ES2229230T3 - Secuencias de acidos nucleicos reguladoras y utilizaciones. - Google Patents

Secuencias de acidos nucleicos reguladoras y utilizaciones.

Info

Publication number
ES2229230T3
ES2229230T3 ES95902830T ES95902830T ES2229230T3 ES 2229230 T3 ES2229230 T3 ES 2229230T3 ES 95902830 T ES95902830 T ES 95902830T ES 95902830 T ES95902830 T ES 95902830T ES 2229230 T3 ES2229230 T3 ES 2229230T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
psam2
promoter
sequence
baselineskip
free
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
ES95902830T
Other languages
English (en)
Inventor
Annick Friedmann
Michel Guerineau
Juliette Hagege
Jean-Luc Pernodet
Guennady Sezonov
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aventis Pharma SA
Original Assignee
Aventis Pharma SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Aventis Pharma SA filed Critical Aventis Pharma SA
Application granted granted Critical
Publication of ES2229230T3 publication Critical patent/ES2229230T3/es
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/69—Increasing the copy number of the vector

Landscapes

  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A NUEVAS SECUENCIAS NUCLEICAS DE VECTORES PARA SU EXPRESION, Y SU UTILIZACION,PARTICULARMENTE EN PROCEDIMIENTO DE FERMENTACION EN LOS ACTINOMICETOS.

Description

Secuencias de ácidos nucléicos reguladoras y utilizaciones.
La presente invención se refiere a una nueva secuencia nucléica, a vectores para su expresión y a su utilización en procedimientos de fermentación de actinomicetos.
Los actinomicetos son bacterias Gram (+) filamentosas y ramificadas. Entre los actinomicetos, los estreptomicetos representan la familia más importante. Los estreptomicetos son bacterias filamentosas, esporulantes y que viven naturalmente en el suelo en condiciones de aerobiosis estricta.
Los actinomicetos, y principalmente los estreptomicetos, presentan un gran interés desde el punto de vista industrial. En particular, presentan la particularidad de producir una gran variedad de metabolitos secundarios (Deniain, Biology of Actinomycetes 88, Okami (Eds), Tokyo, Japan Scientific Societies Press, 1.988, págs.19-25). Estos metabolitos pueden tener estructuras y propiedades biológicas muy diferentes (herbicidas, anticancerosos, antihelmínticos, anabolizantes, antibióticos, etc.). Los más conocidos de estos metabolitos son los antibióticos (sustancias químicas producidas por un organismo y que tienen un efecto nefasto sobre otros organismos). Los estreptomices están actualmente en el origen del 70% de los antibióticos producidos industrialmente. La diversidad estructural de los antibióticos sintetizados no se encuentra en ningún otro género bacteriano. Así, casi todos los tipos de estructura están representados: las \beta lactaminas (p. ej. la ampicilina), los antibióticos polipeptídicos (p. ej.: estreptograminas), los antibióticos aminoglicosídicos (p. ej.: estreptomicina, canamicina, etc.), los macrólidos (p. ej.: eritromicina, espiramicina, etc.) o también las ciclinas (p. ej.: tetraciclina), etc.
Por estas razones es particularmente interesante poder disponer de herramientas (vectores, promotores, etc.) que permitan manipular genéticamente estos microorganismos. Tales herramienta permitirían en efecto modificar los niveles de síntesis de estos metabolitos, o preparar intermedios de síntesis o derivados de estos metabolitos, etc. Tales herramientas permitirían igualmente hacer que estos microorganismos fabriquen productos recombinantes, principalmente proteínas heterólogas, según las técnicas de la ingeniería genética.
Desde este punto de vista, la solicitud de patente Nº EP 0350341 describe vectores derivados del plásmido pSAM2 que tienen propiedades muy interesantes. Así, estos vectores son capaces de integrarse de forma específica en un punto en el genoma de los actinomicetos, que poseen un amplio espectro de huésped y una elevada estabilidad. Por otro lado, también pueden utilizarse para la transferencia y la expresión de ácidos nucléicos en los actinomicetos. Sin embargo, estos vectores presentan algunos inconvenientes que residen principalmente en su pequeño número de copias por célula y en la ausencia de medios de control del número de copias. Así, el pSAM2 y sus derivados se integran generalmente a razón de una sola copia por cromosoma.
La presente invención aporta una solución a este problema suministrando herramientas capaces de mejorar las condiciones de utilización industrial de los vectores derivados del pSAM2. La presente invención describe en efecto un gen cuyo producto de expresión lleva a la aparición, a partir de formas integradas, de formas libres replicativas del plásmido pSAM2 o de vectores derivados de este. Esto tiene como efecto aumentar el número de copias del pSAM2 o de sus derivados puesto que las formas libres están presentes en un número elevado de copias por célula.
La presente invención describe también casetes de expresión de este gen, vectores que le contienen y su utilización para inducir la aparición de copias libres del pSAM2 o de vectores integradores derivados de este.
La firma solicitante, en efecto, ha aislado, secuenciado y caracterizado una región del plásmido pSAM2 capaz de inducir la aparición de copias libres replicativas del pSAM2 o de sus derivados. La firma solicitante ha demostrado igualmente que esta región podía utilizarse en configuración cis (sobre el mismo vector ) o en trans (no sobre el mismo vector) para actuar sobre el pSAM2 o sus derivados. La secuencia de esta región se representa en la secuencia SEQ ID nº 1. Más precisamente, esta región y su papel funcional han sido puestos en evidencia por el estudio de variantes del plásmido pSAM2: por una parte el pSAM2(B2), proveniente de la S.ambofaciens ATCC 15154 para el que no se ha observado ninguna forma libre, por otra parte el pSAM2(B3) y el pSAM2(B4) que provienen de otras S. ambofaciens, para los que se ha observado la forma libre con la forma integrada. Este estudio ha permitido caracterizar dos mutaciones puntuales diferentes (la del pSAM2(B3) y la del pSAM2(B4)) localizadas ambas en la región promotora que controla la expresión de un gen del pSAM2 (Cf SEQ ID nº 1). Estas mutaciones llevan a la aparición de la forma libre del pSAM2(B3) y del pSAM2(B4). A continuación, este gen se ha clonado y secuenciado y se ha demostrado su capacidad para provocar la aparición de la forma libre de plásmidos derivados del pSAM2 a partir de la copia integrada.
Un primer objetivo de la invención reside por lo tanto en una secuencia de ácido nucléico que comprende toda o una parte de la secuencia SEQ ID nº 1 o de una variante de esta que resulta de la degeneración del código genético y que tiene la capacidad de inducir formas libres replicativas del plásmido pSAM2 en los actinomicetos.
En el seno de la presente invención, el término variante designa cualquier secuencia diferente de la secuencia SEQ ID nº1 en razón de la degeneración del código genético, así como cualquier secuencia hibridante con estas secuencias o fragmentos de estas y cuyo producto posea la actividad indicada. Estos variantes pueden obtenerse por cualquier técnica conocida por los expertos en la técnica a partir de la SEQ ID nº 1, principalmente mutación, deleción, sustitución, adición, hibridación, etc. Las hibridaciones se pueden realizar en condiciones de astringencia convencionales (Maniatis et al., Cf. técnicas generales de biología molecular) o, preferentemente, en condiciones de astringencia elevadas. La capacidad de los variantes para inducir la aparición de formas libres replicativas del pSAM2 o de sus derivados se puede determinar en una cepa de actinomiceto que contiene tal plásmido integrado (por ejemplo en la cepa ATCC 15154), transfectando dicho variante en la cepa, en condiciones que permiten su expresión, y verificando la aparición de formas libres (Cf. ejemplos).
Otro objetivo de la invención se refiere a cualquier casete de expresión de la secuencia SEQ ID nº 1 o de un variante de esta tal como se ha definido anteriormente, que comprende dicha secuencia o variante controlada por un promotor constitutivo o regulado.
La utilización de un promotor constitutivo es especialmente ventajosa cuando la casete se utiliza en trans para inducir formas libres de un plásmido integrado. En este caso, las células que contienen la forma integrada del plásmido son transfectadas con la casete de expresión para inducir la aparición de formas libres replicativas que permiten por ejemplo aislar y/o purificar el plásmido.
La utilización de un promotor regulado es especialmente ventajosa cuando la casete se utiliza en cis (sobre el mismo vector derivado del pSAM2), por ejemplo en un procedimiento industrial de fermentación. En este caso, cualquier fase de proliferación y crecimiento de las células se efectúa sin expresión del gen de la invención, es decir con una sola copia del plásmido por cromosoma y, para la fase de producción (de un producto recombinante, de un gen de biosíntesis o de regulación de la síntesis de un metabolito, etc.) el promotor regulado se induce ocasionando la aparición de varias copias libres del plásmido y así una actividad de producción aumentada. Este modo de realización es especialmente ventajoso cuando el vector derivado del pSAM2 tiene secuencias heterólogas cuya presencia en varias copias puede ser tóxica para las células y/o afectar su crecimiento.
Entre los promotores constitutivos utilizables en el marco de la presente invención, se puede citar más especialmente cualquier promotor constitutivo funcional de los actinomicetos, tales como, por ejemplo, el promotor del gen ermE o un variante de este (Bibb et al., Gene 41 (1.986) E357), el promotor p14 del fago I19 de S. ghanaensis (Labes et al., Sixth DFGWT/AFAST, 27-30/11/92), o cualquier fragmento que contenga una región promotora de un opéron ribosómico de S. ambofaciens (Pernodet et al., Gene 79 (1.989) 33).
Entre los promotores regulables utilizables en el marco de la presente invención, se puede citar más especialmente cualquier promotor regulable funcional en los actinomicetos. Se puede tratar de promotores inducidos específicamente por un agente introducido en el medio de cultivo, tal como por ejemplo el promotor tipA inducible por el tiostrepón (Murakami et al., J. Bactt. 171 (1.989) 1.459) o promotores termoinducibles como el de los genes groEL por ejemplo (Mazodier et al., J. Bact. 173 (1.991) 7.382). Se puede tratar igualmente de un promotor de actinomicetos específicamente activo en las fases tardías del ciclo de proliferación de los actinomicetos, tales como por ejemplo algunos promotores de genes del metabolismo secundario (principalmente genes de producción de antibióticos).
Otro objetivo de la invención se refiere a la utilización de secuencias de la invención tales como las definidas anteriormente, o de casetes que les contienen, para inducir la aparición de copias libres de vectores derivados del pSAM2 integrados en un actinomiceto.
Como se ha indicado anteriormente, esta utilización puede efectuarse en cis (estando contenidos el gen o la casete en el vector integrador derivado del pSAM2) o en trans (estando el gen o la casete sobre otro vector o incluso introducidos directamente tal cuales).
Los vectores integradores derivados del pSAM2 tal como los mencionados anteriormente son vectores que comprenden al menos los elementos del pSAM2 necesarios para la integración, la excisión y la replicación. Más especialmente, estos vectores comprenden por lo tanto al menos las regiones attP e int tal como se han descrito en la solicitud EP 0350341, el gen Xis, el gen repSA y el origen de la replicación (ori). Estas regiones diferentes están represenadas en el mapa del plásmido pSAM2 dado en la figura 1 que menciona igualmente algunos lugares de restricción que permiten extraer estas regiones.
Ventajosamente, los vectores integradores derivados del pSAM2 comprenden igualmente una secuencia de ADN recombinante que codifica un producto buscado. Se puede tratar de un péptido, polipéptido o proteína que presente un interés farmacéutico o agroalimentario. En este caso, el sistema de la invención permite aumentar el número de copias de esta secuencia por célula y por lo tanto aumentar los niveles de producción de este producto y así aumentar los rendimientos del procedimiento de preparación. El producto buscado puede ser igualmente un péptido, polipéptido o proteína que intervenga en la biosíntesis (síntesis, degradación, transporte o regulación) de un metabolito por la cepa de actinomiceto implicada. En este caso, el sistema de la invención permite aumentar el número de copias de esta secuencia por célula y por lo tanto aumentar los niveles de producción de este producto y así bien aumentar los niveles de producción del metabolito, bien bloquear la biosíntesis del metabolito o bien producir derivados del metabolito.
Las secuencias de la invención pueden así utilizarse en cualquier actinomiceto en el genoma del que los vectores pSAM2 o sus derivados sean capaces de integrarse. En particular, se pueden utilizar en procedimientos de fermentación que implican cepas de estreptomices, micobacterias, etc. Como ejemplo se pueden citar las cepas de S. pristinaespiralis (ATCC 25486), S. antibioticus (DSM 40868), S. bikiniensis (ATCC 11062), S. parvulus (ATCC 12434), S. glaucescens (ETH 22794), S. actuosus (ATCC25421), S. coelicolor (A3(2)), S. ambofaciens, S. lividans, S. griseofuscus, S. Iimosus, etc. (Véase igualmente Smokvina et al., Applications of the integrated plasmid pSAM2, GIM90, Proceedings, Vol. 1, p.403-407).
Los vectores derivados del pSAM2 que contienen los elementos descritos anteriomente pueden ser construidos por los expertos en la técnica, en base a sus conocimientos generales y enseñanzas de la presente solicitud (Cf igualmente las técnicas generales de biología molecular).
Las secuencias de la invención están muy especialmente adaptadas para su utilización en un procedimiento industrial de producción de antibióticos (espiramicina, estreptograminas, \beta lactamas, etc. cuyos genes se describen en las solicitudes EP 0346000 y PCT/FR93/00923 principalmente).
La presente invención se describirá de manera más completa por medio de los ejemplos siguientes, que deben considerarse como ilustrativos y no limitativos.
Leyendas de los dibujos
Figura 1 : Mapa de restricción del plásmido pSAM2
Figura 2 : Mapa de restricción del vector pOS531
Figura 3 : Mapa de restricción del vector pOS532
Figura 4 : Mapa de restricción del vector pOS541
Figura 5 : Mapa de restricción del vector pOS544
Figura 6 : Mapa de restricción del vector pOS666. Este vector se construye a partir del plásmido pPM927 (Smokvina et al. Gene 94 (1.990) 53) por inserción del gen rmf (igualmente denominado pra) y del origen de replicación del pSAM2: tsr: gen de resistencia al tiostrepón; stm/spc: gen de resistencia a la estreptomicina/espectinomicina; oriR: origen de replicación E. coli; oripSAM2: origen de replicación del pSAM2; ter: terminador de la transcripción.
Figura 7 : Actividad de los vectores.
Técnicas generales de biología molecular
Los métodos utilizados clásicamente en biología molecular tales como extracciones preparativas del ADN plasmídico, centrifugación del ADN plasmídico en gradiente de cloruro de cesio, electroforesis en geles de agarosa o acrilamida, purificación de fragmentos de ADN por electroelución, extracción de proteínas con fenol o fenol-cloroformo, precipitación de ADN en medio salino con etanol o isopropanol, transformación en Escherichia coli, etc. son bien conocidas por los expertos en la técnica y están ampliamente descritas en la bibliografía [Maniatis T. et. al., "Molecular Cloning, a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1.982; Ausubel F.M. et al. (eds), "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, New York, 1.987].
Los plásmidos de tipo pBR322, pUC y los fagos de la serie M13 son de origen comercial (Bethesda Research Laboratories).
Para las ligaduras, los fragmentos de ADN pueden separarse según su tamaño por electroforesis en geles de agarosa o acrilamida, extraerse con fenol o con una mezcla de fenol/cloroformo, precipitarse en etanol y después incubarse en presencia de la ADN-ligasa del fago T4 (Biolabs) según las recomendaciones del fabricante.
El relleno de los extremos 5' prominentes se puede realizar con el fragmento de Klenow de la ADN-polimerasa I de E. coli (Biolabs) según las especificaciones del fabricante. La destrucción de los extremos 3' prominentes se efectúa en presencia de la ADN-polimerasa del fago T4 (Biolabs) utilizada según las recomendaciones del fabricante. La destrucción de los extremos 5' prominentes se efectúa por un tratamiento efectuado con nucleasa S1.
La mutagénesis dirigida in vitro por oligodesoxinucleótidos sintéticos se puede realizar según el método desarrollado por Taylor et al. [Nucleic Acids Res. 13 (1.985) 8.749-8.764] utilizando el kit distribuido por Amersham.
La amplificación enzimática de fragmentos de ADN por la técnica denominada PCR [siglas en inglés de Polyme-
rase-catalyzed Chain Reaction, Saiki R.K. et al., Science 230 (1.985) 1.350-1.354; Mullis K.B. y Faloona F.A, Meth. Enzym. 155 (1.987) 335-350] se puede realizar utilizando un "DNA thermal cycler" (Perkin Elmer Cetus) según las especificaciones del fabricante.
La verificación de las secuencias de nucleótidos se puede realizar por el método desarrollado por Sanger et al. [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 (1.977) 5.463-5.467) utilizando el kit distribuido por Amersham.
Ejemplos Ejemplo 1 Clonación y secuenciación de la secuencia SEQ ID nº 1
La forma libre del pSAM2 (B2) no se ha observado en S. lividans TK24 (Hopwood et al., J. Gen. Microbiol. 129 (1.983) 2.257), solo se ha observado la forma integrada. Con el pSAM2 (B3) la forma libre del plásmido coexiste con la forma integrada. Se han construido plásmidos híbridos a partir del pSAM2 (B3) en los que se han reemplazado diferentes regiones por las regiones equivalentes que provienen del pSAM2 (B2). Esto ha permitido mostrar que la mutación que permite al pSAM2 (B3) existir en forma libre estaba localizada en un fragmento de restricción KpnI de 2 kb. La secuencia de este fragmento KpnI ha sido determinada para el pSAM2 (B2) y el pSAM2 (B3). Un único nucleótido difiere entre estas dos secuencias: un par G/C en el pSAM2 (B2) se reemplaza por un par A/T en el pSAM2 (B3). El análisis de la secuencia ha demostrado que esta mutación se encontraba anteriormente a una fase abierta de lectura que se prolongaría más allá que el punto KpnI. Se ha determinado la secuencia de esta fase abierta de lectura, se presenta en la secuencia SEQ ID nº1. Esta fase abierta de lectura, denominada rmf (o pra), se sitúa entre los genes korSA y traSA. La mutación hace desaparecer un punto de reconocimiento para la enzima de restricción ApaLI (punto de reconocimiento: 5'GTGCAC 3'). Este punto se presenta en el pSAM2 (B2) pero está ausente en el pSAM2 (B3).
La secuencia SEQ ID nº1 comprende igualmente 100 pb anteriores a la región codificadora que comprende una parte del promotor (restos 1 à 101) y la région 5' no codificadora pero transcita (restos 102 à 154), que contiene principalmente el punto de unión de los ribosomas (RBS).
En el mutante pSAM2 (B4), para el que se puede observar la forma libre, el lugar ApaLI está también presente, lo que indica que la mutación no está localizada en el mismo punto que en el pSAM2 (B3). La secuencia del pSAM2 (B4) para la región correspondiente ha demostrado que las secuencias del pSAM2 (B2) y del pSAM2 (B4) diferían en un nucleótido. Esta mutación estaba localizada 8 nucleótidos antes que la mutación detectada en el pSAM2 (B3). Así, en dos casos independientes, la presencia de la forma libre del pSAM2 (B3) y del pSAM2 (B4) que coexiste con la forma integrada es debida a una mutación puntual anterior a un gen del pSAM2. Estas dos mutaciones independientes están las dos situadas en una región de las que los experimentos de análisis de los ARN mensajeros han demostrado que constituía el promotor de este gen.
Ejemplo 2 Construcción de casetes y vectores de expresión de la secuencia SEQ ID nº 1
Se han realizado varias construcciones utilizando los promotores y plásmidos siguientes:
- Promotor ermE modificado (ermE*): El promotor ermE modificado utilizado corresponde al promotor descrito por Bibb et al citado anteriormente que posee una deleción de 3 nucleótidos (bases 252-254, figura 2 de Bibb et al. citado anteriormente). Este promotor modificado da una expresión fuerte y constitutiva. Se ha aislado en forma de un fragmento KpnI-BamHI de 275 pb.
- Promotor tipA: Este promotor (Murakami et al. citado anteriormente) se presenta en el plásmido pPM927 (Smokvina et al., Gene 94 (1.990) 53). Se induce específicamente en presencia del tiostrepón.
- Plásmidos pIJ486 y pIJ487: Estos dos plásmidos han sido descritos por Ward et al. (Mol. Gen. Genet. 203 (1.986) 468). Estos plásmidos solos no tienen influencia en el estado (libre o integrado) del pSAM2.
2.1. Construcción del vector pOS531
El vector pOS531 se ha construido por clonación de la parte codificadora del gen rmf (restos 155 a 505 de la secuencia SEQ ID nº 1) en los puntos BamHI-HindIII del plásmido pIJ487. Este vector contiene por lo tanto el gen rmf desnudo (sin señal de expresión ni región 5' no codificadora). En la figura 2 se representa un mapa de este vector.
2.2. Construcción del vector pOS532
El vector pOS532 se ha construido por clonación del fragmento de 275 pb que contiene el promotor ermE modificado en los puntos EcoRI-BamHI del vector pOS531. Este vector contiene por lo tanto el gen rmf desnudo bajo control del promotor ermE modificado (figura 3).
2.3. Construcción del vector pOS541
El vector pOS541 se ha construido en 2 etapas :
- clonación de un fragmento que contiene la parte codificadora del gen rmf y la región 5' no codificadora (restos 102 a 505 de la secuencia SEQ ID nº 1) en los puntos BamHI-HindIll del plásmido pIJ487,
- adición del fragmento de 275 pb que contiene el promotor ermE modificado en los puntos EcoRI-BamHI del vector obtenido anteriormente.
Este vector contiene por lo tanto el gen rmf provisto de su región 5' no codificadora, bajo control del promotor ermE modificado (figura 4).
2.4. Construcción del vector pOS544
El vector pOS544 contiene un gen rmf eliminado en su parte 3' (están presentes los restos 102 a 276 de las secuencia SEQ ID nº 1). Se ha construido por clonación de esta región en forma de un fragmento BamHI-BspHI (extemo BspHl tratado con el fragmento de Klenow de la ADN-polimerasa de la E. coli) en los puntos BamHI y Hindlll del plásmido pIJ487 (extremo HindIII tratado con el fragmento de Klenow de la ADN-polimerasa de la E. coli). El vector pOS544 contiene por lo tanto la parte 5' del gen rmf (región 5' no codificadora + región 5' codificadora), pero desprovista de su promotor. En la figura 5 se representa un mapa de este vector.
Ejemplo 3 Aparición de formas libres replicativas de vectores integradores derivados del pSAM2 debido al producto de expresión del gen rmf
Este ejemplo muestra que la sobre-expresión del gen SEQ ID nº 1 puede provocar la aparición en forma libre de una copia integrada del pSAM2.
3.1. Una prueba directa del papel de activador de la replicación que tiene el rmf puede obtenerse provocando, por expresión del rmf, la aparición en forma libre de una copia integrada del pSAM2 (B2). El hecho de que el pSAM2 (B2) posea un punto ApaLI suplementario con respecto al pSAM2 (B3) permite verificar de forma sencilla por observación del perfil de digestión ApaLI que el plásmido libre es el pSAM2 (B2).
3.2. La actividad de la secuencia SEQ ID nº 1 ha sido igualmente puesta en evidencia por transformación de S. lividans que contiene un copia integrada del pSAM2(B2) con los diferentes vectores descritos anteriormente y luego por búsqueda de formas libres. Para ello, se ha transformado S. lividans que contiene el plásmido pSAM2(B2) por la técnica de los protoplastos con los diferentes vectores descritos en el ejemplo 2. El ADN plasmídico o el ADN celular total se extraen a partir de un cultivo en fase estacionaria de los clones transformados. El ADN plasmídico es digerido por la enzima ApaLI y los fragmentos de digestión se separan por electroforesis en gel de agarosa. La observación del perfil de restricción permite saber si hay presentes copias libres de pSAM2(B2). Estos resultados se confirman a continuación por experimentos de hibridación del ADN total con una sonda pSAM2.
Los resultados obtenidos se presentan en la figura 7.
Estos resultados demuestran que el pOS541, que contiene el promotor ermE modificado, la región no traducida anterior al rmf con el punto de fijación de los ribosomas y la fase codificadora rmf, provoca la aparición de formas libres replicativas del pSAM2(B2). Como se esperaba, no se ha observado ningún efecto con un vector que no contiene más que la parte codificadora rmf (pOS531) o con un vector que contiene el ermE modificado y la parte codificadora de rmf, pero ninguna región de fijación de los ribosomas (pOS532). No se ha observado ningún efecto con un vector que contiene una deleción en la parte 3' del rmf (pOS544).
El mismo tipo de efecto se obtiene cuando la casete que permite la expresión inducible de rmf se localiza sobre el plásmido para el que se desea provocar la aparición de formas libres (vector pOS666, figura 6).
El conjunto de estos resultados demuestra que la secuencia de la invención es capaz de inducir, en cis o en trans, la aparición de formas libres de vectores derivados del pSAM2.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: RHONE-POULENC RORER S.A.
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: 20, avenue R. ARON
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
CIUDAD: ANTONY
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: FRANCIA
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 920165
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Secuencias de ácidos nucléicos reguladoras y utilizaciones.
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 1
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
TIPO DE SOPORTE: Cinta
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (OEB)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 812 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE HEBRAS: dos
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADNc
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO: 155...505
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
OTRAS INFORMACIONES: /productO = "gen rmf"
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: -35_señal
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO: 65...70
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: -10_señal
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO: 89...94
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: promotor
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO: 1...101
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: RBS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
EMPLAZAMIENTO: 140...145
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
1

Claims (9)

1. Molécula de ácido nucléico caracterizado porque se elige entre:
a)
la secuencia de ácido nucléico representada por SEQ ID Nº 1,
b)
los fragmentos de esta secuencia que codifican un polipéptido capaz de permitir la aparición, a partir de formas integradas, de formas libres replicativas del plásmido pSAM2 en los actinomicetos,
c)
los variantes de esta secuencia y que resultan de la degeneración del código genético y que codifican un polipéptido capaz de permitir la aparición, a partir de formas integradas, de formas libres replicaticas del plásmido pSAM2 en los actinomicetos.
2. Casete de expresión que comprende una secuencia según la reivindicación 1 controlada por un promotor constitutivo o regulado.
3. Casete de expresión según la reivindicación 2, caracterizada porque el promotor constitutivo se elige entre el promotor del gen ermE o un variante de este, el promotor p14 del fago I19 de S.ghanaensis, o cualquier fragmento que contiene una región promotora de un operón ribosómico de S.ambofaciens.
4. Casete de expresión según la reivindicación 2, caracterizada porque el promotor regulado se elige entre los promotores inducidos específicamente por un agente introducido en el medio de cultivo, tal como, por ejemplo, el promotor tipA inducible por el tiostrepón o promotores termoinducibles como el de los genes groEL.
5. Casete de expresión según la reivindicación 2 caracterizada porque el promotor regulado se elige entre los promotores de actinomicetos específicamente activos en las fases tardías del ciclo de proliferación de los actinomicetos, tal como, por ejemplo, los promotores de genes del metabolismo secundario (principalmente, genes de producción de antibióticos).
6. Utilización de una secuencia o casete según una de las reivindicaciones precedentes para inducir la aparición de copias libres de vectores derivados del pSAM2 integrados en un actinomiceto.
7. Utilización según la reivindicación 6, caracterizada porque la secuencia o la casete están contenidas en el vector integrador derivado del pSAM2.
8. Utilización según la reivindicación 6, caracterizada porque la secuencia o la casete están contenidas en otro vector o introducidos directamente tal cuales.
9. Utilización según las reivindicaciones 6 a 8, caracterizada porque el actinomiceto se elige entre los estreptomices y las micobacterias.
ES95902830T 1993-12-08 1994-12-05 Secuencias de acidos nucleicos reguladoras y utilizaciones. Expired - Lifetime ES2229230T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR9314701 1993-12-08
FR9314701A FR2713658B1 (fr) 1993-12-08 1993-12-08 Séquences d'acides nucléiques régulatrices et utilisations.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2229230T3 true ES2229230T3 (es) 2005-04-16

Family

ID=9453681

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES95902830T Expired - Lifetime ES2229230T3 (es) 1993-12-08 1994-12-05 Secuencias de acidos nucleicos reguladoras y utilizaciones.

Country Status (15)

Country Link
US (1) US5741675A (es)
EP (1) EP0788549B1 (es)
JP (1) JP3751019B2 (es)
KR (1) KR100367753B1 (es)
AT (1) ATE279521T1 (es)
AU (1) AU686707B2 (es)
CA (1) CA2177600C (es)
DE (1) DE69434072T2 (es)
DK (1) DK0788549T3 (es)
ES (1) ES2229230T3 (es)
FR (1) FR2713658B1 (es)
NZ (1) NZ277049A (es)
PT (1) PT788549E (es)
WO (1) WO1995016046A1 (es)
ZA (1) ZA949807B (es)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6861513B2 (en) * 2000-01-12 2005-03-01 Schering Corporation Everninomicin biosynthetic genes
AU2001249673A1 (en) * 2000-04-04 2001-10-15 Schering Corporation Isolated nucleic acids from micromonospora rosaria plasmid pmr2 and vectors made therefrom
US7220567B2 (en) 2000-05-17 2007-05-22 Schering Corporation Isolation of Micromonospora carbonacea var africana pMLP1 integrase and use of integrating function for site-specific integration into Micromonospora halophitica and Micromonospora carbonacea chromosome
TW201118170A (en) * 2009-11-20 2011-06-01 Ind Tech Res Inst Expression vector for expressing recombinant protein in cyanobacterium

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR350341A (fr) * 1904-11-24 1906-01-12 Louis Boisard Système de taille des vis globiques
FR2631634B1 (fr) * 1988-05-18 1991-06-14 Centre Nat Rech Scient Vecteurs de clonage et d'expression dans une souche d'actinomycete, procede de transformation de cette souche, souche d'actynomycete obtenue et preparation de proteines
US5098837A (en) * 1988-06-07 1992-03-24 Eli Lilly And Company Macrolide biosynthetic genes for use in streptomyces and other organisms
FR2696189B1 (fr) * 1992-09-25 1994-11-10 Rhone Poulenc Rorer Sa Polypeptides impliqués dans la biosynthèse des streptogramines, séquences nucléotidiques codant pour ces polypeptides et leur utilisation.

Also Published As

Publication number Publication date
WO1995016046A1 (fr) 1995-06-15
FR2713658B1 (fr) 1996-04-12
US5741675A (en) 1998-04-21
EP0788549B1 (fr) 2004-10-13
ZA949807B (en) 1996-04-01
ATE279521T1 (de) 2004-10-15
DE69434072T2 (de) 2005-11-17
CA2177600C (fr) 2009-02-03
DK0788549T3 (da) 2005-02-14
EP0788549A1 (fr) 1997-08-13
DE69434072D1 (de) 2004-11-18
NZ277049A (en) 1997-09-22
CA2177600A1 (fr) 1995-06-15
JP3751019B2 (ja) 2006-03-01
AU1193595A (en) 1995-06-27
JPH09506257A (ja) 1997-06-24
FR2713658A1 (fr) 1995-06-16
AU686707B2 (en) 1998-02-12
KR100367753B1 (ko) 2003-12-31
PT788549E (pt) 2005-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Neal et al. Nucleotide sequence analysis reveals similarities between proteins determining methylenomycin A resistance in Streptomyces and tetracycline resistance in eubacteria
Zyskind et al. Chromosomal replication origin from the marine bacterium Vibrio harveyi functions in Escherichia coli: oriC consensus sequence.
Bartlett et al. Nucleotide sequence of IS492, a novel insertion sequence causing variation in extracellular polysaccharide production in the marine bacterium Pseudomonas atlantica
Clary et al. Drosophila mitochondrial DNA: conserved sequences in the A+ T-rich region and supporting evidence for a secondary structure model of the small ribosomal RNA
Mazodier et al. Completion of the nucleotide sequence of the central region of Tn 5 confirms the presence of three resistance genes
Ciliberto et al. Common and interchangeable elements in the promoters of genes transcribed by RNA polymerase III
Priebe et al. Region of the streptococcal plasmid pMV158 required for conjugative mobilization
Taylor et al. Characterization and expression of a cloned tetracycline resistance determinant from Campylobacter jejuni plasmid pUA466
Robson et al. Second gene (nif H*) coding for a nitrogenase iron protein in Azotobacter chroococcum is adjacent to a gene coding for a ferredoxin‐like protein
Smith et al. Identification of a circular intermediate in the transfer and transposition of Tn4555, a mobilizable transposon from Bacteroides spp
Shoemaker et al. Tetracycline-dependent appearance of plasmidlike forms in Bacteroides uniformis 0061 mediated by conjugal Bacteroides tetracycline resistance elements
Bancroft et al. Characterization of an insertion sequence (IS891) of novel structure from the cyanobacterium Anabaena sp. strain M-131
Ng et al. Minimal replication origin of the 200-kilobase Halobacterium plasmid pNRC100
Selvaraj et al. Transposon Tn5 specifies streptomycin resistance in Rhizobium spp
Chant et al. Archaebacteria: transcription and processing of ribosomal RNA sequences in Halobacterium cutirubrum
Lampson et al. Nucleotide sequence of the constitutive macrolide-lincosamide-streptogramin B resistance plasmid pNE131 from Staphylococcus epidermidis and homologies with Staphylococcus aureus plasmids pE194 and pSN2
Sekine et al. Linearization and transposition of circular molecules of insertion sequence IS3
Helftenbein et al. Both α-tubulin genes are transcriptionally active in Stylonchyia lemnae
JP2913406B2 (ja) 放線菌株におけるクローン化および発現ベクター，この株の形質転換方法，得られた放線菌株および蛋白質の製造方法
Podbielski et al. Genetic variability of the emm-related genes of the large vir regulon of group A streptococci: potential intra-and intergenomic recombination events
Habib et al. Roles of a ribosome-binding site and mRNA secondary structure in differential expression of Shiga toxin genes
De Vos et al. Host-dependent transposon Tn5-mediated streptomycin resistance
AU686707B2 (en) Regulatory nucleic acid sequences and uses thereof
Wood et al. A native plasmid of Pasteurella haemolytica serotype A1: DNA sequence analysis and investigation of its potential as a vector
Glazebrook et al. Molecular analysis of the UV protection and mutation genes carried by the I incompatibility group plasmid TP110