ES2229286T3

ES2229286T3 - Cesion prolongada de gm-csf.

Info

Publication number: ES2229286T3
Application number: ES96936356T
Authority: ES
Inventors: Wayne Gombotz; Dean Pettit; Susan Pankey; James Ronald Lawter; W. James Huang
Original assignee: Schering AG; Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Current assignee: Bayer Pharma AG; Wyeth Holdings LLC; Wyeth LLC
Priority date: 1995-10-12
Filing date: 1996-10-10
Publication date: 2005-04-16
Anticipated expiration: 2016-10-10
Also published as: JPH11513667A; US6274175B1; JP2007308500A; DK0859601T3; WO1997013502A2; AU7438496A; AU714074B2; ATE275941T1; EP0859601B1; PT859601E; DE69633399D1; EP1350518A1; EP0859601A2; WO1997013502A3; US6120807A; DE69633399T2; US5942253A

Abstract

SE HAN DESARROLLADO FORMULACIONES PARA LA LIBERACION CONTROLADA Y PROLONGADA DE GM-CSF. ESTAS FORMULACIONES ESTAN BASADAS EN MICROPARTICULAS SOLIDAS FORMADAS POR LA COMBINACION DE POLIMEROS SINTETICOS Y BIODEGRADABLES COMO EL ACIDO POLILACTICO (PLA), EL ACIDO POLIGLICOLICO (PGA) Y COPOLIMEROS DE ESTOS CON EXCIPIENTES Y CARGAS FARMACOLOGICAS QUE PROPORCIONAN UNA LIBERACION DE ORDEN CERO O DE PRIMER ORDEN, O UNA LIBERACION MULTIFASICA EN UN PERIODO APROXIMADO DE 3 A 21 DIAS, PREFERIBLEMENTE UNA SEMANA, AL ADMINISTRARLAS EN INYECCION. EN LA PRESENTACION PREFERIDA, LAS MICROPARTICULAS SON MICROESFERAS CON DIAMETROS DE ENTRE 10 Y 60 MICRAS, FORMADAS POR UNA MEZCLA DE PLGA CON DIFERENTES PESOS MOLECULARES, PREFERIBLEMENTE 6.000, 30.000 Y 41.000. SE HAN DESARROLLADO OTRAS PRESENTACIONES PARA MODIFICAR LA CINETICA DE LIBERACION O EL MODO DE DISTRIBUCION DEL FARMACO IN VIVO. POR EJEMPLO, EN ALGUNOS CASOS SE SELECCIONA UN POLIMERO QUE PRODUCE UNA LIGERA REACCION INFLAMATORIA, EL PLGA Y LOS POLIANHIDRUROS PUEDEN ACTUAR COMO ATRAYENTE QUIMICO, DEBIDO AL POLIMERO MISMO O A CONTAMINANTES MENORES DEL POLIMERO, O POLIMEROS BIOADHERENTES EMPLEADOS PARA LA LIBERACION TRANSMUCOSA U ORAL. EN OTRA PRESENTACION SE ADMINISTRA GM-CSF EN HIDROGEL QUE SE PUEDE INYECTAR SUBCUTANEAMENTE O EN UNA ZONA ESPECIFICA PARA SU LIBERACION CONTROLADA. LAS MICROPARTICULAS O EL HIDROGEL SE ADMINISTRAN AL PACIENTE EN UNA CANTIDAD QUE SEA EFICAZ PARA ESTIMULAR LA PROLIFERACION DE CELULAS HEMATOPOYETICAS, ESPECIALMENTE LEUCOCITOS.

Description

Cesión prolongada de GM-CSF.

La presente invención se encuentra comprendida, en general, en el campo de formulaciones de microesferas de cesión prolongada, regulada, de factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos humanos, recombinante (GM-CSF).

El factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos, GM-CSF, es un factor de crecimiento hematopoyético que favorece la proliferación y diferenciación de células progenitorias hematopoyéticas. El gen de GM-CSF clonado ha sido expresado en células de bacterias, levaduras y mamíferos. La proteína endógena humana es una glicoproteína monómera con un peso molecular de 22.000 daltons, aproximadamente. El GM-CSF producido en un sistema de expresión en levadura es obtenible comercialmente como Leukine® de Immunex Corporation, Seattle, Washington. Es una glicoproteína de 127 aminoácidos caracterizada por tres especies moleculares primarias que poseen masas moleculares de 19.500, 16.800 y 15.500 daltons.

En general el GM-CSF se administra durante un período de tiempo de 6 a 6 días, por lo menos, con objeto de obtener el efecto óptimo sobre los glóbulos blancos de la sangre. En algunas circunstancias es deseable disponer de una formulación que proporcione una cesión continua de GM-CSF de una cinética de orden cero o de primer orden a lo largo de un período de una semana aproximadamente. Además, una formulación de GM-CSF de cesión prolongada puede tener una utilidad terapéutica ventajosa puesta de manifiesto por las formulaciones líquidas estándar. No obstante, no se dispone actualmente de formulaciones de GM-CSF de cesión prolongada.

Formulaciones de cesión prolongada son bien conocidas para la liberación de sustancias medicamentosas. Polímeros tanto biodegradables como no biodegradables han sido usados para formar microcápsulas, microesferas o micropartículas de diversos diámetros, porosidades y cargas de fármacos con el objeto de obtener cesión del fármaco encapsulado a lo largo de un período de tiempo. Muchas formulaciones que han sido desarrolladas han estado destinadas a la administración por inyección, aun cuando la mayoría de las formulaciones de cesión controlada poseen revestimientos entéricos o son formulaciones que resisten al paso a través del tracto gastrointestinal, que han sido desarrolladas para administrar por vía oral.

Es difícil conseguir una cesión controlada, lineal, usando las formulaciones estándar. La mayor parte de las formulaciones están ideadas o bien para proporcionar una cesión muy rápida por difusión y/o degradación del polímero que forma la micropartícula, o proporcionar una cesión repentina seguida de algún tipo de cesión lineal que generalmente se estabiliza al cabo de un cierto período de tiempo. La patente de EE.UU. No. 5.192.741 otorgada a Orsolini et al., es representativa de la bibliografía concerniente a las dificultades de obtener una cesión controlada partiendo de microesferas formadas por poli(lactidas-co-glicolidas) (PLGAs)- Similarmente, Lu y Park, J. Pharm. Sci. Technical 49, 13-19 (1995), describen el uso de microcápsulas, indicando que no pueden obtenerse buenas características de cesión con microesferas y que la estabilidad de proteínas en las microesferas constituye un problema. Dado que el GM-CSF es un compuesto sumamente potente en el que el efecto puede variar ampliamente dependiendo de la dosis administrada, puede ser ventajoso en algunos casos obtener una cesión más lineal en vez de una cesión repentina seguida de una estabilización del fármaco liberado.

Son representativas de las muchas patentes que se refieren a cesión controlada la patente de EE.UU. No. 4.767.628 otorgada a Hutchinson que describe la cesión multifásica de un péptido desde un vehículo de PLGA. Se usan mezclas de polímeros en un sistema de cesión de matriz grande para evitar la cesión multifásica. La Patente de EE.UU. No. 4.897.268 otorgada a Tica et al., describe el uso de PLGAs diferentes en la misma composición, pero mezclas de microesferas hechas con PLGAs diferentes para conseguir una cesión lineal. La patente de EE.UU. No. 4.849.228 otorgada a Yamamoto et al., reivindica microesferas de PLGA que tienen un contenido muy bajo de ácidos monobásicos que, según se afirma, poseen características excelentes de cesión. El documento PCT WO 94/01133 de Schering Corporation describe microesferas de GM-CSF preparadas usando diversos polímeros tales como polianhídridos, polifosfazenos y colágeno. El documento PCT WO 91/12882 de Medgenix Group S.A. describe microesferas para la cesión controlada de sustancias solubles en agua preparadas usando polímeros tales como poli(ácido láctico-co-glicólico). El documento PCT WO 95/06077 de Sandoz Patent GMBH describe matrices poliméricas que incluyen poli(carbonato de etileno) y composiciones farmacéuticas obtenidas a partir de las matrices poliméricas. El documento DE 44 06 172 A1 de Schwarz AG describe poliésteres ramificados con pesos moleculares de hasta 500.000 preparados a partir de polioles sustituidos con electrólitos y poli(hidroxiácidos).

Por consiguiente, es un objeto de la presente invención proporcionar una formulación de encapsulación de GM-CSF que proporciona cesión prolongada, controlada, con cinética de cesión orden cero o cinética de cesión de primer orden, o cinética de cesión múltiple, a lo largo de un período de tiempo mayor que un día después de administrar a un paciente mediante inyección.

Es otro objeto de la presente invención proporcionar una formulación para la cesión de GM-CSF para administrar por vía oral, transmucosal, tópica o mediante inyección.

Sumario de la invención

Han sido desarrolladas formulaciones de GM-CSF para cesión prolongada, controlada. Estas formulaciones se basan en micropartículas sólidas formadas con la combinación de polímeros sintéticos biodegradables tales como poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA) y sus copolímeros, con excipientes y cargas de sustancias medicamentosas que proporcionan una cesión prolongada a lo largo de un período desde un día hasta una semana por lo menos, cuando se administran por vía oral, transmucosal, tópica o mediante inyección. En la realización preferida las micropartículas poseen diámetros diferentes dependiendo de su vía de administración. Las micropartículas administradas mediante inyección poseen diámetros lo suficientemente pequeños para pasar a través de una aguja, en un tamaño que varía entre 10 y 100 micrómetros. Las micropartículas administradas por vía oral tienen un diámetro menor que 10 micrómetros para facilitar la captación por los parches de Peyer en el intestino delgado.

Se han desarrollado otras realizaciones para alterar la cinética de la cesión o el modo en que el fármaco es distribuido in vivo. Por ejemplo, en algunos casos se selecciona un polímero que ocasiona una reacción inflamatoria suave, por ejemplo, PLGA y polianhídridos, que puede actuar como quimioatractivo debido o bien al propio polímero o a contaminantes menores existentes en el polímero. En otra realización el GM-CSF se administra en un hidrogel que puede ser inyectado por vía subcutánea o en un sitio específico para obtener cesión controlada.

Las micropartículas o el hidrogel se administran al paciente en una cantidad eficaz para estimular la proliferación de células hematopoyéticas, en especial glóbulos blancos. Éstas son, lo más preferible, microesferas administradas mediante inyección. Hay ejemplos que demuestran la preparación de micropartículas que liberan el GM-CSF durante un período de tiempo prolongado, con cinética de cesión de orden cero, de primer orden o multifásica, El tipo de cinética de cesión se determina por la aplicación clínica particular. Los resultados obtenidos demuestran que es posible no solamente conseguir las características de cesión deseadas, sino también retener niveles sumamente altos de bioactividad del GM-CSF encapsulado. Ejemplos demuestran también la cesión a partir de hidrogeles.

Descripción breve de los dibujos

La Figura 1 A es una gráfica de cesión de GM-CSF que representa la cesión acumulativa media en tanto por ciento, in vitro, respecto al tiempo (días) para una carga de 1% (cuadrados) y una carga de 3% (rombos) de microesferas preparadas mediante separación de fases, con un copolímero único de PLGA. La Figura 1B es una gráfica de cesión de GM-CSF, que representa la cesión acumulativa media en tanto por ciento, in vitro, respecto al tiempo (días) para una carga de 1,54% (cuadrados, lote B4), una carga de 1,28% (rombos, lote O4) y una carga de 1,5%, lote V4), de microesferas preparadas mediante separación de fases usando una mezcla de polímeros de PLA y PLGA.

La Figura 2 A es una gráfica de cinética de cesión, in vitro, para microesferas del "Lote O" preparadas por separación de fases de un PLGA de peso molecular único, que muestra la cesión de GM-CSF como cesión acumulativa en tanto por ciento, in vitro, respecto al tiempo (días). La Figura 2 B es una gráfica de niveles de GM-CSF en el suero de ratón (ng/ml) respecto al tiempo (días) después de inyecciones de microesferas o bolos, para microesferas de 50 mg, bolos de 500 \mug y bolos de 50 \mug. La Figura 2 C es una gráfica de los niveles de GM-CSF después de la inyección de microesferas (rombos) frente a niveles calculados de la velocidad de cesión, in vitro, y semivida experimental (línea).

La Figura 3 A es una gráfica de cesión de GM-CSF, que representa la cesión acumulativa media en tanto por ciento, in vitro, respecto al tiempo (días) para las microesferas V4 preparadas por separación de fases usando una mezcla de dos PLGAs de pesos moleculares diferentes y un PLA. La Figura 3 B es una gráfica de bioactividad de TF-1 de muestras de cesión del lote V4, actividad en puntos de tiempo discretos (días). La Figura 3 C son gráficas de los recuentos de glóbulos blancos (WBC), recuentos de neutrófilos absolutos (ANC), y recuentos de plaquetas en primates inyectados con microesferas que contienen GM-CSF, en función del tiempo (días).

La Figura 4 es una gráfica de cesión del GM-CSF a partir de un gel de PLGA que significa la cesión acumulativa en tanto por ciento respecto al tiempo (días).

La Figura 5 es una gráfica de actividad de células T-1 de GM-CSF extraído de microesferas de PLGA con ácido acético, que representa la actividad en tanto por ciento frente al lote de microesferas.

La Figura 6 es una gráfica de la degradación de PLGA a lo largo del tiempo, de tres tipos de microesferas preparadas a partir de o bien PLGA (Cytec 0,7 V.I.), PLA (R104) o una mezcla 80/20 de los dos polímeros, que representa el peso molecular medio ponderal respecto al tiempo (días).

Descripción detallada de la invención

Existen muchas ventajas de una formulación de GM-CSF de cesión controlada. Entre estas ventajas se encuentra la conveniencia de una inyección única, para el paciente y el médico, la evitación de picos y valles en la concentración sistémica de GM-CSF asociada con las inyecciones repetidas, el potencial para reducir la dosificación de GM-CSF y el potencial de intensificar los efectos farmacológicos del GM-CSF. Una formulación de GM-CSF de cesión controlada proporciona también la oportunidad de usar el GM-CSF de un modo no explotado anteriormente, tal como un adyuvante de vacunas.

Formulaciones de cesión controlada

Tal como se emplea en esta memoria, la cesión o liberación "prolongada" o "extendida" del GM-CSF puede ser continua o discontinua, lineal o no lineal. Esto puede ser conseguido usando uno o más tipos de composiciones de polímeros, cargas de sustancia medicamentos, inclusión de excipientes o intensificadores de la degradación u otros modificadores, administrados solos, en combinación o secuencialmente, para producir el efecto deseado. La cesión de orden cero o lineal se explica, en general, significando que la cantidad de GM-CSF liberada a lo largo del tiempo permanece relativamente constante en función de la cantidad/tiempo unitario durante el marco de tiempo deseado, por ejemplo, seis a siete días. Multifásico se interpreta, en general, significando que la cesión tiene lugar en más de una "explosión".

Tal como se emplea en esta memoria, "micropartículas" hace referencia a partículas que tienen un diámetro menor de un mm, más típicamente menor de 100 micrómetros. Micropartículas puede referirse a microesferas que son micropartículas esféricas sólidas y microcápsulas que son micropartículas esféricas que tienen un núcleo de un polímero, fárrmaco o composición diferente. A menos que se indique de otro modo en esta memoria, micropartículas hace referencia a partículas sólidas, no a microcápsulas.

Polímeros para la formación de micropartículas

Muchos polímeros han sido usados para la cesión controlada de fármacos. Los polímeros son, típicamente, polímeros termoplásticos sintéticos tales como acetato de etilenovinilo y poli(ácido acrílico), que, en general, se consideran como no biodegradables dado que permanecen, relativamente, en la misma forma durante un período de tiempo de dos o tres años por lo menos después de su implantación en el cuerpo, y polímeros biodegradables, tales como los poli(hidroxiácidos) con inclusión de poliácido láctico, poliácido glicólico y sus copolímeros, polianhídridos, poliortoésteres y ciertos tipos de proteínas y polímeros de polisacáridos. El término bioerosionable o biodegradable, tal como se emplea en esta memoria, significa un polímero que se disuelve o que se degrada dentro de un período de tiempo que es aceptable en la aplicación deseada (habitualmente terapia in vivo), menor que cinco años aproximadamente y, lo más preferible, menor que aproximadamente un año, una vez expuesto a una solución fisiológica de pH 6-8, a una temperatura de entre 25ºC y 38ºC aproximadamente.

Un material polímero preferido es uno que es biodegradable y que retiene la forma suficiente para controlar la cesión durante un período de tiempo después de la implantación de seis a siete días, por lo menos. Los poli(hidroxiácidos), en especial el poli(ácido láctico-co-ácido glicólico) ("PLGA") es un polímero particularmente preferido ya que ha sido usado en la fabricación de suturas degradables durante varias décadas. El polímero se degrada por hidrólisis después de exponer al medio acuoso del cuerpo. El polímero se hidroliza produciendo monómeros de ácido láctico y de ácido glicólico, que son subproductos normales del metabolismo celular. La velocidad de desintegración puede variar desde varias semanas hasta periodos superiores a un año, dependiendo de factores diversos que incluyen el peso molecular del polímero, la relación de monómeros de lactida a glicolida en la cadena del polímero, y la estereorregularidad de las subunidades de monómero (las mezclas de estereoisómeros L y D quebranta la cristalinidad del polímero favoreciendo la rotura del polímero). Se obtienen resultados particularmente útiles mezclando PLGAs de pesos moleculares diferentes, y/o relaciones diferentes de lactida a glicolida. El peso molecular y las relaciones de monómeros pueden ser optimizadas para adaptar según se desee la cinética de cesión a lo largo de un período de tiempo definido. Los pesos moleculares superiores dan como resultado matrices de polímeros que retienen su integridad estructural durante períodos más largos, al tiempo que los pesos moleculares inferiores dan como resultado tanto cesiones más rápidas como vidas más cortas de la matriz.

En una realización preferida, descrita en esta memoria, las micropartículas contienen mezclas de al menos dos y más preferiblemente tres o más polímeros biodegradables, preferiblemente polímeros hidrolíticamente inestables y lo más preferible, poli(hidroxiácidos) de diferente peso molecular y/o diferente relación de monómeros. En una realización preferida se mezclas tres PLGAs de diferente peso molecular para formar una composición que proporciona cesión lineal a lo largo de un período de tiempo definido que varía desde un día al menos, hasta aproximadamente seis días. En una realización más preferida para obtener una cesión desde uno hasta veintiún días aproximadamente, los PLGAs poseen pesos moleculares entre 1000 y 20.000, más preferiblemente entre 5.000 y 10.000, entre 20.000 y 35.000, más preferiblemente entre 25.000 y 30.000, y entre 35.000 y 70.000. En la realización más preferida para obtener cesión a lo largo de un período de una semana aproximadamente, se combinan PLGAs que tienen pesos moleculares de aproximadamente 6.000, 30.000 y 41.000.

Los polímeros PLA se preparan habitualmente partiendo de los ésteres cíclicos de ácidos lácticos. Ambas formas L(+) y D(-) de ácido láctico pueden ser usadas para preparar los polímeros PLA, así como la mezcla ópticamente inactiva de ácido DL-láctico de D(-) y L(+). Métodos de preparación de polilactidas están bien documentados en la bibliografía de patentes. Las siguientes patentes de EE.UU. describen con detalle polilaactidas adecuadas, sus propiedades y su preparación: patentes de EE.UU. Nos. 1.995.970, otorgada a Dorough; 2.703.316 otorgada a Schneider; 2.758.987, otorgada a Salzberg; 2.951.828, otorgada a Zeile; 2.676.945, otorgada a Higgins; y 2.683.136; 3.531.561 a Trehu.

Dado que es deseable la cesión como diana del GM-CSF en glóbulos blancos, particularmente en el caso en que el GM-CSF se use como adyuvante, solo o en combinación con un antígeno, el polímero puede ser seleccionado basándose en propiedades distintas de las de justamente la cesión controlada. Por ejemplo, es sabido que ciertos polímeros son inflamatorios y por tanto atraen leucocitos, macrófagos y otros glóbulos "blancos". Los ejemplos de polímeros "quimioatractivos" incluyen poli(hidroxiácidos) (PL, PG, PLGAs), los polianhídridos, los poli(ortoésteres) y los polifosfazenos.

En el caso en que las micropartículas estén destinadas a cesión transmucosal u oral, puede ser deseable seleccionar polímeros que sean bioadhesivos. Como ejemplos de polímeros bioadhesivos se incluyen polímeros hidrófilos, en especial aquellos que contienen grupos carboxílicos, tales como poli(ácido acrílico). Son particularmente útiles los polímeros rápidamente bioerosionables tales como poli(lactida-co-glicolida), polianhídridos y poliortoésteres que poseen sobre la superficie externa grupos carboxílicos expuestos, ya que su superficie lisa se erosiona. Son polímeros naturales representativos proteínas tales como la zeína, la albúmina y el colágeno, y polisacáridos tales como la celulosa, los dextranos y el ácido algínico. Otros polímeros sintéticos representativos incluyen poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polialquilenglicoles, polióxidos de alquileno, politereftalatos de alquileno, polialcoholes vinílicos, poliésteres vinílicos, polihaluros de vinilo, polivinilpirrolidona, poliglicolidas, polisiloxanos, poliuretanos, celulosas, con inclusión de alquilcelulosa, hidroxialquilcelulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa y nitrocelulosas, polímeros de ésteres acrílicos y metacrílicos, poli(lactida-co-glicolida), mezclas de polianhídridos, poliortoésteres y sus copolímeros.

Polímeros para formación de hidrogeles

Otros materiales polímeros que pueden ser usados incluyen hidrogeles tales como polisacáridos naturales tales como alginatos, así como materiales de hidrogeles sintéticos tales como algunos de los poliácidos acrílicos, polifosfazenos, copolímeros de polietilenglicol-PLGA y otros polímeros sintéticos biodegradables que absorben hasta el 90% del peso final de agua.

El material polimérico que se mezcla con el GM-CSF para su implantación en el cuerpo debe formar un hidrogel. Un hidrogel se define como una sustancia formada cuando un polímero orgánico (natural o sintético) es reticulado por medio de enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno, creando un estructura de retículo abierto, tridimensional, que retiene moléculas de agua formando un gel. Como ejemplos de materiales que pueden ser usados para formar un hidrogel se incluyen polisacáridos tales como alginatos, polifosfazenos y poliacrilatos, que están reticulados iónicamente, o copolímeros de bloques tales como Pluronics™ o Tetronics™, copolímeros de bloques de polióxido de etileno-polipropilenglicol reticulados por temperatura o pH, respectivamente. Otros materiales incluyen proteínas tales como fibrina, polímeros tales como polivinilpirrolidona, ácido hialurónico y colágeno. Las patentes de EE.UU. Nos. 5.286.495 y 5.410.016, otorgadas a Hubbell et al., describen materiales útiles para formar hidrogeles biocompatibles.

En general, estos polímeros son, por lo menos, parcialmente solubles en soluciones acuosas, tales como el agua, soluciones salinas tamponadas o soluciones acuosas alcohólicas, que tienen cargados grupos laterales, o una de sus sales iónicas monovalentes. Son ejemplos de polímeros con grupos laterales ácidos que pueden hacerse reaccionar con cationes, poli(fosfazenos), poli(ácidos acrílicos), poli(ácidos metacrílicos), copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, poli(acetato de vinilo) y polímeros sulfonados tales como poliestireno sulfonado. También pueden emplearse copolímeros que poseen grupos laterales ácidos formados por reacción de ácido acrílico o metacrílico y monómeros o polímeros de éteres vinílicos. Son ejemplos de grupos ácidos, grupos de ácidos carboxílicos, grupos de ácidos sulfónicos, grupos de alcoholes halogenados (preferiblemente fluorados), grupos OH fenólicos y grupos OH ácidos

Son ejemplos de polímeros con grupos laterales básicos que pueden hacerse reaccionar con aniones, poli (aminas vinílicas), poli(vinil piridina), poli(vinil imidazol), y algunos polifosfazenos sustituidos con grupos imino. Asimismo, puede formarse la sal amónica o cuaternaria de los polímeros a partir de los grupos nitrógenos o imino pendientes, de la cadena principal. Son ejemplos de grupos laterales básicos los grupos amino e imino.

El alginato cálcico y otros ciertos polímeros que pueden formar hidrogeles iónicos que son maleables, pueden ser usados para encapsular GM-CSF. Los alginatos pueden reticularse iónicamente con cationes divalentes, en agua, a temperatura ambiente, formando matrices de hidrogeles. El hidrogel se produce mediante reticulación de la sal aniónica del ácido algínico, un hidrato de carbono polímero aislado de algas marinas, con cationes divalentes, cuya resistencia aumenta o bien aumentando las concentraciones de calcio o bien de alginato.

El polímero soluble en agua con grupos laterales cargados, es reticulado haciendo reaccionar el polímero con una solución acuosa que contiene iones multivalentes de la carga opuesta, o bien cationes multivalentes si el polímero posee grupos laterales ácidos, o aniones multivalentes si el polímero posee grupos laterales básicos. Los cationes preferidos para la reticulación de los polímeros con grupos laterales ácidos formando un hidrogel, son cationes divalentes y trivalentes tales como cobre, calcio, aluminio, magnesio, estroncio, bario y estaño, aun cuando pueden usarse también cationes orgánicos di-, tri- o tetra-funcionales tales como sales de alquilamonio, por ejemplo, R_{3}N^{+}-C_{6}-^{+}NR_{3}. Soluciones acusas de las sales de estos cationes se añaden a los polímeros para formar hidrogeles y membranas, blandos, que se hinchan fuertemente. Cuanto más alta es la concentración de cationes o más alta es la valencia, mayor es el grado de reticulación del polímero. Se ha demostrado que concentraciones desde tan bajas como 0,005 M reticulan el polímero. Las concentraciones superiores están limitadas por la solubilidad de la sal.

Los aniones preferidos para la reticulación de los polímeros para formar un hidrogel, son los aniones divalentes y trivalentes tales como ácidos dicarboxílicos de peso molecular bajo, por ejemplo, el ácido tereftálico, los iones sulfato y los iones carbonato. Soluciones acuosas de las sales de estos aniones se añaden a los polímeros formando hidrogeles y membranas, blandos, que se hinchan fuertemente, según se ha descrito con respecto a los cationes.

Puede utilizarse una variedad de policationes para complejarse y estabilizar con ello el hidrogel de polímero en una membrana de superficie semipermeable. Como ejemplos de materiales que pueden ser usados se incluyen polímeros que poseen grupos reactivos básicos tales como grupos amina o imina, que poseen un peso molecular preferido entre 3.000 y 100.000, tales como polietilenimina y polilisina. Estos compuestos pueden obtenerse comercialmente. Un policatión es poli(L-lisina); ejemplos de poliaminas sintéticas son polietilenimina, poli(vinilamina) y poli(alilamina). Hay también policationes naturales el polisacárido, quitosán. Como polianiones que pueden ser usados para formar una membrana semipermeable por reacción con grupos superficiales básicos existentes en el hidrogel de polímero, se incluyen polímeros y copolímeros del ácido acrílico, ácido metacrílico y otros derivados del ácido acrílico, polímeros con grupos SO_{3}H colgantes tales como poliestireno sulfonado y poliestireno con grupos de ácidos carboxílicos.

Estos polímeros o bien son obtenibles comercialmente o pueden ser sintetizados usando métodos conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Concise Encyclopedia of Polymer Science y Polymeric Amines and Ammonium Salts, E. Goethals, compilador, (Pergamen Press, Elmsford, NY 1980).

El factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos, GM-CSF, es un factor de crecimiento hematopoyético que favorece la proliferación y diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas. El gen clonado del GM-CSF ha sido expresado en células de bacterias, levaduras y de mamífero. La proteína endógena es una glicoproteína monómera con un peso molecular de 22.000 daltons aproximadamente. La preparación recombinante expresada en células bacterianas esta sin glicosilar. El GM-CSF producido en un sistema de expresión de levadura ha sido comercializado como Leukine por Immunex Corporation, Seattle, Washington. La Leukine™ se vende en forma liofilizada. Es una glicoproteína de 127 aminoácidos caracterizada por tres especies moleculares primarias que poseen masas moleculares de 19.500, 16.800 y 15.500 daltons.

El GM-CSF está descrito en la patente de EE.UU. No. 5.078.996 otorgada a Conlon et al. Análogos del GM-CSF están descritos en las patentes de EE.UU. Nos. 5.229.496, 5.393.870 y 5.391.485 otorgadas a Deeley et al. En la realización preferida, el GM-CSF es una proteína recombinante que posee un peso molecular entre 14.000 y 20.000, aproximadamente, obtenida en levadura que hiperglicosila la proteína presumiblemente limitando la cantidad de absorción inespecífica observada con la proteína. También pueden usarse proteínas de fusión del GM-CSF. Como ejemplos con proteínas de fusión de GM-CSF se incluyen proteínas de fusión con IL-3 y otras linfoquinas o factores de crecimiento.

Preparación de micropartículas

Pueden prepararse microesferas o micropartículas sólidas usando cualquiera de los diversos procedimientos conocidas por los expertos en la técnica. El GM-CSF muestra ser inusualmente estable para el procesamiento, en especial en presencia de disolventes orgánicos, lo que facilita la formación de micropartículas que contienen GM-CSF, que poseen niveles de bioactividad muy altos, típicamente superiores al 90% en comparación con el GM-CSF antes de incorporar en las micropartículas. Como ejemplos de métodos de preparación se incluyen la evaporación de disolvente, el secado por pulverización, la extracción con disolventes y otros métodos conocidos por los expertos en la técnica. Según se ha descrito antes, los hidrogeles se forman, típicamente, por reticulación iónica, por adición de iones o poliiones, o por fotorreticulación u otras formas de reticulación química.

Preparación de microesferas

Pueden prepararse microesferas bioerosionables usando cualquiera de los métodos desarrollados para la preparación de micoresferas destinadas a la cesión de sustancias medicamentosas, por ejemplo, como se ha descrito por Mathiowitz y Langer, en J. Controlled Release, 5, 13-22 (1987); Mathiowitz et al., Reactive Polymers 6, 275-283 (1987); y Mathiowitz et al., en J. Appl. Polymer Sci. 35, 755-774 (1988). La selección del método depende de la selección del polímero, el tamaño, la morfología externa, y la cristalinidad que se desee, como se describe, por ejemplo, por Mathiowitz et al., en Scanning Microscopy 4, 329-340 (1990); Mathiowitz et al., J. Appl. Polymer Sci. 45 125-134 (1992); y Benita et al., J. Pharm. Sci. 73, 1721-1724 (1984). Los métodos incluyen evaporación de disolventes, separación de fases, secado por pulverización y encapsulación en fusión en caliente. Las patentes de EE.UU. Nos. 3.773.919; 3.737.337 y 3.523.906 son representativas de métodos de fabricación de microesferas.

Un método preferido se describe en la patente de EE.UU. No. 5.000.886 otorgada a Lawter et al. El GM-CSF se dispersa en una solución acuosa que luego se mezcla con una solución orgánica del polímero. La dispersión se añade a un no disolvente para el polímero y el GM-CSF y luego las micropartículas son endurecidas por extracción del disolvente del polímero con un fluido de silicona volátil.

En la evaporación de disolventes, descrita, por ejemplo, por Mathiowitz et al (1990), Benita y en la patente de EE.UU. No. 4.272.398 otorgada a Jaffe, el polímero se disuelve en un disolvente orgánico volátil. El GM-CSF, en forma soluble o disperso en forma de partículas finas, se añade a la solución del polímero, y la mezcla se suspende en una fase acuosa que contiene un agente tensioactivo tal como poli(alcohol vinílico). La emulsión resultante se agita hasta que la mayor parte del disolvente orgánico se evapora, quedando microesferas sólidas.

En general, el polímero puede disolverse en cloruro de metileno. Pueden emplearse varias concentraciones diferentes del polímero, por ejemplo, entre 0,01 y 0,50 g/ml. Después de cargar la solución con GM-CSF, la solución se suspende en 200 ml de agua destilada que contiene poli(alcohol vinílico) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) al 1% (p/v) agitando fuertemente. Al cabo de cuatro horas de agitación el disolvente orgánico se habrá evaporado desde el polímero y las microesferas que resultan se lavan con agua y se secan durante la noche en un liofilizador.

Microesferas de diferentes tamaños (entre 1 y 1000 micrómetros) y diferentes morfologías pueden ser obtenidas mediante este método, que es útil para polímeros relativamente estables tales como poliésteres y poliestireno. Sin embargo, los polímeros lábiles tales como los polianhídridos pueden degradarse debido a la exposición al agua. Para estos polímeros, pueden preferirse la encapsulación en estado de fusión, en caliente, y la separación del disolvente.

La separación del disolvente es particularmente útil con los polianhídridos En este método el fármaco se dispersa o se disuelve en una solución de un polímero seleccionado en un disolvente orgánico volátil tal como el cloruro de metileno. La mezcla se suspende luego en un aceite, tal como aceite de silicona, con agitación, para formar una emulsión. Dentro de 24 horas el solvente se difunde hacia la fase oleosa y las gotitas de emulsión se endurecen formando microesferas de polímero sólidas. A diferencia de la evaporación del disolvente, este método puede ser usado para fabricar microesferas a partir de polímeros con puntos de fusión altos y una amplia gama de pesos moleculares. Con este procedimiento operatorio pueden obtenerse microesferas de un diámetro entre uno y 300 micrómetros. La morfología externa de las esferas depende en alto grado del tipo de polímero empleado.

En el secado por pulverización, se disuelve el polímero en cloruro de metileno (0,04 g/ml). Una cantidad conocida de fármaco activo se suspende (si es insoluble) o se disuelve conjuntamente (si es soluble) en la solución del polímero. La solución o la dispersión se seca por pulverización después. Pueden obtenerse microesferas de un diámetro que varía entre uno y diez micrómetros, con una morfología que depende de la selección del polímero.

Pueden prepararse micropartículas de hidrogeles obtenidas con polímeros de tipo gel tales como alginatos o polifosfazenos u otros polímeros dicarboxílicos, disolviendo el polímero en una solución acuosa, suspendiendo el material que haya de ser incorporado a la mezcla, y sometiendo a extrusión la mezcla de polímero a través de un dispositivo de formación de microgotas, provisto de un chorro de nitrógeno gaseoso. Las micropartículas que resultan caen en un baño de endurecimiento, iónico, con agitación lenta, según se describe, por ejemplo, por Salib et al. en Pharmazeutische Industrie 40-11 A, 1230 (1978). La ventaja de este sistema consiste en la capacidad de modificar posteriormente la superficie de las micropartículas revistiéndolas con polímeros policatiónicos tales como polilisina, después de fabricar, por ejemplo, como ha sido descrito por Lim et al., en J. Phar. Sci. 70, 351-354 (1981). Como describen Lim et al., en el caso de alginatos, puede formarse un hidrogel reticulando iónicamente el alginato con iones calcio, y reticulando entonces la superficie externa de las micropartículas con un policatión tal como polilisina, después de la fabricación. El tamaño de partículas de las microesferas se regula usando extrusoras de diversos tamaños, diversos caudales del polímero y diversos caudales del gas.

Pueden prepararse micropartículas de quitosán disolviendo el polímero en una solución ácido y reticulando con tripolifosfato. Por ejemplo, se preparan microesferas de carboximetilcelulosa (CMC) disolviendo el polímero en una solución de un ácido y precipitando las micropartículas con iones plomo. Puede prepararse alginato/polietilenimida (PEI) para reducir la cantidad de grupos carboxilo existentes en las micropartículas de alginato.

Carga de GM-CSF

El intervalo de carga del GM-CSF que ha de ser liberado, está comprendido, típicamente, entre aproximadamente 0,001% y 10%, en peso. El GM-CSF puede incorporarse en una matriz de polímero en una proporción de entre 0,001% en peso hasta 10% en peso. En una realización preferida el GM-CSF se incorpora en mezclas de PLGA al 2% en peso.

La carga depende del trastorno que haya de ser tratado así como del período de tiempo durante el que el GM-CSF haya de ser liberado. Se requieren dosificaciones inferiores para usar como un adyuvante de vacuna, en el intervalo de 0,001 a 0,1%. Para el tratamiento de una infección grave el GM-CSF sería cargado típicamente en micropartículas con 2% en peso de carga de fármaco.

Aditivos a las micropartículas para alterar la cesión

La hidrólisis de loa polímeros se acelera en pHs ácidos o básicos y por tanto puede usarse la inclusión de excipientes ácidos o básicos para modular el grado de erosión del polímero. Los excipientes pueden añadirse en forma de partículas, pueden mezclarse con el GM-CSF incorporado o pueden disolverse dentro del polímero.

Los intensificadores de degradación están basados en el peso con relación al peso del polímero. Pueden añadirse a la fase de proteína, añadirse como una fase separada (es decir, en forma de partículas) o pueden disolverse conjuntamente en la fase de polímero dependiendo del compuesto. En todos los casos, la cantidad debe estar entre 0,1 y treinta por ciento (p/p, polímero). Los tipos de intensificadores de la degradación incluyen ácidos inorgánicos tales como sulfato amónico y cloruro amónico, ácidos orgánicos tales como ácido cítrico, ácido benzoico, heparina y ácido ascórbico, bases inorgánicas tales como carbonato sódico, carbonato potásico, carbonato cálcico, carbonato de cinc e hidróxido de cinc, y bases orgánicas tales como sulfato de protamina, espermina, colina, etanolamina, dietanolamina y trietanolamina, y tensioactivos tales como Tween™ y Pluronic™.

Se usan agentes de formación de poros para añadir microestructura a las matrices (es decir, compuestos solubles en agua tales como sales inorgánicas y azúcares). Estos agentes se añaden en forma de partículas. El intervalo debe estar entre uno y treinta por ciento (p/p, polímero).

También pueden añadirse excipientes al GM-CSF para mantener su potencia, dependiendo de la duración de la cesión. Los estabilizadores incluyen hidratos de carbono, aminoácidos, ácidos grasos y tensioactivos, y son conocidos por los expertos en la técnica. Además, pueden usarse excipientes que modifiquen la solubilidad del GM-CSF tales como sales, agentes de complejación (albúmina, protamina), para regular la velocidad de cesión de la proteína desde las micropartículas.

Los estabilizadores para el GM-CSF están basados en la proporción en peso de estabilizador respecto al GM-CSF, sobre la base de peso. Como ejemplos se incluyen hidratos de carbono tales como sacarosa, lactosa, manitol, dextrano y heparina, proteínas tales como albúmina y protamina, aminoácidos tales como arginina, glicina y treonina, tensioactivos tales como Tween™ y Pluronic™, sales tales como cloruro cálcico y fosfato sódico, y lípidos tales como ácidos grasos, fosfolípidos y sales biliares.

Las proporciones son, por lo general, de 1:10 a 4:1, hidrato de carbono a proteína, aminoácidos a proteína, estabilizador de proteína a proteína y sales a proteína; 1:1000 a 1:20, tensioactivo a proteína; y 1:20 a 4:1, lípidos a proteína.

Indicaciones clínicas a tratar Distribución sistémica para la proliferación de células

El GM-CSF está aprobado para el tratamiento de pacientes que requieren una proliferación aumentada de glóbulos blancos de la sangre. Resultados obtenidos indican que el GM-CSF es útil también como adyuvante de vacunas, Morrissey et al., J. Immunology 139, 1113-1119 (1987). También pueden usarse las micropartículas de GM-CSF para tratar pacientes propensos a infecciones tales como aquellos que experimentan cirugía intestinal de alto riesgo, son víctimas de traumatismos e individuos con HIV. Los protocolos y la eficacia clínica del GM-CSF es bien conocida de los expertos en la técnica. Como se ha descrito en esta memoria, los protocolos se modifican para que reflejen los cambios en las velocidades de distribución y en las dosificaciones que resultan de los perfiles de cesión de las micropartículas o de los hidrogeles, según sea apropiado.

Los resultados obtenidos in vitro con referencia a las perfiles de cesión para el GM-CSF, así como la eficacia, parecen ser reveladores, aun cuando no idénticos, de los resultados in vivo. Como demuestran los ejemplos que siguen, los resultados obtenidos en el mono Rhesus muestran incrementos máximos en el número de leucocitos al cabo de los cuatro días siguientes a la administración de GM-CSF, al tiempo que los resultados in vitro demostraron que se requieren seis a siete días para la liberación completa del GM-CSF incorporado. La ventaja de usar GM-CSF es que la proteína es en si misma sumamente estable, estando retenida al menos el 60%, en muchos casos 90 a 100%, de la bioactividad después de incorporar en micropartículas usando uno cualquiera de varios procedimientos.

Administración local como adyuvante

Puede obtenerse una respuesta mejorada de vacunas mediante el uso de GM-CSF solo, pero se obtiene más preferiblemente mediante una selección del polímero en combinación con la cesión controlada del GM-CSF. Es sabido que ciertos polímeros sirven como quimioatractivos de los glóbulos blancos. El PLGA es suavemente inflamatorio, como lo son los polianhídridos y los poliortoésteres. Mediante la selección del polímero quimioatractivo como la matriz para el GM-CSF, en una forma que produzca una cesión controlada a lo largo de un período de tiempo de una semana aproximadamente, puede obtenerse una mejora máxima de la vacuna. En esta realización, la cesión puede ser procedente de matrices de polímeros en una diversidad de formas, no justamente micropartículas o hidrogeles. El GM-CSF y el polímero pueden actuar incluso sinérgicamente mejorando el efecto de adyuvante del GM-CSF, así como la realización de la "diana" del GM-CSF en los glóbulos blancos.

El GM-CSF puede ser inyectado, también, con un antígeno tumoral o células tumorales que expresen antígenos, o sus superficies, para usar como una vacuna tumoral.

Administración tópica o transmucosal

Las formulaciones de hidrogel son particularmente útiles para aplicaciones tópicas. Por ejemplo, ha sido indicado por Braunstein et al., J. Invest. Dermatol. 103, 601-604 (1994), que el GM-CSF estimula la proliferación de queratinocitos de la piel humana y por tanto podría utilizarse como agente tópico para la curación de heridas. La distribución de micropartículas de GM-CSF en las mucosas podría, asimismo, ser eficaz para la estimulación de la inmunidad de las mucosas dado que se ha puesto de manifiesto que la proteína desempeña un papel importante en la producción de anticuerpos (Grabstein et al., J. Mol. Cewll. Immunol. 2, 199-207 (1986)).

Administración de las micropartículas de GM-CSF

En la realización preferida para estimular la proliferación de células progenitoras hematopoyéticas, el GM-CSF se administra incorporado en micropartículas que se degradan a lo largo de un período de tiempo de 1 ó 2 meses. Las micropartículas varían de tamaño, preferiblemente, desde 10 a 60 micrómetros, con un tamaño medio de diámetro de 35 micrómetros, y se inyectan simultáneamente con ayuda de un medio de suspensión. En una realización, el medio de suspensión consiste en metilcelulosa al 3%, manitol al 4% y Tween™ 80 al 0,1%, usando una aguja de calibre 22. En otra realización la metilcelulosa al 3% está reemplazada por carboximetilcelulosa al 1%. Se requiere un ml del medio de suspensión para suspender 100 miligramos de micropartículas que contengan suficiente GM-CSF para distribuir 125 microgramos/m^{2}/día durante un período de tiempo de 7 días. Pueden conseguirse dosis mayores inyectando más micropartículas. Por ejemplo, una dosis de 250 microgramos/m^{2}/día requeriría dos inyeciones de 1 ml, conteniendo cada una de ellas 100 mg de micropartículas.

La presente invención será entendida, además, con referencia a los ejemplos no limitativos que figuran seguidamente.

Ejemplo 1 Preparación de microesferas empleando el proceso de separación de fases A. Lote nº 14223-133. Muestra "A"

El polímero de encapsulación era un poli(glicolida-co-d,l-lactida) que tenía una viscosidad intrínseca de 0,43 dl/g (determinada en una solución al 0,5% (p/v) en hexafluoroisopropanol, a 30ºC), y una relación de glicolida a lactida de 45:55. Se preparó con ácido glicólico como iniciador y cloruro estannoso dihidratado como catalizador. Se mostró que la distribución de grupos lactoilo y glicoilo dentro del copolímero era aleatoria mediante NMR del C13 y medidas de solubilidad. El contenido de lactida residual se redujo mediante desorción en vacío. La solución del polímero de encapsulación se preparó añadiendo 100 g del polímero a 900 g de cloruro de metileno y agitando la mezcla hasta que se disolvió el polímero.

0,978 ml de una solución de GM-CSF (63,3 mg/ml en solución tampón de Tris 100 mM) se añadieron a una porción de 20 g de la solución del polímero de encapsulación. La mezcla se agitó con un homogeneizador empleando una cabeza de 10 mm, a 10.000 rpm, durante 2 minutos, para crear una emulsión de agua-en-aceite (W/O).

Se añadieron a la emulsión W/O 18,0 g de Dow Corning® 380 Fluid (polidimetilsiloxano) y la mezcla se homogeneizó a 10.000 rpm durante 2 minutos. La mezcla se añadió después a 2,4 kg de Dow Corning® 244 Fluid (octametilciclotetrasiloxano), con agitación, a 750 rpm, para endurecer las microesferas. Se continuó agitando durante 90 minutos. Se recogieron las microesferas con un tamiz provisto de un malla de acero inoxidable de 1 \mum y después se secaron en vacío.

Se analizó la distribución del tamaño de partícula con un Malvem 2600 Particle Sizer. Aproximadamente 50 mg de microesferas fueron suspendidas en aproximadamente 10 ml del Dow Corning® 244 Fluid, y se sometieron a sonicación durante 2 minutos para dispersar completamente las microesferas. Unas gotas de esta suspensión fueron añadidas luego a la cubeta óptica que contenía Dow Corning® 244 Fluid. Entonces se midió la distribución del tamaño de partícula. La muestra tenía un diámetro medio volumétrico de 66,7 \mum, el 10% de las microesferas estaban por debajo de 24,1 \mum y el 90% de las microesferas estaban por debajo de 118,6 \mum.

B. Lote nº 14223-134. Muestra "B"

El polímero de encapsulación y sus solución en cloruro de metileno eran los mismos que se han descrito en "A".

0,320 ml de solución de GM-CSF (63,3 mg/ml en 100 ml de solución tampón de Tris 100 mM) se añadieron a una porción de 20 g de la solución del polímero de encapsulación. La mezcla se agitó con un homogeneizador usando una cabeza de 10 mm, a 10.000 rpm, durante 2 minutos, para crear una emulsión de agua-en-aceite (W/O).

18,0 g de Dow Corning® 360 Fluid (polidimetilsiloxano) se añadieron a la emulsión de agua en aceite, y la mezcla se homogeneizó a 10.000 rpm, durante 2 minutos. La mezcla se añadió después a 2,4 kg de Dow Corning® 244 Fluid (octametilciclotetrasiloxano) agitando durante 90 minutos, a 750 rpm, para endurecer las microesferas. Se recogieron las microesferas, se secaron y se analizó la distribución del tamaño de partícula según se ha descrito en "A". La muestra tenía un diámetro medio volumétrico de 43,8 \mum, el 10% de las microesferas estaban por debajo de 7,0 \mum y el 90% de las microesferas estaban por debajo de 77,9 \mum.

Como muestra la Figura 1 A, las muestras "A" y "B" ponen de manifiesto que pueden fabricarse microesferas de PLGA para liberar GM-CSF de un modo trifásico. En la primera fase, la proteína es liberada continuamente durante 5 días, aproximadamente. Esta fase va seguida de un período de cesión mínima del GM-CSF hasta el día 35. En este momento otra pulsación de GM-CSF es liberada desde el sistema. La duración de cada fase puede ser regulada por el tipo de polímeros usados para preparar las microesferas.

C. Lote nº 9663-96 A. Muestra "B4"

El polímero de encapsulación era una mezcla 60:20:20 de 1) un poli(glicolida-co-d,l-lactida) que tenía una relación de glicolida a lactida de 47:53 y una viscosidad intrínseca de 0,72 dl/g, determinada en solución al 0,5% (p/v) en hexafluoroisopropanol, a 30ºC (polímero I), 2) un poli(glicolida-co-d,l-lactida) que tenía una relación de glicolida a lactida de 50:50 y una viscosidad intrínseca de 0,33 dl/g, determinada en solución al 0,1% (p/v) en cloroformo, a 25ºC (polímero II), y 3) un poli(d,l-lactida) con un peso molecular medio de 1938 determinado por titulación del grupo final (polímero III).El polímero II y el polímero III fueron reprecipitados antes de su uso. La solución del polímero de encapsulación se preparó añadiendo 1,20 g de polímero I, 0,40 g de polímero II y 0,40 g de polímero III, a 18,00 g de cloruro de metileno, y agitando la mezcla hasta que los polímeros se disolvieron.

0,481 ml de una solución de GM-CSF de 84,8 mg/ml en solución tampón de Tris 100 mM, se añadió a la solución del polímero de encapsulación, y se homogeneizó con una cabeza de 20 mm, a 10.000 rpm, durante 60 segundos para crear una emulsión de agua-en-aceite (W/O).

El vaso de precipitados que contenía la emulsión W/O se colocó en un mezclador provisto de un agitador de Teflón de 3 cuchillas y se agitó a 1000 rpm. Se añadieron a la emulsión W/O usando una jeringuilla, 20 ml de Dow Corning® 360 Fluid al tiempo que se agitaba a 1000 rpm durante un período de tiempo de 1 minuto.

La mezcla se añadió luego a 2,0 kg de Dow Corning® Fluid agitando durante 90 minutos a 400 rpm para endurecer las microesferas.

Las microesferas se recogieron, se secaron y se analizó la distribución del tamaño de partícula según se ha descrito anteriormente. La muestra tenía un diámetro medio volumétrico de 31,8 \mum, el 10% estaba por debajo de 14,1 \mum y el 90% de las microesferas estaba por debajo de 52,2 \mum.

D. Lote nº 9663-135 C. Muestra "04"

El polímero de encapsulación era una mezcla 60:20:20 de: 1) un poli(glicolida-co-d,l-lactida) que tenía una relación de glicolida a lactida de 47:53 y una viscosidad inrtrínseca de 0,72 dl/g, determinada en una solución al 0,5% (p/v) en hexafluoroisopropanol, a 30ºC (polímero I), 2) un poli(glicolida-co-d,l-lactida) que tenía una relación de glicolia a lactida de 50:50 y una viscodiad intrínseca de 0,33 dl/g determinada en una solución al 0,1% (p/v) en cloroformo, a 25ºC (polímero II), y 3) un poli (d,l-lactida) con un peso molecular medio de 1938, determinado mediante titulación del grupo final (polímero III). El polímero II y el polímero III fueron reprecipitados antes de su uso. La solución del polímero de encapsulación se preparó añadiendo1,20 g de polímero I, 0,40 g de polímero II y 0,40 g de polímero III a 18,00 g de cloruro de metileno, agitando la mezcla hasta que los polímeros se disolvieron.

0,462 ml de una solución de GM-CSF (88,4 mg en solución tampón de Tris 100 mM) se añadió a la solución del polímero de encapsulación, se homogeneizó con una cabeza de 20 mm, a 10.000 rpm, durante 60 segundos para crear una emulsión de agua-en-aceite (W/O). La emulsión W/O se agitó a 1000 rpm. Se añadieron a la emulsión W/O 20 ml de Dow Corning® 360 Fluid mientras se agitaba durante un período de tiempo de 1 minuto, usando una jeringuilla. La mezcla se añadió después a 2,0 kg de Dow Corning® 244 Fluid, con agitación a 400 rpm, durante 90 minutos, para endurecer las microesferas.

Se recogieron las microesferas, se secaron y se analizó la distribución del tamaño de partícula como se ha descrito anteriormente. La muestra tenía un diámetro medio volumétrico de 39,5 \mum, el 10% de las microesferas estaban por debajo de 14,9 \mum y el 90% de las microesferas estaban por debajo de 65,1 \mum.

E. Lote nº 9490-168. Muestra "V4". Proceso aséptico

Se prepararon asépticamente microesferas del modo siguiente. El material de vidrio, los ejes de los agitadores y las cabezas de los mismos, así como los recipientes de acero inoxidable fueron sometidos a calentamiento en autoclave antes de su uso.

El polímero de encapsulación era una mezcla 60:20:20 de 1) poli(glicolida-co-d,l-lactida) que tenía una relación de glicolida a lactida de 47:53 y una viscosidad intrínseca de 0,72 dl/g determinada en una solución al 0,5% (p/v) en hexafluoroisopropanol, a 30ºC,(polímero I), 2) un poli(glicolida-co-d-l-lactiida) que tenía una relación de glicolida a lactida de 50:50 y una viscosidad intrínseca de 0,33 dl/g determinada en una solución al 0,1% (p/v) en cloroformo, a 25ºC (polímero II), y 3) un poli(d,l-lactida) con un peso molecular medio de 1938 determinado mediante titulación del grupo final (polímero III). El polímero II y el polímero III fueron reprecipitados antes de su uso. La solución de polímero de encapsulación se preparó añadiendo 3,00 g del polímero I, 1,00 g del polímero II y 1,00 g del polímero III a 45,00 g de cloruro de metileno y agitando la mezcla hasta que los polímeros se disolvieron. 20,00 g de esta solución se filtraron a través de un prefiltro de fibra de vidrio y un filtro de Teflón de 0,45 \mum para la microencapsulación.

Aproximadamente 100 g de Dow Corning® 360 Fluid se calentaron a 160ºC durante 1 hora en un vaso de precipitados de vidrio cubierto con una lámina de aluminio y luego se dejó enfriar a temperatura ambiente.

2,0 kg de Dow Corning® 244 Fluid se filtraron a través de un filtro "Millipak™ 20" de 0,22 \mum al recipiente d endurecimiento.

0,485 ml de una solución de GM-CSF (87,3 mg/ml en solución tampón de Tris 100 mM, filtrada a través de un filtro de 0,2 \mum) se añadió a los 20 gramos de solución filtrada del polímero de encapsulación y se agitó con un homogeneizador usando una cabeza de 20 mm, a 10.000 rpm, durante 60 segundos, para crear una emulsión de agua-en-aceite (W/O).

El vaso de precipitados que contenía la emulsión W/O se colocó en un mezclador provisto de un agitador de Teflón de 3 cuchillas y se agitó a 1000 rpm. 20 ml del Dow Corning® 360 Fluid tratados por calor, se añadieron a la emulsión de agua-en-aceite usando una jeringuilla, mientras se agitada a 1000 rpm durante 1 período de tiempo de 1 minuto.

La mezcla se añadió luego a los 2,0 kg del Dow Corning® 244 Fluid filtrado agitando a 400 rpm para endurecer las microesferas. Se continuó agitando durante 90 minutos.

Se recogieron las microesferas, se secaron y se determinó la distribución del tamaño de partícula con un aparato Malvern 2600 Particle Sizer. La distribución del tamaño de partícula se midió entonces. La muestra tenía un diámetro medio volumétrico de 32,5 \mum, el 10% de las microesferas estaban por debajo de 14,7 \mum y el 90% de las microesferas estaban por debajo de 64,8 \mum.

Ejemplo 2 Análisis de GM-CSF incorporado en microesferas usando cromatografía líquida de alta resolución, de fase invertida (RP-HPLC)

Se extrajo primeramente GM-CSF de microesferas usando ácido acético, cloruro de metileno y solución salina tamponada con fosfato. Se extrajo simultáneamente un testigo constituido por microesferas en "blanco" con GM-CSF recién añadido. Los extractos fueron evaluados después mediante RP-HPLC para determinar la distribución de la glicoforma.

Variantes glicosiladas del GM-CSF humano recombinante (rhu) se midieron empleando cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). La columna era una columna C18 de 10 micrómetros, 300 angstrom (4,6 mm x 25 cm) de Vydac. Las glicoformas del GM-CSF pueden ser resueltas en este método usando un gradiente de la fase móvil de 25 a 65% de ácido trifluoroacético (TFA) al 0,1%/acetonitrilo en TFA al 1%/agua con NaCl 200 mM constante.

Los resultados obtenidos indican que la distribución de glicoformas del GM-CSF del testigo no está alterado debido al protocolo de extracción y que el perfil por RP-HPLC del GM-CSF incorporado en microesferas permanece sin cambio.

Ejemplo 3 Cinética de cesión del GM-CSF a partir de preparaciones de microesferas

Se analizó la cinética de cesión de microesferas de GM-CSF usando los métodos siguientes. Lotes de microesferas fueron mantenidos a 2-8ºC en sus recipientes originales. Los estudios de cesión in vitro fueron iniciados al cabo de unos días de preparación. Los estudios fueron llevados a cabo por duplicado para la selección y por triplicado para obtener un nivel de confianza aumentado en cuanto a exactitud y precisión. La solución tampón para la cesión era solución salina tamponada con fosfato (PBS, fosfato sódico 12 mM, fosfato potásico 3,7 mM, cloruro sódico 150 mM, pH 7,0, filtrada a través de un filtro de 0,22 \mum) que contenía azida de sodio al 0,02% como conservante, aun cuando es recomendable suprimir la azida y llevar a cabo el estudio de cesión tan asépticamente como sea posible cuando se planea realizar análisis de bioactividad del GM-CSF liberado. Los intervalos de tiempo de recolección de un estudio pueden incluir tiempos de 2, 6, 24, 48 y 72 horas y 5, 7, 10 y 14 días.

Para efectuar un ensayo de cesión in vitro, de 50 a 75 mg de microesferas se colocaron en el espaciador de teflón de 9 mm DI x 13 mm DE x 5 mm que está dentro de la camisa de teflón del dispositivo. El espacidor se ancló en ambos extremos con tamices de malla de acero inoxidable de 10 \mum, de 13 mm de diámetro, lo que permite la circulación de la solución tampón de liberación a través de las microesferas.

El dispositivo cargado se colocó en un tubo de ensayo amplio, de polipropileno, de 30 ml, con 6 ml de la solución tampón de liberación. Los tubos abiertos que contenían el dispositivo cargado y la solución tampón de liberación fueron tapados con tapones, flojos, de Kimwipes® sujetos con bandas de goma, y colocados en un desecador de vacío. La exposición al vacío durante 2 horas aproximadamente ayuda a retirar las burbujas de aire retenidas y favorece el humedecimiento inicial de las microesferas. Los tubos fueron tapados luego e incubados a 37ºC en un agitador orbital fijado en 100 rpm.

A intervalos de tiempo apropiados la solución tampón de liberación fue recuperada por decantación a tubos de ensayo de polipropileno de 15 ml, marcados, previamente pesados,. Se determinó el volumen obtenido por peso (ml = g, aproximadamente). El dispositivo, con la adición de solución tampón de liberación de nueva aportación (6 ml), se devolvió después al agitador orbital, a 37ºC.

Las muestras de cesión de las microesferas fueron evaluadas mediante el Ensayo de Proteína Total de Bio-Rad para cuantificar la cesión de GM-CSF. Puede usarse el ensayo de proteína total ya que no hay otras proteínas presentes.

Los resultados de los análisis de la cinética de cesión se exponen en las Figuras 1B y 3 A. Las muestras "B4", "04" y "V4" preparadas en el Ejemplo 1, indican que pueden fabricarse microesferas de PLGA para liberar continuamente GM-CSF durante un período de tiempo de 6 días, aproximadamente. La cesión es lineal a lo largo de este tiempo y se aproxima al orden cero. Además, el GM-CSF es liberado con una retención de bioactividad esencialmente completa como muestra la Figura 3B (dada la desviación típica del ensayo biológico, el GM-CSF liberado puede considerarse completamente activo). Estos ejemplos ponen de manifiesto también que el procedimiento de fabricación de microesferas es sumamente reproducible, como indican los perfiles de cesión del GM-CSF, muy similares, generados partiendo de las tres preparaciones.

Ejemplo 4 Perfil de cesión in vivo, de huGM-CSF en un modelo murino A. Lote nº 9402-94. Muestra "O"

Se prepararon asépticamente microesferas del modo siguiente:

El material de vidrio, los ejes y las cabezas de los mezcladores y los recipientes de acero inoxidable fueron sometidos a calentamiento en autoclave antes de usarlos. se filtraron 4,0 kg de Dow Corning® 244 Fluid (octametilciclotetrasiloxano) a través de un filtro "Millipak™ 40" de 0,22 \mum, al recipiente de endurecimiento. Aproximadamente 100 g de Dow Corning® 360 Fluid (polidimetilsiloxano), 360 centistokes) se calentaron a 180ºC durante 80 minutos en un vaso de precipitados de vidrio tapado con una lámina de aluminio, y luego se enfrió a temperatura ambiente.

Una porción de 40 gramos de una solución al 10% de poli(glicolida-d,l-lactida) en cloruro de metileno, se filtró a través de un filtro de 0,22 \mum de polifluoruro de vinilideno para realizar la microencapsulación. El polímero tenía una viscosidad intrínseca de 0,43 dl/g, determinada en una solución al 0,5% (p/v) en hexafluoroisopropanol, a 30ºC, y una relación de glicolida a lactida de 45:55. El polímero se preparó con ácido glicólico como el iniciador y cloruro estannoso dihidratado como catalizador. Se mostró que la distribución de grupos lactoílo y glicoílo en el copolímero era aleatoria mediante NMR del C13 y medidas de solubilidad. El contenido de lactida residual fue reducido mediante desorción en vacío.

0,664 ml de una solución de GM-CSF (aproximadamente 63,1 mg/ml en solución tampón de Tris 100 mM, filtrada a través de un filtro de 0,2 \mum) se añadió a los 40 gramos de solución del polímero filtrada y se agitó con un homogeneizador usando una cabeza de 20 mm, a 10.000 rpm, durante 60 segundos, para crear una emulsión de agua-en-aceite (W/O). 36 ml del Dow Corning® 360 Fluid se añadieron a la emulsión W/O y la mezcla se homogeneizó a 5000 rpm durante 90 segundos. La mezcla se añadió luego a los 4,0 kg de Dow Corning® 244 Fluid filtrados, con agitación a 500 rpm, para endurecer las microesferas. Se continuó agitando durante 1 hora. Se recogieron las microesferas, se secaron y se analizó la distribución del tamaño de partícula según se ha descrito anteriormente. La muestra tenía un diámetro medio volumétrico de 56,0 \mum, el 10% de las microesferas estaban por debajo de 26,3 \mum y el 90% de las microesferas estaban por debajo de 91,6 \mum.

Las microesferas fueron analizadas primeramente para determinar las características de cesión in vitro y asegurar la cesión continua de huGM-CSF durante un período de tiempo mayor que 7 días (Figura 2 A)- Después se pesaron las microesferas y se cargaron en jeringuillas de 3 cc con 50 mg de microesferas/jeringuilla. El vehículo de inyección de las microcápsulas era una solución acuosa de metilcelulosa de baja viscosidad, que contenía metilcelulosa al 3% (p/p), Tween 80 al 0,1%, y manitol al 4% (osmolalidad final = 292 mOsm/kg). Se llenaron viales con 1 g cada uno de solución de vehículo de inyección filtrado estéril. Para la inyección se unió una aguja de calibre 18 a una jeringuilla de 3 cc vacía y se usó para retirar 0,5-0,6 ml de vehículo de inyección. Se separó después la aguja de la jeringuilla y la jeringuilla que contenía el vehículo se fijó a una jeringuilla que contenía microesferas por medio de un "conector de jeringuillas". Se mezcló impulsando las jeringuillas atrás y adelante 25 veces en cada dirección. La jeringuilla vacía y el conector de jeringuillas fueron retirados después. Entonces se fijó una aguja de calibre 22 a la jeringuilla que contenía las microesferas suspendidas, lista para la inyección.

Estudios de cesión en el ratón

Se llevaron a cabo estudios de cesión en el ratón del modo siguiente: Ratones B6 machos (de 6 semanas) fueron obtenidos de Jackson Laboratories (Bar Narbor, ME) y se alojaron en la instalación de laboratorio de animales Immunex durante una período adicional de 10 semanas antes de iniciar el estudio. Diecisiete grupos de ratones fueron utilizados en el estudio, empleándose tres ratones por grupo. Para el grupo de ensayo 50 mg de microesferas que contenían 500 \mug de huGM-CSF (1% en peso) fueron inyectados por vía subcutánea en 0,5 ml del vehículo de inyección de metilcelulosa. Grupos de ratones que recibieron estas inyecciones fueron sacrificados a intervalos de 1, 2, 6 y 24 horas y 3, 5, 7 y 9 días. Como testigo negativo se sacrificó un grupo de ratones que no había recibido huGM-CSF en forma alguna. Como testigo final se inyectó subcutáneamente un bolo de huGM-CSF en una dosis de o bien 500 o bien 50 \mug de huGM-CSF. La dosis de 500 \mug representaba la cantidad total de huGM-CSF contenida en una inyección de 50 mg de microesferas, y la dosis de 50 \mug representaba una aproximación de la cantidad de huGM-CSF liberada por 50 mg de microesferas durante un período de tiempo de 1 día, in vitro. Grupos de ratones que habían recibido inyecciones de bolos fueron sacrificados a intervalos de 1, 2, 6 y 24 horas después de la inyección.

Después de sacrificar a los ratones se obtuvieron muestras de sangre y se dejó coagular a 4ºC. Se recogieron luego los sueros y se desecharon los coágulos. El desecho celular restante fue retirado por centrifugación y las muestras de suero fueron congeladas luego a -70ºC hasta su análisis posterior.

TABLA 1

1

Se descongelaron muestras de suero y se analizaron mediante ELISA para determinar las concentraciones de huGM-CSF. El inmunoensayo enzimático (EIA) de GM-CSF es un ensayo diseñado para cuantificar niveles de GM-CSF recombinante humano (rhu) en una muestra desconocida. Un anticuerpo monoclonal murino anti-GM-CSF se adsorbe en una placa de poliestireno de 96 pocillos durante la noche. Después de lavar se establece una curva estándar y se añaden muestras a la placa y se incuba. La placa se lava para separar el exceso de de rhU-GM-CSF sin adsorber. Luego se añade a cada pocillo un anticuerpo policlonal para el rhu-GM-CSF y se incuba. Se lava la placa para separar el anticuerpo policlonal sin fijar y se añade a cada pocillo una solución que contiene anticuerpo de IgG de asno anti-oveja conjugado con enzima de peroxidasa de rábano picante (HRP). Después de incubar se lava la placa para separar el exceso de anticuerpo enlazado a HRP que no se había fijado a los anticuerpos de oveja presentes. Se añade a la placa una solución de desarrollo que contiene el sustrato cromógeno para el conjugado de HRP. El color que se desarrolla es directamente proporcional a la cantidad de HRP-conjugado presente. Las lecturas de la densidad óptica en la longitud de onda correcta proporciona valores numéricos para cada uno de los pocillos. Estos pocillos pueden compararse con los valores de la curva estándar, lo que permite cuantificar los niveles de rhu-GM-CSF. Un anticuerpo monoclonal anti-GM-CSF puede obtenerse de Immunex. Un conjugado de anticuerpo de IgG de asno anti-oveja-HRP se obtiene de Jackson Immunoreseach Laboratories.

Se analizaron también muestras de suero para determinar su bioactividad mediante el ensayo de proliferación de células TF-1. El bioensayo de TF1 se utiliza para detectar la presencia y cantidad de GM-CSF humano. El bioensayo de TF1 utiliza una línea celular de eritroleucemia humana, TF-1, pra detetctar la presencia de huGM-CSF, hu IL-3 o rhuPIXY321 en muestras de ensayo. Estas células son dependientes de huGM-CSF para su crecimiento y se mantienen en medio suplementado con huGM-CSF. La adición de huGM-CSF, hu IL-3 o rhu PIXY321 a estas células estimula una proliferación que depende de la dosis, permitiendo la cuantificación de huGM-CSF, hu IL-3 o rhu PIXY321 en muestras de ensayo por comparación con un estándar de huGM-CSF, hu-IL-3 o rhu PIXY321 de concentración conocida.

La magnitud de la proliferación se mide "pulsando" cada uno de los micropocillos con timidina tritiada (^{3}H-TdR) durante 4 horas, a 37ºC. Las células TF-1 que proliferan pueden incorporar en su DNA (^{3}H-TdR) que se añade al medio, a medida que se dividen. Las células procedentes de cada pocillo son recolectadas después sobre un papel de filtro de fibra de vidrio que retiene el GM-CSF marcado. La cantidad de ^{3}H-TdR retenida sobre cada papel de filtro se somete a recuento luego en un contador de partículas beta. El número de cuentas por minuto (cpm) de cada pocillo es directamente proporcional a la magnitud de la proliferación por las células TF-1 activadas en respuesta a huGM-CSF, hu-IL-3 o rhu PIXY321. Las cuentas por minuto que resultan son directamente proporcionales a la cantidad de GM-CSF que estimulaba a la colonia de células.

Para determinar la bioactividad de GM-CSF en las muestras de cesión, todas las muestras se diluyen hasta 0,2 ng de GM-CSF/ml y se someten a análisis. Las actividades que resultan, expresadas en unidades/ml, se comparan con la actividad de una muestra de reserva de GM-CSF sin tratar analizada simultáneamente. Teóricamente, todas las muestras deben tener una actividad del 100%, aproximadamente, con relación a la muestra de reserva. Entra los ensayos, los valores testigo pueden variar en torno al 20 a 25%, un nivel de precisión no inusual con ensayos basados en el crecimiento celular.

El porcentaje de actividad específica retenido en cada punto de tiempo se determinó dividiendo la actividad específica medida en cada punto de tiempo por la actividad específica de huGM-CSF de reserva del mismo lote que no había sido incorporado a las microesferas.

Los resultados del estudio de cesión se muestran en la Figura 2 A, que es una gráfica de la cinética de cesión in vitro que manifiesta la cesión a lo largo de un período de diez días aproximadamente. La Figura 2 B es una gráfica de los niveles de huGM-CSF séricos en circulación (determinados por ELISA) en función del tiempo. Ambas inyecciones de bolos de 500 y 50 \mug, fueron despejadas rápidamente desde el suero de ratón. Debido a la rápida disminución de huGM-CSF detectable en el suero de ratón, solamente pudo llevarse a cabo en el suero de ratón un estimado grosero de la semivida de eliminación de las partículas \beta (t_{1/2}\beta = 1,57 horas); no obstante, el estimado concuerda estrechamente con las semividas anteriormente descritas para huGM-CSF que circula en un modelo de ratón. Los niveles de huGM-CSF sérico en los ratones que habían recibido microesferas descendieron rápidamente a lo largo de las primeras 6 horas después de la inyección (desde 218 a 35 ng/ml) y después permanecieron relativamente constantes durante los restantes 9 días del estudio. Presumiblemente, dado el perfil de cesión in vitro para este lote de microesferas (aproximadamente 30% de cesión al cabo de 9 días) el huGM-CSF pudo haberse liberado desde las microesferas más allá del período de 9 días en que se dio por terminado el estudio in vivo.

Como muestra la Figura 2 C, los resultados de cesión obtenidos in vivo fueron comparados con los resultados de cesión in vitro del modo siguiente: (1) los resultados obtenidos de la cesión in vitro fueron, en primer lugar, modelados matemáticamente para que se ajustaran a una serie de potencias; (2) se calculó luego un perfil teórico de concentración del huGM-CSF sérico, in vivo tomando un equilibrio de masas en un modelo de un solo compartimiento (es decir, la concentración de huGM-CSF en el ratón en cualquier momento, es igual a la concentración de huGM-CSF ya existente en el ratón en un punto de tiempo anterior más la cantidad de huGM-CSF liberada desde las microesferas durante tal período de tiempo menos la cantidad de huGM-CSF eliminado por los mecanismos fisiológicos normales de eliminación a lo largo del mismo período de tiempo). La comparación de concentración sérica que resulta, basada en los niveles de huGM-CSF sérico de cesión in vitro e in vivo, real, se indica en la Figura 2C. Como demuestra esta Figura los niveles de huGM-CSF sérico in vivo reales eran más bajos que los predichos por la cesión in vitro; sin embargo, los perfiles eran similares en cuanto a su forma y notablemente próximos en valores en puntos de tiempo más tardíos.

La bioactividad de huGM-CSF liberado desde microesferas, in vivo, fue estimada mediante el bioensayo de TF-1. El tanto por ciento de bioactividad específica varió desde un valor alto de 67% en 1 hora y gradualmente descendió hasta un valor bajo de 33% al cabo de 9 días.

Ejemplo 5 Cesión de GM-CSF humano desde microesferas en un modelo de primate

Se prepararon microesferas que contenían huGM-CSF para inyectar in vivo en un modelo de mono Rhesus (Lote nº 9490-168, muestra "V4"). Las microesferas fueron caracterizadas primeramente in vitro para determinar la carga de proteínas (1,48% (p/p) mediante análisis de aminoácidos), la cinética de cesión (véase la Figura 3 A) y la bioactividad del material liberado mediante el bioensayo de TF-1 (véanse la Figuras 1 B y 3 B). En base al perfil de cesión in vitro, las microesferas fueron pesadas de tal modo que los primates pudieran recibir, aproximadamente, 25 \mug/kg/día durante 7 días. Se cargaron jeringuillas con microesferas que incluían un 6% extra para tener en cuenta el volumen retenido encontrado al inyectar (volumen retenido, 50 \mul para una jeringuilla de tuberculina de 1 cc). Tres primates recibieron inyecciones con microesferas que contenían GM-CSF. Un primate recibió microesferas placebo que no contenían GM-CSF. La cantidad de microesferas inyectada en cada uno de los primates fue 39,4 mg, 35,5 mg, 42,1 mg y 36,8 mg, para animales de 3,2 kg, 2,9 kg, 3,4 kg y 3,0 kg, respectivamente.

El vehículo de inyección para las microesferas era una solución acuosa de metilcelulosa de baja viscosidad que contenía metilcelulosa al 3% (p/p) Tween 80 al 0,1% y manitol al 4%.

Se recogieron muestras de suero y se analizaron para efectuar el recuento de glóbulos blancos de la sangre (WBC), el recuento absoluto de neutrófilos (ANC) y el recuento de plaquetas, los días 3 y 1 antes de la inyección, el día de la inyección y diariamente, después de la inyección, durante 10 días. Los recuentos de diarios de las células sanguíneas se muestran en la Figura 3C.

Los WBCs y ANCs estaban claramente elevados los días 1 hasta el 4 en cada uno de los animales que había recibido microesferas que contenían GM-CSF. No se midieron cambios en los recuentos de las células sanguíneas en el primate que había recibido la inyección del placebo.

Este ejemplo muestra que el GM-CSF humano recombinante liberado desde microesferas de PLGA, in vivo, es capaz de producir una respuesta biológica en un modelo no humano, de primate.

Una respuesta altamente inflamatoria localizada, apreciada en los monos, fue caracterizada por un hinchamiento importante localizado (un bulto de 1-2 cm de diámetro) en el sitio de la inyección, como resultado de la reunión de neutrófilos, macrófagos, células dendríticas y monocitos.

Ejemplo 6 Cesión de GM-CSF partiendo de un gel de PLGA

Se preparó una solución al 20% de PLGA (relación de glicolida a lactida 50:50, viscosidad intrínseca (V.I.)0,38 dl/g, calentando 2 g de PLGA en 8 g de triacetato de glicerilo (triacetina) a 70ºC durante 30 minutos. Se añadió GM-CSF liofilizado a la solución de PLGA a 10 mg/ml y se sometió a sonicación para completar la mezcla. Se llenaron viales con el cuello a rosca (5 ml) con 3 ml de PBS y se añadieron a cada vial mediante pipeta, aproximadamente 250 \mug de la solución de PLGA/GM-CSF (conteniendo aproximadamente 2,5 mg de GM-CSF). Los viales fueron agitados suavemente a 37ºC durante 6 días. La solución inyectada formó un gel al inyectar en el PBS. A intervalos de 4 horas, 8 horas, 1 día, 3 días y 6 días, las soluciones fueron retiradas de los viales y analizadas para determinar el contenido de GM-CSF mediante un ensayo de proteína total, de BioRad.

La cinética de liberación de proteína se indica en la Fiigura 4 y muestra cinética de primer orden a lo largo de un período de seis días, aproximadamente.

Ejemplo 7 Preparación de microesferas usando un proceso de extracción con W/O/W-metanol (Lote nº 14254-138)

El polímero de encapsulación era una mezcla 70:20:10 de 1) un poli(glicolida-co-d,l-lactida) que tenía una relación de glicolida a lactida de 50:50 y una viscosidad intrínseca de 0,33 dl/g, determinada en solución al 0,1% en cloroformo, a 25ºC (polímero I), 2) un poli(L-lactida) con un peso molecular medio de 1786, determinado por titulación de grupo final (polímero II), y 3) un poli(d,l-lactida) con un peso molecular medio de 1938 determinado mediante titulación de grupo final (polímero III). Los polímeros fueron reprecipitados antes de su uso. La solución del polímero de encapsulación se preparó añadiendo 1,40 g de polímero I, 0,40 g de polímero II y 0,20 g de polímero III, a 8,00 g de cloruro de metileno y agitando la mezcla hasta que los polímeros se disolvieron.

Se preparó una solución acuosa de poli(alcohol vinílico) (PVA) al 5%, añadiendo 20,00 g de PVA de peso molecular bajo (P.M. = 31.000-50.000, hidrolizado 87-89%) a 380 g de agua desionizada, y agitando con calentamiento (a aproximadamente 70ºC) hasta que se disolvió el PVA. La solución se filtró a través de un filtro de 0.2 \mum después de enfriar a temperatura ambiente.

Se añadieron 0,389 ml de una solución de GM-CSF (aproximadamente 87,3 mg/ml en 100 ml de solución tampón de Tris 100 mM) a 8,50 g de la solución de polímero de encapsulación en un vaso de precipitados de vidrio, de 30 ml, y se homogeneizó con una cabeza de 20 mm a 6000 rpm, durante 80 segundos, para crear una emulsión de agua-en-aceite (W/O).

La emulsión anterior se añadió a 400 g de la solución de PVA al 5%, en un recipiente de acero inoxidable, mientras se agitaba con un homogeneizador a 6000 rpm, usando una cabeza de 20 mm para crear una emulsión de agua-en-aceite-en-agua (W/O/W). El tiempo total transcurrido fue 1 minuto.

El recipiente que contenía la emulsión W/O/W se colocó en un mezclador provisto de un "dispersor de alta cizalla" y se agitó a 400 rpm. Se añadieron 400 g de metanol a la emulsión W/OW a lo largo de un período de 45 minutos para extraer el cloruro de metileno desde las microesferas. Se continuó agitando otros 45 minutos después de la adición de metanol.

Se recogieron las microesferas, se secaron y se determinó la distribución del tamaño de partícula según se ha descrito anteriormente.

La muestra tenía un diámetro medio volumétrico de 24,1 \mum, el 10% de las microesferas estaban por debajo de 10,8 \mum y el 90% de las microesferas estaban por debajo de 42,3 \mum.

Ejemplo 8 Preparación de microesferas usando un proceso de extracción con W/O/W-metanol (Lote nº 14254-160)

El polímero de encapsulación era una mezcla 80:10:10 de 1) un poli(glicolida-co-d,l-lactida) que tenía una relación de glicolida a lactida de 50:50 y una viscosidad intrínseca de 0,33 dl/g, determinada en solución al 0,1% en cloroformo, a 25ºC (polímero I), 2) un poli(L-lactida) con un peso molecular medio de 1786, determinado por titulación de grupo final (polímero II), y 3) un poli(d,l-lactida) con un peso molecular medio de 1938 determinado mediante titulación de grupo final (polímero III). Los polímeros fueron reprecipitados antes de su uso. La solución del polímero de encapsulación se preparó añadiendo 1,60 g de polímero I, 0,20 g de polímero II y 0,20 g de polímero III, a 8,00 g de cloruro de metileno y agitando la mezcla hasta que los polímeros se disolvieron.

La emulsión anterior se añadió a 400 g de la solución de PVA al 5%, en un recipiente de acero inoxidable, mientras se agitaba con un homogeneizador a 6000 rpm usando una cabeza de 20 mm para crear una emulsión de agua-en-aceite-en-agua (W/O/W). El tiempo total transcurrido fue 1 minuto.

El recipiente que contenía la emulsión W/O/W se colocó en un mezclador provisto de un "dispersor de alta cizalla" y se agitó a 400 rpm. Se añadieron 400 g de metanol a la emulsión W/OW con velocidad constante, a lo largo de un período de 5 minutos para extraer el cloruro de metileno desde las microesferas. Se continuó agitando otros 85 minutos después de la adición de metanol.

La muestra tenía un diámetro medio volumétrico de 26,1 \mum, el 10% de las microesferas estaban por debajo de 111,6 \mum y el 90% de las microesferas estaban por debajo de 46,7 \mum.

Ejemplo 9 Preparación de microesferas, Lote nº 14259-100 (Hidrogel), mediante un proceso de extracción con W/O/W-metanol

El polímero de encapsulación era un tripolímero de bloques (67:23:10) de caprolactona, tricarbonato de metileno y polióxido de etileno 8000. Se mezclaron 3,27 g del polímero con 18,53 g de cloruro de metileno y se agitó hasta que se disolvió el polímero.

Se preparó una solución acuosa al 1% de polialcohol vinílico (PVA) añadiendo 1,0 g de PVA de peso molecular bajo (P.M. 31.000-50.000) a 1089,00 g de agua desionizada y agitando con calentamiento (a aproximadamente 70ºC) hasta que el PVA se disolvió La solución se filtró a través de un filtro de 0,2 \mum después de enfriar a temperatura ambiente.

0,174 ml de una solución de GM-CSF (87,1 mg/ml en solución tampón de Tris 100 mM) se añadió a una porción de 10,00 g de la solución del polímero de encapsulación en un vaso de precipitados de vidrio de 30 ml, y se homogeneizó con una cabeza de 20 mm a 6000 rpm durante 60 segundos para crear una emulsión de agua-en-aceite (W/O).

La emulsión anterior se añadió a una porción de 500 g de la solución al 1% de PVA en un recipiente de acero inoxidable mientras se agitaba con un homogeneizador a 6000 rpm usando una cabeza de 20 mm para crear una emulsión de agua-en-aceite-en-agua (W/O/W). El tiempo total transcurrido fue 1 minuto.

El recipiente que contenía la emulsión W/O/W se colocó en un mezclador provisto de un "dispersor de alta cizalla" y se agitó a 400 rpm. Se hicieron pasar 500 g de metanol a la solución W/O/W a lo largo de un período de 5 minutos para extraer el cloruro de metileno desde las microesferas. Se continuó agitando durante otros 55 minutos después de la adición del metanol.

Se recogieron las microesferas, se secaron y se determinó la distribución del tamaño de partícula con un Malvern 2600 Particle Sizer. Aproximadamente 50 mg de microesferas se suspendieron en 10 ml, aproximadamente, de metanol y se sometió a sonicación durante 2 minutos para dispersar completamente las microcápsulas. Algunas gotas de esta suspensión se añadieron luego a la cubeta óptica que contenía metanol Después se midió la distribución del tamaño de partícula. La muestra tenía un diámetro medio volumétrico de 68,3 \mum, el 10% de las microesferas estaban por debajo de 14,3 \mum y el 90% de las microesferas estaban por debajo de 177,3 \mum.

Ejemplo 10 Extracción de GM-CSF desde microesferas para la determinación de bioactividad, in vivo

Este método de extracción de la proteína desde las microesferas es tanto cuantitativo como no destructivo y por tanto puede ser utilizado para determinar la integridad de la proteína incorporada. Aproximadamente 20 mg de microesferas (Lotes L3, M3, N3, K3, J3 y E3) preparados mediante el método de separación de fases descrito en el Ejemplo 1, fueron pesados en un tubo Eppendorf de 2 ml. Se añadió entonces 500 \mul de ácido acético glacial, se taparon los tubos y se sometieron periódicamente a agitación con formación de vórtice para disolver completamente las microesferas. Después se añadió 500 \mul de cloruro de metileno, se taparon los tubos y se sometió periódicamente a agitación con formación de vórtice durante 5 minutos aproximadamente. Finalmente se añadió 500 \mul de PBS y, de nuevo, los tubos se taparon y se sometió continuamente a agitación con formación de vórtice durante 2 minutos aproximadamente. Seguidamente los tubos tapados fueron sometidos a centrifugación a alta velocidad durante 2 minutos para facilitar la separación de la fase acuosa y de la fase de disolvente orgánico. Se determinó la absorbancia en 280 nm de la capa acuosa superior (1 ml) que contenía el GM-CSF y se calculó la concentración de GM-CSF en mg/ml dividiendo la absorbancia por el coeficiente de extinción de 1,08. Las muestras fueron sometidas luego a bioensayo de TF1 para determinar la bioactividad del GM-CSF.

La Figura 5 muestra el tanto por ciento de bioactividad del GM-CSF extraído desde las microesferas. El testigo es una muestra acuosa de GM-CSF que ha sido sometida al mismo proceso de extracción Estos resultados indican que el GM-CSF extraído desde las microesferas ha retenido su bioactividad completa.

Ejemplo 11 Preparación de microesferas de PLGA y perfiles de degradación del PLGA

Se prepararon microesferas que contenían PLGA de 0,7 dl/g de viscosidad intrínseca (V.I.) Cytec al 100%, PLA R104 al 100%, y una mezcla 80:20 del PLGA:PLA mediante el proceso de endurecimiento con aceite de silicona. Muestras de cada una de estas microesferas fueron incubadas a 37ºC en el seno de PBS durante períodos de 1, 2, 4, 6, 8, 10, 14, 28, 42 y 56 días. Después de incubar las microesferas fueron disueltas en tetrahidrofurano (THF) para preparar soluciones de 1 a 2% (peso de microesferas/volumen de THF). Luego se analizaron las muestras por cromatografía de penetrabilidad en gel (GPC) usando un sistema de HPLC de Waters con una columna estiragel HR-4E (Waters) que se mantuvo a 30ºC a lo largo de toda la operación de GPC. Se usaron paran calibrar la columna patrones de poliestireno de intervalo estrecho de pesos moleculares. Los pesos moleculares medios ponderales y numéricos de los polímeros PLGA degradados fueron determinados con el soporte lógico de GPC Millenium (Waters). La Figura 6 ilustra los pesos moleculares medios ponderales de cada una de las formulaciones de microesferas en función del tiempo de incubación. Ha de apreciarse que la degradación de microesferas preparadas a partir del PLGA de V.I. 0,7 Cytec al 100 fue incompleta a lo largo de un período de incubación de 14 días mientras que la mezcla 80:20 de Cytec 0,7 V.I./R104 estaba esencialmente degradada. En este ejemplo el PLA R104 actuó como intensificador de la degradación de las microesferas.

Modificaciones y variaciones de las composiciones y métodos de fabricación y uso que se describen en esta memoria, serán evidentes para los expertos en la técnica teniendo en cuenta la descripción anterior. Se determina que tales modificaciones y variaciones están comprendidas dentro del alcance de las reivindicaciones que se acompañan.

Claims

1. Micropartículas que comprenden GM-CSF disperso dentro de micropartículas poliméricas sintéticas, formadas a partir de una mezcla de dos o más polímeros sintéticos biodegradables, seleccionados entre el grupo que consta de polihidroxiácidos, polianhídridos, poliortoésteres, polifosfazenos, y sus copolímeros, que proporcionan cesión prolongada en condiciones fisiológicas.

2. Micropartículas según la reivindicación 1, en las que al menos uno de los polímeros está seleccionado entre el grupo que consta de polihidroxiácidos, polianhídridos, poliortoésteres, y sus combinaciones.

3. Micropartículas según las reivindicaciones 1 y 2, en las que al menos uno de los polímeros es bioadhesivo.

4. Micropartículas según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en las que al menos uno de los polímeros es quimioatractivo para los glóbulos blancos.

5. Micropartículas según la reivindicación 2, en las que al menos uno de los polímeros está seleccionado entre el grupo que consta de poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico), y sus copolímeros.

6. Micropartículas según la reivindicación 5, en las que los polímeros son copolímeros de polilactida-co-glicolida que poseen pesos moleculares medios ponderales seleccionados entre los de entre 1000 y 20.000 D, entre 20.000 y 35.000 D y entre 35.000 y 70.000 D.

7. Micropartículas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las que el GM-CSF es liberado durante un período de entre tres y siete días.

8. Micropartículas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las que la cesión se aproxima a cesión de orden cero o cesión de primer orden.

9. Micropartículas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en las que más del 60% del GM-CSF es biológicamente activo.

10. Micropartículas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprenden, además, compuestos seleccionados entre el grupo que consta de estabilizantes, agentes complejantes, agentes de formación de poros, intensificadores de degradación excipientes ácidos y excipientes básicos.

11. Micropartículas que comprenden una mezcla de tres o más polímeros seleccionados entre el grupo que consta de poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) y copolímeros de poli(ácido láctico-ácido glicólico) que poseen pesos moleculares diferentes, que tienen disperso en ellos un compuesto que ha de ser liberado.

12. Micropartículas según la reivindicación 11, en las que los polímeros son copolímeros de poli(ácido láctico-ácido glicólico) que poseen pesos moleculares diferentes.

13. Micropartículas según la reivindicación 12, en las que los polímeros poseen pesos moleculares medios ponderales de entre 1000 y 20.000 D, entre 20.000 y 35.000 D y entre 35.000 y 70.000 D.

14. Micropartículas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprenden, además, un polímero bioadhesivo seleccionado entre polímeros hidrófilos, polímeros rápidamente bioerosionables, proteínas, polisacáridos, poliamidas, policarbonatos, polialquilenos, polialquilenglicoles, poli(óxidos de alquileno), poli(tereftalatos de alquileno), poli(alcoholes vinílicos), poli(éteres vinílicos), poli(ésteres vinílicos), poli(haluros vinílicos), polivinilpirrolidona, poliglicolidas, polisiloxanos, poliuretanos, celulosas con inclusión de alquilcelulosas, hidroxialquilcelulosas, éteres de celulosa, ésteres de celulosa, y nitrocelulosas, polímeros de ésteres acrílicos y metacrílicos, poli(lactida-co-glicolia), polianhídridos, poliortoésteres, sus mezclas y sus copolímeros.

15. Micropartículas que comprenden GM-CSF disperso dentro de micropartículas poliméricas sintéticas, formadas a partir de una mezcla de dos o más polímeros sintéticos biodegradables, seleccionados entre el grupo que consta de polihidroxiácidos, polianhídridos, poliortoésteres, polifosfazenos, y sus copolímeros, que proporcionan cesión prolongada en condiciones fisiológicas, para usar en medicina.

16. Micropartículas que comprenden una mezcla de tres o más polímeros seleccionados entre el grupo que consta de poli(ácido láctico), poli(ácido glicólico) y copolímeros de poli(ácido láctico-ácido glicólico), que poseen pesos moleculares diferentes, que tienen disperso en ellos un compuesto a ser liberado, para usar en medicina.

17. El uso de micropartículas que comprenden GM-CSF disperso dentro de micropartículas poliméricas sintéticas, formadas a partir de una mezcla de dos o más polímeros sintéticos biodegradables, seleccionados entre el grupo que consta de polihidroxiácidos, polianhídridos, poliortoésteres, polifosfazenos, y sus copolímeros, que proporcionan cesión prolongada en condiciones fisiológicas, para la preparación de un medicamento para favorecer la proliferación y diferenciación de células progenitoras hematopoyéticas.