JP2913406B2 - 放線菌株におけるクローン化および発現ベクター，この株の形質転換方法，得られた放線菌株および蛋白質の製造方法 - Google Patents
放線菌株におけるクローン化および発現ベクター，この株の形質転換方法，得られた放線菌株および蛋白質の製造方法Info
- Publication number
- JP2913406B2 JP2913406B2 JP1122704A JP12270489A JP2913406B2 JP 2913406 B2 JP2913406 B2 JP 2913406B2 JP 1122704 A JP1122704 A JP 1122704A JP 12270489 A JP12270489 A JP 12270489A JP 2913406 B2 JP2913406 B2 JP 2913406B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- strain
- plasmid
- vector
- sequence
- producing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
- C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
- C12N9/2405—Glucanases
- C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2411—Amylases
- C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
- C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
- C12N15/76—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Actinomyces; for Streptomyces
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Mycology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、放線菌（Actinomycetes）における蛋白質
のクローン化および発現ベクター並びにこれらベクター
により形質転換された株に関する。
のクローン化および発現ベクター並びにこれらベクター
により形質転換された株に関する。
（従来の技術） 放線菌株に属する細菌、特にストレプトミセス（Stre
ptomyces）に属する細菌は、微生物工業において特に重
要な地位を占めている。実際、ストレプトマイシンを生
成するストレプトミセスのWaksmanによる発見以来、最
近の40年間、多くの様々な抗生物質生成ストレプトミセ
スが単離され且つ工業的に利用されている。ストレプト
ミセスにより生成される二次代謝産物は、多量に且つ様
々な種類となって製造されており、このことはストレプ
トミセスが1978年までの天然抗生物質の55％を合成して
いるという事実から明らかである。現在、工業的に生成
されている抗生物質の約70％は、ストレプトミセスによ
り製造されている。微生物からの二次代謝産物は、特に
それらの抗菌性、防カビ性または抗腫瘍性のために用い
られている。これらの特性を有する物質は、1950〜1970
年におびただしい数が発見されている。現在、これら種
類の発見のペースは鈍ってきたが、微生物二次代謝産物
のすべてが利用されているわけではない。実際、それら
の用途については、多くの利用分野で現在検討されてい
る。例えば、これらの利用分野としては、寄生虫駆除
剤、殺虫剤、除草剤およびこれら生成物の薬理学的用途
の分野がある。これら分野においても、ストレプトミセ
スの生成物が多い。即ち、それらの例としては、胞子虫
病に対する物質、牛の寄生線虫に対して非常に活性で且
つまた殺虫作用を有するアベルメクチン（avermectin
s）、およびキチン質の合成を妨害し、殺虫作用を有す
るニコマイシン（nikkomycins）が挙げられる。ストレ
プトミセスはまた抗炎症剤および血管拡張剤のような薬
理学的活性を有する物質を生成する。
ptomyces）に属する細菌は、微生物工業において特に重
要な地位を占めている。実際、ストレプトマイシンを生
成するストレプトミセスのWaksmanによる発見以来、最
近の40年間、多くの様々な抗生物質生成ストレプトミセ
スが単離され且つ工業的に利用されている。ストレプト
ミセスにより生成される二次代謝産物は、多量に且つ様
々な種類となって製造されており、このことはストレプ
トミセスが1978年までの天然抗生物質の55％を合成して
いるという事実から明らかである。現在、工業的に生成
されている抗生物質の約70％は、ストレプトミセスによ
り製造されている。微生物からの二次代謝産物は、特に
それらの抗菌性、防カビ性または抗腫瘍性のために用い
られている。これらの特性を有する物質は、1950〜1970
年におびただしい数が発見されている。現在、これら種
類の発見のペースは鈍ってきたが、微生物二次代謝産物
のすべてが利用されているわけではない。実際、それら
の用途については、多くの利用分野で現在検討されてい
る。例えば、これらの利用分野としては、寄生虫駆除
剤、殺虫剤、除草剤およびこれら生成物の薬理学的用途
の分野がある。これら分野においても、ストレプトミセ
スの生成物が多い。即ち、それらの例としては、胞子虫
病に対する物質、牛の寄生線虫に対して非常に活性で且
つまた殺虫作用を有するアベルメクチン（avermectin
s）、およびキチン質の合成を妨害し、殺虫作用を有す
るニコマイシン（nikkomycins）が挙げられる。ストレ
プトミセスはまた抗炎症剤および血管拡張剤のような薬
理学的活性を有する物質を生成する。
ストレプトミセスに興味を抱く他の理由は、これらが
異型遺伝子を発現するホストとして使用できることであ
る。実際、この分野に係わる多くの企業では、ストレプ
トミセスを培養し且つ培養物を利用するのに必要なノウ
ハウおよび装置を保有している。定常期における培養物
は数週間代謝活性を維持し、且つ蛋白質および二次代謝
産物を合成し続ける。ストレプトミセスは多数の細胞外
酵素を生成し、そのうちの幾つかがプロテアーゼまたは
グルコース異性化酵素のように工業的に使用されている
ことを考えると、それらの代謝排出物は異種蛋白質の生
成に使用することができるはずである。ストレプトミセ
ス・リビダンス（lividans）は、Biogen Companyによ
ってウシの成長ホルモンの発現用ホストとしてすでに有
益に採用されている（Gray etcoll.、1985）。
異型遺伝子を発現するホストとして使用できることであ
る。実際、この分野に係わる多くの企業では、ストレプ
トミセスを培養し且つ培養物を利用するのに必要なノウ
ハウおよび装置を保有している。定常期における培養物
は数週間代謝活性を維持し、且つ蛋白質および二次代謝
産物を合成し続ける。ストレプトミセスは多数の細胞外
酵素を生成し、そのうちの幾つかがプロテアーゼまたは
グルコース異性化酵素のように工業的に使用されている
ことを考えると、それらの代謝排出物は異種蛋白質の生
成に使用することができるはずである。ストレプトミセ
ス・リビダンス（lividans）は、Biogen Companyによ
ってウシの成長ホルモンの発現用ホストとしてすでに有
益に採用されている（Gray etcoll.、1985）。
ストレプトミセス・アンボファシエンス（ambofacien
s）株は、Rhone−Poulencによって特にスピラマイシ
ン、即ちマクロライド科の抗生物質の生成に利用されて
いる。さらに、この株は分子クローン化を容易にする異
種DNAに対して制限的特性を示さない（Coxet coll.、1
984）。マクロライド生成ストレプトミセスを研究し、
且つストレプトミセス・アンボファシエンスを使用して
いる主なグループは、日本のOmura教授のグループ、米
国のEli Lilly CompanyのR.H. Baltsのグループ、お
よびRhone Poulenc Sante CompanyのＡ Sabatier博
士のグループである。
s）株は、Rhone−Poulencによって特にスピラマイシ
ン、即ちマクロライド科の抗生物質の生成に利用されて
いる。さらに、この株は分子クローン化を容易にする異
種DNAに対して制限的特性を示さない（Coxet coll.、1
984）。マクロライド生成ストレプトミセスを研究し、
且つストレプトミセス・アンボファシエンスを使用して
いる主なグループは、日本のOmura教授のグループ、米
国のEli Lilly CompanyのR.H. Baltsのグループ、お
よびRhone Poulenc Sante CompanyのＡ Sabatier博
士のグループである。
Omuraのグループは主にマクロライドの生合成の方
法、新規なマクロライドの発見およびハイブリッドマク
ロライドの生成について研究している（Omura、198
4）。Baltzのグループは特にチロシンおよびエリスロマ
イシンをそれぞれ生成するストレプトミセス・フラジア
エ（S. fradiae）およびストレプトミセス・エリスラ
エウス（S. erythraeus）について研究をしているが、
多くの分子クローン化実験においてストレプトミセス・
アンボファシエンスをホストとして使用している（Kuhs
tossおよびRao、1983;MatsuhimaおよびBaltz,1985）。
法、新規なマクロライドの発見およびハイブリッドマク
ロライドの生成について研究している（Omura、198
4）。Baltzのグループは特にチロシンおよびエリスロマ
イシンをそれぞれ生成するストレプトミセス・フラジア
エ（S. fradiae）およびストレプトミセス・エリスラ
エウス（S. erythraeus）について研究をしているが、
多くの分子クローン化実験においてストレプトミセス・
アンボファシエンスをホストとして使用している（Kuhs
tossおよびRao、1983;MatsuhimaおよびBaltz,1985）。
異なる地域からの２つの単離細胞に属するストレプト
ミセス・アンボファシエンスの幾つかの株の研究によっ
て、特別なプラスミドの存在が検出された。このプラス
ミドはpSAM2である（「Plasmids in different stra
ins of Streptomyces ambofaciens: free and in
tegrated form of plasmid pSAM2」、Mol. Gen.Ge
net.、198、35〜41頁、1984年および「Excision and
integration of ａ self−transmissible replicon
of Streptomyces ambofaciens」、et Gene,59、13
7〜144頁、1987年）。
ミセス・アンボファシエンスの幾つかの株の研究によっ
て、特別なプラスミドの存在が検出された。このプラス
ミドはpSAM2である（「Plasmids in different stra
ins of Streptomyces ambofaciens: free and in
tegrated form of plasmid pSAM2」、Mol. Gen.Ge
net.、198、35〜41頁、1984年および「Excision and
integration of ａ self−transmissible replicon
of Streptomyces ambofaciens」、et Gene,59、13
7〜144頁、1987年）。
プラスミドpSAM2は11kbの大きさを有し、遊離状態お
よび／または組込み状態で存在し、且つ１つの株から他
の株に転移することができると説明されている。受容体
株の染色体へのプラスミドpSAM2の組込み現象もまた実
証可能であると思われるが、この現象は現在のところ明
らかにされていない。
よび／または組込み状態で存在し、且つ１つの株から他
の株に転移することができると説明されている。受容体
株の染色体へのプラスミドpSAM2の組込み現象もまた実
証可能であると思われるが、この現象は現在のところ明
らかにされていない。
（発明の構成） 従って、本発明は、放線菌株における特定の蛋白質を
コードするDNA配列のクローン化および発現用ベクター
において、 att付加配列と、 上記株における機能性int配列をコードするDNA配列
と、 上記特定蛋白質をコードし、且つ上記株における上記
配列の発現を確実にする要素をコードするDNA配列とか
ら成るベクターに関する。
コードするDNA配列のクローン化および発現用ベクター
において、 att付加配列と、 上記株における機能性int配列をコードするDNA配列
と、 上記特定蛋白質をコードし、且つ上記株における上記
配列の発現を確実にする要素をコードするDNA配列とか
ら成るベクターに関する。
さらに詳しくは、このベクターは有用な所望の蛋白質
をコードし、または特に抗菌剤、防カビ剤、抗潰瘍剤お
よび酵素等の蛋白質のような上記二次代謝産物の生成を
促進する発現ベクターである。なお、上記二次代謝産物
は、放線菌株から既に得られており、または他の生物体
により生成することもできる。
をコードし、または特に抗菌剤、防カビ剤、抗潰瘍剤お
よび酵素等の蛋白質のような上記二次代謝産物の生成を
促進する発現ベクターである。なお、上記二次代謝産物
は、放線菌株から既に得られており、または他の生物体
により生成することもできる。
上記att配列としては、次の配列から選ばれるものを
特に挙げることができる。
特に挙げることができる。
TTCTCTGTCGGGGTGGCGGGATTTGAACCCACGACCTCTTCGTCCCGAA の配列およびこの配列と少なくとも50％相同な部分を有
する配列。
する配列。
実際、本発明によれば、プラスミドpSAM2の染色体組
込み機構は、この種のヌクレオチド配列により特徴付け
られる付加配列を含むことが実証された。
込み機構は、この種のヌクレオチド配列により特徴付け
られる付加配列を含むことが実証された。
pSAM2の制限地図が決定され、この地図は第１図に示
されている。付加配列は第３図に呈示されている。この
配列は＋24の位置から開始し、−24の位置で終わってい
る。０の位置におけるヌクレオチドは付加位置の中央に
対応する。
されている。付加配列は第３図に呈示されている。この
配列は＋24の位置から開始し、−24の位置で終わってい
る。０の位置におけるヌクレオチドは付加位置の中央に
対応する。
本発明のベクターは、さらに上記株において機能性in
t配列をコードする配列を含む。この配列はインテグラ
ーゼをコードする配列であり、通常付加配列の上流に位
置するか、または付加配列の付近に位置する（第２図参
照）。int配列は組込み現象において重要な役割を演じ
る。
t配列をコードする配列を含む。この配列はインテグラ
ーゼをコードする配列であり、通常付加配列の上流に位
置するか、または付加配列の付近に位置する（第２図参
照）。int配列は組込み現象において重要な役割を演じ
る。
この遺伝子intに対応するヌクレオチド配列はすでに
決定されており、この配列は第３図に示されている。in
t配列は＋1261部位〜＋97部位のDNA配列に対応する。こ
のint配列は、殆どの場合、切除部分をコードする遺伝
子であるxis配列の下流に位置するか、またはxis配列に
部分的に挟まれる。この遺伝子配列もまた第３図に示さ
れている。
決定されており、この配列は第３図に示されている。in
t配列は＋1261部位〜＋97部位のDNA配列に対応する。こ
のint配列は、殆どの場合、切除部分をコードする遺伝
子であるxis配列の下流に位置するか、またはxis配列に
部分的に挟まれる。この遺伝子配列もまた第３図に示さ
れている。
本発明のベクターは、大部分、非常に高い安定性をも
って染色体に組込まれる。
って染色体に組込まれる。
ベクターコピーが染色体に組込まれていようと、また
は組込まれていまいと、自己複製可能なプラスミドの形
で１つのゲノムにつく多数のベクターコピーを得るため
には、pSAM2のEcoR I部位のNo.33の各側から600bpのフ
ラグメントを切除したベクター、即ちEcoR I部位のNo.3
3の各側に位置する２つの反復配列間のフラグメントか
ら600bpのフラグメントを本質的に切除したベクターに
再配列することが有益である（第１図参照）。さらに、
これらのベクターはintおよびxis遺伝子を有するフラグ
メントを含むことができる。
は組込まれていまいと、自己複製可能なプラスミドの形
で１つのゲノムにつく多数のベクターコピーを得るため
には、pSAM2のEcoR I部位のNo.33の各側から600bpのフ
ラグメントを切除したベクター、即ちEcoR I部位のNo.3
3の各側に位置する２つの反復配列間のフラグメントか
ら600bpのフラグメントを本質的に切除したベクターに
再配列することが有益である（第１図参照）。さらに、
これらのベクターはintおよびxis遺伝子を有するフラグ
メントを含むことができる。
このようにして得られたベクターは多量に増殖する性
質を有している。
質を有している。
あらゆるクローン化ベクターまたは発現ベクターのよ
うに、細菌特に大腸菌からの要素を挿入することが好ま
しく、これによりベクターをこれら細菌に組込むことが
できる。しかしながら、放線菌株に利用する場合、大腸
菌に対応するこれらフラグメントは排除することができ
るはずである。菌体において使用可能な要素は公知であ
る。殆どの場合、これら要素はプラスミドを増殖し、機
能抵抗性を有する複製起源から成り、また必要に応じ
て、大腸菌への組込みを容易にする他の要素を含むこと
もできる。
うに、細菌特に大腸菌からの要素を挿入することが好ま
しく、これによりベクターをこれら細菌に組込むことが
できる。しかしながら、放線菌株に利用する場合、大腸
菌に対応するこれらフラグメントは排除することができ
るはずである。菌体において使用可能な要素は公知であ
る。殆どの場合、これら要素はプラスミドを増殖し、機
能抵抗性を有する複製起源から成り、また必要に応じ
て、大腸菌への組込みを容易にする他の要素を含むこと
もできる。
上記特定蛋白質をコードし且つ上記株において上記配
列の発現を確実にする要素をコードするDNA配列は、ベ
クター内のさまざまな位置に挿入することができる。
列の発現を確実にする要素をコードするDNA配列は、ベ
クター内のさまざまな位置に挿入することができる。
染色体に組込まれるDNA配列の特定の蛋白質を生成す
る放線菌株を製造する場合、上記のようなベクターを使
用することが好ましく、且つ上記DNA配列はattおよびin
t配列以外の場所に組込まれる。この場合、染色体への
組込みは促進される。
る放線菌株を製造する場合、上記のようなベクターを使
用することが好ましく、且つ上記DNA配列はattおよびin
t配列以外の場所に組込まれる。この場合、染色体への
組込みは促進される。
これに対して、上記プラスミドの一部が染色体に組込
まれる場合、上記DNA配列はint遺伝子に挿入される。
まれる場合、上記DNA配列はint遺伝子に挿入される。
ベクタープラスミドが１つの株から他の株に転移する
ことができないように構成する場合、特定の蛋白質をコ
ードするDNA配列は、形質転換した株の機能性転移要素
をコードする配列部分に挿入することができる。
ことができないように構成する場合、特定の蛋白質をコ
ードするDNA配列は、形質転換した株の機能性転移要素
をコードする配列部分に挿入することができる。
特定の蛋白質をコードする配列としては、所定の抗生
物質に対する抵抗性をコードする配列が挙げられ、特に
チオストレプトンに対する抵抗性をコードする配列が挙
げられる。
物質に対する抵抗性をコードする配列が挙げられ、特に
チオストレプトンに対する抵抗性をコードする配列が挙
げられる。
或る場合には、チオストレプトンに対する抵抗性は標
識化遺伝子として使用することができる。この場合、他
の蛋白質を発現することが望まれるならば、他のクロー
ン化部位を設けることが必要である。このとは、例え
ば、多価ベクターによって、即ち上記ベクターの１つに
「ポリリンカー」配列を挿入することにより達成するこ
とができる。
識化遺伝子として使用することができる。この場合、他
の蛋白質を発現することが望まれるならば、他のクロー
ン化部位を設けることが必要である。このとは、例え
ば、多価ベクターによって、即ち上記ベクターの１つに
「ポリリンカー」配列を挿入することにより達成するこ
とができる。
後者の場合、標識化遺伝子は本発明のベクターの付加
部位の下流に位置することが好ましい。
部位の下流に位置することが好ましい。
従って、「ポリリンカー」は付加部位に対して標識化
遺伝子の下流に位置することが好ましく、この場合、得
られたベクターは組込みベクターとなる。特に好ましい
例は、下記実施例１に述べられるベクターpTS55であ
る。
遺伝子の下流に位置することが好ましく、この場合、得
られたベクターは組込みベクターとなる。特に好ましい
例は、下記実施例１に述べられるベクターpTS55であ
る。
本発明に従って得られた組込み複製ベクターにおいて
は、「ポリリンカー」配列の部位を変更して、得られた
ベクターが１つの株から多の株に転移できないようにす
ることができる。
は、「ポリリンカー」配列の部位を変更して、得られた
ベクターが１つの株から多の株に転移できないようにす
ることができる。
このようなベクターは、ヒトまたは動物の健康に特に
有益な蛋白質をコードする異種遺伝子の場合に特に有用
である。
有益な蛋白質をコードする異種遺伝子の場合に特に有用
である。
その１例としてはベクターpTS12があり、この構造に
ついては次の実施例で説明される。
ついては次の実施例で説明される。
「ポリリンカー」配列は、標識化遺伝子の上流、即ち
int遺伝子内に配置させることもでき、この場合、得ら
れたベクターは受容体株の染色体に組込むことができな
い。その１つの例はベクターpTS13であり、この構造は
次の実施例で詳述される。
int遺伝子内に配置させることもでき、この場合、得ら
れたベクターは受容体株の染色体に組込むことができな
い。その１つの例はベクターpTS13であり、この構造は
次の実施例で詳述される。
本発明のベクターはとくに有益である。なぜならば安
定性が高く且つ多くのホストに組込みが可能であるから
である。
定性が高く且つ多くのホストに組込みが可能であるから
である。
ベクターの安定性が高いので、遺伝子を組込み状態に
保持するための所定の圧力は不必要である。
保持するための所定の圧力は不必要である。
複製ベクターの場合も、組込み状態のベクターが最も
安定である。場合によって、組込まれたコピーは、遊離
のプラスミドを再生することのできるマトリックスを形
成することができる。
安定である。場合によって、組込まれたコピーは、遊離
のプラスミドを再生することのできるマトリックスを形
成することができる。
さらに、本発明によるベクターは、上記組込み部位、
即ち第３図に示された部位＋24〜−24のヌクレオチド配
列のすべて、または一部から成る配列を有する部位、こ
の部位を含むすべての株に組込むことができる。この部
位は、S. antibioticus （DSM 40868）、S. bikini
ensis （ATCC 11062）、S. parvulus （ATCC 1243
4）、S. glaucescens （ETH 22794）、S. actuosus
（ATCC 25421）、S. coelicolor （A3（２））、
S. ambofaciens.S. lividans TK64（66）およびS.
griseofuscus（DSM 40191）における＋21〜−18の位置
のプローブでハイブリッド形成することによりすでに検
出されている。
即ち第３図に示された部位＋24〜−24のヌクレオチド配
列のすべて、または一部から成る配列を有する部位、こ
の部位を含むすべての株に組込むことができる。この部
位は、S. antibioticus （DSM 40868）、S. bikini
ensis （ATCC 11062）、S. parvulus （ATCC 1243
4）、S. glaucescens （ETH 22794）、S. actuosus
（ATCC 25421）、S. coelicolor （A3（２））、
S. ambofaciens.S. lividans TK64（66）およびS.
griseofuscus（DSM 40191）における＋21〜−18の位置
のプローブでハイブリッド形成することによりすでに検
出されている。
この後者の株については、第４番目のヌクレオチド、
即ち＋21の位置におけるヌクレオチドはチミジン（Ｔ）
ではなくてアデニン（Ａ）であることに注意すべきであ
る。
即ち＋21の位置におけるヌクレオチドはチミジン（Ｔ）
ではなくてアデニン（Ａ）であることに注意すべきであ
る。
このような置換は、本発明のベクターとの組込みの実
用性に対して影響を及ぼすことはない。
用性に対して影響を及ぼすことはない。
一般的に、組込みの実現性が影響されないように、ヌ
クレオチドの少なくとも50％は置換すべきではない。
クレオチドの少なくとも50％は置換すべきではない。
また、本発明は、染色体に組込まれたDNA配列の特定
蛋白質を生成する放線菌株の製造方法において、上記DN
A配列がattおよびint配列以外の部位に挿入され、好ま
しくはこのDNA配列が転移要素をコードする配列に挿入
される放線菌株の製造方法に関する。
蛋白質を生成する放線菌株の製造方法において、上記DN
A配列がattおよびint配列以外の部位に挿入され、好ま
しくはこのDNA配列が転移要素をコードする配列に挿入
される放線菌株の製造方法に関する。
また、本発明は、染色体に部分的に組込み可能なプラ
スミドに組込まれたDNA配列の特定蛋白質を生成する放
線菌株の製造方法において、上記DNA配列がint遺伝子に
組込まれる放線菌株の製造方法に関する。
スミドに組込まれたDNA配列の特定蛋白質を生成する放
線菌株の製造方法において、上記DNA配列がint遺伝子に
組込まれる放線菌株の製造方法に関する。
本発明は、本発明のベクターにより形質転換した放線
菌株、特にストレプトミセスに関する。本発明はまたこ
れら形質転換した株の工業的用途に係わり、また特に、
所望の培地で本発明の形質転換した株を発酵させ、特定
の蛋白質を回収することから成る特定蛋白質を製造する
方法に関する。
菌株、特にストレプトミセスに関する。本発明はまたこ
れら形質転換した株の工業的用途に係わり、また特に、
所望の培地で本発明の形質転換した株を発酵させ、特定
の蛋白質を回収することから成る特定蛋白質を製造する
方法に関する。
かなり多くの蛋白質は本発明のベクターにより生成す
ることができる。
ることができる。
従って、特定のベクターは、強力な発現が必要でない
蛋白質に対して特別に適用することができる。特に、こ
の例としては、染色体に単一遺伝子の組込みを可能にす
るベクターpTS55がある。従って、形質転換した細胞１
個につきプラスミドの単一コピーが存在する。そのよう
なベクターは、蛋白質または工業的に有益な代謝産物の
生成に作用する調節遺伝子またはアミラーゼのような酵
素蛋白の発現に望ましいものである。
蛋白質に対して特別に適用することができる。特に、こ
の例としては、染色体に単一遺伝子の組込みを可能にす
るベクターpTS55がある。従って、形質転換した細胞１
個につきプラスミドの単一コピーが存在する。そのよう
なベクターは、蛋白質または工業的に有益な代謝産物の
生成に作用する調節遺伝子またはアミラーゼのような酵
素蛋白の発現に望ましいものである。
他のベクターは、かなりの発現を必要とする異種蛋白
質の発現に大変望ましいものである。例えば、pSAM2のE
coR I−No.33の部位の各側を切除することにより得られ
るpTS13およびpTS12は、ストレプトミセスおよび特にス
トレプトミセス・リビダンスTK64に導入される時、多量
のコピーを生成する。コピーの数はゲノム１個当たり10
0以上である。
質の発現に大変望ましいものである。例えば、pSAM2のE
coR I−No.33の部位の各側を切除することにより得られ
るpTS13およびpTS12は、ストレプトミセスおよび特にス
トレプトミセス・リビダンスTK64に導入される時、多量
のコピーを生成する。コピーの数はゲノム１個当たり10
0以上である。
（実施例） 実施例1:組込みベクターpTS55の形成 「Genetic Manipulation of Streptomyces」（Ａ
Laboratory Manual 1985）においてHopwoodにより
述べられたアルカリ化法に従って、プラスミドpSAM2
（第１図）をストレプトミセス・アンボファシエンス
（JI3212）から抽出し且つ精製した。
Laboratory Manual 1985）においてHopwoodにより
述べられたアルカリ化法に従って、プラスミドpSAM2
（第１図）をストレプトミセス・アンボファシエンス
（JI3212）から抽出し且つ精製した。
第１段階 プラスミドpSAM2を制限酵素BamH Iで消化し、7.75kb
（kb:キロ塩基対）のフラグメントを単離し、プラスミ
ドpBR329のBamH I部位でクローン化し、プラスミドpOS2
10（第４図）を得た。
（kb:キロ塩基対）のフラグメントを単離し、プラスミ
ドpBR329のBamH I部位でクローン化し、プラスミドpOS2
10（第４図）を得た。
第２段階 プラスミドpOS210をEcoR Iで消化し、BamH I−No.27
部位からEcoR I−No.33部位までのpSAM2のフラグメント
を含む7.25kbのフラグメントおよびプラスミドpBR329の
3.55kbのフラグメントBamH I−EcoR Iを単離し、それ自
身で閉環して、プラスミドpOS210A（第４図）を得た。
部位からEcoR I−No.33部位までのpSAM2のフラグメント
を含む7.25kbのフラグメントおよびプラスミドpBR329の
3.55kbのフラグメントBamH I−EcoR Iを単離し、それ自
身で閉環して、プラスミドpOS210A（第４図）を得た。
第３段階 プラスミドpIJ39は、ストレプトミセス・アズレウス
（azureus）の1.8kbのBamH Iフラグメントによってチオ
ストレプトンに対する抵抗性を与える遺伝子を含むプラ
スミドpBR322に対応する（Thompson C.J.;Ward J.M.;
Hopwood D.A.、Nature 286、525〜527頁、1980年）。
（azureus）の1.8kbのBamH Iフラグメントによってチオ
ストレプトンに対する抵抗性を与える遺伝子を含むプラ
スミドpBR322に対応する（Thompson C.J.;Ward J.M.;
Hopwood D.A.、Nature 286、525〜527頁、1980年）。
プラスミドpIJ39をBamH Iで消化し、チオストレプト
ンに対する抵抗性を有する1.8kbのフラグメントを単離
し、BamH Iで消化したpOS21OAと混合した（BamH IはpOS
21OAにおける特有な部位である）。
ンに対する抵抗性を有する1.8kbのフラグメントを単離
し、BamH Iで消化したpOS21OAと混合した（BamH IはpOS
21OAにおける特有な部位である）。
第４段階 プラスミドpTS52は２つのBamH I部位を含んでおり且
つ9.08kbの大きさを有する。このプラスミドをBamH Iで
部分的に消化し、9.08kbの線状プラスミドを単離した。
このプラスミドをポリメラーゼのクレノウ・フラグメン
トで処理し、次にそれ自身で閉環して、２つのBamH Iの
一方を除去した。
つ9.08kbの大きさを有する。このプラスミドをBamH Iで
部分的に消化し、9.08kbの線状プラスミドを単離した。
このプラスミドをポリメラーゼのクレノウ・フラグメン
トで処理し、次にそれ自身で閉環して、２つのBamH Iの
一方を除去した。
Sph I部位およびBcl I部位の間に位置する単一BamH I
部位を有するプラスミドpTS54を得た（第５図）。
部位を有するプラスミドpTS54を得た（第５図）。
第５段階 第７図に示された配列を有するポリリンカー二本鎖オ
リゴヌクレオチドを、「応用バイオシステム」装置で合
成した。
リゴヌクレオチドを、「応用バイオシステム」装置で合
成した。
BamH Iで消化したプラスミドpTS55をポリリンカー・
オリゴヌクレオチドと混合し、ファージT4からのリガー
ゼにより結合した。
オリゴヌクレオチドと混合し、ファージT4からのリガー
ゼにより結合した。
得られたプラスミドpTS55は第６図に示されている。
このプラスミドはクローン化に有用な次の独特な制限部
位を有している。即ち、Xba I、XhoI、Hind III、Kpn
I、Sac I、BamH IおよびSph I。
このプラスミドはクローン化に有用な次の独特な制限部
位を有している。即ち、Xba I、XhoI、Hind III、Kpn
I、Sac I、BamH IおよびSph I。
ベクターpTS55はアンピシリンに対する抵抗性を選択
することにより大腸菌内に保持することができる。
することにより大腸菌内に保持することができる。
制限酵素EcoR Iで消化することにより、プラスミドpB
R329を除去した。なぜならばこのプラスミドはストレプ
トミセスの染色体への組込みに対して必須のものではな
いからである。このようにして、ストレプトミセスのDN
Aのみを含むストレプトミセスの組込み形質転換物質を
得た。
R329を除去した。なぜならばこのプラスミドはストレプ
トミセスの染色体への組込みに対して必須のものではな
いからである。このようにして、ストレプトミセスのDN
Aのみを含むストレプトミセスの組込み形質転換物質を
得た。
このストレプトミセス形質転換物質は、抗生物質チオ
ストレプトンまたはノシヘプチド（Nosiheptide）に対
する抵抗性を付与するものである。
ストレプトンまたはノシヘプチド（Nosiheptide）に対
する抵抗性を付与するものである。
上記形質転換物質はpSAM2のフラグメントBamH I−Eco
R Iを有している。つぎに、Tth111−No.2の部位からBg
IIIおよびBamH Iの間に位置するプラスミドの組込み部
位までのヌクレオチド配列を得た（第２図参照）。この
配列は第３図に示されている。
R Iを有している。つぎに、Tth111−No.2の部位からBg
IIIおよびBamH Iの間に位置するプラスミドの組込み部
位までのヌクレオチド配列を得た（第２図参照）。この
配列は第３図に示されている。
＋1261部位から開始し＋97部位で終わるコード化相
は、染色体へのプラスミドの組込みに必要なインテグラ
ーゼに対応する。＋1448部位から開始し＋1247部位で終
わるコード化相は、xis遺伝子に対応する。
は、染色体へのプラスミドの組込みに必要なインテグラ
ーゼに対応する。＋1448部位から開始し＋1247部位で終
わるコード化相は、xis遺伝子に対応する。
＋24部位から開始し−24部位で終わる形成配列は、プ
ラスミド（att）の組込み部位に対応する。ヌクレオチ
ド位置０は付加部位の中央に対応する。このヌクレオチ
ド位置は、「実験の手引き」に述べられた技術に従っ
て、形質転換によりストレプトミセスに導入することが
できる。上記ヌクレオチド位置は特に次の株に組込まれ
る： ストレプトミセス・アンボファシエンス ストレプトミセス・リビダンスTK64および ストレプトミセス・グリセオフカス（griseofuscu
s）。
ラスミド（att）の組込み部位に対応する。ヌクレオチ
ド位置０は付加部位の中央に対応する。このヌクレオチ
ド位置は、「実験の手引き」に述べられた技術に従っ
て、形質転換によりストレプトミセスに導入することが
できる。上記ヌクレオチド位置は特に次の株に組込まれ
る： ストレプトミセス・アンボファシエンス ストレプトミセス・リビダンスTK64および ストレプトミセス・グリセオフカス（griseofuscu
s）。
上記ヌクレオチド位置はプラスミドに対する組込み部
位を有するあらゆる株に組込むことができる。この部位
は、第３図に述べられている＋24〜−24の位置までのヌ
クレオチド配列と同様な配列を有するもの、またはこの
ヌクレオチド配列をすべて、または部分的に含むものと
定義することができる。この部位は、S. antibioticu
s、 S. bikiniensis、S. parvulus、S. actuosus、
S. coelicolor、S. gluacescensにおける＋21の位置
から−18の位置までのプローブでのハイブリッド形成に
より検出された。
位を有するあらゆる株に組込むことができる。この部位
は、第３図に述べられている＋24〜−24の位置までのヌ
クレオチド配列と同様な配列を有するもの、またはこの
ヌクレオチド配列をすべて、または部分的に含むものと
定義することができる。この部位は、S. antibioticu
s、 S. bikiniensis、S. parvulus、S. actuosus、
S. coelicolor、S. gluacescensにおける＋21の位置
から−18の位置までのプローブでのハイブリッド形成に
より検出された。
このベクターによれば、染色体の特定の位置に遺伝子
を組込むことができる。従って、１つの細胞に１つのコ
ピーのみが存在し、組込みが非常に安定で、このため組
込まれた遺伝子を保持するために所定の圧力を加える必
要がない。
を組込むことができる。従って、１つの細胞に１つのコ
ピーのみが存在し、組込みが非常に安定で、このため組
込まれた遺伝子を保持するために所定の圧力を加える必
要がない。
実施例2:遊離ベクターpTS39の形成および性質 ａ）形成 ストレプトミセス・アンボファシエンスJI3212由来の
プラスミドpSAM2をEcoR Iで部分的に消化し、11kbの直
線状プラスミドを単離し、プラスミドpIJ39（上記に説
明されている）のEcoR I部位においてクローン化した。
得られたプラスミドpTS39は、プラスミドpSAM2からEcoR
I−No.22の部位にクローン化したプラスミドpIJ39を含
む（制限地図pSAM2、第１図）。
プラスミドpSAM2をEcoR Iで部分的に消化し、11kbの直
線状プラスミドを単離し、プラスミドpIJ39（上記に説
明されている）のEcoR I部位においてクローン化した。
得られたプラスミドpTS39は、プラスミドpSAM2からEcoR
I−No.22の部位にクローン化したプラスミドpIJ39を含
む（制限地図pSAM2、第１図）。
ｂ）性質 上記プラスミドは形質転換によりストレプトミセスの
異なる株に導入することができ、この場合、上記プラス
ミドは遊離の状態に保持され、且つチオストレプトンお
よびノシヘプチドに対する抵抗性を付与することにより
組込まれる。上記プラスミドは多くのホストに組込むこ
とができるベクターである。コピーの数は１つのゲノム
につき５〜20コピーである。
異なる株に導入することができ、この場合、上記プラス
ミドは遊離の状態に保持され、且つチオストレプトンお
よびノシヘプチドに対する抵抗性を付与することにより
組込まれる。上記プラスミドは多くのホストに組込むこ
とができるベクターである。コピーの数は１つのゲノム
につき５〜20コピーである。
実施例3:ベクターpOS11の形成および性質 第１段階 pOS7プラスミドについてはJ.M. Simonet等の論文、1
987年、137〜144頁に述べられている。pSAM2（第１図）
の0.88kb（BamH I−No.15〜21）および1.01kb（BamH I
−No.21〜27）の２つのフラグメントBamH Iを切除し、
且つチオストレプトンおよびノシヘプチドに対する抵抗
性を付与するストレプトミセス・アズレウスの1.79kbの
BamH Iフラグメントと置換した。
987年、137〜144頁に述べられている。pSAM2（第１図）
の0.88kb（BamH I−No.15〜21）および1.01kb（BamH I
−No.21〜27）の２つのフラグメントBamH Iを切除し、
且つチオストレプトンおよびノシヘプチドに対する抵抗
性を付与するストレプトミセス・アズレウスの1.79kbの
BamH Iフラグメントと置換した。
プラスミドpOS7およびプラスミドpBBR322をEcoR Iで
消化し、混合し、結合した。この結果プラスミドpOS11
を得た。このプラスミドはpSAM2のEcoR I−No.33の部位
にクローン化したpBR322を含んでいる。
消化し、混合し、結合した。この結果プラスミドpOS11
を得た。このプラスミドはpSAM2のEcoR I−No.33の部位
にクローン化したpBR322を含んでいる。
第２段階 通常の方法に従って形質変換することにより、上記プ
ラスミドをストレプトミセス・リビダンスに導入し、こ
の場合、上記プラスミドはチオストレプトンおよびノシ
ヘプチドに対する抵抗性を付与する。
ラスミドをストレプトミセス・リビダンスに導入し、こ
の場合、上記プラスミドはチオストレプトンおよびノシ
ヘプチドに対する抵抗性を付与する。
ストレプトミセス・リビダンスの転移クローンから、
プラスミドpTS11（第８図）を抽出した。
プラスミドpTS11（第８図）を抽出した。
このプラスミドはもはやプラスミドpBR322を含んでお
らず、且つこのプラスミドからpSAM2のNo.33の部位に位
置する塩基の600対を切除した。Pvu II−No.1部位およ
びApal−No.1ビス部位は消失した（pSAM2の制限地図、
第１図参照）。
らず、且つこのプラスミドからpSAM2のNo.33の部位に位
置する塩基の600対を切除した。Pvu II−No.1部位およ
びApal−No.1ビス部位は消失した（pSAM2の制限地図、
第１図参照）。
第３段階 pTS11プラスミド（第10図）をBgl IIで部分的に消化
し、10.3kbの大きさを有するプラスミドを線状にした。
プラスミドの大きさを有するこの線状分子を単離した。
し、10.3kbの大きさを有するプラスミドを線状にした。
プラスミドの大きさを有するこの線状分子を単離した。
第10図に示されている配列を有するポリリンカー・オ
リゴヌクレオチドを合成した。
リゴヌクレオチドを合成した。
この合成物をpTS11のフラグメントBg1 IIと混合し、
結合した。Bgl II−No.14に挿入したオリゴヌクレオチ
ドを有する形成プラスミドをpTS12と呼び（第11図）、
且つBg1 II−No.28部位に挿入したオリゴヌクレオチド
を有する形成プラスミドをpTS13と呼ぶ（第12図）。
結合した。Bgl II−No.14に挿入したオリゴヌクレオチ
ドを有する形成プラスミドをpTS12と呼び（第11図）、
且つBg1 II−No.28部位に挿入したオリゴヌクレオチド
を有する形成プラスミドをpTS13と呼ぶ（第12図）。
同様の方法で、チオストレプチドの抵抗性遺伝子を有
する1.79kbのフラグメントBamH Iに接するBamH I部位
に、ポリリンカーを挿入することが可能である。
する1.79kbのフラグメントBamH Iに接するBamH I部位
に、ポリリンカーを挿入することが可能である。
得られたベクターの性質は次の通りである： pSAM2のEcoR I−No.33部位の各側の切除により形成さ
れたこれらベクターは、多量のコピーを形成する。なぜ
ならばこれらベクターはストレプトミセス、特にストレ
プト・リビダンスTK64に導入されているからである。コ
ピーの数は１つのゲノムにつき100以上である。
れたこれらベクターは、多量のコピーを形成する。なぜ
ならばこれらベクターはストレプトミセス、特にストレ
プト・リビダンスTK64に導入されているからである。コ
ピーの数は１つのゲノムにつき100以上である。
これらベクターはチオストレプトンに対する抵抗性を
付与し、クローン化部位Hind III、Pst I、Sph I、Xba
I、Xho IおよびEcoR Iを有する。
付与し、クローン化部位Hind III、Pst I、Sph I、Xba
I、Xho IおよびEcoR Iを有する。
ベクターpTS13は染色体に組込み不可能であり、且つ
唯一の複製開始部位を有する。
唯一の複製開始部位を有する。
ベクターpTS12はもはや転移するこができず、且つも
はや接合不可能である。
はや接合不可能である。
この切除部分を含むpSAM2から誘導されたベクター
は、約10コピーから100コピー以上を形成する。
は、約10コピーから100コピー以上を形成する。
実施例4:プラスミドpSAM2の組込み誘導体を使用するス
トレプトミセス・リモサス（limosus）のアルファ−ア
ミラーゼ遺伝子の発現形成法 抗生物質スペクチノマイシン（PrentkiおよびKirsh、
Gene29、303〜312頁、1984年）に対する抵抗性を付与す
るオメガ・インターポソン（Omega interposon）を、
第４図のプラスミドpOS210のEcoR I部位に挿入した。ス
トレプトミセス・リモサスのアルファ−アミラーゼの構
造遺伝子を有するフラグメント並びにプロモーター配列
（Long等、Jounal of bacteriology、169、5745〜575
4頁、1987年）（この遺伝子はCetus Companyの特許で
ある）を、得られたプラスミドのBamH I部位に挿入し
た。次に、組換えプラスミドを形成転換によりストレプ
トミセス・リビダンスに導入した。抗生物質スペクチノ
マイシンに対する抵抗性を与えるために選ばれた上記形
成形質変換物質は、非常に安定で、且つ組換えプラスミ
ドを組込み状態に保持するための所定圧力を必要とする
ことなしに、アルファーアミラーゼを生成する。
トレプトミセス・リモサス（limosus）のアルファ−ア
ミラーゼ遺伝子の発現形成法 抗生物質スペクチノマイシン（PrentkiおよびKirsh、
Gene29、303〜312頁、1984年）に対する抵抗性を付与す
るオメガ・インターポソン（Omega interposon）を、
第４図のプラスミドpOS210のEcoR I部位に挿入した。ス
トレプトミセス・リモサスのアルファ−アミラーゼの構
造遺伝子を有するフラグメント並びにプロモーター配列
（Long等、Jounal of bacteriology、169、5745〜575
4頁、1987年）（この遺伝子はCetus Companyの特許で
ある）を、得られたプラスミドのBamH I部位に挿入し
た。次に、組換えプラスミドを形成転換によりストレプ
トミセス・リビダンスに導入した。抗生物質スペクチノ
マイシンに対する抵抗性を与えるために選ばれた上記形
成形質変換物質は、非常に安定で、且つ組換えプラスミ
ドを組込み状態に保持するための所定圧力を必要とする
ことなしに、アルファーアミラーゼを生成する。
文献目録 （１） Batlz R.H.、Seno E.T.、Stonesifer J.お
よびWild G.M.共著、「Biosynthesis of the macro
lide antibiotic tylosin ａ preferred pathway
from tylactone to tylosin」、J. of Antibiot
ics、36巻、２号、131〜141頁、1983年。
よびWild G.M.共著、「Biosynthesis of the macro
lide antibiotic tylosin ａ preferred pathway
from tylactone to tylosin」、J. of Antibiot
ics、36巻、２号、131〜141頁、1983年。
（２） Cox K.L.、Balts R.H.共著、「Restriction
of Bacteriophage plaque formation in Strept
omyces ssp.」、J.Bact.、159巻、1984年。
of Bacteriophage plaque formation in Strept
omyces ssp.」、J.Bact.、159巻、1984年。
（３） Gray G.、Seltzer G.、Buell G.、Shaw
P.、Escanes S.、Hofer S.、Voegeli P.およびThomp
son C.J.、「Synthesis of bovine growth by St
reptomyces lividans］、Gene、1124巻、21〜30頁、19
84年。
P.、Escanes S.、Hofer S.、Voegeli P.およびThomp
son C.J.、「Synthesis of bovine growth by St
reptomyces lividans］、Gene、1124巻、21〜30頁、19
84年。
（４） Kuhstoss S.およびNagaraja Rao R.共著、
「Expression in Streptomyces ambofaciens of a
n Escherichia coli Ｋ−12 gene which confers
resistance to hygromycin」、B. Gene、26巻、29
5〜299頁、1983年。
「Expression in Streptomyces ambofaciens of a
n Escherichia coli Ｋ−12 gene which confers
resistance to hygromycin」、B. Gene、26巻、29
5〜299頁、1983年。
（５） Matsushima P.およびBaltz R.H.共著、「Eff
icientplasmid transformation of Streptomyces a
mbofaciens and Streptomycesfradiae protoplast
s」、J. Bact、163巻、180〜185頁、1985年。
icientplasmid transformation of Streptomyces a
mbofaciens and Streptomycesfradiae protoplast
s」、J. Bact、163巻、180〜185頁、1985年。
（６） Omura S.、「Mecrolide Antibiotics:Chemis
try,Biology and Practice」、Academic Press、198
4年。
try,Biology and Practice」、Academic Press、198
4年。
（７） Covarrubias L.およびBolivar F.共著、「Co
nstruction and characterization of new clonin
g vehicles. VI. Plasmid pBR329、ａ new deriv
ative of pBR328 lacking the 482 base−pair
inverted dupication」、Gene17、79〜89頁、1982年。
nstruction and characterization of new clonin
g vehicles. VI. Plasmid pBR329、ａ new deriv
ative of pBR328 lacking the 482 base−pair
inverted dupication」、Gene17、79〜89頁、1982年。
第１図はプラスミドpSAM2の制限地図を示しており、制
限部位は１〜33の番号で表示され、最初がPvu II（No.
1）で、最後がEcoR I（No.33）である。 第２図は組込みに必要なpSAM2のフラグメントBamH I−E
coR Iの制限地図を示しており、このフラグメントはBam
H I−EcoR I部位で、BamH I−No.27部位からEcoR I−N
o.33部位に渡っている。 第３図（Ａ）はpSAM2のTth111−No.2および組込み部位a
ttの間の領域の配列を示す。なお、pSAM2の制限部位は
第２図に示されている。従って、第３図（Ｂ）はプラス
ミドpSAM2のヌクレオチド配列を示しており、この配列
はTth111−No.2の下流から組込み部位（att）までの70
ヌクレオチドより決定され、ヌクレオチド０はatt媒質
に対応する。 第４図はpTS53の形成工程を図示する。 第５図はベクターpTS53の制限地図を示す。 第６図は組込みベクターpTS55の制限地図を示す。 第７図はpTS55を形成するためにpTS54に導入するオリゴ
ヌクレオチドの配列を示す。 第８図はpTS11の形成工程を図示する。 第９図はpTS12およびpTS13を形成するためにpTS11に導
入するオリゴヌクレオチドの配列を示す。 第10図はpTS11の制限地図を示す。 第11図は多数コピー形成プラスミドpTS12の制限地図を
示す。 第12図はプラスミドpTS13の制限地図を示す。
限部位は１〜33の番号で表示され、最初がPvu II（No.
1）で、最後がEcoR I（No.33）である。 第２図は組込みに必要なpSAM2のフラグメントBamH I−E
coR Iの制限地図を示しており、このフラグメントはBam
H I−EcoR I部位で、BamH I−No.27部位からEcoR I−N
o.33部位に渡っている。 第３図（Ａ）はpSAM2のTth111−No.2および組込み部位a
ttの間の領域の配列を示す。なお、pSAM2の制限部位は
第２図に示されている。従って、第３図（Ｂ）はプラス
ミドpSAM2のヌクレオチド配列を示しており、この配列
はTth111−No.2の下流から組込み部位（att）までの70
ヌクレオチドより決定され、ヌクレオチド０はatt媒質
に対応する。 第４図はpTS53の形成工程を図示する。 第５図はベクターpTS53の制限地図を示す。 第６図は組込みベクターpTS55の制限地図を示す。 第７図はpTS55を形成するためにpTS54に導入するオリゴ
ヌクレオチドの配列を示す。 第８図はpTS11の形成工程を図示する。 第９図はpTS12およびpTS13を形成するためにpTS11に導
入するオリゴヌクレオチドの配列を示す。 第10図はpTS11の制限地図を示す。 第11図は多数コピー形成プラスミドpTS12の制限地図を
示す。 第12図はプラスミドpTS13の制限地図を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:465） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:465） (72)発明者 ミッセェル・ゲリネア フランス国75006 パリ，リュー・セン ト‐ジャーク 45 (56)参考文献 Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．198 （1984）Ｐ−35−41 Ｇｅｎｅ 59（1987）ｐ．137−144 Ｇｅｎｅ 19［１］（1982）ｐ．21− 32 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (11)
- 【請求項１】クローン化及び発現用ベクターとして必要
なフラグメントをpSAMより単離し、前記フラグメントを
他のプラスミドに挿入して製造されたクローン化および
発現用ベクターであり、且つ放線菌株における特定の蛋
白質のDNA配列のクローン化および発現用ベクターであ
って、基本的に TTCTCTGTCGGGGTGGCGGGATTTGAACCCACGACCTCTTCGTCCCGAA
の配列を有するatt付加配列と、 上記株における機能性int配列をコードするDNA配列と、 上記特定蛋白質をコードし、且つ上記株における上記配
列の発現を確実にする要素をコードするDNA配列とから
なり、 前記attおよびintフラグメントがpSAM2フラグメントか
ら誘導されるものであることを特徴とするベクター。 - 【請求項２】attおよびintフラグメントが、EcoR I−N
o.33の部位の各側の約600bpから切除したpSAM2フラグメ
ントから誘導される請求項１に記載のベクター。 - 【請求項３】上記切除部分が、２つの繰り返し配列間の
フラグメントを保有する請求項２に記載のベクター。 - 【請求項４】上記株における機能性転移要素をさらに含
む請求項１〜３のいずれかに記載のベクター。 - 【請求項５】染色体に組込まれているDNA配列の特定の
蛋白質を生成する放線菌株の製造方法において、上記DN
A配列がattおよびint以外の部位に挿入されている請求
項１〜４のいずれかのベクターにより上記株を形質転換
することから成る放線菌株の製造方法。 - 【請求項６】上記ベクターが非転移性であり、上記蛋白
質をコードする上記DNA配列が、上記転移要素をコード
する配列に挿入される請求項５記載の方法。 - 【請求項７】染色体に部分的に組込み可能なプラスミド
である請求項１〜４のいずれかのベクターに組込まれて
いるDNA配列の特定の蛋白質を生成する放線菌株の製造
方法において、上記DNA配列がint遺伝子に組込まれる放
線菌株の製造方法。 - 【請求項８】特定の蛋白質をコードする配列が、チオス
トレプトンに対する抵抗性をコードする配列である請求
項５〜７のいずれかに記載の方法。 - 【請求項９】請求項５〜８のいずれかに記載の方法を使
用することにより得られる放線菌株。 - 【請求項１０】ストレプトミセスの株である請求項９記
載の株。 - 【請求項１１】特定の蛋白質を製造する方法において、
請求項９および10の一方の株を適切な培地で発酵させ、
特定の蛋白質を回収することから成る方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8806638A FR2631634B1 (fr) | 1988-05-18 | 1988-05-18 | Vecteurs de clonage et d'expression dans une souche d'actinomycete, procede de transformation de cette souche, souche d'actynomycete obtenue et preparation de proteines |
| FR8806638 | 1988-05-18 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0269185A JPH0269185A (ja) | 1990-03-08 |
| JP2913406B2 true JP2913406B2 (ja) | 1999-06-28 |
Family
ID=9366396
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP1122704A Expired - Lifetime JP2913406B2 (ja) | 1988-05-18 | 1989-05-16 | 放線菌株におけるクローン化および発現ベクター，この株の形質転換方法，得られた放線菌株および蛋白質の製造方法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5688689A (ja) |
| EP (1) | EP0350341B1 (ja) |
| JP (1) | JP2913406B2 (ja) |
| AT (1) | ATE122399T1 (ja) |
| CA (1) | CA1340746C (ja) |
| DE (1) | DE68922533T2 (ja) |
| ES (1) | ES2073451T3 (ja) |
| FR (1) | FR2631634B1 (ja) |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2713658B1 (fr) * | 1993-12-08 | 1996-04-12 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Séquences d'acides nucléiques régulatrices et utilisations. |
| US6825012B2 (en) | 1995-02-23 | 2004-11-30 | Gencell S.A. | DNA molecules, preparation and use in gene therapy |
| FR2731014B1 (fr) * | 1995-02-23 | 1997-03-28 | Rhone Poulenc Rorer Sa | Molecules d'adn, preparation et utilisation en therapie genique |
| US7255989B1 (en) | 1999-11-29 | 2007-08-14 | Aventis Pharma S.A. | Method for obtaining nucleic acids from an environment sample, resulting nucleic acids and use in synthesis of novel compounds |
| US6861513B2 (en) | 2000-01-12 | 2005-03-01 | Schering Corporation | Everninomicin biosynthetic genes |
| WO2001087936A2 (en) * | 2000-05-17 | 2001-11-22 | Schering Corporation | Isolation of micromonospora carbonacea var africana pmlp1 integrase and use of integrating function for site-specific integration into micromonospora halophitica and micromonospora carbonacea chromosome |
| FR2921663A1 (fr) | 2007-10-02 | 2009-04-03 | Bluestar Silicones France Soc | Polyorganosiloxanes a fonction piperidine depourvus de toxicite par contact cutane et utilisation de ces derniers dans des compositions cosmetiques |
| DE102011118018B4 (de) | 2011-10-25 | 2017-10-26 | Plasmidfactory Gmbh & Co. Kg | Minicircles mit Transpositionskassetten und ihre Verwendung zur Transformation von Zellen |
| DE102013220859B4 (de) | 2013-10-15 | 2016-09-08 | Plasmidfactory Gmbh & Co. Kg | Minicircles mit viralen Expressionskassetten und ihre Verwendung zur Transformation von Zellen zur Erzeugung rekombinanter Viren oder viraler Genvektoren |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4743546A (en) * | 1985-02-13 | 1988-05-10 | Biotechnica International, Inc. | Controlled gene excision |
| DE3751631T2 (de) * | 1986-02-28 | 1996-05-02 | Smithkline Beecham Corp | Das Streptomyces-Gal-Operon |
| DE3614310A1 (de) * | 1986-04-28 | 1987-10-29 | Hoechst Ag | Verfahren zur isolierung mutierter gene sowie der entsprechenden wildtyp-gene |
-
1988
- 1988-05-18 FR FR8806638A patent/FR2631634B1/fr not_active Expired - Lifetime
-
1989
- 1989-05-15 CA CA000599737A patent/CA1340746C/fr not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-16 ES ES89401347T patent/ES2073451T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-16 EP EP89401347A patent/EP0350341B1/fr not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-16 JP JP1122704A patent/JP2913406B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-05-16 AT AT89401347T patent/ATE122399T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-05-16 DE DE68922533T patent/DE68922533T2/de not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-07 US US08/477,502 patent/US5688689A/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| Ｇｅｎｅ １９［１］（１９８２）ｐ．２１−３２ |
| Ｇｅｎｅ ５９（１９８７）ｐ．１３７−１４４ |
| Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１９８（１９８４）Ｐ−３５−４１ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DE68922533T2 (de) | 1995-10-19 |
| ATE122399T1 (de) | 1995-05-15 |
| FR2631634A1 (fr) | 1989-11-24 |
| DE68922533D1 (de) | 1995-06-14 |
| ES2073451T3 (es) | 1995-08-16 |
| EP0350341A1 (fr) | 1990-01-10 |
| JPH0269185A (ja) | 1990-03-08 |
| EP0350341B1 (fr) | 1995-05-10 |
| US5688689A (en) | 1997-11-18 |
| FR2631634B1 (fr) | 1991-06-14 |
| CA1340746C (fr) | 1999-09-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5102797A (en) | Introduction of heterologous genes into bacteria using transposon flanked expression cassette and a binary vector system | |
| Priebe et al. | Region of the streptococcal plasmid pMV158 required for conjugative mobilization | |
| US5622866A (en) | Expression cassettes useful in construction of integrative and replicative expression vectors for Streptomyces | |
| JP3162707B2 (ja) | 細菌ゲノムにおけるｄｎａの安定な組込み | |
| Motamedi et al. | Integrative vectors for heterologous gene expression in Streptomyces spp. | |
| Janssen et al. | Unusual transcriptional and translational features of the aminoglycoside phosphotransferase gene (aph) from Streptomyces fradiae. | |
| Brünker et al. | Genetic engineering of an industrial strain of Saccharopolyspora erythraea for stable expression of the Vitreoscilla haemoglobin gene (vhb) | |
| Horinouchi et al. | Construction and application of a promoter-probe plasmid that allows chromogenic identification in Streptomyces lividans | |
| JP2913406B2 (ja) | 放線菌株におけるクローン化および発現ベクター，この株の形質転換方法，得られた放線菌株および蛋白質の製造方法 | |
| Oultram et al. | Conjugal transfer of a small plasmid from Bacillus subtilis to Clostridium acetobutylicum by cointegrate formation with plasmid pAMβ1 | |
| Omer et al. | Site-specific insertion of biologically functional adventitious genes into the Streptomyces lividans chromosome | |
| EP0187630B1 (en) | Cloned streptomyces beta-galactosidase promoter fragment | |
| EP0468217A2 (en) | A bifunctional cosmid useful for cloning actinomycete DNA | |
| Neesen et al. | Construction and shuttling of novel bifunctional vectors for Streptomyces spp. and Escherichia coli | |
| Schupp et al. | Expression of a neomycin phosphotransferase gene from Streptomyces fradiae in Escherichia coli after interplasmidic recombination | |
| JP2984239B2 (ja) | ストレプトマイセスｇａｌオペロン | |
| AU686707B2 (en) | Regulatory nucleic acid sequences and uses thereof | |
| Roberts et al. | Transformation of Arthrobacter and studies on the transcription of the Arthrobacter ermA gene in Streptomyces lividans and Escherichia coli | |
| Margolin et al. | Isolation and characterization of a DNA replication origin from the 1,700-kilobase-pair symbiotic megaplasmid pSym-b of Rhizobium meliloti | |
| EP0288200A1 (en) | Spiramycin resistance-conferring cloning vectors | |
| JP3946300B2 (ja) | ビフィズス菌用シャトルベクター及びビフィズス菌プラスミドの複製タンパク質遺伝子 | |
| EP1652929A1 (en) | Plasmids for gene transfer by bacterial conjugation | |
| US4859601A (en) | Streptomyces Bgl protein gene promoter | |
| US4865982A (en) | Cloned streptomycete gene | |
| AU647471B2 (en) | Heterologous promoter systems |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080416 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080416 Year of fee payment: 9 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090416 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090416 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090416 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090416 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090416 Year of fee payment: 10 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100416 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100416 Year of fee payment: 11 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100416 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100416 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20100416 Year of fee payment: 11 |