E6 o E7 con L2 (documento WO 96/26277),

Alternativamente las proteínas de expresión temprana E6 y E7 del VPH 16 ó 18, pueden estar presentes en una única molécula, preferiblemente una fusión de proteína D - E6/E7.

Otros antígenos derivados de los parásitos que provocan la Malaria se pueden purificar según el procedimiento de la invención. Por ejemplo, el antígeno preferido de Plasmodia falciparum incluye RTS,S y TRAP. RTS es una proteína híbrida que comprende sustancialmente toda la parte C terminal de la proteína del circumsporozoito (CS) de P. falciparum unido mediante cuatro aminoácidos de la parte preS2 del antígeno de superficie de la Hepatitis B al antígeno de superficie (S) del virus de la hepatitis B. Su estructura completa se desvela en la solicitud de Patente internacional Núm. PCT/EP/02591, publicada con el número WO 93/10152 reivindicando prioridad de la solicitud de patente del Reino Unido Núm. 9124390.7. Cuando se expresa en levadura RTS se produce como una partícula de lipoproteína, y cuando se co-expresa con el antígeno S del VBH produce una partícula mezclada conocida como RTS,S. Los antígenos TRAP se describen en la solicitud de Patente internacional Núm. PCT/GB89/00895, publicada bajo el documento WO 90/01496. Otros antígenos de plasmodia que son probablemente candidatos a ser componentes de una vacuna para la Malaria de varias etapas son P. falciparum MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP 2, Sequestrin, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27/25, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 y sus análogos en Plasmodium spp y se pueden purificar a partir de su forma insoluble mediante el procedimiento de la
invención.

En una realización preferida de la invención el material de partida de la invención es un extracto de células, como el homogenado de células de E. coli que contiene una de las proteínas insolubles: ProtD - Mage3 - His, NS1-P703p*-His, ProtD-E7-His, protD-Mage1-His, Naf-TET. Alternativamente, el material de partida puede ser un homogenado de células de Pichia pastoris, Saccharomyces cerevisae, u otros sistemas de expresión. Alternativamente, se podrían usar células completas permeabilizadas también como material de partida.

Las proteínas anteriores se pueden producir convenientemente con una cola de afinidad como una secuencia de poli histidina.

En una realización preferida el procedimiento de la invención funciona de esta manera:

El filtro de membrana vibratoria por ejemplo el FMV PallSep se equipa con una o varias membranas, por ejemplo, hasta 100 membranas o más normalmente 5-50 a menudo entre 1 y 20 aunque se pueden utilizar de 1 a 10 membranas hidrófilas. Se usan preferiblemente membranas de polietersulfona hidrofilizadas. Más preferiblemente se usa la membrana hidrófila "045PS10PES element" adquirida de Pall-Filtron. Las membranas utilizadas tendrán un tamaño de poro que varía entre 0,1 micrómetros y 1,2 micrómetros, más preferiblemente entre 0,2 y 0,8 \mu - a menudo entre 0,2 - 0,65 micrómetros. Normalmente se utiliza una membrana de entre 0,45 y 0,2 micrómetros, aunque en ciertas realizaciones se usa una membrana que tiene 0,8 \mu de tamaño de poro nominal.

La unidad de FMV funciona a una frecuencia de vibración y a una amplitud que proporcionan los máximos flujos y transmisión a través de la membrana. Idealmente la amplitud del dispositivo del filtro de membrana está entre 1,27 y 2,54 centímetros, normalmente aproximadamente 1,91 centrímetros. Las condiciones de funcionamiento se proporcionan en la bibliografía del fabricante.

Las células se recolectan de un caldo de fermentación y se concentran. En una realización, las células se concentran y se lavan usando un filtro FMV como se describe en la presente memoria descriptiva. Una vez que las células se han retirado se homogenizan o de lo contrario se extraen. La extracción del homogenado de células se circula en el lado del concentrado del montaje de la membrana por medio de una bomba. La velocidad de flujo está en el intervalo entre 0,2 y 5 l/min por un metro cuadrado de montaje de la membrana. Se aplica una ligera presión al lado del concentrado de la membrana para forzar que el líquido pase a través del filtro. Para permitir una transmisión elevada y estable de los contaminantes la presión en el lado del concentrado debe ser menor que 172,4 kPa, preferiblemente menor que 103,4 kPa, y puede ser menor que 68,9 kPa. (A menudo la presión es la más baja al comienzo del procedimiento y se aumenta gradualmente). El volumen de extracto se reduce mediante la filtración mientras la transmisión de los contaminantes a través del microfiltro es significativa. El concentrado se lava entonces mediante diafiltración con un tampón adecuado. Esto se puede hacer mediante el suministro continuo de tampón en el concentrado para volver a llenar el volumen de líquido eliminado a través del filtro (diafiltración continua) o mediante una o varias adiciones discretas de tampón seguido por la reducción de volumen a través del procedimiento de filtración (diafiltración discontinua). El volumen de tampón para la etapa de lavado se selecciona para maximizar la eliminación de contaminantes a través de la membrana. La reducción del volumen del concentrado al nivel deseado puede terminar la operación de lavado.

El producto obtenido a través del procedimiento anterior está formado por una suspensión de la proteína insoluble, que se purifica de todas las impurezas solubles y de las partículas finas que son capaces de cruzar el filtro. La composición de tampón se puede controlar también mediante el procedimiento de diafiltración.

La presente invención permite que se alcance una velocidad de flujo de permeabilidad media mayor de 5 l/h/m^{2}, haciéndola de este modo muy eficaz para procedimientos de mayor escala, que es aproximadamente el doble de la velocidad alcanzada en la misma muestra con FFT.

Por consiguiente la presente invención proporciona un procedimiento para la purificación de una proteína insoluble, que comprende la aplicación de una suspensión de proteína a un filtro de membrana vibratoria con una membrana hidrófila y recoger la proteína insoluble en el concentrado. Este extracto purificado que contiene el producto insoluble se puede tratar más aun de varias maneras. Normalmente, uno añadiría un agente solubilizador como cloruro de guanidina, urea, detergente o una mezcla de éstos y mantendría el extracto en las condiciones apropiadas de duración, pH y temperatura para permitir la mayor disolución posible de la proteína. El extracto solubilizado contiene material formado de partículas, que pueden ser fragmentos de la pared celular, ácidos nucleicos u otras sustancias.

Debido al material formado de partículas, el extracto no se puede cargar en columnas de cromatografía sin un severo taponamiento. Existen varias opciones para hacer frente al material formado de partículas: lecho fluidizado o adsorción en lecho expandido, adsorción por lotes, centrifugación, filtración o filtración de flujo tangencial. Sin embargo, los presentes inventores han descubierto que el filtro de membrana vibratoria usado en las condiciones detalladas anteriormente era particularmente adecuado para llevar a cabo la depuración del extracto solubilizado. Los flujos del filtrado y las transmisiones del producto en el filtrado fueron mayores que con filtración de flujo tangencial convencional.

Por consiguiente en un aspecto de la invención se proporciona el uso del filtro de membrana vibratoria, que comprende una membrana hidrófila para depurar un extracto soluble de proteína.

Tras la depuración, la proteína se puede purificar más a fondo, normalmente mediante aplicación directa a una o más columnas cromatográficas, como cromatografía de afinidad con un ion de metal inmovilizado, Q-Sefarosa y similar.

Las proteínas purificadas resultantes se pueden formular con, por ejemplo, adyuvantes u otros excipientes aceptables farmacéuticamente para producir una vacuna o composiciones farmacéuticas. Alternativamente, las proteínas se pueden utilizar como un reactivo diagnóstico, o para cualquier fin en el que las proteínas purificadas encuentran utilidad.

Ejemplos General

La combinación de etapas que conducen a la producción de material purificado según la invención cubre la eliminación de contaminantes solubles a través del microfiltro, la solubilización de la proteína deseada (Figura 1) y la depuración de la proteína solubilizada a través del microfiltro (Figura 2). Esto está esquemáticamente representado por los diagramas de flujo de las figuras 1 y 2. Además la recolección de células se puede llevar a cabo usando el mismo equipo (véase el ejemplo 8 más adelante).

Tras la depuración, la proteína se puede purificar más a fondo, normalmente por medio de una o más etapas cromatográficas, como cromatografía de afinidad con un ion de metal inmovilizado, Q-Sefarosa y similar.

Las proteínas purificadas resultantes se pueden formular con, por ejemplo, adyuvantes u otros excipientes aceptables farmacéuticamente para producir una vacuna o composiciones farmacéuticas. Alternativamente, las proteínas se pueden utilizar como un reactivo diagnóstico.

Ejemplo 1 Purificación de la proteína protD-Mage3-His expresada en E. Coli como material insoluble

La sobreexpresión intracelular de esta proteína de fusión se obtuvo en una cepa de E. coli recombinante como se describe en el documento WO99/40188. No se observaron cuerpos de inclusión bajo el microscopio. Sólo se describen las primeras etapas de la purificación (lavado de la fracción aglomerada / solubilización / depuración del material solubilizado). La Figura 3 acentúa las etapas principales e indican los códigos de muestras simples que se usan a continuación en los análisis. El extracto purificado se puede cargar entonces sin ningún taponamiento en un adsorbente cromatográfico, por ejemplo un Flujo Rápido de Sefarosa de Amersham Pharmacia.

Los detalles del procedimiento experimental fueron los siguientes. La pasta de células se resuspendió a una densidad óptica de 120 (aproximadamente 60 g de peso de célula seco por litro) en un tampón fosfato 20 mM pH 7,5, que contiene NaCl 2 M y AEDT 5 mM. La suspensión de células se homogeneizó mediante dos pases en un homogeneizador Rannie a 103.425 kPa. El homegenado de células representa el extracto que contiene la protD-Mage3-His insoluble. El extracto se recirculó a 1 l/min en el lado del concentrado del PallSep PS10 equipado con diez montajes de membrana de polietersulfona (PES) de 0,45 \mum de tamaño de poro (0,1 m^{2} por montaje). La amplitud de la vibración del montaje de membrana fue de 1,9 cm. La operación se llevó a cabo a temperatura ambiente. La válvula del concentrado se fijó para producir una sobrepresión de 17,2 kPa en el lado del concentrado y para iniciar la filtración del extracto. El volumen se redujo entre 5 y 2 litros mediante esta filtración. El concentrado se lavó entonces mediante diafiltración con 15 litros de tampón de diafiltración que contiene un detergente (tampón fosfato 20 mM pH 7,5 - Empigen BB 0,5%) para eliminar la máxima cantidad de contaminantes. La velocidad de flujo del filtrado fue aproximadamente 10 l/h/m^{2}.

La segunda fase del procedimiento se inició inmediatamente con la adición de dos litros de tampón de solubilización al concentrado (tampón fosfato 20 mM a pH 7,5 - Empigen BB 0,5% - Guanidina.HCl 8 M - Glutatión 20 mM). La solución se recirculó durante una hora en el lado del concentrado del PallSep para dejar que la proteína se disolviese completamente. No ocurrió ninguna filtración durante este periodo.

La recuperación de la protD-Mage3-His solubilizada se logró primero mediante filtración con una reducción de volumen de cuatro a dos litros, seguido por una diafiltración con seis litros de tampón fosfato 10 mM pH 7,5 - Empigen BB 0,5% - Guanidina.HCl 4 M - Glutatión 10 mM. El PallSep funcionó en las mismas condiciones que para la primera filtración. Todas las diafiltraciones se hicieron en el modo continuo.

Los resultados obtenidos en cuatro diferentes experimentos se resumen en la Tabla 1 y 2. La Figura 4 muestra el patrón SDS-PAGE de las muestras tomadas en uno de estos experimentos.

La Tabla 1 indica la cantidad total de proteína analizada en las etapas principales del procedimiento. Los resultados se normalizan hasta el 100% para la cantidad de proteínas en el homogenado de células (extracto). La Figura 4 muestra el patrón SDS-PAGE de las fracciones obtenidas durante el procedimiento. La posición de la protD-Mage3-His se indica mediante una flecha. Los geles contienen las muestras recogidas durante todas las etapas del procedimiento. El gel en la izquierda muestra que una gran proporción de los contaminantes se quitaron mediante lavado durante la primera fase del procedimiento (línea 9 en comparación con la línea 2). En el gel de la parte derecha, parece que tras la solubilización la mayor parte de la proteína de interés se recuperó a través de la membrana en el concentrado (línea 7). El patrón de la proteína retenida en el lado del concentrado del FMV al final del procedimiento contenía principalmente una impureza de proteína de E. coli con poca protD-Mage3-His residual (línea 9 en el gel de la derecha).

Los patrones de SDS-PAGE de las muestras analizadas en la Tabla 1 permiten asignar las cantidades de proteína de la Tabla 1 a una gran proporción de protD-Mage3-his para el concentrado del FMV (línea 7 en el gel de la derecha) y para contaminantes de E. coli principalmente en el lavado del FMV (línea 9 en el gel de la izquierda).

Las conclusiones principales a partir de estos datos son las siguientes. El procedimiento permitió eliminar una mayor proporción de contaminantes en el lavado del FMV (aproximadamente 80% de la proteína del extracto de media). Se eliminaron contaminantes adicionales (aproximadamente 6% de la proteína del extracto) en la depuración final en el concentrado del FMV. En general, las operaciones permitieron limpiar aproximadamente el 86% de los contaminantes de la proteína del extracto. Además, la mayor proporción de protD-Mage3-his se recuperó en el concentrado del FMV.

La cantidad de las LPS (endotoxinas) en el material procesado se ilustra en la Tabla 2. Las cantidades de entodoxina encontradas después de la operación del FMV en cuatro experimentos fue remarcadamente baja y consistente.

La depuración de endotoxinas en el procedimiento se puede evaluar a aproximadamente 95% a partir de la comparación de la cantidad residual medida en la ProtD-Mage3-His purificada (aproximadamente 5 x 10^{9} UE) y la cantidad teórica en el extracto de células (aproximadamente 10^{11} UE). Las endotoxinas totales en los 5 l de extracto se estimaron al tomar en cuenta la biomasa de E. coli; el contenido de 3,4% de LPS/ peso seco de células de E. coli publicado por Neidhardt F. C. y Umbarger (Neidhart F. C. y Umbarger, Capítulo 3 en Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, 2ª Edición, Vol. 1, ASM Press, Washington, 1996) y considerando un valor medio de 10 UE/ng de LPS.

En resumen, el procedimiento descrito permitió tratar 5 l de extracto de E. coli bruto para producir una preparación sustancialmente purificada que contiene la mayor parte de la protD-Mage3-His como 8 l de solución transparente. Todas las partículas de los desechos de células se eliminaron; así como una mayoría de los contaminantes de la célula huésped (86% de las proteínas, ácidos nucleicos, aproximadamente 99% de LPS).

La purificación se continuó usando técnicas de cromatografía de IMAC (cromatografía de Sefarosa que compleja ion de cinc seguido por Q - sefarosa seguido por ultrafiltración. El antígeno se formuló con un adyuvante como una vacuna.

Esta secuencia de purificación se usó con éxito en la producción de material bajo GMP para suministro clínico. La operación descrita en la invención sustituyó ventajosamente el procedimiento inicial que se basó en centrifugación repetida y resuspensión para eliminar los contaminantes solubles del producto y depuración del extracto solubilizado mediante filtración de flujo tangencial.

Las diferentes etapas del procedimiento descritas en la invención sólo duraron aproximadamente ½ día de trabajo, (3 - 5 horas) en comparación con los dos días de trabajo para el procedimiento anterior. El procedimiento fue continuo y requirió menos mano de obra que el previo.

Ejemplo 2 Purificación de proteína NS1-P703P*-His expresada en E. coli como cuerpos de exclusión

La expresión intracelular de esta proteína de fusión se obtuvo en una cepa de E. coli recombinante documento PCT/EP00/06618. En este caso, se observaron claramente cuerpos de inclusión bajo el microscopio. Sólo se describen las primeras etapas de la purificación (lavado de la fracción aglomerada / solubilización / purificación del material solubilizado).

La pasta de células se resuspendió a una densidad óptica de 120 (aproximadamente 60 g de peso de célula seco por litro) en un tampón fosfato 20 mM pH 7,5, que contiene NaCl 2 M y AEDT 5 mM. La suspensión de células se homogeneizó mediante dos pases en un homogeneizador Rannie a 103.425 kPa. El homegenado de células representa el extracto que contiene los cuerpos de inclusión. El extracto se recirculó a 1 l/min en el lado del concentrado del PallSep PS10 equipado con dos montajes de membrana de polietersulfona (PES) (0,1 m^{2} por montaje). La amplitud de la vibración del montaje de membrana fue de 1,9 cm. La operación se llevó a cabo a temperatura ambiente. La válvula del concentrado se fijó para producir una sobrepresión de 17,2 kPa en el lado del concentrado y para iniciar la filtración del extracto. El volumen se redujo de 1 a 0,5 litros mediante esta filtración. El concentrado se lavó entonces mediante diafiltración con 3,75 litros de tampón de diafiltración (tampón fosfato 20 mM pH 7,5 - Empigen BB 0,5%) para eliminar la máxima cantidad de contaminantes.

La segunda fase del procedimiento se inició inmediatamente con la adición de dos litros de tampón de solubilización al concentrado (tampón fosfato 20 mM pH 7,5 - Empigen BB 0,5% - Guanidina.HCl 8 M - Glutatión 40 mM). La solución se recirculó durante una hora en el lado del concentrado del PallSep para dejar que la proteína se disolviese completamente. No ocurrió ninguna filtración durante este periodo.

La recuperación de la NS1-P703P*-His solubilizada se logró primero mediante filtración con una reducción de volumen de un litro a medio litro, seguido por una diafiltración con 1,5 litros de tampón fosfato 10 mM a pH 7,5 - Empigen BB 0,5% - Guanidina.HCl 4 M - Glutatión 10 mM. El PallSep funcionó en las mismas condiciones que en la primera filtración.

El extracto purificado contenía la mayor parte de la NS1-P703P*-His del extracto inicial, como dos litros de solución transparente. De este modo, la secuencia de purificación usada para tratar el precipitado amorfo de ProtD-Mage3-His del ejemplo 1 se mostró efectiva también para tratar un proteína expresada como cuerpos de inclusión.

Se evidenciaron las mismas ventajas que en el ejemplo 1 en esta proteína: procedimiento continuo integrado, corta duración, menor aportación de mano de obra, y eficaz eliminación de contaminantes. El extracto depurado se purificó más a fondo mediante cromatografía. Esta secuencia de purificación se usó para producir varios lotes clínicos de material purificado que se formularon entonces con adyuvante para producir una vacuna de tipo clínico.

Los resultados típicos obtenidos a dicha escala se resumen en la tabla 3 más adelante para 3 experimentos diferentes:

La proteína de interés se detecta muy bien sobre el gel en este caso (banda principal visible a aproximadamente 30 Kd) (Figura 5).

A partir del 1^{er} gel de la fig 5, de nuevo, es evidente que muchos de los contaminantes se quitaron mediante lavado durante la primera fase del procedimiento (líneas 3-8 comparadas con la línea 2). Tras la solubilización de la fracción aglomerada lavada la mayor parte de la proteína de interés se recupera a través de la membrana en el permeado tras la concentración (línea 9). Se busca la recuperación del material solubilizado con la diafiltración (véase gel 2, (figura 5 bis) líneas 2 a 7). Sólo se retiene una pequeña fracción de la proteína en el lado del concentrado del FMV al final de la operación.

Las condiciones reductoras para el análisis afectan el patrón sobre el gel (véase gel 2, líneas 6-7 y 8-9).

Ejemplo 3 Purificación de proteína Nef-Tat-His expresada en Pichia pastoris como material insoluble

La expresión intracelular de esta proteína de fusión se obtuvo en una cepa de Pichia Pastoris recombinante documento WO99/16884.

La pasta de células se suspendió a una DO de 100 en un tampón fosfato 50 mM pH 7,5. Las células se rompieron mediante cuatro pases en un molino de vidrio (Dynomill KDL). El extracto (10 litros) se procesó en el PallSep PS10 esencialmente en las mismas condiciones que en el ejemplo 1, usando 10 montajes de membrana. La presión del concentrado fue aproximadamente 35,5 kPa. Se omitió la primera etapa de reducción de volumen y la diafiltración continua comenzó desde el principio de la operación de filtración. Se usaron treinta litros de tampón de diafiltración, tampón fosfato 10 mM pH 7,5 - NaCl 150 mM.

La Nef-Tat-His se solubilizó mediante la adición de 10 litros de tampón fosfato 10 mM pH 7,5 - NaCl 150 mM - Guanidina.HCl 8 M - Glutatión 80 mM e incubación durante 1 hora con recirculación en el lado del concentrado del sistema.

La proteína soluble se recuperó mediante filtración con una reducción del volumen inicial de 20 a 5 litros, seguido por la diafiltración con 10 litros de tampón fosfato 10 mM pH 7,5 - NaCl 150 mM - Guanidina.HCl 4 M - Glutatión 40 mM.

La Nef-Tat-His solubilizada y depurada se recuperó en aproximadamente 25 litros y se pudo purificar más a fondo mediante cromatografía.

Esta secuencia de purificación sustituyó a un procedimiento previo por medio del cual se usaron varios ciclos de centrifugación y etapas de resuspensión para eliminar contaminantes solubles y lípidos, seguidos por solubilización y depuración de la Nef-Tat solubilizado mediante centrifugación y filtración del sobrenadante. Se observaron las mismas ventajas que las enumeradas en los ejemplos 1 y 2. Por ejemplo, en una escala de 2 l, el procedimiento con FMV necesitó aproximadamente 3 h 30 en comparación con las más de 8 h del procedimiento de "centrifugación" anterior.

Los resultados de las tres series se dan en la Tabla 4. La proteína de interés es visible en un gel a aproximadamente 35 Kd (banda principal de la línea 4 del material solubilizado depurado en la figura 6). Durante la primera fase del procedimiento (lavado de la fracción insoluble), se quitaron mediante lavado muchas de las proteínas contaminantes (línea 3).

Tras la etapa de solubilización, la proteína de interés se recoge a través de la membrana en el concentrado mediante concentración y diafiltración (líneas 4-5 y 6). Al final de la operación del FMV, sólo unas pocas proteínas contaminantes siguen siendo detectables en el concentrado.

Ejemplo 4 Comparación de rendimientos del filtro de membrana vibratoria con una membrana de PTFE no hidrófila y membrana de PES hidrófila para la purificación de proteínas insolubles FMV con membranas de PTFE no hidrófilas

Se evaluó un procedimiento similar al que se describió en los ejemplos 1-3 para la proteína VHP18 protD-E7-His documento WO99/10375 producida intracelularmente en E. Coli.

En un primer experimento, el PallSep equipado con una membrana de 0,45 \mum de PTFE no logró tratar la proteína satisfactoriamente: a pesar de que se observó una velocidad de flujo de permeabilidad aceptable durante la fase de lavado del material insoluble, la proteína de interés no se recuperó en el concentrado durante la fase de solubilización/depuración. Los resultados se muestran a continuación:

La posición de la proteína en el gel se indica mediante un flecha en la figura 7 bis.

\newpage

A partir del gel I (figura 7) y a partir del gel 2 (líneas 1, 3 y 4), parece que durante la fase de lavado de la fracción insoluble, se quitan mediante el lavado algunas proteínas contaminantes.

No obstante, a partir del gel 2, líneas 5-8, parece que muy poca cantidad de la proteína de interés pasa a través de la membrana y se recupera en el permeado del FMV tras la etapa de solubilización. Como se mostró claramente en la línea 9, la mayoría de la proteína de interés permanece en el lado concentrado con muchas proteínas contaminantes.

FMV con membranas hidrófilas (PES)

Sin embargo, el uso de membranas de polietersulfona hidrofilizada (PES 0,2 \mu) como se describe en la presente invención permitió una buena recuperación de la proteína de interés en el filtrado y al final del procedimiento completo.

Véase el análisis de SDS-PAGE (teñidos con azul coomassie) que sigue a la operación de FMV: (figura 8 y 8 bis)

La posición de la proteína en el gel está indicada por una flecha.

Inversamente a lo que se observó con el experimento previo llevado a cabo en una membrana de PTFE, la mayoría de la proteína de interés cruza la membrana tras la etapa de solubilización (gel 2, líneas 6-8). No quedó nada de la proteína de interés en el concentrado del FMV (gel 2, línea 9).

Esta comparación acentúa la importancia de la elección de la membrana para obtener los resultados esperados, con lo que las membranas hidrófilas como PES fueron esenciales comparadas con las membranas de PTFE estándar para el PallSep que son hidrófobas.

Ejemplo 5 Evaluación comparativa de una membrana de PTFE no hidrófila y membrana de PES hidrófila para el FMV en el contexto de la purificación de la proteína VHP16-protD-E7-His

Se hizo la misma comparación que la descrita en el ejemplo 4 en el contexto de la purificación de la proteína VPH16protD-E7-His producido intracelularmente en E. coli (documento WO 99/10375).

Las conclusiones fueron las mismas: la membrana de 0,45 \mum de PTFE no tuvo éxito al tratar la proteína de interés, mientras que la membrana de 0,2 \mum de PES sí lo tuvo. En particular, la etapa de lavado fue tan eficaz al eliminar partículas muy pequeñas del extracto que el permeado fue muy turbio. La primera ejecución con la membrana de PES fue abortada erróneamente por el operador en función de la turbidez sorprendentemente elevada del filtrado en comparación con lo observado con las membranas de PTFE. La turbidez parecía indicar que la membrana estaba dañada, pero el análisis a posteriori demostró que no era el caso y que la proteína insoluble de interés se mantuvo bien en el concentrado durante la fase de lavado.

Esta observación demostró sorprendentemente que el procedimiento descrito en la invención ofrece únicas posibilidades para separar la proteína insoluble de interés a partir de partículas muy finas.

Como también se describió en el ejemplo previo, parece que sólo una parte de la proteína de interés cruza la membrana de PTFE tras la solubilización. La mayor parte de la proteína se recupera en el concentrado del FMV con otras proteínas contaminantes. (Véase la Figura 9b en la línea 14).

Por otro lado cuando el mismo experimento se llevó a cabo con filtros de PES, la proteína de interés es fácilmente detectable como la banda principal en la fracción solubilizada depurada, por ejemplo figura 10 bis. (línea 8)

Inversamente a lo que se observó en el experimento previo llevado a cabo en la membrana de PTFE, la mayoría de la proteína de interés cruza la membrana después de la etapa de solubilización (fig 10 bis, líneas 6-8). Queda muy poca proteína en el concentrado del FMV (línea 9).

Ejemplo 6 Comparación del procedimiento descrito en la presente invención con tecnología de FFT estándar (Filtración de Flujo Tangencial) en el contexto de la purificación de la proteína protD-Mage1-His

La protD-Mage1-His (documento WO99/40188) se sobreexpresó intracelularmente como un precipitado amorfo en E. coli.

En una primera experiencia, el extracto de células (DO 120) que contiene la proteína insoluble se trató en el PallSep PS10 equipado con dos membranas de PES de 0,2 \mum (2 x 0,1 m^{2}) en condiciones muy similares a los ejemplos 1 y 2.

Por otro lado, 1 l del mismo extracto se trató del mismo modo en un sistema de FFT con una membrana de PVDF de 0,45 micrómetros (Millpore, 0,5 m^{2}).

Se usaron las mismas condiciones de solubilización y lavado para llevar a cabo los dos experimentos en paralelo.

Los resultados mostraron:

Una mejor velocidad de flujo de permeabilidad media para el procedimiento descrito en esta invención: 7,8 l/h/m^{2} en comparación con 4,5 l/h/m^{2} para la tecnología de FFT.

Una mejor transmisión de la proteína solubilizada de interés durante la etapa de depuración final para el procedimiento descrito en esta invención, como se evaluó mediante análisis de SDS-PAGE. Sólo una fracción de la proteína de interés cruzó la membrana de FFT en esa etapa.

Este ejemplo demostró la superioridad del procedimiento descrito en esta invención sobre la tecnología de FFT clásica en términos de rendimiento, pureza y flujo del filtrado.

Se llevaron a cabo otros experimentos en las mismas condiciones de procedimiento pero a una escala de 10 l y con un sistema de FMV de PallSep PS10 equipado con 10 membranas. Las velocidades de flujo del permeado medias para estas pruebas fueron entre 6,8 y 13,2 l/m^{2}h. Éstas se compararon con FFT y los resultados se muestran en la Tabla 5 a partir de la cual se puede concluir que el procedimiento de FFT es menos eficaz al eliminar contaminantes.

El procedimiento descrito en esta invención proporcionó un extracto purificado que contiene menos endotoxinas con 2,4 - 21,4 UE/\mug de proteína en comparación con 3152 UE/\mug de proteína para el extracto obtenido mediante FFT. (Tabla 6)

Ejemplo 7 Comparación del procedimiento descrito en la presente invención con tecnología de FFT en el contexto de la purificación de la proteína VPH18 proD-E7-His

Como ya se describió anteriormente, la proteína VPH18 protD-E7-His (documento WO99/10375) se sobreexpresó intracelularmente como un precipitado amorfo en E. coli.

En un primer experimento, se trató el extracto de células (DO 60) que contiene la proteína insoluble en el PallSep PS10 equipado con dos membranas de PES de 0,2 \mum (2 x 0,1 m^{2}) en condiciones similares a las de los ejemplos previos.

Como comparación el extracto de células se trató del mismo modo en diferentes sistemas de FFT:

- Membrana Omega de 0,3 micrómetros (Pall-Filtron), canal abierto (figura 11, 11 bis).

- Membrana de PVDF de 0,2 micrómetros (Millipore), canal de criba ("C") (figura 12).

- Membrana de PVDF de 0,2 micrómetros (Millipore), canal abierto ("V") (figura 13).

Se usaron las mismas condiciones de solubilización y lavado para llevar a cabo diferentes experimentos. Los resultados se analizaron mediante SDS-PAGE y son como se muestran en la figura 11, 12 y 13.

A partir de la figura 11 bis, línea 6 (permeado del FFT, fracción solubilizada depurada), resulta evidente que muy pocas proteínas cruzaron la membrana omega 0,3 tras la etapa de solubilización, sugiriendo un taponamiento de la membrana.

Además, toda la proteína de interés (como se muestra mediante una flecha) y otras proteínas contaminantes se recuperaron en la fracción del concentrado del FFT al final de la operación (figura 11 bis, línea 7).

En el experimento del canal C de PVDF de 0,2 \mu, no se detectó casi nada de proteína de interés (flecha) en el permeado de FFT al final del procedimiento completo (véase línea 15, fig 12). La transmisión de la proteína de interés se deterioró por el taponamiento de la membrana.

Los resultados sólo se mejoran marginalmente con el canal abierto de la membrana de PVDF de 0,2 (figura 13). Comparando la fracción del concentrado del FFT al final de la operación (línea 2) de la figura 13 y la fracción del concentrado del FFT que contiene la proteína solubilizada purificada (línea 15), resulta evidente que sólo se obtuvo una transmisión parcial de la proteína de interés después de la etapa de solubilización. Por lo tanto, aunque el canal abierto fue superior al canal de criba, la transmisión de proteína siguió siendo sólo parcial.

FMV membrana de PES de 0,2 micrómetros (Pall-Filtron)

Por el contrario, al realizar la misma operación en la membrana de PES de 0,2 (véase el ejemplo 4) el procedimiento demostró muy buena transmisión de la proteína de interés a través de la membrana después de la etapa de solubilización y sólo quedó una pequeña cantidad de proteína en el lado del concentrado al final de la operación. La Tabla 7 muestra la endotoxina residual. La endotoxina fue comparable para los tres FFT y se redujo drásticamente con el FMV según la invención.

Ejemplo 8 Recolección de células de E. coli de un caldo de fermentación y posterior purificación de la proteína protD-Mage3-His como material insoluble

El caldo de fermentación se puede recolectar normalmente mediante centrifugación y resuspender directamente la pasta de células (o almacenar a -20ºC y resuspender posteriormente) en el tampón de disgregación como se describe en el ejemplo 1.

Como se describió en este ejemplo, se usó la filtración de membrana vibratoria como un procedimiento alternativo a la centrifugación, para concentrar y para lavar las células de E. coli presentes en el caldo de fermentación. Estas células se retiraron entonces del equipo PallSep PS10 y se homogeneizaron. Este extracto se introdujo directamente en el mismo PallSep PS10 para la purificación posterior.

Todo el caldo de fermentación se concentró hasta 3 veces, a partir de una densidad óptica de 80 (aproximadamente 40 g en peso seco por litro) hasta un peso de célula seco de aproximadamente 120 g por litro. Todo el caldo se recirculó a 1 l/min en el lado del concentrado del PallSep PS10 equipado con dos montajes de membrana de polietersulfona (PES) de 0,45 \mum de tamaño de poro (0,1 m^{2} por montaje). La amplitud de la vibración del montaje de membrana fue de 1,9 cm. La operación se llevó a cabo a temperatura ambiente. La válvula del concentrado se fijó para producir una sobrepresión de 34,5 kPa en el lado del concentrado y para iniciar la filtración de todo el caldo de fermentación. El volumen se redujo de 3,22 a 1,07 litros mediante esta filtración. El concentrado se lavó entonces mediante diafiltración con 3,22 litros de tampón fosfato 20 mM pH 7,5 que contiene NaCl 2 M y AEDT 5 mM para eliminar la máxima cantidad de contaminantes en el medio de cultivo. Esta velocidad de flujo del filtrado fue aproximadamente 11,5 l/h/m^{2}. Aproximadamente se eliminaron el 5% de las proteínas totales presentes en el caldo de fermentación durante estas operaciones.

El concentrado se retiró del sistema de filtración y se homogeneizó directamente mediante dos pases en un homogeneizador Rannie a 103.425 kPa. El homegenado de células representa el extracto que contiene la protD-Mage3-His insoluble. El extracto se recirculó entonces a 1 l/min en el lado del concentrado del mismo PallSep PS10 usado para recolectar las células. Entre las operaciones de recolección y purificación, los montajes de membrana y el conducto del PallSep PS10 se lavaron primero con agua y en segundo lugar con tampón de disgregación para eliminar cualquier concentrado de células restante. La amplitud de la vibración del montaje de membrana fue de 1,9 cm. La operación se llevó a cabo a temperatura ambiente. La válvula del concentrado se fijó para producir una sobrepresión de 34,5 kPa en el lado del concentrado y para iniciar la filtración del extracto. El volumen se redujo de 0,85 a 0,7 litros mediante esta filtración. El concentrado se lavó mediante diafiltración, a una sobrepresión entre 34,5 y 103,5 kPa, con 5,25 litros de tampón de diafiltración que contiene un detergente (tampón fosfato 20 mM pH 7,5 - Empigen BB 0,5%) para eliminar la máxima cantidad de contaminación. La velocidad de flujo del filtrado fue aproximadamente
4,2 l/h/m^{2}.

La fase de solubilización se inició entonces con la adición de 0,7 litros del tampón de solubilización al concentrado (tampón fosfato 20 mM pH 7,5 - Empigen BB 0,5% - Guanidina.HCl 8 M - Glutatión 20 mM). La solución se recirculó durante una hora en el lado del concentrado del PallSep para dejar que la proteína se disuelva completamente. No ocurrió filtración durante este periodo.

La recuperación de la protD-Mage3-His solubilizada se logró primero mediante filtración con una reducción de volumen de 1,4 a 0,7 litros, seguido por una diafiltración con 2,1 litros de tampón fosfato 10 mM a pH 7,5 - Empigen BB 0,5% - Guanidina.HCl 4 M - Glutatión 10 mM. El PallSep operó en las mismas condiciones que para la primera filtración. Todas las diafiltraciones se hicieron en el modo continuo.

El extracto depurado contuvo la mayor parte de la protD-Mage3-His del extracto inicial, como 2,8 litros de la solución transparente (concentrado del FMV). Todas las partículas de los restos de células fueron eliminadas; así como una mayoría de los contaminantes de la célula huésped (proteínas, ácidos nucleicos, LPS). Como se muestra en la Tabla siguiente, aproximadamente el 60% de la proteína total presente en todo el caldo, la mayor parte de los contaminantes de la célula huésped se eliminaron en el procedimiento (lavado del FMV), y aproximadamente el 5% de las proteínas, principalmente restos de células, permanecieron en el concentrado del FMV.

TABLA

Fase	Etapa	Proteína total (%)
Recolección de células	Todo el caldo	100
	Células lavadas y concentradas	95,5
Purificación de proteínas	Extracto	94,6
	Lavado del FMV	60,4
	Concentrado del FMV	5,5
	Permeado del FMV	27,3

Claims (10)

1. Un procedimiento para purificar una proteína insoluble que comprende la aplicación de una suspensión de proteína a un dispositivo de filtro de membrana vibratoria que comprende una membrana hidrófila y la retención de la proteína insoluble en el concentrado.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1 en el que las membranas tienen un tamaño de poro entre 0,1 y 1,2 micrómetros.

3. Un procedimiento para depurar un extracto de proteína soluble o solubilizada de una proteína que comprende la aplicación del extracto a un filtro de membrana vibratoria que comprende una membrana hidrófila, y recoger la proteína soluble en el filtrado.

4. Un procedimiento para purificar una proteína insoluble según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 que comprende la etapa de solubilizar el concentrado y re-aplicar la proteína solubilizada al filtro de membrana vibratoria y recoger el filtrado.

5. Un procedimiento según la reivindicación 4 en el que la solubilización ocurre en el montaje del FMV.

6. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que la membrana hidrófila se produce a partir de una membrana de celulosa regenerada, PVDF, nailon modificado o polietersulfona.

7. Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 en el que la membrana hidrófila es una membrana de poliétersulfona.

8. Un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que las células que expresan dicha proteína en forma insoluble, se recolectan a partir de un caldo de fermentación concentrado y lavado usando filtro de membrana vibratoria que comprende una membrana hidrófila y la proteína se purifica entonces según el procedimiento de la reivindicación 1.

9. Un procedimiento para la producción de una composición farmacéutica que comprende la purificación de una proteína según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, sometiendo opcionalmente a esa proteína a etapas cromatográficas posteriores adicionales y mezclándola con un excipiente aceptable farmacéuticamente.

10. Un procedimiento según la reivindicación 9 en el que el excipiente aceptable farmacéuticamente es un adyuvante.