ES2229355T3 - Procedimiento para la fabricacion de complejos medicamentosos. - Google Patents
Procedimiento para la fabricacion de complejos medicamentosos.Info
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Abstract
SE PRESENTA UN PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR UN COMPLEJO MEDICAMENTOSO EN EL CUAL UN DERIVADO QUE TIENE GRUPOS DE CARBOXILO Y UN RESIDUO DE UN COMPUESTO MEDICAMENTOSO SE UNEN ENTRE SI POR MEDIO DE UN SEPARADOR QUE COMPRENDE UN AMINO-ACIDO O DE UN SEPARADOR QUE COMPRENDE UN PEPTIDO UNIDO A LOS AMINOACIDOS DE 2 A 8, O UN COMPLEJO MEDICAMENTOSO EN EL CUAL UN DERIVADO DEL POLISACARIDO QUE TIENE GRUPOS DE CARBOXILO Y UN RESIDUO DE UN COMPUESTO MEDICAMENTOSO SE UNEN ENTRE SI SIN EL SEPARADOR, QUE SE CARACTERIZA EN QUE LA SAL DE AMINO ORGANICO DEL DERIVADO DEL POLISACARIDO QUE TIENE GRUPOS DE CARBOXILO SE HACE REACCIONAR CON EL COMPUESTO MEDICAMENTOSO O EL SEPARADOR SE UNE CON EL COMPUESTO MEDICAMENTOSO EN UN SISTEMA NO ACUOSO. LA REACCION ENTRE EL DERIVADO DEL POLISACARIDO QUE TIENE GRUPOS DE CARBOXILO DEL COMPUESTO MEDICAMENTOSO UNIDO CON EL SEPARADOR O SIMILAR PUEDE LLEVARSE A CABO CON UN GRAN RENDIMIENTO, Y CUANDO EL COMPUESTO MEDICAMENTOSO QUE TIENE UN ANILLO DE LACTONA SE EXPONE A LA REACCION,PUEDEN REDUCIRSE LAS REACCIONES COLATERALES.
Description
Procedimiento para la fabricación de complejos
medicamentosos.
La presente invención se refiere a un
procedimiento para la fabricación de un complejo medicamentoso en el
cual están ligados entre sí un derivado de polisacárido y un
compuesto medicamentoso, tal como un agente neoplásico.
Los agentes antineoplásicos, utilizados para el
tratamiento de cánceres sólidos tales como cáncer de pulmón o
carcinomas de órganos digestivos, y cánceres de sangre tal como
leucemia, se administran sistémicamente a través de rutas como la
administración intravenosa u oral y luego se distribuyen hasta
localizaciones tumorales específicas, e inhiben o suprimen la
proliferación de células cancerosas para mostrar su eficacia
terapéutica. Sin embargo, los agentes neoplásicos administrados
sistémicamente son rápidamente asimilados por el hígado y órganos
retículoendoteliales desde la sangre, o rápidamente excretados en
la orina y, por tanto, su concentración en sangre puede reducirse
en ocasiones hasta ser insuficiente para su distribución en áreas
tumorales. Además, los agentes neoplásicos comunes presentan escasa
capacidad de distribución hacia áreas tumorales (selectividad
tumoral) y, por tanto, los agentes neoplásicos se distribuyen
uniformemente en diversos tejidos y células de todo el cuerpo y
actúan como citotoxinas también contra células y tejidos normales,
lo cual se traduce en problemas de aparición de efectos adversos,
por ejemplo emesis, pirexia o alopecia, en una proporción muy alta.
Por tanto, era deseable desarrollar un medio de distribución
eficiente y selectiva de agentes neoplásicos hacia áreas
tumorales.
El documento EP 757049 A1 describe, según el
artículo 54.3 del CPE, un derivado de camptotecina y un
procedimiento para su preparación. Los derivados de camptotecina
presentan una actividad antitumoral incrementada y se preparan
mediante combinación del hidrocloruro del compuesto medicamentoso
con la sal sódica de un polisacárido en un sistema equivalente.
El documento EP 059221 A1 describe composiciones
medicinales para el tracto gastrointestinal. La composición
comprende una sal hidrosoluble del ácido algínico como su
ingrediente activo. Como sal hidrosoluble se utiliza sal amónica y
sal amina.
El documento JP 57046920 A describe en forma
similar un medicamento para los órganos digestivos que contiene
como ingrediente activo una sal hidrosoluble del ácido algínico.
Las sales preferibles son las sódicas, potásicas, amónicas y
aminas. El medicamento presenta actividad protectora de la mucosa
del órgano digestivo y actividad hemostática del órgano
digestivo.
Como uno de tales medios, se ha propuesto un
procedimiento en el cual se utiliza como
transportador-suministrador del medicamento un
derivado de polisacárido que presenta grupos carboxilo, y un agente
antineoplásico está ligado al derivado polisacárido para retrasar
la desaparición del agente antineoplásico de la sangre y mejorar la
selectividad hacia tejidos tumorales. Por ejemplo, la publicación
internacional W094/19376 describe un complejo medicamentoso en el
cual una cadena peptídica (número de residuos aminoácidos: 1 a 8)
está ligada a un grupo carboxilo de un polisacárido que presenta
grupos carboxilo, y adicionalmente está ligada doxorrubicina,
daunorrubicina, mitomicina C, bleomicina, o similares, por medio de
la cadena peptídica. Además, la publicación de la patente japonesa
(KOKOKU) nº (Hei) 7-84481/1995 describe un complejo
medicamentoso en el cual el agente antineoplásico antes mencionado
se introduce en un derivado de manoglucano carboximetilado por
medio de una base Schiff o un enlace ácido-amida.
Estos complejos medicamentosos se caracterizan porque poseen una
actividad antitumoral mejorada en comparación con el agente
antitumoral aislado, que no está ligado a un
transportador-suministrador del medicamento, y
toxicidad y efectos adversos reducidos.
En cuanto a las tecnologías relativas a complejos
medicamentosos utilizando derivados polisacáridos polialcoholizados
como transportadores-suministradores del
medicamento, están disponibles algunos informes, por ejemplo,
"Researches on
polysaccharide-peptide-doxorubicin
complexes - Correlations between stabilities of polysaccharide
carriers in blood and their anti-neoplastic
activities" (Abstracts of 10th Meeting of the Japan
Society of Drug Delivery System, 279, 1994); "Researches
on
polysaccharide-peptide-doxorubicin
complexes - Pharmacokinetics and anti-neoplastic
activity" (Abstracts of 9th Annual Meeting of Japanese
Society for the study of xenobiotics, 292, 1994); Abstracts
of 19th Seminar of Trends in Research and Development
(organizada por The Organization for Drug A D R Relief. R&D
Promotion and Product Review), D-9, 1995; y
"Researches on drug delivery to a tumor tissue by
polysaccharide carriers" (Abstracts of 12th Colloid and
Interface Technology Symposium, The Chemical Society of Japan, 51,
1995).
Estos complejos medicamentosos se han fabricado
convencionalmente preparando la sal sódica de un derivado de
polisacárido que presenta grupos carboxilo, por ejemplo
carboximetilpululano o carboximetilmanoglucano, y luego enlazando
un grupo carboxilo del derivado polisacárido a un grupo amino de un
agente antitumoral (o un grupo amino N-terminal de
una cadena peptídica enlazado al agente antitumoral) por medio de
un enlace ácido-amida. La sal sódica de derivados
polisacáridos es totalmente insoluble al menos en disolventes
orgánicos y, por tanto, cuando se realiza la reacción anterior, se
ha adoptado el procedimiento que comprende preparar la sal sódica
de un derivado de polisacárido como una solución en agua o un
disolvente orgánico acuoso que contenga agua, y luego disolver en la
solución un agente condensador y un agente antitumoral (o un agente
antitumoral que posea una cadena peptídica) en forma de
hidrocloruro o similar.
Sin embargo, en la reacción, la condensación por
deshidratación se realiza en un disolvente que contiene agua y, por
tanto, era imposible obtener el producto deseado con altos
rendimientos. Los agentes antitumorales utilizados como materiales
de reacción son caros generalmente, y resultaba deseable
desarrollar un procedimiento para producir eficientemente los
complejos medicamentosos antes mencionados desde el punto de vista
del coste de fabricación. Además, los compuestos descritos en la
publicación de la patente japonesa sin examinar (KOKAI) nº (Hei)
6-87746/1994, que son útiles como agentes
antitumorales, presentan un anillo lactona en sus moléculas y
entonces aparecen problemas, ya que cuando estos compuestos, cada
uno ligado a una cadena peptídica, se someten a la reacción antes
mencionada, el anillo lactona se abre en presencia de una base y
agua, y el grupo carboxilo resultante puede reaccionar con el grupo
amino N-terminal de la cadena peptídica ligada al
agente antitumoral para reducir apreciablemente el rendimiento del
producto deseado y fracasar en la obtención del deseable complejo
medicamentoso uniforme. Por tanto, se ha buscado desarrollar un
método de reacción que pueda evitar la generación de compuestos
cuyo anillo lactona se abra.
Un objetivo de la presente invención es
proporcionar un procedimiento para producir eficientemente
complejos medicamentosos que son capaces de hacer llegar con
selectividad de localización un ingrediente activo, tal como agentes
antitumorales o agentes anti-inflamatorios, hacia
áreas tumorales o similares. Más específicamente, el objetivo de la
presente invención es proporcionar un procedimiento capaz de
producir los complejos medicamentosos en gran escala y a bajo coste
haciendo reaccionar eficientemente un derivado de polisacárido que
presenta grupos carboxilo con un compuesto medicamentoso, tal como
un agente antitumoral, o con un espaciador que comprende un
oligopéptido o similar que está ligado a un compuesto
medicamentoso.
Para lograr tales objetivos, los inventores de la
presente realizaron intensivas investigaciones, y como resultado
hallaron que cuando se hace reaccionar un derivado de polisacárido
que presenta grupos carboxilo con un compuesto medicamentoso o con
un espaciador ligado a un compuesto medicamentoso, utilizando una
sal de amina orgánica del derivado polisacárido en lugar de la sal
sódica utilizada convencionalmente, la sal del derivado
polisacárido puede disolverse con una alta concentración en un
disolvente orgánico sustancialmente libre de agua, de forma que la
reacción de los derivados polisacáridos con el compuesto
medicamentoso o con el espaciador ligado al compuesto medicamentoso
puede realizarse con rendimientos extraordinariamente altos, y que
los subproductos o similares pueden ser reducidos. La presente
invención se logró con base en estos hallazgos.
La presente invención proporciona así un
procedimiento para la fabricación de un complejo medicamentoso en
el cual un derivado de polisacárido que presenta grupos carboxilo y
un residuo de un compuesto medicamentoso están ligados entre sí por
medio de un espaciador que comprende un aminoácido o un espaciador
que comprende 2 a 8 aminoácidos enlazados peptídicamente, o un
complejo medicamentoso en el cual un derivado de polisacárido que
presenta grupos carboxilo y un residuo de un compuesto
medicamentoso están ligados entre sí sin el espaciador,
caracterizado porque una sal de amina orgánica del derivado
polisacárido que presenta grupos carboxilo se hace reaccionar con
el compuesto medicamentoso o el compuesto medicamentoso ligado al
espaciador en un sistema no acuoso; y un procedimiento para la
fabricación del antes mencionado complejo medicamentoso, que
comprende las etapas de (1) convertir una sal de metal alcalino del
derivado polisacárido que presenta grupos carboxilo en una sal de
amina orgánica de dicho derivado, y (2) hacer reaccionar la sal de
amina orgánica con el compuesto medicamentoso o el compuesto
medicamentoso ligado al espaciador en un sistema no acuoso.
De acuerdo con realizaciones preferibles de la
presente invención, se proporciona el procedimiento anterior en el
cual el derivado de polisacárido que presenta grupos carboxilo es
un polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano; el
procedimiento anterior en el cual el polialcohol dextrano que
constituye el polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano es un
polialcohol dextrano obtenido mediante tratamiento de un dextrano
bajo condiciones que permiten una polialcoholización
sustancialmente completa; el procedimiento anterior en el cual el
polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano es un
polialcohol carboximetildextrano; el procedimiento anterior en el
cual el polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano es un
polialcohol carboximetildextrano que presenta un peso molecular en
el intervalo de 5.000 a 500.000, preferiblemente en el intervalo de
50.000 a 450.000, y más preferiblemente en el intervalo de 200.000
a 400.000, y el grado de carboximetilación por cada residuo
sacárido constitutivo está en el intervalo de 0,01 a 2,0,
preferiblemente en el intervalo de 0,1 a 1,0, y más preferiblemente
en el intervalo de 0,3 a 0,5; y el procedimiento anterior en el cual
el compuesto medicamentoso es un agente antineoplásico o un agente
anti-inflamatorio.
De acuerdo con realizaciones preferibles
adicionales de la presente invención, se proporciona el
procedimiento anterior en el cual el compuesto medicamentoso es un
compuesto que puede formar un anillo lactona; el procedimiento
anterior en el que un compuesto medicamentoso en el cual está
formado un anillo lactona o un espaciador ligado a un compuesto
medicamentoso en el cual está formado un anillo lactona es
utilizado para la reacción de la sal de amina orgánica con el
compuesto medicamentoso o con el espaciador ligado al compuesto
medicamentoso; y el procedimiento anterior en el cual el compuesto
medicamentoso que puede formar un anillo lactona es
(1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13(9H,15H)-diona.
La Figura 1 representa el diagrama GPC
(cromatografía de permeación de gel) del complejo medicamentoso del
Ejemplo 8 preparado mediante el procedimiento de la presente
invención.
La Figura 2 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso del Ejemplo 8 preparado
mediante el procedimiento de la presente invención.
La Figura 3 representa el diagrama GPC del
complejo medicamentoso del Ejemplo 9 preparado mediante el
procedimiento de la presente invención.
La Figura 4 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso del Ejemplo 9 preparado
mediante el procedimiento de la presente invención.
La Figura 5 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso del Ejemplo 10 preparado
mediante el procedimiento de la presente invención.
La Figura 6 representa el diagrama GPC del
complejo medicamentoso del Ejemplo 15 preparado mediante el
procedimiento de la presente invención.
La Figura 7 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso del Ejemplo 15 preparado
mediante el procedimiento de la presente invención.
La Figura 8 representa el diagrama GPC del
complejo medicamentoso del Ejemplo 28 preparado mediante el
procedimiento de la presente invención.
La Figura 9 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso del Ejemplo 28 preparado
mediante el procedimiento de la presente invención.
La Figura 10 representa el diagrama GPC del
complejo medicamentoso del Ejemplo 29 preparado mediante el
procedimiento de la presente invención.
La Figura 11 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso del Ejemplo 29 preparado
mediante el procedimiento de la presente invención.
La Figura 12 representa el diagrama GPC del
complejo medicamentoso del Ejemplo 34 preparado mediante el
procedimiento de la presente invención.
La Figura 13 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso del Ejemplo 34 preparado
mediante el procedimiento de la presente invención.
La Figura 14 representa el diagrama GPC del
complejo medicamentoso del Ejemplo 39 preparado mediante el
procedimiento de la presente invención.
La Figura 15 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso del Ejemplo 39 preparado
mediante el procedimiento de la presente invención.
La Figura 16 representa el diagrama GPC del
complejo medicamentoso del Ejemplo 41 preparado mediante el
procedimiento de la presente invención.
La Figura 17 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso del Ejemplo 41 preparado
mediante el procedimiento de la presente invención.
La Figura 18 representa el diagrama GPC del
complejo medicamentoso del Ejemplo 44 preparado mediante el
procedimiento de la presente invención.
La Figura 19 representa el espectro de absorción
ultravioleta del complejo medicamentoso del Ejemplo 44 preparado
mediante el procedimiento de la presente invención.
La Figura 20 representa la farmacocinética del
complejo medicamentoso del Ejemplo 15 preparado mediante el
procedimiento de la presente invención. Cada punto en la figura
representa un valor promedio de tres experimentos.
El complejo medicamentoso preparado mediante el
procedimiento según la presente invención se caracteriza porque un
derivado de polisacárido que presenta grupos carboxilo y un residuo
de un compuesto medicamentoso están ligados entre sí por medio de
un espaciador que comprende un aminoácido o un espaciador que
comprende 2 a 8 aminoácidos enlazados peptídicamente, o un derivado
de polisacárido que presenta grupos carboxilo y un residuo de un
compuesto medicamentoso están ligados entre sí sin el espaciador.
El residuo de un compuesto medicamentoso contenido en el complejo
se deriva de un compuesto medicamentoso utilizado como un
medicamento para el tratamiento terapéutico y/o preventivo de
enfermedades de mamíferos incluyendo el humano, por ejemplo, un
agente antineoplásico, un agente anti-inflamatorio,
un agente antibacteriano, o similares, y el residuo está compuesto
de una estructura parcial del compuesto medicamentoso. Sin embargo,
el compuesto medicamentoso del cual se deriva el residuo no se
limita a los mencionados anteriormente. Además, como compuesto
medicamentoso, pueden ser utilizados cualesquiera compuestos
siempre que posean uno o más grupos funcionales reactivos capaces
de participar en la formación de enlace con un derivado de
polisacárido o un espaciador (por ejemplo, un grupo amino, grupo
carboxilo, grupo hidroxilo, grupo tiol, grupo éster o similares). En
la presente descripción el término "compuesto medicamentoso"
también incluye un profármaco que contiene, como parte de él, una
estructura principal de un compuesto medicamentoso que posee
actividad farmacológica propia y puede reproducir el compuesto
in vivo.
Más específicamente, en la presente descripción
el término "residuo del compuesto medicamentoso" significa una
estructura parcial derivada del compuesto medicamentoso existente
en el compuesto después de la formación del enlace, presumiendo que
se ha formado un enlace entre el derivado de polisacárido o el
espaciador y el residuo de un compuesto medicamentoso, a través de
una reacción de un grupo funcional reactivo del compuesto
medicamentoso y un grupo funcional reactivo del derivado
polisacárido o el espaciador (p.ej. condensación por deshidratación
etc.). Cuando el compuesto medicamentoso se representa, por
ejemplo, mediante D-NH_{2},
D-COOH, D-COOR,
D-OH, D-SH,
D-CONH_{2}, o
D-NH-COOR (R es un grupo alquilo
inferior o similar), el residuo del compuesto medicamentoso se
representa por
D-NH-(D-NH-CO-Q,
etc.),
D-CO-(D-CO-NH-Q,
D-CO-O-Q,
D-CO-S-Q, etc.),
D-CO-(D-CO-NH-Q,
D-CO-O-Q,
D-CO-S-Q, etc.),
D-O-(D-O-CO-Q,
D-O-Q, etc.),
D-S-(D-S-CO-Q,
D-S-Q, etc.),
D-CONH-(D-CO-NH-CO-Q,
etc.) y
D-NH-CO-(D-NH-CO-O-Q,
D-NH-CO-NH-Q,
etc.), respectivamente (el paréntesis representa un enlace entre el
espaciador o el derivado de polisacárido y el residuo del compuesto
medicamentoso, en el cual Q representa una estructura parcial
remanente del espaciador y el derivado polisacárido excluyendo un
grupo funcional reactivo y un grupo carboxilo, respectivamente).
Sin embargo, el tipo de enlace entre el espaciador o el derivado de
polisacárido y el residuo del compuesto medicamentoso no se limita a
los mencionados anteriormente. El residuo del compuesto
medicamentoso puede estar ligado a un grupo carboxilo del derivado
polisacárido, al grupo amino N-terminal o el grupo
carboxilo C-terminal del espaciador, o a un grupo
funcional reactivo existente en un aminoácido que constituye el
espaciador.
Por ejemplo, como residuo del compuesto
medicamentoso, pueden utilizarse preferiblemente residuos de agentes
neoplásicos tales como doxorrubicina, daunorrubicina, mitomicina C,
bleomicina, ciclocitidina, vincristina, vinblastina, metotrexato,
agentes neoplásicos platinados (cisplatino o sus derivados), taxol o
sus derivados, camptotecina o sus derivados (agentes neoplásicos
descritos en la publicación de la patente japonesa sin examinar
(KOKAI) nº (Hei) 6-87746/1994, preferiblemente
(1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':
6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13-(9H,15H)-diona
descrito en la reivindicación 2, o similares). Además, son también
preferibles residuos de agentes anti-inflamatorios
esteroides, tales como succinato de hidrocortisona y succinato de
prednisolona y agentes anti-inflamatorios no
esteroides, tales como ácido mefenámico, ácido flufenámico,
diclofenac, ibuprofeno y tinoridina.
El residuo del compuesto medicamentoso puede
ligarse directamente al polisacárido, o puede ligarse por medio de
un espaciador. Como espaciador, pueden utilizarse aquellos que
comprenden un aminoácido ó 2 a 8 aminoácidos enlazados
peptídicamente. Más específicamente, cuando el residuo del
compuesto medicamentoso y el derivado polisacárido están ligados
por medio de un espaciador, el espaciador adopta una forma de
residuo de un aminoácido, lo cual significa un residuo obtenido
mediante eliminación de un átomo de hidrógeno y un grupo hidroxilo
de un grupo amino y un grupo carboxilo del aminoácido,
respectivamente, o un residuo de un oligopéptido que comprende 2 a
8 aminoácidos enlazados peptídicamente, lo que significa un residuo
obtenido mediante eliminación de un átomo de hidrógeno y un grupo
hidroxilo del grupo amino N-terminal y el grupo
carboxilo C-terminal del oligopéptido,
respectivamente.
Espaciadores preferibles son los residuos de
oligopéptidos que comprenden 2 a 6 aminoácidos. El tipo del
aminoácido constitutivo del espaciador no está particularmente
limitado y, por ejemplo, pueden ser utilizados L- o
D-aminoácidos, preferiblemente
L-aminoácidos, y también pueden ser utilizados
\beta-alanina, ácido
\varepsilon-aminocapróico, ácido
\gamma-aminobutírico, o similares, así como
\alpha-aminoácidos. Estos aminoácidos, distintos
de los \alpha-aminoácidos, están situados
preferiblemente próximos al derivado de polisacárido en el
espaciador.
Por ejemplo, cuando se utiliza un espaciador
oligopeptídico, la dirección de enlace no está particularmente
limitada y, generalmente, la N-terminación del
espaciador puede estar ligada a un grupo carboxilo del polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano por
medio de un enlace ácido-amida, y la
C-terminación del espaciador puede estar ligada a un
grupo amino del compuesto medicamentoso. Alternativamente, por
ejemplo, cuando un residuo lisina se incorpora como una unidad
constitutiva del espaciador peptídico, se permite al grupo
\alpha-amino y al grupo
\varepsilon-amino del residuo lisina formar
respectivos enlaces ácido-amida con grupos carboxilo
de otros aminoácidos para formar N-terminaciones en
ambos extremos del espaciador peptídico, lo cual posibilita la
formación de enlaces con grupos carboxilo de los compuestos
medicamentosos. Además, incorporando en un espaciador uno o más
residuos de compuestos diamina o compuestos de ácido dicarboxílico
(residuos de compuestos diamina tales como etilenodiamina o
compuestos de ácido dicarboxílico tal como ácido succínico) como
unidades constitutivas, puede ser utilizado un espaciador que posee
tanto N-terminaciones como
C-terminaciones en ambos extremos.
Cuando se utiliza un espaciador que comprende un
oligopéptido, la secuencia aminoácida no está particularmente
limitada. Los espaciadores preferiblemente utilizados incluyen, por
ejemplo, un espaciador que es un residuo de un dipéptido
representado por -X-Z-, en el cual X representa un
residuo de un aminoácido hidrofóbico y Z representa un residuo de
un aminoácido hidrofílico; y X-Z- significa un
residuo que consta de un dipéptido que está formado por un enlace
peptídico entre un aminoácido hidrofóbico (X) y un aminoácido
hidrofílico (Z) en el extremo N-terminal y el
extremo C-terminal, respectivamente, y cuyo átomo
de hidrógeno y grupo hidroxilo son eliminados del grupo amino en la
N-terminación y el grupo carboxilo en la
C-terminación, respectivamente, y un espaciador que
contiene un residuo del dipéptido como una secuencia peptídica
parcial. Por ejemplo, como aminoácido hidrofóbico puede utilizarse
fenilalanina, tirosina, leucina o similares, y como aminoácido
hidrofílico pueden ser utilizados, por ejemplo, glicina, alanina o
similares. El espaciador puede presentar una secuencia repetida del
residuo dipeptídico (por ejemplo,
X-Z-X-Z-,
-X-Z-X-Z-X-Z-,
etc.).
Utilizando el espaciador que contiene tal
estructura dipeptídica, el espaciador puede ser hidrolizado en
áreas tumorales o zonas inflamatorias, que se consideran abundantes
en peptidasa, para liberar el compuesto medicamentoso con alta
concentración en dichos lugares y, por tanto, la estructura formada
mediante enlace entre el espaciador que contiene el anterior
dipéptido y el compuesto medicamentoso es una estructura parcial
preferible del complejo medicamentoso, de acuerdo con el
procedimiento de la presente invención. Cuando se utiliza un
residuo de un agente antineoplásico que presenta actividad
antineoplásica dependiente de su concentración (agentes neoplásicos
que poseen una más potente actividad antineoplásica a mayor
concentración: agentes neoplásicos dependientes de la
concentración, p.ej. doxorrubicina, etc.) como el residuo del
compuesto medicamentoso, puede utilizarse preferiblemente un
espaciador compuesto del anterior residuo dipeptídico representado
por -X-Z- o un espaciador que contiene el anterior
residuo dipeptídico como una secuencia peptídica parcial.
Además, cuando se utiliza como residuo del
compuesto medicamentoso un tipo de agente antineoplásico
dependiente del espacio de tiempo, el cual requiere un tiempo de
actividad sostenida bajo determinada concentración, puede obtenerse
algunas veces una actividad antineoplásica mejorada utilizando el
espaciador anterior. Los ejemplos incluyen los agentes neoplásicos
descritos en la publicación de la patente japonesa sin examinar
(KOKAI) nº (Hei) 6-87746/1994, preferiblemente el
agente antineoplásico descrito en la reivindicación 2.
Generalmente, el espaciador no se limita a los mencionados
anteriormente y es necesario elegir un espaciador apropiado desde
los puntos de vista del modo de actuación del agente antineoplásico,
características farmacocinéticas o aparición de toxicidad,
liberación in vivo del agente antineoplásico y otros. Para
carcinomas que presentan rápida proliferación, es preferible
generalmente elegir el espaciador anterior capaz de liberar el
compuesto medicamentoso con alta concentración en un corto
intervalo.
En la tabla siguiente se representan ejemplos
específicos del espaciador. Sin embargo, el espaciador utilizado en
el procedimiento para la fabricación de los complejos medicamentosos
de la presente invención no se limita a los mencionados más
adelante, y se comprende que un experto medio en la materia puede
seleccionar apropiadamente un espaciador para lograr un índice
óptimo de liberación de un compuesto medicamentoso. En la tabla, los
extremos izquierdos de las secuencias peptídicas son
N-terminaciones y los residuos de compuestos
medicamentosos están ligados a C-terminaciones.
D-Phe representa un residuo
D-fenilalanina y los otros aminoácidos representan
L-aminoácidos. Los grados del índice de liberación
fueron estimados a partir del grado de aparición de eficacia de los
complejos medicamentosos ligados con doxorrubicina experimentados en
ratas portadoras de tumores Walker 256, o a partir de la
concentración de doxorrubicina libre en áreas tumorales de ratas
portadoras de tumores Walker 256. Entre estos espaciadores, para
doxorrubicina se utiliza preferiblemente un espaciador que puede
liberar el compuesto medicamentoso con alta concentración en un
corto intervalo, por ejemplo
(N-terminación)-Gly-Gly-Phe-Gly-.
(a) Espaciadores que presentan alto índice de
liberación
- -Leu-Gly-
- -Tyr-Gly-
- -Phe-Gly-
- -Gly-Phe-Gly-
- -Gly-Gly-Phe-Gly-
- -Gly-Phe-Gly-Gly-
- -Phe-Gly-Gly-Gly-
- -Phe-Phe-Gly-Gly-
- -Gly-Gly-Gly-Phe-Gly-
(b) Espaciadores que presentan índices de
liberación relativamente altos
- -Gly-Gly-Phe-Phe-
- -Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-Gly-
(c) Espaciadores que presentan índices de
liberación relativamente bajos
- -Phe-Phe-
- -Ala-Gly-
- -Pro-Gly-
- -Gly-Gly-Gly-Phe-
(d) Espaciadores que presentan bajo índice de
liberación
- -Gly-
- -D-Phe-Gly-
- -Gly-Phe-
- -Ser-Gly-
- -Gly-Gly-
- -Gly-Gly-Gly-
- -Gly-Gly-Gly-Gly-
Como derivado polisacárido que presenta grupos
carboxilo y que constituye la fracción derivado de polisacárido del
complejo medicamentoso pueden ser utilizados, por ejemplo, cualquier
polisacárido y sus derivados química o biológicamente modificados
siempre que posean grupos carboxilo en sus moléculas. Por ejemplo,
pueden ser utilizados polisacáridos tales como ácido hialurónico,
ácido péctico, ácido algínico, condroitina y heparina; y
polisacáridos tales como pululano, dextrano, manano, quitina,
inulina, levan, xylan, araban, manoglucano y quitosano, en los
cuales todos o una parte de los grupos hidroxilo se introducen con
grupos funcionales que presentan un grupo carboxilo. Por ejemplo,
pueden utilizarse preferiblemente aquellos que presentan grupos
hidroxilo carboxi(C_{1-4})alquilados
o aquellos que poseen grupos hidroxilo esterificados con uno de los
grupos carboxilo de un ácido polibásico. Además, también pueden
utilizarse los obtenidos mediante polialcoholización de los
anteriores polisacáridos y posterior introducción de grupos
funcionales que poseen un grupo carboxilo.
Entre tales derivados polisacáridos, se prefiere
un polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano.
Aunque no está particularmente limitado el grado de
polialcoholización del polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano, es
preferible que el polialcohol dextrano que constituye el polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano sea
un polialcohol dextrano obtenido mediante tratamiento de un dextrano
bajo condiciones que posibiliten una polialcoholización
sustancialmente completa.
El tipo de dextrano utilizado para la preparación
del polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano no
está particularmente limitado, y el dextrano puede contener
\alpha-D-1,6-enlaces
en cualquier cantidad. Por ejemplo, pueden ser utilizados los
dextranos que contienen
\alpha-D-1,6-enlaces
en una tasa del 85% o más, 90% o más, y 95% o más. El peso molecular
del dextrano no está particularmente limitado y, por ejemplo, pueden
ser utilizados los dextranos que presentan un peso molecular desde
aproximadamente 10.000 hasta aproximadamente 2.000.000,
preferiblemente desde aproximadamente 50.000 hasta aproximadamente
800.000. Como grupo C_{1-4}alquilo que constituye
el grupo carboxi(C_{1-4})alquilo del
polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano,
pueden ser utilizados un grupo C_{1-4}alquilo
linear o ramificado, específicamente, grupo metilo, grupo etilo,
grupo n-propilo, grupo isopropilo, grupo
n-butilo, grupo sec-butilo o
similares, y puede utilizarse preferiblemente un grupo metilo.
El procedimiento de la presente invención se
caracteriza porque para preparar el complejo medicamentoso antes
mencionado, se hace reaccionar una sal de amina orgánica del
derivado polisacárido que presenta grupos carboxilo con el
compuesto medicamentoso aislado, o una sal de amina orgánica del
derivado polisacárido que presenta grupos carboxilo se hace
reaccionar con un espaciador ligado al compuesto medicamentoso en
un disolvente orgánico sustancialmente libre de agua, por ejemplo
un sistema no acuoso. Como una realización preferible del
procedimiento de la presente invención, un procedimiento que
utiliza un polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano como
el derivado de polisacárido será explicado específicamente más
adelante. Sin embargo, el objeto de la presente invención no está
limitado a dicha realización.
Cuando se utiliza un dextrano como un material de
partida, el dextrano puede ser tratado sucesivamente con un gran
exceso de periodato sódico y borohidruro sódico para obtener un
polialcohol dextrano sometido a una polialcoholización
sustancialmente completa. Sin embargo, el procedimiento para la
polialcoholización de dextranos no está limitado al procedimiento
mencionado anteriormente, y puede ser adoptado cualquier
procedimiento utilizable por los expertos en la materia. La
carboxi(C_{1-4})alquilación puede
ser realizada, por ejemplo, haciendo reaccionar un ácido
(C_{1-4})alquilcarboxílico halogenado tal
como ácido cloroacético, ácido bromoacético, ácido
\alpha-cloropropiónico, ácido
\alpha-metil-\alpha-cloropropiónico,
ácido \beta-cloropropiónico, ácido
\alpha-metil-\beta-cloropropiónico,
ácido \alpha-clorobutírico, ácido
\beta-clorobutírico o ácido
\gamma-clorobutírico, preferiblemente ácido
cloroacético, con grupos hidroxilo del polialcohol dextrano para
alcanzar una
carboxi(C_{1-4})alquilación parcial
o completa de los grupos hidroxilo.
Por ejemplo, el polialcohol dextrano se disuelve
en un disolvente inerte que no participa en las reacciones (p.ej.
agua, N,N-dimetilformamida, o dimetil sulfóxido) y
la solución se añade con un ácido
(C_{1-4})alquilcarboxílico halogenado o
una sal de éste en presencia de una base (p.ej. hidróxido sódico o
hidróxido potásico), y entonces se deja reaccionar la mezcla desde
varios minutos hasta varios días a una temperatura desde
enfriamiento con hielo hasta aproximadamente 100ºC. El grado de
introducción del grupo
carboxi(C_{1-4})alquilo puede ser
fácilmente controlado, por ejemplo mediante adecuada elección de
la temperatura de reacción de la
carboxi(C_{1-4})alquilación o la
cantidad de ácido
(C_{1-4})alquilcarboxílico halogenado o
las bases utilizadas como reactivos, y estos medios son bien
conocidos para los expertos en la materia. El grado de
carboxi(C_{1-4})alquilación para los
grupos hidroxilo del polialcohol dextrano no está particularmente
limitado y, por ejemplo, el grado puede estar en el intervalo de
0,01 a 2,0, preferiblemente de 0,1 a 1,0, y más preferiblemente de
0,3 a 0,5 por cada residuo del sacárido constitutivo. El peso
molecular del polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano es
desde aproximadamente 5.000 a 500.000, preferiblemente desde
aproximadamente 50.000 a 450.000, y más preferiblemente desde
aproximadamente 200.000 a 400.000, cuando se determina por el
método de filtración de gel.
El polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano
preparado según lo anterior está previsto como una solución acuosa
de una sal de metal alcalino, tal como la sal sódica o potásica. El
procedimiento de la presente invención se caracteriza porque se
utiliza una sal de amina orgánica del derivado polisacárido, en
lugar del anterior derivado polisacárido en forma de una sal de
metal alcalino, para la formación del enlace entre el compuesto
medicamentoso o el espaciador ligado al compuesto medicamentoso y
los grupos carboxilo del derivado polisacárido. La sal de amina
orgánica de los derivados polisacáridos puede disolverse con una
alta concentración en un disolvente orgánico sustancialmente libre
de agua y posibilita que la reacción se realice en un sistema no
acuoso y, por tanto, puede ser notablemente mejorada la eficiencia
de la reacción.
Por ejemplo, como sal de amina orgánica pueden
ser utilizadas sales de aminas alifáticas, tales como trietilamina,
trimetilamina, o trietanolamina; sales de aminas alicíclicas y
aromáticas tales como N-metilpirrolidina,
N-metilpiperidina, N-metilmorfolina,
o dimetil-aminopiridina; o sales de amonio
cuaternario tales como cloruro tetrametilamónico o cloruro
tetraetilamónico. La conversión desde la sal sódica del derivado
de polisacárido en la sal de amina orgánica puede ser realizada
utilizando una resina de intercambio fónico, o similar. Por
ejemplo, la sal sódica de polialcohol carboximetildextrano puede
disolverse en agua, aplicarse a una columna cargada con resina
Bio-Rad AG 50W-X2 (trama
200-400, tipo H^{+}), eluirse con agua, y luego
el efluente resultante puede ser adicionado con una amina orgánica,
tal como trietilamina, y ser liofilizado. Alternativamente, también
es posible realizar la conversión en una etapa, por ejemplo
disolviendo la sal sódica de un polialcohol carboximetildextrano en
agua y pasando la solución a través de resina tipo
trietilamónica.
El enlace entre el compuesto medicamentoso
aislado, y el grupo carboxilo del polialcohol carboximetildextrano,
o el enlace entre el espaciador ligado al compuesto medicamentoso y
el grupo carboxilo del polialcohol carboximetildextrano, puede
estar formado generalmente enlazando un grupo amino reactivo del
compuesto medicamentoso, o el grupo amino N-terminal
del espaciador, a un grupo carboxilo del polialcohol
carboximetildextrano por medio de un enlace
ácido-amida. Sin embargo, el enlace entre el
compuesto medicamentoso o el espaciador y el grupo carboxilo del
polialcohol carboximetildextrano no está limitado al enlace antes
descrito, y pueden ser utilizados otros enlaces químicos y enlaces
utilizando uno o más espaciadores. Por ejemplo, puede estar formado
un anhídrido ácido entre el grupo carboxilo
C-terminal del espaciador o un grupo carboxilo del
compuesto medicamentoso y un grupo carboxilo del polialcohol
carboximetildextrano, o utilizando un compuesto diamina, tal como
etilenodiamina, como un espaciador. Cada uno de los grupos
carboxilo puede estar ligado por medio de un enlace
ácido-amida a cada uno de los grupos amino del
compuesto diamina.
Cuando el grupo amino reactivo sustituido en el
compuesto medicamentoso, o el grupo amino
N-terminal del espaciador, está ligado a un grupo
carboxilo del polialcohol carboximetildextrano por medio de un
enlace ácido-amida, pueden ser utilizados agentes
de condensación por deshidratación ordinariamente utilizados para
síntesis de cadenas peptídicas, por ejemplo,
N,N'-dicicloalquilcarbodiimidas, tal como
N,N'-diciclohexilcarbodiimida (DCC), derivados de
carbodiimida, tal como
1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)carbodiimida
(EDAPC), derivados de benzotriazol, tal como
1-hidroxibenzotriazol (HOBT),
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(EEDQ), y similares. Además, la reacción también puede ser
realizada mediante el procedimiento de éster activado o el
procedimiento de ácido haluro.
La reacción puede ser realizada con cualquier
disolvente orgánico siempre que esté sustancialmente libre de agua
y pueda disolver los reactantes (la sal de amina orgánica de
polialcohol carboximetildextrano y el compuesto medicamentoso o el
espaciador ligado al compuesto medicamentoso). Por ejemplo, pueden
utilizarse preferiblemente N,N-dimetilformamida,
dimetil sulfóxido, acetoamida, N-metilpirrolidona,
sulfolano y similares. Aunque no está particularmente limitada la
cantidad del residuo del compuesto medicamentoso, que se introduce
en el polialcohol carboximetildextrano mediante la reacción con el
compuesto medicamentoso o el espaciador ligado al compuesto
medicamentoso, dicha cantidad debe ser adecuadamente seleccionada
desde los puntos de vista de las propiedades
físico-químicas del residuo del compuesto
medicamentoso, farmacocinética, eficacia y toxicidad del complejo
medicamentoso. Generalmente, puede ser elegido el intervalo desde
0,1 a 30% en peso aproximadamente, y preferiblemente desde 1 a 15%
en peso aproximadamente. La proporción del residuo del compuesto
medicamentoso introducido en el polialcohol carboximetildextrano
puede ser fácilmente determinada, por ejemplo, mediante análisis
espectrométrico de absorción.
Como una realización preferible del procedimiento
de fabricación de la presente invención, el siguiente esquema
representa el procedimiento para introducir el oligopéptido ligado
al compuesto medicamentoso, que es el agente antineoplásico
descrito en la reivindicación 2 de la publicación de la patente
japonesa sin examinar (KOKAI) nº (Hei)
6-87746/1994, en un polialcohol
carboximetildextrano. Sin embargo, los procedimientos de la
presente invención no se limitan a los representados. En el esquema
siguiente, la cantidad introducida del residuo del compuesto
medicamentoso es, por ejemplo, desde aproximadamente 1 a 15% en
peso, preferiblemente desde 4 a 8% en peso aproximadamente. Además,
entre las unidades constitutivas de los polialcoholes, solamente
una unidad constitutiva, que se introduce con uno o dos grupos
carboximetilo, se representa como ejemplo en el esquema siguiente.
Sin embargo, debe entenderse que la fracción derivado de
polisacárido del complejo medicamentoso no está formada por la
repetición de la antes mencionada unidad constitutiva.
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(Esquema pasa a página
siguiente)
Es conocido que el equilibrio del compuesto
medicamentoso en el esquema anterior se sitúa en el compuesto cuyo
anillo lactona está cerrado (el compuesto de anillo cerrado) en un
medio acuoso ácido (por ejemplo, a pH 3 aproximadamente), mientras
que el equilibrio se sitúa en el compuesto cuyo anillo lactona está
abierto (el compuesto de anillo abierto) en un medio acuoso básico
(por ejemplo, a pH 10 aproximadamente), y el complejo medicamentoso
introducido con el residuo correspondiente al compuesto de anillo
cerrado o de anillo abierto posee similar actividad antineoplásica.
Sin embargo, cuando un reactante, cuyo anillo lactona está abierto,
está presente en el sistema para la reacción entre el polialcohol
carboximetildextrano y el espaciador ligado al antes mencionado
compuesto medicamentoso (p.ej. un espaciador oligopeptídico), la
reacción de condensación progresará entre un grupo carboxilo
derivado del anillo lactona y un grupo amino derivado del
espaciador, lo cual resulta en un apreciable descenso del
rendimiento de la reacción y, además, algunas veces no puede
obtenerse un deseable complejo medicamentoso uniforme. Dicha
reacción colateral puede ser evitada utilizando el compuesto de
anillo cerrado como reactante en un sistema no acuoso que no
permite el equilibrio. Por tanto, el procedimiento de la presente
invención es particularmente adecuado para preparar el complejo
medicamentoso que contiene el compuesto medicamentoso antes
mencionado.
El complejo medicamentoso antes mencionado
preparado según el procedimiento de la presente invención se
caracteriza porque puede presentar una actividad farmacológica
específicamente deseada en una localización definida, tal como
áreas tumorales o zonas inflamatorias, dependiendo del tipo de
residuo del compuesto medicamentoso (p.ej. el residuo del compuesto
medicamentoso como agente antineoplásico o
anti-inflamatorio), y puede reducir la toxicidad
inherente al compuesto medicamentoso aislado. Por ejemplo, el
polialcohol carboximetildextrano al ser la fracción derivada de
polisacárido posee una excelente retención en sangre y alcanza
elevada acumulación en zonas tumorales o inflamatorias como un
transportador-suministrador del medicamento y
permite al complejo medicamentoso presentar selectividad de
localización neoplásica y selectividad de localización
inflamatoria. Además, se considera que la proteasa (peptidasa) se
expresa en áreas tumorales o zonas inflamatorias y, por tanto, el
complejo medicamentoso que presenta un espaciador que comprende un
oligopéptido es fácilmente hidrolizado en la fracción espaciador
para permitir mostrar su eficacia al compuesto medicamentoso
liberado.
Un medicamento que contiene el complejo
medicamentoso preparado de acuerdo con el procedimiento de la
presente invención puede generalmente envasarse en viales o
similares en forma de un producto liofilizado u otro, y estar
previsto para uso clínico como preparaciones para administración
parenteral, tales como inyecciones o infusiones por goteo que se
disuelven al tiempo de utilizarse. Sin embargo, la presentación de
las preparaciones farmacéuticas del medicamento no está limitada a
las formas antes mencionadas. Para la fabricación de las anteriores
preparaciones farmacéuticas, pueden ser utilizadas composiciones
farmacéuticas preparadas utilizando aditivos farmacéuticos
disponibles en el estado de la técnica, por ejemplo,
solubilizantes, modificadores de pH, estabilizadores y similares.
Aunque la dosis del medicamento anterior no está particularmente
limitada, deberá decidirse normalmente en función de la dosis del
compuesto medicamentoso que constituye el residuo del compuesto
medicamentoso, la cantidad del residuo del compuesto medicamentoso
introducida en el complejo medicamentoso, la condición del
paciente, el tipo de enfermedad, y similares. Por ejemplo, cuando
se administra parenteralmente un complejo medicamentoso que se
introduce con aproximadamente 6% en peso del residuo del agente
antineoplásico descrito en la reivindicación 2 de la publicación de
la patente japonesa sin examinar (KOKAI) nº (Hei)
6-87746/1994, puede administrarse generalmente una
vez al día aproximadamente 1 a 500 mg, preferiblemente 10 a 100 mg
aproximadamente por cada m^{2} de superficie corporal por día, y
la administración puede repetirse preferiblemente cada 3 a 4
semanas.
La presente invención se describirá más
específicamente mediante ejemplos. En los ejemplos,
"A-NH-" representa un residuo de un compuesto
medicamentoso en el cual el compuesto medicamentoso presenta un
anillo lactona, tal como el compuesto medicamentoso descrito en la
reivindicación 2 de la publicación de la patente japonesa sin
examinar (KOKAI) nº (Hei) 6-87746/1994 (en ocasiones
designado como "DX-8951" en los ejemplos), y
el compuesto medicamentoso que posee un anillo lactona cerrado se
representa por A-NH_{2}. Un ejemplo incluye el
grupo representado por A-NH- en el esquema antes
descrito, en el cual está formado un anillo lactona. Además,
A'-NH- representa que el anillo lactona del residuo
de un compuesto medicamentoso representado por A-NH-
está en forma de anillo cerrado o de anillo abierto o,
alternativamente, una mezcla de ambos.
En los ejemplos, a no ser que se mencione
específicamente, el grado de carboximetilación en polialcohol
carboximetildextrano (el grado de sustitución con grupo
carboximetilo por cada residuo sacárido constitutivo) se determinó
mediante conversión en forma de ácido libre de la sal sódica del
polialcohol carboximetildextrano, disolviendo el ácido resultante
en una solución acuosa de hidróxido sódico 0,1 N, y luego valorando
(neutralizando) con ácido clorhídrico 0,1 N. Una solución acuosa de
la sal sódica del polialcohol carboximetildextrano se aplicó a una
columna Bio-Rad AG 50W-X2 (tipo
H^{+}) y el efluente fue liofilizado y luego utilizado como
muestra. La muestra se disolvió en un exceso determinado de
solución acuosa de hidróxido sódico 0,1 N y fue neutralizada con
ácido clorhídrico 0,1 N utilizando fenolftaleína como un indicador.
El grado de carboximetilación se calculó utilizando la siguiente
ecuación: Grado de carboximetilación =
13,4(a-b)/[s-5,8(a-b)]
en la cual "s" es el peso de la muestra aplicada (mg),
"a" es el exceso determinado de solución acuosa de hidróxido
sódico 0,1 N (ml), y "b" es el volumen de ácido clorhídrico 0,1
N consumido para la valoración (ml). La cantidad de medicamento
introducida (porcentaje en peso) se determinó mediante análisis
espectroscópico de absorción utilizando absorciones características
del compuesto medicamentoso (aproximadamente 362 nm). La filtración
de gel se realizó bajo las siguientes condiciones: columna: TSK Gel
G4000 PW_{XL}; eluyente: NaCl 0,1 M; índice de flujo: 0,8 ml/min;
y temperatura de columna: 40ºC.
Se disolvieron
Boc-Gly-Gly-Phe-Gly
(600 mg) y N-hidroxisuccinimida (160 mg) en
N,N-dimetilformamida (20 ml), se enfrió a 4ºC, y
luego se adicionó con N,N'-diciclohexilcarbodiimida
(280 mg). A esta solución, se añadió una solución de
metanosulfonato del compuesto medicamentoso descrito en la
reivindicación 2 de la publicación de la patente japonesa sin
examinar (KOKAI) nº (Hei) 6-87746/1994 (600 mg del
compuesto descrito en el Ejemplo 50 de la publicación de patente
antes mencionada) y trietilamina (0,16 ml) disueltos en
N,N-dimetilformamida (30 ml), y se dejó reaccionar
la mezcla a temperatura ambiente durante 16 horas con agitación
bajo condiciones protegidas de la luz. Esta mezcla de reacción fue
evaporada hasta sequedad bajo presión reducida, y el residuo se
purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice
(eluyente: diclorometano:metanol = 10:1 solución conteniendo ácido
acético 0,5%) para obtener el compuesto del enunciado (1,0 g).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,40 (d,1H,J=8,3 Hz),
8,10-8,17 (m,2H), 7,91-8,01 (m,1H),
7,78 (d,1H,J=10,75 Hz), 7,32 (s,1H), 6,94-6,96
(m,1H), 6,50 (s,1H), 5,57 (t,1H,J=4,5 Hz), 5,43 (s,2H), 5,23
(s,2H), 3,77 (dd,2H,J=5,85 Hz,J=8,80 Hz), 3,70 (d,2H,J=4,40 Hz),
3,65 (d,2H,J=5,35 Hz), 3,56 (d,2H,J=5,85),
3,15-3,25 (m,2H), 2,40 (s,3H),
2,05-2,25 (m,1H), 1,86 (m,2H), 1,35 (s,9H), 0,88
(t,3H,J=7,35).
Masa (FAB); m/e 854 (M+1).
Se disolvieron
Boc-Gly-Gly-Gly-Phe
(600 mg) y N-hidroxisuccinimida (160 mg) en
N,N-dimetilformamida (20 ml) y se enfrió a 4ºC,
luego se adicionó con N,N'-diciclohexilcarbodiimida
(280 mg). A esta solución, se añadió una solución de
metanosulfonato de DX-8951 (600 mg) y trietilamina
(0,16 ml) disueltos en N,N-dimetilformamida (30 ml)
y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante 16
horas con agitación bajo condiciones protegidas de la luz. Esta
mezcla de reacción fue evaporada hasta sequedad bajo presión
reducida, y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna
de gel de sílice (eluyente: diclorometano:metanol = 10:1 solución
conteniendo ácido acético 0,5%) para obtener el compuesto del
enunciado (700 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,57 (d,1H,J=7,8 Hz), 8,19
(d,1H), 8,05-8,07 (m,2H), 7,79 (d,1H,J=11,2 Hz),
7,32 (s,1H), 7,10 (d,2H,J=7,8 Hz), 6,93-7,03
(m,4H), 6,51 (s,1H), 5,52-5,55 (m,1H), 5,44 (s,2H),
5,18 (d,1H,J=18,5 Hz), 4,84 (d,1H,J=18,5 Hz),
4,57-4,59 (m,1H), 3,57-3,71 (m,6H),
3,15-3,25 (m,2H), 3,00-3,02 (m,1H),
2,80-2,90 (m,1H), 2,40 (s,3H),
2,05-2,25 (m,1H), 1,86 (m,2H), 1,35 (s,9H), 0,88
(t,3H,J=7,35 Hz).
Masa (FAB); m/e 854 (M+1).
Se disolvieron
Boc-Gly-Gly-Gly-Gly
(120 mg) y N-hidroxisuccinimida (39 mg) en
N,N-dimetilformamida (20 ml), se enfrió a 4ºC, y
luego se adicionó con N,N'-diciclohexilcarbodiimida
(70 mg). A esta solución, se añadió una solución de metanosulfonato
de DX-8951 (150 mg) y trietilamina (0,039 ml)
disueltos en N,N-dimetilformamida (10 ml), y se
dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante 16 horas
con agitación bajo condiciones protegidas de la luz. Esta mezcla de
reacción fue evaporada hasta sequedad bajo presión reducida, y el
residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de
sílice (eluyente: solución diclorometano:metanol = 10:1) para
obtener el compuesto del enunciado (100 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,40 (d,1H,J=8,3 Hz),
8,10-8,17 (m,2H), 7,91-8,01 (m,1H),
7,78 (d,1H,J=10,75 Hz), 7,32 (s,1H), 6,94-6,96
(m,1H), 6,50 (s,1H), 5,57 (t,1 H,J=4,5 Hz), 5,43 (s,2H), 5,23
(s,2H), 3,77 (dd,2H,J=5,85 Hz,J=8,80 Hz), 3,70 (d,2H,J=4,40 Hz),
3,65 (d,2H,J=5,35 Hz), 3,56 (d,2H,J=5,85 Hz),
3,15-3,25 (m,2H), 2,40 (s,3H),
2,05-2,25 (m,1H), 1,86 (m,2H),1,35(s,9H),
0,88 (t,3H,J=7,35 Hz).
Masa (FAB); m/e 764 (M+1).
Se disolvió
3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) (79 mg) en
ácido trifluoroacético (3 ml) y se dejó reposar durante una hora. Se
evaporó el disolvente, el residuo fue sometido a destilaciones
azeotrópicas dos veces con metanol (30 ml) y dos veces con etanol
(30 ml), y entonces el residuo fue lavado con éter para obtener el
compuesto del enunciado (80 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,59-8,61
(m,1H), 8,50 (d,1H,J=8,3 Hz), 8,21-8,27 (m,2H),
7,91-8,01 (br,3H), 7,81 (d,1H,J=11,2 Hz), 7,32
(s,1H), 6,50-6,52 (br,1H),
5,57-5,59 (m,1H), 5,43 (s,2H), 5,23 (s,2H),
3,80-3,82 (m,3H), 3,70-3,75 (m,3H),
3,15-3,25 (m,2H), 2,41 (s,3H),
2,05-2,25 (m,1H), 1,86-1,88 (m,2H),
0,88 (t,3H,J=7,35 Hz).
Se disolvió Dextran T2000 (10 g, Pharmacia, peso
molecular medio: 2.000.000) en tampón acetato 0,1 M (pH 5,5, 1.000
ml) y se añadió con una solución acuosa (1000 ml) de periodato
sódico (33,0 g). Después de agitar a 4ºC durante 10 días con
protección de luz, la mezcla se añadió con glicol etileno (7,0 ml) y
fue agitada durante la noche. La mezcla de reacción se ajustó a pH
7,5 con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento con hielo. Se
añadió y disolvió borohidruro sódico (14 g), y la mezcla fue
entonces agitada a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla
de reacción fue enfriada con hielo, ajustada a pH 5,5 con ácido
acético, y agitada a 4ºC durante una hora, y entonces ajustada a pH
7,5 con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento con hielo. La
solución acuosa resultante se sometió a ultrafiltración utilizando
una membrana Biomax-30 (Millipore) para eliminar la
fracción de bajo peso molecular. La fracción polimérica fue
liofilizada para obtener polialcohol dextrano. Después de tratar
este polialcohol dextrano a pH 3,0 durante una hora, la fracción de
bajo peso molecular fue eliminada con una membrana
Biomax-50, y seguidamente, la fracción polimérica
fue eliminada con una membrana Biomax-100, y el
resultado fue liofilizado para obtener polialcohol dextrano
purificado (2,0 g). El peso molecular de esta sustancia fue 220K
(filtración de gel, estándar dextrano).
Este polialcohol dextrano purificado (1,8 g) se
añadió a una solución acuosa obtenida mediante disolución de
hidróxido sódico (10,5 g) en agua (45 ml) y se disolvió a
temperatura ambiente. A esta solución, se añadió ácido
monocloroacético (15 g), se disolvió bajo enfriamiento con hielo, y
luego se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante
20 horas. Después de ajustar esta mezcla de reacción a pH 8 con
ácido acético, la fracción de bajo peso molecular fue eliminada
mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-10. La fracción polimérica fue liofilizada
para obtener la sal sódica de polialcohol carboximetildextrano (1,8
g). El peso molecular de esta sustancia fue 330K (filtración de
gel, estándar dextrano) y el grado de carboximetilación fue 0,8.
Se disolvió en agua la anterior la sal sódica de
polialcohol carboximetildextrano (300 mg), se aplicó a una columna
Bio-Rad AG 50W-X2 (trama
200-400, tipo H^{+}) (1,5x8,6 cm) y fue eluida con
agua. Este efluente se añadió con trietilamina (0,5 ml) y fue
liofilizado para obtener sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano (380 mg). Fueron tratadas porciones de la sal
sódica de polialcohol carboximetildextrano (300 mg cada una) con la
columna, según se describió anteriormente, para obtener sal
trietilamónica de polialcohol carboximetildextrano (380 mg, 400
mg).
La sal sódica de polialcohol carboximetildextrano
(0,15 g) obtenida en el Ejemplo 5 anterior se añadió a una solución
acuosa obtenida mediante disolución de hidróxido sódico (1,05 g) en
agua (4,5 ml) y luego se disolvió a temperatura ambiente. A esta
solución, se añadió y disolvió ácido monocloroacético (1,5 g) bajo
enfriamiento con hielo, y se dejó reaccionar la mezcla a
temperatura ambiente durante 18 horas. Esta mezcla de reacción se
ajustó a pH 8 con ácido acético, se añadió por goteo en 90 ml de
metanol, y se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (0,15 ml), y los
precipitados depositados se recogieron mediante centrifugación
(3500 rpm, 8 minutos). Los precipitados fueron lavados con metanol
y luego disueltos en agua (5 ml), y se añadieron con cloruro sódico
acuoso 3 M (0,15 ml). Esta solución acuosa se filtró a través de un
filtro Millipore (0,45 \mum), y el filtrado se añadió por goteo a
35 ml de etanol y los precipitados depositados se recogieron
mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los precipitados
fueron lavados con etanol, disueltos en agua y dializados con agua
purificada utilizando una membrana de diálisis (Spectrapore 1, peso
molecular de corte; 6.000-8.000). La solución
dializada interna se filtró a través de un filtro Millipore (0,22
\mum) y fue liofilizada para obtener sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (0,18 g). El grado de carboximetilación de
esta sustancia fue 1,2 por cada residuo sacárido (alcalimetría).
El polialcohol dextrano purificado (0,2 g)
obtenido en el Ejemplo 5 se añadió a una solución acuosa obtenida
mediante disolución de hidróxido sódico (0,84 g) en agua (6 ml) y
se disolvió a temperatura ambiente. A esta solución, se añadió y
disolvió ácido monocloroacético (1,2 g) bajo enfriamiento con hielo,
y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante 18
horas. La mezcla de reacción se ajustó a pH 8 con ácido acético, se
añadió por goteo a 120 ml de metanol, y luego se adicionó con
cloruro sódico acuoso 3 M (0,2 ml), y los precipitados depositados
se recogieron mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los
precipitados fueron lavados con metanol y luego disueltos en agua
(5 ml), y se añadieron con cloruro sódico acuoso 3 M (0,2 ml). Esta
solución acuosa se filtró a través de un filtro Millipore (0,45
\mum), el filtrado se añadió por goteo a 35 ml de etanol y los
precipitados depositados se recogieron mediante centrifugación
(3500 rpm, 8 minutos). Los precipitados fueron lavados con etanol,
disueltos en agua y dializados con agua purificada utilizando una
membrana de diálisis (Spectrapore 1, peso molecular de corte;
6.000-8.000). La solución dializada interna se
filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y fue
liofilizada para obtener sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (0,20 g). El grado de carboximetilación de esta
sustancia fue 0,4 por cada residuo sacárido (alcalimetría).
La sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 5 (380 mg, grado de
carboximetilación: 0,8) se disolvió en
N,N-dimetilformamida (30 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de sal de ácido
trifluoroacético
3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) (49 mg) en
N,N-dimetilformamida (5 ml), trietilamina (0,017 ml)
y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(380 mg), y entonces se dejó reaccionar la mezcla a temperatura
ambiente durante la noche con agitación. Esta mezcla de reacción se
ajustó a pH 10 con hidróxido sódico acuoso 1 M y cada una de las
porciones de 5 ml de la mezcla se añadió por goteo a 25 ml de
etanol. Esta mezcla se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (1 ml)
y éter dietilo (5 ml) y los precipitados depositados se recogieron
mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos).
Los precipitados fueron disueltos en agua y
dializados con agua purificada utilizando una membrana de diálisis
(Spectrapore 1, peso molecular de corte;
6.000-8.000), y la solución dializada interna se
filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y fue
liofilizada. El producto crudo resultante se disolvió en agua (30
ml), se ajustó a pH 9 con hidróxido sódico acuoso 0,1 M, y tratado
a 37ºC durante una hora. Esta solución tratada se dializó como se ha
descrito anteriormente, y entonces la solución dializada interna se
filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y fue
liofilizada para obtener el compuesto del enunciado (289 mg). El
resultado obtenido mediante análisis GPC (cromatografía de
permeación de gel) después de disolver este compuesto en cloruro
sódico acuoso 0,1 M (columna: TSK Gel PW-4000XL,
Tosoh, disolvente: NaCl 0,1 M, índice de flujo: 0,8 ml/min), y el
espectro de absorción ultravioleta del compuesto (solución tampón
Tris 0,1 M, pH 9,0, 0,25 mg/ml) se representan en las Figuras 1 y
2, respectivamente. El contenido del residuo del compuesto
medicamentoso en el compuesto fue 5,3% (w/w) cuando se determinó con
base en la absorción a 362 nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH
9,0).
El compuesto del enunciado (300 mg) fue
sintetizado de acuerdo con una forma similar a la del Ejemplo 8
mediante introducción de sal de ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A,
la cual se había obtenido mediante eliminación del grupo Boc del
3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =-DX-8951) (50 mg) de
una manera similar a la del Ejemplo 4, en la sal trietilamónica de
polialcohol carboximetildextrano (380 mg) obtenida en el Ejemplo 5.
El resultado obtenido mediante análisis GPC después de disolver este
compuesto en cloruro sódico acuoso 0,1 M (columna: TSK Gel
PW-4000XL, Tosoh, disolvente: NaCl 0,1 M, índice de
flujo: 0,8 ml/min), y el espectro de absorción ultravioleta del
compuesto (solución tampón Tris 0,1 M, pH 9,0, 0,19 mg/ml) se
representan en las Figuras 3 y 4, respectivamente. El contenido del
residuo del compuesto medicamentoso en el compuesto fue 5,3% (w/w)
cuando se determinó con base en la absorción a 362 nm en solución
tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
El compuesto del enunciado (190 mg) fue
sintetizado según una forma similar a la del Ejemplo 8 mediante
introducción de sal de ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A,
la cual se había obtenido a través de eliminación del grupo Boc del
3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) (41 mg) de
una manera similar a la del Ejemplo 4, en la sal trietilamónica de
polialcohol carboximetildextrano (380 mg) obtenida en el Ejemplo 5.
El espectro de absorción ultravioleta de este compuesto (solución
tampón Tris 0,1 M, pH 9,0, 0,34 mg/ml) se representa en la Figura
5. El contenido del residuo del compuesto medicamentoso en el
compuesto fue 5,3% (w/w) cuando se determinó con base en la
absorción a 362 nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
Se prepararon ratones portadores de tumor Meth A
(7 ratones por grupo) mediante trasplante subcutáneo de 1x10^{6}
células de fibrosarcoma Meth A de ratón en las regiones inguinales
derechas de ratones macho BALB/c (de 7 semanas). El 7º día, el
complejo medicamentoso del Ejemplo 9 disuelto en agua destilada para
inyecciones, se inyectó en la vena de cola de los ratones
portadores de tumor Meth A 4 veces cada 4 días. El 21º día después
del trasplante, se extirparon y pesaron masas tumorales para
calcular la tasa de inhibición de crecimiento tumoral, de acuerdo
con la siguiente ecuación: tasa de inhibición de crecimiento
tumoral (%) = [1-(peso tumoral medio del grupo administrado con la
muestra de prueba/peso tumoral medio del grupo de control)] x 100.
Como resultado, se halló que el complejo medicamentoso de la
presente invención obtenido en el Ejemplo 9 presentaba una
actividad antitumoral considerablemente mejorada en comparación con
el compuesto medicamentoso aislado, sin el espaciador y el derivado
polisacárido, mientras que no mostraba toxicidad (pérdida de peso).
El derivado polisacárido (Ejemplo 5) aislado, y el compuesto
medicamentoso introducido con el espaciador solamente (sal de ácido
trifluoroacético de
H_{2}N-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) obtenida
mediante eliminación del grupo Boc del compuesto del Ejemplo 1 según
el procedimiento del Ejemplo 4) no mostraron efectividad.
Se prepararon ratones portadores de tumor Meth A
(6 ratones por grupo) de acuerdo con una forma similar a la del
Ejemplo 11, y la actividad antitumoral fue comparada con la
obtenida por administración simple, una vez el 7º día, de los
complejos medicamentosos de los Ejemplos 8 y 9. Como resultado, el
grado de actividad antitumoral fue el siguiente: (Derivado
polisacárido)-Gly-Gly-Phe-Gly-NH-
A' > (Derivado
polisacárido)-Gly-Gly-Gly-Phe-NH-A'
> el compuesto medicamentoso aislado. No mostró efectividad el
compuesto que comprende el residuo del compuesto medicamentoso
directamente enlazado a un grupo carboxilo del polialcohol
carboximetildextrano del Ejemplo 5 sin espaciador (cantidad de
residuo del compuesto medicamentoso introducida: 6,2% en peso).
Se disolvió en tampón acetato 0,1 M (pH 5,5, 1000
ml) Dextran T500 (10 g, Pharmacia, peso molecular: 500K) y se
añadió con una solución acuosa (1000 ml) de periodato sódico (33
g). Después de agitar a 4ºC durante diez días con protección de
luz, la mezcla se añadió con glicol etileno (7,0 ml) y fue agitada
durante la noche. La mezcla de reacción se ajustó a pH 7,5 con
hidróxido sódico acuoso 8 M. Se añadió y disolvió borohidruro
sódico (14 g), y luego la mezcla fue agitada durante la noche. La
mezcla de reacción fue enfriada con hielo, ajustada a pH 5,5 con
ácido acético y agitada a 4ºC durante una hora, y luego ajustada a
pH 7,5 con hidróxido sódico acuoso 8 M para obtener la Solución 1.
Separadamente, se realizaron una serie de procesos descritos
anteriormente utilizando Dextran T500 (10 g, Pharmacia, peso
molecular 500K) para obtener la Solución 2. Adicionalmente, se
repitió una serie de procesos descritos anteriormente utilizando
Dextran T250 (10 g cada vez, Pharmacia, peso molecular 250K) para
obtener las Soluciones 3 y 4. Estas Soluciones 1 a 4 fueron
combinadas y sometidas a ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-50 para eliminar la fracción de bajo peso
molecular. La fracción polimérica fue liofilizada para obtener
polialcohol dextrano (25 g). El peso molecular de esta sustancia
fue 163K (filtración de gel, estándar pululano).
Este polialcohol dextrano (11 g) se añadió a una
solución acuosa obtenida mediante disolución de hidróxido sódico
(46,2 g) en agua (330 ml) y se disolvió a temperatura ambiente. A
esta solución, se añadió bajo enfriamiento con hielo ácido
monocloroacético (66 g), se disolvió y se dejó reaccionar la mezcla
a temperatura ambiente durante la noche. Esta mezcla de reacción se
ajustó a pH 9 con ácido acético y fue desalada mediante
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-30.
La solución restante que no había pasado a través de la membrana
fue liofilizada para obtener la sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (13 g). El peso molecular de esta sustancia fue
228K (filtración de gel, estándar pululano) y el grado de
carboximetilación fue 0,4.
Esta sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (600 mg) se disolvió en agua, se aplicó a una
columna Bio-Rad AG 50W-X2 (trama
200-400, tipo H^{+}) (diámetro: 44 mm, longitud:
210 mm) y fue eluida con agua. Este efluente se añadió con
trietilamina (0,93 ml) y luego liofilizado para obtener el compuesto
del enunciado (690 mg).
El
3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) (79 mg)
obtenido en el Ejemplo 1 se disolvió en ácido trifluoroacético (3
ml) y se dejó reposar durante una hora. Se evaporó el disolvente, y
el residuo fue sometido a destilación azeotrópica dos veces con
metanol (30 ml) y dos veces con etanol (30 ml), y luego lavado con
éter para obtener el compuesto del enunciado (80 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,53 (d, 1H, J=8,3 Hz),
8,40-8,48 (m, 2H), 8,28 (d, 1H, J=8,3 Hz),
7,95-8,07 (br, 3H), 7,81 (d, 1H, J=10,2 Hz),
7,30-7,37 (m, 2H), 7,15-7,30 (m,
5H), 6,50-6,55 (br, 1H), 5,50-5,57
(m, 1H), 5,41 (d, 2H, J=7,82 Hz), 5,25 (s, 2H),
4,55-4,62 (m, 1H), 3,55-3,92 (m,
6H), 3,15-3,25 (br, 2H), 2,98-3,03
(m, 1H), 2,73-2,82 (m, 1H), 2,40 (s, 3H),
2,05-2,25 (m, 1H), 1,84-1,92 (m,
2H), 0,88 (t, 3H, J=7,35 Hz).
La sal sódica de polialcohol carboximetildextrano
obtenida en el Ejemplo 13 (400 mg) se convirtió en la sal
trietilamónica (470 mg) y se disolvió en
N,N-dimetilformamida (30 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de sal de ácido
trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) obtenida en
el Ejemplo 14 (62 mg) en N,N-dimetilformamida (5
ml), trietilamina (0,02 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(470 mg), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación y protección de luz. Cada una de las
porciones de 5 ml de esta mezcla de reacción se añadió por goteo a
lotes de 10 ml de etanol. Se añadieron a la mezcla cloruro sódico
acuoso 3 M (2,5 ml) y éter dietilo (20 ml), y se recogieron los
precipitados depositados mediante centrifugación. Los precipitados
se disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M, se ajustaron a pH 9
con hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo enfriamiento con hielo y
luego fueron dializados con agua purificada utilizando una membrana
de diálisis (Spectrapore 1, peso molecular de corte;
6.000-8.000). La solución dializada interna se
filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y luego fue
liofilizada para obtener el compuesto del enunciado (600 mg). El
resultado obtenido mediante análisis GPC después de disolver este
compuesto en cloruro sódico acuoso 0,1 M (columna: TSK Gel
PW-4000XL, Tosoh; disolvente: NaCl 0,1 M; índice de
flujo: 0,8 ml/min) y el espectro de absorción ultravioleta del
compuesto (solución tampón Tris 0,1 M, pH 9,0, 0,1 mg/ml) se
representan en las Figuras 6 y 7, respectivamente. El contenido del
residuo del compuesto medicamentoso en el compuesto fue 5,8% (w/w)
cuando se determinó con base en la absorción a 362 nm en solución
tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
El
3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) (79 mg)
obtenido en el Ejemplo 2 se disolvió en ácido trifluoroacético (3
ml) y se dejó reposar durante una hora. Se evaporó el disolvente, y
el residuo fue sometido a destilación azeotrópica dos veces con
metanol (30 ml) y dos veces con etanol (30 ml), y entonces el
residuo fue lavado con éter para obtener el compuesto del enunciado
(80 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,62-8,66
(m, 2H), 8,23 (d, 1H, J=8,3 Hz), 8,18-8,20 (m, 1H),
7,98-8,10 (br, 2H), 7,79 (d, 1H, J=10,7 Hz), 7,32
(s, 1H), 7,09 (d, 2H, J=7,3 Hz), 6,93-7,03 (m, 4H),
6,50-6,60 (br,1H), 5,52-5,55 (m,
1H), 5,44 (s, 2H), 5,18 (d, 1H, J=18,5 Hz), 4,80 (d, 1H, J=18,5
Hz), 4,57-4,59 (m, 1H), 3,57-3,71
(m, 6H), 3,15-3,25 (m, 2H),
3,00-3,02 (m, 1H), 2,80-2,90 (m,
1H), 2,50 (s, 3H), 2,05-2,25 (m, 1H),
1,86-2,00 (m, 2H), 0,88 (t, 3H), J=7,35
Hz).
Hz).
La sal sódica de polialcohol carboximetildextrano
obtenida en el Ejemplo 13 (1,0 g) se convirtió en la sal
trietilamónica (1,2 g) y se disolvió en
N,N-dimetilformamida (90 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de sal de ácido
trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) obtenida en
el Ejemplo 16 (158 mg) en N,N-dimetilformamida (15
ml), trietilamina (0,05 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(1,2 g), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación y protección de luz. Cada una de las
porciones de 5 ml de esta mezcla de reacción se añadió por goteo a
lotes de 10 ml de etanol. La mezcla se añadió con cloruro sódico
acuoso 3 M (2,5 ml) y éter dietilo (20 ml), y luego los precipitados
depositados se recogieron mediante centrifugación. Los precipitados
se disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M, se ajustaron a pH 9
con hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo enfriamiento con hielo y
fueron dializados con agua purificada utilizando una membrana de
diálisis (Spectrapore 1, peso molecular de corte;
6.000-8.000). La solución dializada interna se
filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y luego fue
liofilizada para obtener el compuesto del enunciado (1,4 g). El
contenido del residuo del compuesto medicamentoso en este compuesto
fue 5,2% (w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362
nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
Se añadió
H-Gly-Phe-Leu-OH
(3,0 g) a dioxano acuoso 50% (48 ml) y se enfrió con hielo. A esta
solución, se añadieron hidróxido sódico acuoso 1 N (9,45 ml) y una
solución de dioxano (24 ml) conteniendo (Boc)_{2}O (2,27
g), y la mezcla fue agitada durante la noche. Se añadió ácido
clorhídrico 1 N (9,45 ml) a la mezcla de reacción y se evaporó el
disolvente. El residuo resultante se purificó mediante
cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: solución
diclorometano:metanol = 5:1) para obtener el compuesto del enunciado
(2,5 g).
El
Boc-Gly-Phe-Leu-OH
obtenido en el Ejemplo 18 (2,4 g) y
N-hidroxisuccinimida (656 mg) se disolvió en
N,N-dimetilformamida (50 ml), se enfrió a 4ºC, y
luego se adicionó con N,N'-diciclohexilcarbodiimida
(1,17 g), y se agitó durante 2 horas. A esta solución, se añadió
una solución de N,N-dimetilformamida (40 ml) en la
cual se habían disuelto tosilato de
H-Gly-OBzl (1,9 g) y trietilamina
(0,79 ml), y se dejó reaccionar la mezcla con agitación a
temperatura ambiente durante 16 horas. Esta mezcla de reacción fue
evaporada hasta sequedad bajo presión reducida, y el residuo se
purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice
(eluyente: solución diclorometano:metanol = 50:1) para obtener el
compuesto del enunciado (2,0 g).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,20-8,30
(m, 1H), 8,12 (d, 1H, J=8,3 Hz), 7,83 (d, 1H, J=8,3 Hz),
7,32-7,37 (m, 5H), 6,89-6,95 (m,
1H), 5,12 (s, 1H), 4,52-4,59 (br, 1H), 4,34 (dd, H,
J=7,3 Hz, J=15,1 Hz), 3,93 (dd, 1H, J=5,5 Hz, J=17,2 Hz), 3,84 (dd,
1H, J=5,5 Hz, J=17,2 Hz), 3,54 (dd, 1H, J=5,9 Hz, J=16,7 Hz), 3,42
(dd, J=5,9 Hz, J=16,7 Hz), 3,00 (dd, 1H, J=4,4 Hz, 13,7 Hz), 2,78
(dd, 1H, J=8,8 Hz, J=13,2 Hz), 1,50-1,65 (m, 1 H),
1,45 (t, 2H, J=7,3 Hz), 1,36 (s, 9H), 0,86 (d, 3H, J=6,4 Hz), 0,82
(d, 3H, J=6,4 Hz).
El
Boc-Gly-Phe-Leu-OBzl
(1,7 g) obtenido en el Ejemplo 19 se disolvió en una solución mixta
de acetato de etilo (30 ml) y metano) (30 ml), y se añadió con 5%
Pd-C (1,5 g) para realizar reducción catalítica. La
mezcla de reacción se filtró y el filtrado fue evaporado hasta
sequedad bajo presión reducida para obtener el compuesto del
enunciado (1,15 g).
El
Boc-Gly-Phe-Leu-Gly-OH
obtenido en el Ejemplo 20 (200 mg) y
N-hidroxisuccinimida (58 mg) se disolvieron en
N,N-dimetilformamida (5 ml). Después de enfriar a
4ºC, se añadió N,N'-diciclohexilcarbodiimida (104
mg) a la solución y se disolvió. A esta solución, se añadió una
solución de N,N-dimetilformamida (5 ml) en la cual
se habían disuelto metanosulfonato de DX-8951 (224
mg) y trietilamina (0,059 ml), y se dejó reaccionar la mezcla con
agitación a temperatura ambiente durante 16 horas bajo condiciones
protegidas de la luz. Esta mezcla de reacción fue evaporada hasta
sequedad bajo presión reducida, y el residuo se purificó mediante
cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente:
diclorometano:metanol = 10:1 solución conteniendo ácido acético
0,5%) para obtener el compuesto del enunciado (200 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d-{6}) \delta: 8,35 (d, 1H, J=7,8 Hz),
8,08-8,18 (m, 2H), 7,75-7,85 (m,
2H), 7,32 (s, 1H), 7,10 (d, 2H, J=6,8 Hz), 7,08-7,13
(m, 3H), 6,85-6,95 (br, 1H),
6,40-6,65 (br, 1H), 5,52-5,55 (m,
1H), 5,46 (d, 1H, J=18,5 Hz), 5,37 (d, 1H, J=18,5 Hz), 5,24 (s,2H),
4,44-4,52 (m, 1H), 4,15-4,25 (m,
1H), 3,68-3,72 (m, 2H), 3,40-3,52
(m, 2H), 3,15-3,25 (br, 2H),
2,85-2,95 (m, 1H), 2,65-2,75 (m,
1H), 2,40 (s, 3H), 2,05-2,25 (m, 1H),
1,80-1,91 (m, 2H), 1,50-1,65 (m,
1H), 1,45 (t, 2H, J=7,3 Hz), 1,35 (s, 9H), 0,88 (t, 3H, J=7,4),0,86
(d, 3H, J=6,4 Hz), 0,82 (d, 3H, J=6,4
Hz).
Hz).
Se disolvió el
3'-N-(Boc-Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) (97 mg)
obtenido en el Ejemplo 21 en ácido trifluoroacético (3 ml) y se dejó
reposar durante una hora. Se evaporó el disolvente, y el residuo
fue sometido a destilación azeotrópica dos veces con metano) (30
ml) y dos veces con etanol (30 ml), y luego lavado con éter para
obtener el compuesto del enunciado (95 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,57 (d, 1H, J=8,3 Hz),
8,47 (d, 1H, J=8,3 Hz), 8,32 (d, 1H, J=7,8 Hz), 8,17 (t, 1H, J=5,5
Hz), 7,81-7,91 (br, 3H), 7,79 (d, 1H, J=10,7 Hz),
7,32 (s, 1H), 7,21-7,23 (m, 5H),
7,12-7,17 (m, 1H), 6,45-6,55 (br,
1H), 5,57 (q, 1H, J=4,4 Hz), 5,43 (d, 1H, J=16,1 Hz), 5,34 (d, 1H,
J=16,1 Hz), 5,23 (s, 2H), 4,67 (dt, 1H, J=4,0 Hz, J=9,0 Hz), 4,31
(dd, 1H, J=8,5 Hz, J=15,0 Hz), 4,0-4,4 (br, 1H),
3,74-3,76 (m, 2H), 3,56 (dd, 1H, J=6,0 Hz, J=16,0
Hz), 3,41 (dd, 1H, J=6,0 Hz, J=16,0 Hz), 3,17-3,19
(br, 2H), 3,02 (dd, 1H, J=4,0 Hz, J=14,0 Hz), 2,70 (dd, 1H, J=10,0
Hz, J=14,0 Hz), 2,40 (s, 3H), 2,05-2,15 (m, 1H),
1,85 (dt, 2H, J=7,0 Hz, J=14,0 Hz), 1,50-1,55 (m,
1H), 1,45 (t, 2H, J=6,0 Hz), 1,35 (s, 9H), 0,88 (t, 3H, J=7,4),
0,85 (d, 3H, J=6,4 Hz), 0,80 (d, 3H, J=6,4 Hz).
La sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 13 (690 mg) se disolvió
en N,N-dimetilformamida (50 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de la sal de ácido
trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Phe-Leu-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) (95 mg)
obtenida en el Ejemplo 22 en N,N-dimetilformamida
(10 ml), trietilamina (0,03 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(690 mg), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 ml
de esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. La mezcla se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,5 ml)
y éter dietilo (20 ml), y los precipitados depositados se
recogieron mediante centrifugación. Los precipitados se disolvieron
en cloruro sódico acuoso 0,5 M, se ajustaron a pH 9 con hidróxido
sódico acuoso 0,1 M, y fueron dializados con agua purificada
utilizando una membrana de diálisis (Spectrapore 1, peso molecular
de corte; 6.000-8.000). La solución dializada
interna se filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum), y
entonces el filtrado fue liofilizado para obtener el compuesto del
enunciado (600 mg). El contenido del residuo del compuesto
medicamentoso en este compuesto fue 4,8% (w/w) cuando se determinó
con base en la absorción a 362 nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH
9,0).
Se disolvió en tampón acetato 0,1 M (pH 5,5, 5000
ml) Dextran T500 (50 g, Pharmacia, peso molecular: 500K), y se
añadió una solución acuosa (5000 ml) de periodato sódico (165,0 g).
Después de agitar a 4ºC durante diez días con protección de luz, la
mezcla se añadió con glicol etileno (35,0 ml) y fue agitada durante
la noche. La mezcla de reacción se ajustó a pH 7,5 con hidróxido
sódico acuoso 8 M. Se añadió y disolvió borohidruro sódico (70 g), y
luego la mezcla fue agitada durante la noche. La mezcla de
reacción fue enfriada con hielo, ajustada a pH 5,5 con ácido acético
y agitada a 4ºC durante una hora, y entonces ajustada a pH 7,5 con
hidróxido sódico acuoso 8 M. La solución resultante se sometió a
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-50
para eliminar la fracción de bajo peso molecular. La fracción
polimérica fue liofilizada para obtener polialcohol dextrano (27,1
g). El peso molecular de esta sustancia fue 140K (filtración de
gel, estándar pululano).
Este polialcohol dextrano (5 g) se añadió a una
solución acuosa obtenida mediante disolución de hidróxido sódico
(21 g) en agua (150 ml), y se disolvió a temperatura ambiente. A
esta solución, se añadió bajo enfriamiento con hielo y se disolvió
ácido monocloroacético (30 g), y luego se dejó reaccionar la mezcla
a temperatura ambiente durante la noche. Esta mezcla de reacción se
ajustó a pH 8 con ácido acético y entonces fue desalada mediante
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-50.
La solución restante que no había pasado a través de la membrana
fue liofilizada para obtener la sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (5,6 g). El peso molecular de esta sustancia
fue 263K (filtración de gel, estándar pululano) y el grado de
carboximetilación fue 0,4.
Esta sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (2,0 g) se disolvió en agua, se aplicó a una
columna Bio-Rad AG 50W-X2 (trama
200-400, tipo H^{+}) (diámetro: 44 mm, longitud:
210 mm) y fue eluida con agua. Este efluente se añadió con
trietilamina (4 ml) y fue liofilizado para obtener el compuesto del
enunciado (2,2 g).
La sal sódica de polialcohol carboximetildextrano
(1,0 g) obtenida en el Ejemplo 24 se disolvió en agua, se aplicó a
una columna Bio-Rad AG 50W-X2 (trama
200-400, tipo Me_{3}N H^{+}) y fue eluida con
agua. Este efluente fue liofilizado para obtener el compuesto del
enunciado (950 mg).
De una manera similar a la del Ejemplo 14, sal de
ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
obtenida desde
3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly-(NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) (400 mg) se
disolvió en agua/MeOH (1:4), se aplicó a una columna
Bio-Rad AG 1-X8 (trama
200-400, tipo Cl^{-}) (1,5 cm x 8,6 cm) y fue
eluida con el anterior disolvente. Este efluente fue concentrado y
luego liofilizado para obtener el compuesto del enunciado (310
mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,53 (d, 1H, J=8,5 Hz),
8,46-8,48 (m, 1H), 8,37-8,39 (m,
1H), 7,95 (d, 1H, J=8,0 Hz), 7,80 (s, 3H), 7,78 (d, 1H, J=11,1 Hz),
7,34 (s, 1H), 7,14-7,24 (m, 5H), 6,50(s, 1H),
5,56-5,60 (m, 1H), 5,35-5,40 (m,
2H), 5,24 (s, 2H), 4,51-4,56 (m, 1H), 3,86 (dd,
J=4,8, 13,5 Hz, 1H), 3,68-3,79 (m, 3H), 3,54 (s,
2H), 3,15-3,22 (m, 2H), 3,01 (dd, J=5,6, 13,5 Hz,
1H), 2,78 (dd, J=9,6, 3,5 Hz, 1H), 2,41 (s, 3H),
2,12-2,23 (m, 2H), 1,81-1,89 (m,
2H), 0,88 (t, 3H, J=7,2 Hz).
Masa (FAB); m/e 753 (M+1).
La sal trimetilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 25 (0,1 g) se disolvió
en N,N-dimetilformamida (6 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución del hidrocloruro de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) (24 mg)
obtenido en el Ejemplo 26 en N,N-dimetilformamida
(10 ml), trietilamina (5 \mul), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(0,1 g), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 ml de
esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. La mezcla se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,5 ml) y
éter dietilo (20 ml), y los precipitados depositados se recogieron
mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los precipitados se
disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M y se ajustaron a pH 9 con
hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo enfriamiento con hielo. La
solución acuosa resultante fue desalada mediante ultrafiltración
utilizando una membrana Biomax-30. La solución
restante que no había pasado a través de la membrana se filtró a
través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y luego fue liofilizada
para obtener el compuesto del enunciado (90 mg). El contenido del
residuo del compuesto medicamentoso en este compuesto fue 11% (w/w)
cuando se determinó con base en la absorción a 362 nm en solución
tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
La sal trimetilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 25 (0,1 g) se disolvió
en N,N-dimetilformamida (6 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución del hidrocloruro de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) (36 mg)
obtenido en el Ejemplo 26 en N,N-dimetilformamida
(10 ml), trietilamina (8 \mul), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(0,1 g), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 ml
de esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. La mezcla se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,5 ml)
y éter dietilo (20 ml), y los precipitados depositados se
recogieron mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los
precipitados se disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M y se
ajustaron a pH 12 con hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo
enfriamiento con hielo. La solución acuosa resultante fue desalada
mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-30. La solución restante que no había pasado
a través de la membrana se filtró a través de un filtro Millipore
(0,22 \mum) y luego fue liofilizada para obtener el compuesto del
enunciado (80 mg). El resultado obtenido mediante análisis GPC
después de disolver este compuesto en cloruro sódico acuoso 1,0 M
(columna: TSK Gel PW-4000XL, Tosoh, disolvente: NaCl
0,1 M, índice de flujo: 0,8 ml/min), y el espectro de absorción
ultravioleta del compuesto (solución tampón Tris 0,1 M, pH 9,0, 36
\mug/ml) se representan en las Figuras 8 y 9, respectivamente. El
contenido del residuo del compuesto medicamentoso en el compuesto
fue 15% (w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362 nm
en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
Se disolvió Dextran T250 (20 g, EXTRASYNTHESE,
peso molecular medio: 250K) en tampón ácido acético 0,1 M (pH 5,5,
2000 ml) y se añadió con una solución acuosa (2000 ml) de periodato
sódico (66,0 g). Después de agitar a 4ºC durante diez días con
protección de luz, la mezcla se añadió con glicol etileno (14,0 ml)
y fue agitada durante la noche. La mezcla de reacción se ajustó a
pH 7,5 con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento con hielo.
Se añadió y disolvió borohidruro sódico (28 g) y entonces la mezcla
fue agitada durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de
reacción fue enfriada con hielo, ajustada a pH 5,5 con ácido
acético y agitada a 4ºC durante una hora, y luego ajustada a pH 7,5
con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento con hielo. La
fracción de bajo peso molecular se eliminó en la solución acuosa
resultante mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-30 para obtener la Solución Retenida 1 que no
pasó a través de la membrana. Separadamente, se disolvió Dextran
T250 (50 g, EXTRASYNTHESE, peso molecular medio: 250K) en tampón
acetato 0,1 M (pH 5,5, 5000 ml) y se añadió con una solución acuosa
(5000 ml) de periodato sódico (165 g). Después de agitar a 4ºC
durante diez días con protección de luz, la mezcla se añadió con
glicol etileno (35,0 ml) y fue agitada durante la noche. La mezcla
de reacción se ajustó a pH 7,5 con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo
enfriamiento con hielo. Se añadió y disolvió borohidruro sódico (70
g), y entonces la mezcla fue agitada durante la noche a temperatura
ambiente. La mezcla de reacción fue enfriada con hielo, ajustada a
pH 5,5 con ácido acético y agitada a 4ºC durante una hora, y luego
ajustada a pH 7,5 con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento
con hielo. La fracción de bajo peso molecular se eliminó en la
solución acuosa resultante mediante ultrafiltración utilizando una
membrana Biomax-30 para obtener la Solución Retenida
2 que no pasó a través de la membrana. Las Soluciones Retenidas 1 y
2 fueron combinadas, sometidas a ultrafiltración utilizando una
membrana Biomax-30 para eliminar la fracción de
bajo peso molecular de la fracción que había pasado a través de
membrana Biomax-50, y fueron liofilizadas para
obtener polialcohol dextrano (25,7 g). El peso molecular de esta
sustancia fue 47K (filtración de gel, estándar pululano).
Este polialcohol dextrano (5 g) se añadió a una
solución acuosa obtenida mediante disolución de hidróxido sódico
(35 g) en agua (150 ml) y se disolvió a temperatura ambiente. A
esta solución, se añadió ácido monocloroacético (50 g) bajo
enfriamiento con hielo y se disolvió, y entonces se dejó
reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante 18 horas. Esta
mezcla de reacción se ajustó a pH 8 con ácido acético y fue
desalada mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-50. La solución restante que no había pasado
a través de la membrana fue liofilizada para obtener la sal sódica
de polialcohol carboximetildextrano (7,2 g). El peso molecular de
esta sustancia fue 127K (filtración de gel, estándar pululano) y el
grado de carboximetilación fue 0,8. Esta sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (2,2 g) se disolvió en agua, se aplicó a una
columna Bio-Rad AG 50W-X2 (trama
200-400, tipo H^{+}) (diámetro: 44 mm, longitud:
210 mm) y fue eluida con agua. Este efluente se añadió con
trietilamina (4 ml) y luego fue liofilizado para obtener sal
trietilamónica de polialcohol carboximetildextrano (2,69 g).
Esta sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano (2,67 g) se disolvió en
N,N-dimetilformamida (200 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución obtenida mediante disolución
de la sal de ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A,
la cual había sido obtenida mediante eliminación del grupo Boc,
según el procedimiento similar al del Ejemplo 16 de
3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A
(A-NH_{2}=DX-8951) (350 mg)
preparada de una manera similar a la del Ejemplo 2, y trietilamina
(0,116 ml) en N,N-dimetilformamida (10 ml), y una
solución obtenida mediante disolución de
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(2,67 g) en N,N-dimetilformamida (10 ml), y se dejó
reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche con
agitación. Esta mezcla de reacción se añadió con cloruro sódico
acuoso 3 M (100 ml) y cada una de las porciones de 8 ml de la
mezcla se añadió por goteo a lotes de 30 ml de etanol. A cada
mezcla, se añadieron cloruro sódico acuoso 3 M (1 ml) y éter
dietilo (5 ml), y los precipitados depositados se recogieron
mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los precipitados
fueron lavados con acetona y luego disueltos en agua, y se
añadieron con cloruro sódico acuoso 3 M (10 ml), y luego se
ajustaron a pH 9 con hidróxido sódico acuoso 0,1 M, y seguidamente
tratados a 37ºC durante 1 hora. La solución tratada fue desalada
mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-10. La solución restante que no había pasado
a través de la membrana se filtró a través de un filtro Millipore
(0,22 \mum) y fue luego liofilizada para obtener el compuesto del
enunciado (2,30 g). El resultado obtenido mediante análisis GPC
después de disolver este compuesto en cloruro sódico acuoso 0,1 M
(columna: TSK Gel PW-4000XL, Tosoh, disolvente:
NaCl 0,1 M, índice de flujo: 0,8 ml/min) y el espectro de absorción
ultravioleta del compuesto (solución tampón Tris 0,1 M, pH 9,0,
0,20 mg/ml) se representan en las Figuras 10 y 11, respectivamente.
El contenido del residuo del compuesto medicamentoso en el
compuesto fue 5,8% (w/w) cuando se determinó con base en la
absorción a 362 nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
A una solución (2000 ml) de Dextran T10 (20 g,
Pharmacia, peso molecular medio: 10K) en tampón ácido acético 0,1 M
(pH 5,5) se añadió una solución acuosa (2000 ml) de periodato
sódico (66,0 g). Después de agitar a 4ºC durante diez días con
protección de luz, la mezcla se añadió con glicol etileno (14,0 ml)
y fue agitada durante la noche. La mezcla de reacción se ajustó a
pH 7,5 con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento con hielo.
Se añadió y disolvió borohidruro sódico (28 g), y la mezcla fue
agitada durante la noche a temperatura ambiente. La mezcla de
reacción fue enfriada con hielo, ajustada a pH 5,5 con ácido acético
y agitada a 4ºC durante una hora, y luego ajustada a pH 7,5 con
hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento con hielo. La solución
acuosa resultante se sometió a ultrafiltración utilizando una
membrana Biomax-5 (Millipore) para eliminar la
fracción de bajo peso molecular, y la solución restante que no había
atravesado la membrana fue pasada a través de una membrana
Biomax-30. El filtrado resultante fue liofilizado
para obtener polialcohol dextrano (8,0 g). El peso molecular de
esta sustancia fue 13K (filtración de gel, estándar pululano).
Este polialcohol dextrano (3,7 g) se añadió a una
solución acuosa obtenida mediante disolución de hidróxido sódico
(25,9 g) en agua (111 ml) y se disolvió a temperatura ambiente. A
esta solución, se añadió ácido monocloroacético (37 g) bajo
enfriamiento con hielo y se disolvió, y entonces se dejó reaccionar
la mezcla a temperatura ambiente durante 20 horas. Esta mezcla de
reacción se ajustó a pH 8 con ácido acético y fue desalada mediante
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-5.
La solución restante que no había pasado a través de la membrana
fue liofilizada para obtener la sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (6,2 g). El peso molecular de esta sustancia
fue 37K (filtración de gel, estándar pululano) y el grado de
carboximetilación fue 0,9.
Esta sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (6,0 g) se disolvió en agua, se aplicó a una
columna Bio-Rad AG 50W-X2 (trama
200-400, tipo H^{+}), y luego fue eluida con
agua. Este afluente se añadió con trietilamina (9,3 ml) y entonces
liofilizado para obtener el compuesto del enunciado (7,2 g).
El polialcohol dextrano (3,9 g) obtenido en el
Ejemplo 30 se añadió a una solución acuosa obtenida mediante
disolución de hidróxido sódico (16,3 g) en agua (117 ml) y se
disolvió a temperatura ambiente. A esta solución, se añadió ácido
monocloroacético (23,4 g) bajo enfriamiento con hielo y se
disolvió, y luego se dejó reaccionar la mezcla a temperatura
ambiente durante 18 horas. Esta mezcla de reacción se ajustó a pH 8
con ácido acético y fue desalada mediante ultrafiltración
utilizando una membrana Biomax-5. La solución
restante que no había pasado a través de la membrana fue
liofilizada para obtener la sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (5,0 g). El peso molecular de esta sustancia
fue 28K (filtración de gel, estándar pululano) y el grado de
carboximetilación fue 0,5. Esta sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (4,8 g) se convirtió en la sal trietilamónica
de una manera similar a la del Ejemplo 30 para obtener el compuesto
del enunciado (5,6 g).
Una solución acuosa (2000 ml) de periodato sódico
(66,0 g) se añadió a una solución (2000 ml) de Dextran 4 (20 g,
Funakoshi, peso molecular medio: 4K-6K) en tampón
ácido acético 0,1 M (pH 5,5). Después de agitar a 4ºC durante diez
días con protección de luz, la mezcla se añadió con glicol etileno
(14,0 ml) y fue agitada durante la noche. La mezcla de reacción se
ajustó a pH 7,5 con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento
con hielo. Se añadió y disolvió borohidruro sódico (28 g), y la
mezcla fue agitada durante la noche a temperatura ambiente. La
mezcla de reacción fue enfriada con hielo, ajustada a pH 5,5 con
ácido acético y agitada a 4ºC durante una hora, y luego ajustada a
pH 7,5 con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento con hielo.
La solución acuosa resultante se sometió a ultrafiltración
utilizando una membrana Biomax-3 (Millipore) para
eliminar la fracción de bajo peso molecular. El filtrado obtenido
fue liofilizado para obtener polialcohol dextrano (6,0 g). El peso
molecular de esta sustancia fue 9K (filtración de gel, estándar
pululano). Este polialcohol dextrano (2,7 g) se añadió a una
solución acuosa obtenida mediante disolución de hidróxido sódico
(18,9 g) en agua (81 ml) y se disolvió a temperatura ambiente. A
esta solución, se añadió ácido monocloroacético (27 g) bajo
enfriamiento con hielo y se disolvió, y entonces se dejó reaccionar
la mezcla a temperatura ambiente durante 20 horas. Esta mezcla de
reacción se ajustó a pH 8 con ácido acético y fue desalada mediante
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-5.
La solución restante que no había pasado a través de la membrana
fue liofilizada para obtener la sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (4,2 g). El peso molecular de esta sustancia
fue 20K (filtración de gel, estándar pululano), y el grado de
carboximetilación fue 0,9.
Esta sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (4,0 g) se convirtió en la sal trietilamónica
de una manera similar a la del Ejemplo 30 para obtener el compuesto
del enunciado (4,8 g).
El polialcohol dextrano (2,7 g) obtenido en el
Ejemplo 32 se añadió a una solución acuosa obtenida mediante
disolución de hidróxido sódico (11,3 g) en agua (81 ml) y se
disolvió a temperatura ambiente. A esta solución, se añadió ácido
monocloroacético (16,2 g) bajo enfriamiento con hielo y se
disolvió, y luego se dejó reaccionar la mezcla a temperatura
ambiente durante 18 horas. Esta mezcla de reacción se ajustó a pH 8
con ácido acético y fue desalada mediante ultrafiltración
utilizando una membrana Biomax-5. La solución
restante que no había pasado a través de la membrana fue
liofilizada para obtener la sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (2,7 g). El peso molecular de esta sustancia
fue 16K (filtración de gel, estándar pululano) y el grado de
carboximetilación fue 0,5. Esta sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (2,7 g) se convirtió en la sal trietilamónica
de una manera similar a la del Ejemplo 30 para obtener el compuesto
del enunciado (3,1 g).
La sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 30 (1,5 g) se disolvió
en N,N-dimetilformamida (90 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de trietilamina (0,07 ml) y
sal de ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) (210 mg) en
N,N-dimetilformamida (40 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(1,5 g), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 ml
de esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. Cada lote se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,5 ml)
y éter dietilo (20 ml), y entonces los precipitados depositados se
recogieron mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los
precipitados se disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M y se
ajustaron a pH 9 con hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo
enfriamiento con hielo. La solución acuosa resultante fue desalada
mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-3. La solución restante que no había pasado a
través de la membrana se filtró a través de un filtro Millipore
(0,22 \mum) y luego fue liofilizada para obtener el compuesto del
enunciado (1,3 g). El resultado obtenido mediante análisis GPC
después de disolver este compuesto en cloruro sódico acuoso 0,1 M
(columna: TSK Gel PW-4000XL, Tosoh, disolvente: NaCl
0,1 M, índice de flujo: 0,8 ml/min) y el espectro de absorción
ultravioleta del compuesto (solución tampón Tris 0,1 M, pH 9,0, 65
\mug/ml) se representan en las Figuras 12 y 13, respectivamente.
El contenido del residuo del compuesto medicamentoso en el
compuesto fue 6,4% (w/w) cuando se determinó con base en la
absorción a 362 nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
La sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 31(1,2 g) se
disolvió en N,N-dimetilformamida (90 ml). A esta
solución, se añadieron sucesivamente una solución de trietilamina
(0,056 ml) y sal de ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) (168 mg) en
N,N-dimetilformamida (30 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(1,2 g), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 ml
de esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. Cada lote se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,5 ml)
y éter dietilo (20 ml), y los precipitados depositados se
recogieron mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los
precipitados se disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M y se
ajustaron a pH 9 con hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo
enfriamiento con hielo. La solución acuosa resultante fue desalada
mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-3. La solución restante que no había pasado a
través de la membrana se filtró a través de un filtro Millipore
(0,22 \mum) y luego fue liofilizada para obtener el compuesto del
enunciado (1,0 g). El contenido del residuo del compuesto
medicamentoso en este compuesto fue 4,8% (w/w) cuando se determinó
con base en la absorción a 362 nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH
9,0).
La sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 32 (1,2 g) se disolvió
en N,N-dimetilformamida (90 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de trietilamina (0,056 ml) y
sal de ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) (168 mg) en
N,N-dimetilformamida (30 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(1,2 g), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 ml
de esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. Cada lote se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,5 ml)
y éter dietilo (20 ml), y los precipitados depositados se
recogieron mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los
precipitados se disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M y se
ajustaron a pH 9 con hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo
enfriamiento con hielo. La solución acuosa resultante fue desalada
mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-3. La solución restante que no había pasado a
través de la membrana se filtró a través de un filtro Millipore
(0,22 \mum) y luego fue liofilizada para obtener el compuesto del
enunciado (1,0 g). El contenido del residuo del compuesto
medicamentoso en este compuesto fue 5,9% (w/w) cuando se determinó
con base en la absorción a 362 nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH
9,0).
La sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 33 (1,5 g) se disolvió
en N,N-dimetilformamida (90 ml). A esta solución, se
añadieron ssucesivamente una solución de trietilamina (0,07 ml) y
sal de ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) (210 mg) en
N,N-dimetilformamida (40 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(1,5 g), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 ml
de esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. Cada lote se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,5 ml) y
éter dietilo (20 ml), y los precipitados depositados se recogieron
mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los precipitados se
disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M y se ajustaron a pH 9
con hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo enfriamiento con hielo. La
solución acuosa resultante fue desalada mediante ultrafiltración
utilizando una membrana Biomax-3. La solución
restante que no había pasado a través de la membrana se filtró a
través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y luego fue liofilizada
para obtener el compuesto del enunciado (1,3 g). El contenido del
residuo del compuesto medicamentoso en este compuesto fue 4,6%
(w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362 nm en
solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
Se disolvieron
Boc-Gly-Gly-Phe-Gly
(42 mg) y N-hidroxisuccinimida (12 mg) en
N,N-dimetilformamida (2 ml), se enfrió a 4ºC, y
luego se adicionó con N,N'-diciclohexilcarbodiimida
(22 mg). A esta solución, se añadió una solución de
N,N-dimetilformamida (6 ml), en la cual se
disolvieron el hidrocioruro del compuesto representado por la
siguiente formula:
[(1
S,9S)-1-amino-5-cloro-9-etil-2,3-dihidro-9-hidroxi-1H,12H-benzo[de]pirano-[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13(9H,15H]-diona:
DW-8286] (50 mg) y trietilamina (0,01 ml), y se dejó
reaccionar la mezcla con agitación y protección de luz a temperatura
ambiente durante 16 horas. Esta mezcla de reacción fue evaporada
hasta sequedad bajo presión reducida, y el residuo se purificó
mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente:
diclorometano:metanol = 10:1 solución conteniendo ácido acético
0,5%) para obtener el compuesto del enunciado (27 mg).
^{1}H-NMR (CDCl_{3})
\delta: 8,10-8,20 (br, 1H),
7,95-8,05 (br, 1H), 7,70-7,80 (br,
2H), 7,50-7,60 (br, 1H), 7,40-7,50
(br, 1H), 7,10-7,25 (m, 5H),
7,05-7,15 (br, 1H),
5,85-5,95(br, 1H), 5,50-5,60
(br, 1H), 5,40-5,50 (m, 1H),
5,25-5,3 5 (m, 1H), 5,05-5,15 (m,
1H), 4,90-5,00 (m, 1H), 4,70-4,80
(br, 1H), 4,10-4,25 (br, 2H),
3,60-3,90 (m, 4H), 3,10-3,40 (m,
3H), 2,95-3,05 (br, 1H), 2,15-2,30
(br, 1H), 1,75-1,90 (br, 2H), 1,39 (s, 9H),
0,80-1,00 (m, 3H).
La sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano (175 mg) obtenida en el Ejemplo 24 se disolvió
en N,N-dimetilformamida (20 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de sal de ácido
trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =DW-8286) (29 mg), la
cual había sido obtenida de
3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(27 mg) preparado en el Ejemplo 38 eliminando el grupo Boc de una
manera similar a la del Ejemplo 4, y trietilamina (9 \mul) en
N,N-dimetilformamida (5 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(175 mg), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 ml de
esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. La mezcla se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,5 ml) y
éter dietilo (20 ml), y los precipitados depositados se recogieron
mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los precipitados se
disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M y se ajustaron a pH 9 con
hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo enfriamiento con hielo. La
solución acuosa resultante fue desalada mediante ultrafiltración
utilizando una membrana Biomax-30. La solución
restante que no había pasado a través de la membrana se filtró a
través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y luego fue liofilizada
para obtener el compuesto del enunciado (135 mg). El resultado
obtenido mediante análisis GPC después de disolver este compuesto en
cloruro sódico acuoso 0,1 M (columna: TSK Gel
PW-4000XL, Tosoh, disolvente: NaCl 0,1 M, índice de
flujo: 0,8 ml/min) y el espectro de absorción ultravioleta del
compuesto (solución tampón Tris 0,1 M, pH 9,0, 99 \mug/ml) se
representan en las Figuras 14 y 15, respectivamente. El contenido
del residuo del compuesto medicamentoso en el compuesto fue 6,1%
(w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362 nm en
solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
Se disolvieron
Boc-Gly-Gly-Phe-Gly
(163 mg) y N-hidroxisuccinimida (45 mg) en
N,N-dimetilformamida (10 ml), se enfrió a 4ºC, y
luego se adicionó con N,N'-diciclohexilcarbodiimida
(79 mg). A esta solución, se añadió una solución de
N,N-dimetilformamida (30 ml), en la cual se
disolvieron tosilato del compuesto representado por la siguiente
formula:
[(1
S,9S)-1-amino-9-etil-2,3-dihidro-9-hidroxi-1
H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,
13(9H,15H)-diona: DW-8089] (170 mg) y trietilamina (0,054 ml), y se dejó reaccionar la mezcla con agitación a temperatura ambiente durante la noche bajo condiciones protegidas de la luz. Esta mezcla de reacción fue evaporada hasta sequedad bajo presión reducida, y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: diclorometano:metanol = 94:6 solución conteniendo ácido acético 0,5%) para obtener el compuesto del enunciado (100 mg).
13(9H,15H)-diona: DW-8089] (170 mg) y trietilamina (0,054 ml), y se dejó reaccionar la mezcla con agitación a temperatura ambiente durante la noche bajo condiciones protegidas de la luz. Esta mezcla de reacción fue evaporada hasta sequedad bajo presión reducida, y el residuo se purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente: diclorometano:metanol = 94:6 solución conteniendo ácido acético 0,5%) para obtener el compuesto del enunciado (100 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,51 (d, 1H, J=8,5 Hz),
8,41 (t, 1H, J=5,6 Hz), 8,29 (s, 1H), 8,17 (d, 1H, J=8,0 Hz), 8,03
(d, 1H, J=8,0 Hz), 7,90 (dd, 1H, J=4,8, 5,6 Hz), 7,79 (t, 1H, J=5,6
Hz), 7,53 (d, 1H, J=7,2 Hz), 7,36 (s, 1H),
7,13-7,25 (m, 5H), 6,94-6,95 (m,
1H), 5,60-5,63 (m, 1H), 5,36-5,47
(m, 2H), 5,21-5,30 (m, 2H),
4,42-4,47 (m, 1H), 3,63-3,96 (m,
3H), 3,51-3,59 (m, 3H), 3,31-3,40
(m, 1H), 3,09-3,21 (m, 1H), 3,02 (dd, 1H, J=4,8,
13,5 Hz), 2,76-2,81 (m, 1H),
2,13-2,17 (m, 2H), 1,85-1,90 (m,
2H), 1,37 (s, 9H), 0,89 (t, 3H, J=8,0 Hz).
Masa (FAB); m/e 822 (M+1).
Se disolvió la sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano (1,6 g) obtenida en el Ejemplo 24 en
N,N-dimetilformamida (60 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución obtenida mediante disolución de
sal de ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =DW-8089), la cual
había sido obtenida de
3'-N-(Boc-Gly-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(200 mg) preparado en el Ejemplo 40 eliminando el grupo Boc de una
manera similar a la del Ejemplo 4, y trietilamina (0,07 ml) en
N,N-dimetilformamida (20 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(1,6 g), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 ml
de esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. Cada lote se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,5 ml) y
éter dietilo (25 ml), y los precipitados depositados se recogieron
mediante centrifugación (2500 rpm, 8 minutos). Los precipitados
fueron lavados con etanol, luego disueltos en agua, se añadieron
con cloruro sódico acuoso 3 M (20 ml), y se ajustaron a pH 9 con
hidróxido sódico acuoso 0,1 M. Esta solución fue desalada mediante
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-10.
La solución restante que no había pasado a través de la membrana se
filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y luego fue
liofilizada para obtener el compuesto del enunciado (1,20 g). El
resultado obtenido mediante análisis GPC después de disolver el
compuesto en cloruro sódico acuoso 0,1 M (columna: TSK Gel
PW-4000XL, Tosoh, disolvente: NaCl 0,1 M, índice de
flujo: 0,8 ml/min) y el espectro de absorción ultravioleta del
compuesto (solución tampón Tris 0,1 M, pH 9,0, 0,26 mg/ml) se
representan en las Figuras 16 y 17, respectivamente. El contenido
del residuo del compuesto medicamentoso en el compuesto fue 5,0%
(w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362 nm en
solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
Se disolvió Dextran T150 (20 g, Pharmacia, peso
molecular medio: 150K) en tampón acetato 0,1 M (pH 5,5, 2000 ml) y
se añadió con una solución acuosa (2000 ml) de periodato sódico
(66,0 g). Después de agitar a 4ºC durante diez días con protección
de luz, la mezcla se añadió con glicol etileno (14,0 ml) y fue
agitada durante la noche. La mezcla de reacción se ajustó a pH 7,5
con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento con hielo. Se
añadió y disolvió borohidruro sódico (28 g), y entonces la mezcla
fue agitada a temperatura ambiente durante la noche. La mezcla de
reacción fue enfriada con hielo, ajustada a pH 5,5 con ácido
acético, y agitada a 4ºC durante 1 hora. El pH de la mezcla se
ajustó a 7,5 con hidróxido sódico acuoso 8 M bajo enfriamiento con
hielo. La solución acuosa resultante fue concentrada hasta 500 ml
mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-5 (Millipore) para obtener la Solución 1.
Separadamente, se realizaron una serie de procesos descritos
anteriormente utilizando Dextran T110 (20 g) para obtener la
Solución 2. Las Soluciones 1 y 2 fueron combinadas, y la solución
combinada se ajustó a pH 3,0 y fue incubada a 40ºC durante 4 horas,
y luego ajustada a pH 7 para obtener una solución conteniendo el
polialcohol dextrano con peso molecular rebajado. La solución fue
pasada a través de una membrana Biomax-30 y fue
desalada mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-5, y luego fue liofilizada para obtener
polialcohol dextrano (4,6 g). El peso molecular de esta sustancia
fue 17K (filtración de gel, estándar pululano).
Este polialcohol dextrano (2,5 g) se añadió a una
solución acuosa obtenida mediante disolución de hidróxido sódico
(17,5 g) en agua (75 ml) y se disolvió a temperatura ambiente. A
esta solución, se añadió ácido monocloroacético (25 g) bajo
enfriamiento con hielo y se disolvió, y luego se dejó reaccionar la
mezcla a temperatura ambiente durante 20 horas. Esta mezcla de
reacción se ajustó a pH 9 con ácido acético y luego fue desalada
mediante ultrafiltración utilizando una mmembrana
Biomax-5. La solución restante que no había pasado
a través de la membrana fue liofilizada para obtener la sal sódica
de polialcohol carboximetildextrano (4,0 g). El peso molecular de
esta sustancia fue 45K (filtración de gel, estándar pululano), y
el grado de carboximetilación fue 0,9.
Esta sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (3,7 g) se disolvió en agua, se aplicó a una
columna Bio-Rad AG 50W-X2 (trama
200-400, tipo H^{+}) y fue eluida con agua. Este
eluyente se añadió con trietilamina (5,8 ml) y luego fue
liofilizado para obtener el compuesto del enunciado (4,4 g).
Se disolvió la sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 42 (4,4 g) en
N,N-dimetilformamida (300 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de trietilamina (0,19 ml) y
sal de ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) (580 mg) en
N,N-dimetilformamida (45 ml) y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(4,4 g), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación y protección de luz. Esta mezcla de
reacción se ajustó a pH 10 con hidróxido sódico acuoso 1 M, y
entonces cada una de las porciones de 5 ml de la mezcla se añadió
por goteo a lotes de 25 ml de etanol. La mezcla se añadió con
cloruro sódico acuoso 3 M (1 ml) y éter dietilo (5 ml), y los
precipitados depositados se recogieron mediante centrifugación
(3500 rpm, 8 minutos). Los precipitados fueron disueltos en agua y
dializados con agua purificada utilizando una membrana de diálisis
(Spectrapore 1, peso molecular de corte;
6.000-8.000), y la solución dializada interna se
filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y luego fue
liofilizada para obtener el compuesto del enunciado (3,4 g). El
contenido del residuo del compuesto medicamentoso en este compuesto
fue 4,6% (w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362
nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
El polialcohol dextrano (2 g) obtenido en el
Ejemplo 42 se añadió a una solución acuosa obtenida mediante
disolución de hidróxido sódico (14 g) en agua (60 ml) y se disolvió
a temperatura ambiente. A esta solución, se añadió y disolvió ácido
\alpha-bromopropiónico (19 ml) bajo enfriamiento
con hielo, y luego se dejó reaccionar la mezcla a temperatura
ambiente durante 18 horas. La mezcla de reacción se ajustó a pH 8
con ácido acético y fue desalada mediante ultrafiltración
utilizando una membrana Biomax-50. La solución
restante que no había pasado a través de la membrana fue liofilizada
para obtener la sal sódica de polialcohol
\alpha-metilcarboximetildextrano (2,95 g). El
peso molecular de esta sustancia fue 45K (filtración de gel,
estándar pululano). El grado de
\alpha-metilcarboximetilación por cada residuo
sacárido se obtuvo de acuerdo con los casos de polialcohol
carboximetildextrano que siguen. Una solución acuosa de la sal
sódica de polialcohol
\alpha-metilcarboximetildextrano se aplicó a una
columna Bio-Rad AG 50W-X2 (tipo
H^{+}), y el efluente fue liofilizado y utilizado como muestra.
Esta muestra se disolvió en un exceso determinado de solución
acuosa de hidróxido sódico 0,1 N y fue neutralizada con ácido
clorhídrico 0,1 N utilizando fenolftaleína como un indicador. El
grado de \alpha-metilcarboximetilación se obtuvo
según la ecuación: grado de
\alpha-metilcarboximetilación =
13,4(a-b)/[s-7,2(a-b)]
en la cual "s" es la cantidad de muestra utilizada (mg),
"a" es el exceso determinado de solución acuosa de hidróxido
sódico 0,1 N (ml), y "b" es la cantidad de ácido clorhídrico
0,1 N consumida para la valoración (ml). Como resultado, el grado
de \alpha-metilcarboximetilación se determinó en
0,8.
Esta sal sódica de polialcohol
\alpha-metilcarboximetildextrano (2,2 g) se
disolvió en agua, se aplicó a una columna Bio-Rad AG
50W-X2 (trama 200-400, tipo
H^{+}) (diámetro: 44 mm, longitud: 210 mm), y luego fue eluida con
agua. Este efluente se añadió con trietilamina (4 ml) y luego fue
liofilizado para obtener sal trietilamónica de polialcohol
\alpha-metilcarboximetildextrano (2,69 g).
Esta sal trietilamónica de polialcohol
\alpha-metilcarboximetildextrano (2,68 g) se
disolvió en N,N-dimetilformamida (60 ml). A esta
solución, se añadieron sucesivamente una solución obtenida mediante
disolución de sal de ácido trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951), la cual
había sido obtenida de una manera similar a la del Ejemplo 16
eliminando el grupo Boc de
3'-N-(Boc-Gly-Gly-Gly-Phe)-NH-A
(350 mg) sintetizado similarmente al del Ejemplo 2, y trietilamina
(0,116 ml) en N,N-dimetilformamida (10 ml), y una
solución obtenida mediante disolución de
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(2,68 g) en N,N-dimetilformamida (10 ml), y se dejó
reaccionar la mezcla a temperatura ambiente durante la noche con
agitación. Esta mezcla de reacción se añadió con cloruro sódico
acuoso 3 M (40 ml), y cada una de las porciones de 6 ml de la
mezcla se añadió por goteo a lotes de 30 ml de etanol. Cada lote se
añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (1 ml) y éter dietilo (5 ml),
y el precipitado depositado fue recogido mediante centrifugación
(3500 rpm, 8 minutos). Este precipitado fue lavado con acetona,
luego disuelto en agua, añadido con cloruro sódico acuoso 3 M (10
ml), ajustado a pH 9 con hidróxido sódico acuoso 0,1 M, y tratado a
37ºC durante 1 hora. Esta solución tratada fue desalada mediante
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-10.
La solución restante que no había pasado a través de la membrana se
filtró a través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y luego fue
liofilizada para obtener el compuesto del enunciado (2,15 g). El
resultado obtenido mediante análisis GPC después de disolver este
compuesto en cloruro sódico acuoso 0,1 M (columna: TSK Gel
PW-4000XL, Tosoh, disolvente: NaCl 0,1 M, índice de
flujo: 0,8 ml/min) y el espectro de absorción ultravioleta del
compuesto (solución tampón Tris 0,1 M, pH 9,0, 0,21 mg/ml) se
representan en las Figuras 18 y 19, respectivamente. El contenido
del residuo del compuesto medicamentoso en el producto resultante
fue 5,9% (w/w) cuando se determinó con base en la absorción a 362
nm en solución tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
Una mezcla de sal de ácido
p-toluenosulfónico de
Phe-Gly-OBzl (3,06 g),
Boc-Gly-OH (1,10 g),
N-hidroxisuccinimida (941 mg),
N-metilmorfolina (0,725 ml), y
N,N-dimetilformamida (40 ml) se enfrió a 4ºC, y se
añadió con
N,N'-diciclohexil-carbodiimida (1,56
g). Se dejó reaccionar la mezcla durante la noche a temperatura
ambiente con agitación, y entonces fue evaporada hasta sequedad
bajo presión reducida. El residuo se purificó mediante cromatografía
en columna de gel de sílice (eluyente: solución
diclorometano:metanol = 98:2) para obtener
Boc-Gly-Phe-Gly-OBzl
(1,93 g).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,52 (dd, 1H, J=5,6, 6,4
Hz), 7,97 (d, 1H, J=8,8 Hz), 7,30-7,39 (m, 5H),
7,15-7,26 (m, 5H), 6,83 (t, 1H, J=5,6 Hz), 5,14 (s,
1H), 4,52-4,57 (m, 1H), 3,87-3,96
(m, 2H), 3,57 (dd, 1H, J=5,6, 16,7 Hz), 3,43 (dd, 1H, J=5,6, 16,7
Hz), 3,01 (dd, 1H, J=4,8, 14,3 Hz), 2,77 (dd, 1H, J=5,6, 14,3 Hz),
1,37 (s, 9H).
El
Boc-Gly-Phe-Gly-OBzl
resultante (1,78 g) se disolvió en acetato de etilo (60 ml) y fue
sometido a reducción catalítica durante 24 horas en presencia de
5%-Pd-C (1,8 g). El catalizador se eliminó mediante
filtración y el filtrado fue concentrado bajo presión reducida para
obtener
Boc-Gly-Phe-Gly-OH
(1,41 g).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,35 (t, 1H, J=5,6 Hz),
7,94 (d, 1H, J=8,8 Hz), 7,15-7,26 (m, 5H), 6,85
(dd, 1H, J=5,6, 6,4 Hz), 4,52-4,58 (m, 1H), 3,76
(d, 2H, J=5,6 Hz), 3,56 (dd, 1H, J=6,4, 16,7 Hz), 3,43 (dd, 1H,
J=5,6, 16,7 Hz), 3,03 (dd, 1H, J=5,0, 13,5 Hz), 2,79 (dd, 1H,
J=9,5, 13,5 Hz), 1,37 (s, 9H).
Se disolvieron el
Boc-Gly-Phe-Gly-OH
(500 mg) obtenido anteriormente y
N-hidroxisuccinimida (161 mg) en
N,N-dimetilformamida (10 ml). A esta solución, se
añadió una solución de N,N-dimetilformamida (50 ml),
en la cual se disolvieron metanosulfonato de
DX-8951 (530 mg) y trietilamina (0,146 ml). La
mezcla se enfrió a 4ºC, se añadió con
N,N'-diciclohexilcarbodiimida (268 mg), y se dejó
reaccionar durante la noche con agitación a temperatura ambiente
bajo condiciones protegidas de la luz. Esta mezcla de reacción fue
evaporada hasta sequedad bajo presión reducida y el residuo se
purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice
(eluyente: solución diclorometano:metanol = 96:4) para obtener
3'-N-(Boc-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) (100 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,39 (d, 1H, J=8,0 Hz),
8,34 (t, 1H, J=5,6 Hz), 7,98 (d, 1H, J=7,2 Hz), 7,78 (d, 1H, J=10,3
Hz), 7,33 (s, 1H), 7,13-7,24 (m, 5H), 6,80 (dd, 1H,
J=5,6, 6,4 Hz), 5,55-5,61 (m, 1H), 5,44 (d, 1H,
J=16,0 Hz), 5,41 (d, 1H, J=16,0 Hz), 5,25 (s, 2H),
4,43-4,46 (m, 1H), 3,69-3,79 (m,
2H), 3,50 (dd, 1H, J=5,6, 16,7 Hz), 3,41 (dd, 1H, J=5,6, 16,7 Hz),
3,16-3,19 (m, 2H), 2,98 (dd, 1H, J=4,8, 14,3 Hz),
2,79 (dd, 1H, J=9,5, 14,3 Hz) 2,41 (s, 3H),
2,19-2,25 (m, 1H), 2,10-2,15 (m,
1H), 1,82-1,90 (m, 2H), 1,35 (s, 9H), 0,88 (t, 3H,
J=8,0 Hz).
Masa (FAB); m/e 797 (M+1).
El
3'-N-(Boc-Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) resultante
(100 mg) se disolvió en ácido trifluoroacético (3 ml) y se dejó
reposar durante una hora. Se evaporó el disolvente, y el residuo
fue sometido a destilaciones azeotrópicas dos veces con metanol (30
ml) y dos veces con etanol (30 ml), y luego lavado con éter para
obtener el compuesto del enunciado (80 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,52-8,62
(m, 1H), 7,94 (s, 3H), 7,79 (t, 1H, J=11,1 Hz), 7,34 (s, 1H),
7,15-7,27 (m, 5H), 6,52 (s, 1H),
5,57-5,61 (m, 1H), 5,36-5,46 (m,
2H), 4,66-4,70 (m, 1H), 3,69-3,81
(m, 2H), 3,61-3,68 (m, 1H),
3,40-3,47 (m, 1H), 3,15-3,23 (m,
1H), 3,01 (dd, 1H, J=4,0, 13,5 Hz), 2,77 (dd, 1H, J=9,5, 13,5 Hz),
2,12-2,23 (m, 2H), 1,81-1,91 (m,
2H), 0,89 (t, 3H, J=7,2 Hz).
Masa (FAB); m/e 697 (M+1).
Se disolvieron
Boc-Phe-Gly (771 mg) y
N-hidroxisuccinimida (300 mg) en
N,N-dimetilformamida (10 ml). A esta solución, se
añadió una solución de N,N-dimetilformamida (50
ml), en la cual se disolvieron metanosulfonato de
DX-8951 (1058 mg) y trietilamina (0,293 ml). La
mezcla se enfrió a 4ºC, y luego se adicionó con
N,N'-diciclohexilcarbodiimida (494 mg), y se dejó
reaccionar con agitación a temperatura ambiente durante la noche
bajo condiciones protegidas de la luz. Esta mezcla de reacción fue
evaporada hasta sequedad bajo presión reducida, y el residuo se
purificó mediante cromatografía en columna de gel de sílice
(eluyente: solución diclorometano:metanoi = 98:2) para obtener
3'-N-(Boc-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) (1,20 g).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,29 (d, 1H, J=8,0 Hz),
8,21 (t, 1H, J=4,8 Hz), 7,76 (d, 1H, J=10,3 Hz), 7,32 (s, 1H),
7,13-7,25 (m, 5H), 6,92 (d, 1H, J=7,2 Hz), 6,49 (s,
1H), 5,56-5,61 (m, 1H), 5,44 (d, 1H, J=15,9 Hz),
5,38 (d, 1H, J=15,9 Hz), 5,25 (s, 2H), 4,08-4,12 (m,
1H), 3,78 (d, 1H, J=4,8 Hz), 3,16-3,25 (m, 2H),
2,99 (dd, 1H, J=4,0, 13,5 Hz), 2,72 (dd, 1H, J=10,3, 13,5 Hz), 2,40
(s, 3H), 2,09-2,35 (m, 2H),
1,80-1,91 (m, 2H), 1,16 (s, 9H), 0,88 (t, 3H, J=8,0
Hz).
Masa (FAB); m/e 741 (M+1).
El
3'-N-(Boc-Phe-Gly)-NH-A
(170 mg) obtenido anteriormente se disolvió en ácido
trifluoroacético (4 ml) y se dejó reposar durante una hora. Se
evaporó el disolvente, y el residuo fue sometido a destilaciones
azeotrópicas dos veces con metano) (10 ml) y dos veces con etanol
(10 ml), y luego lavado con éter para obtener el compuesto del
enunciado (100 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,88 (t, 1H, J=4,8 Hz),
8,68 (d, 1H, J=8,7 Hz), 8,05-8,15 (m, 3H), 7,79 (d,
1H, J=11,1 Hz), 7,26-7,36 (m, 5H), 6,52 (d, 1H,
J=7,2 Hz), 5,57-5,62 (m, 1H), 5,43 ((d, 1H, J=15,9
Hz), 5,38 (d, 1H, J=15,9 Hz), 5,19-5,28 (m, 1H),
4,10-4,18 (m, 1H), 3,93 (dd, 1H, J=4,8, 16,7 Hz),
3,82 (dd, 1H, J=4,8, 16,7 Hz), 3,17-3,24 (m, 2H),
3,14 (dd, 1H, J=4,8, 13,5 Hz), 2,95 (dd, 1H, J=8,0, 13,5 Hz), 2,42
(s, 3H), 2,14-2,25 (m, 2H),
1,83-1,91 (m, 2H), 0,89 (t, 3H, J=8,0 Hz).
Masa (FAB); m/e 640 (M+1).
Se disolvieron metanosulfonato de
DX-8951 (530 mg) y trietilamina (0,28 ml) en
N,N-dimetilformamida (10 ml), se enfrió a 4ºC, y se
añadió con éster N-hidroxisuccinimida de
Boc-Gly (327 mg). Se dejó reaccionar la mezcla con
agitación a temperatura ambiente durante la noche bajo condiciones
protegidas de la luz. Esta mezcla de reacción fue evaporada hasta
sequedad bajo presión reducida, y entonces el residuo se purificó
mediante cromatografía en columna de gel de sílice (eluyente:
solución diclorometano:metanol = 98:2) para obtener
3'-N-(Boc-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) (500 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,38 (d, 1H, J=8,3 Hz),
7,77 (d, 1H, J=10,7 Hz), 7,31 (s, 1H), 6,89-6,91
(m, 1H), 6,49 (s, 1H), 5,55-5,59 (m, 1H), 5,45 (d,
1H, J=16,1 Hz), 5,38 (d, 1H, J=16,1 Hz), 5,27 (d, 1H, J=19,0 Hz),
5,18 (d, 1H, J=19,0 Hz), 3,50-3,62 (m, 2H),
3,15-3,19 (m, 2H), 2,41 (s, 3H),
2,18-2,24 (m, 1H), 2,08-2,12 (m,
1H), 1,81-1,91 (m, 2H), 1,31 (s, 9H), 0,87 (t, 3H,
J=8,0 Hz).
Masa (FAB); m/e 593 (M+1).
El
3'-N-(Boc-Gly)-NH-A
(100 mg) obtenido anteriormente se disolvió en ácido
trifluoroacético (2 ml) y se dejó reposar durante una hora. Se
evaporó el disolvente, y el residuo fue sometido a destilaciones
azeotrópicas dos veces con metanol (10 ml) y dos veces con etanol
(10 ml), y luego lavado con éter para obtener el compuesto del
enunciado (70 mg).
^{1}H-NMR
(DMSO-d_{6}) \delta: 8,88 (d, 1H, J=8,8 Hz),
8,08 (s, 3H), 7,81 (d, 1H, J=11,2 Hz), 7,34 (s, 1H), 6,52 (s, 1H),
5,63-5,67 (m, 1H), 5,45 (d, 1H, J=16,7 Hz), 5,40
(d, 1H, J=16,7 Hz), 5,36 (d, 1H, J=19,1 Hz), 5,25 (d, 1H, J=19,1
Hz), 3,56 (s, 2H), 3,11-3,19 (m, 2H), 2,43 (s, 3H),
2,23-2,28 (m, 1H), 2,11-2,19 (m,
1H), 1,81-1,91 (m, 2H), 0,88 (t, 3H, J=8,0 Hz).
Masa (FAB); m/e 493 (M+1).
Se disolvió Dextran T500 (50 g, Pharmacia, peso
molecular: 500K) en tampón acetato 0,1 M JpH 5,5, 5000 ml) y se
añadió con una solución acuosa (5000 ml) de periodato sódico (165,0
g). Después de agitar a 4ºC durante diez días con protección de
luz, la mezcla se añadió con glicol etileno (35,0 ml) y fue agitada
durante la noche. La mezcla de reacción se ajustó a pH 7 con
hidróxido sódico acuoso 8 M. Se añadió y disolvió borohidruro sódico
(70 g), y la mezcla fue agitada durante la noche. La mezcla de
reacción fue enfriada con hielo, ajustada a pH 5,5 con ácido acético
y agitada a 4ºC durante una hora, y luego ajustada a pH 7,5 con
hidróxido sódico acuoso 8 M. La solución acuosa resultante fue
desalada mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-50. La solución restante que no había pasado
a través de la membrana fue liofilizada para obtener polialcohol
dextrano (20,2 g). El peso molecular de esta sustancia fue 159K
(filtración de gel, estándar pululano).
Este polialcohol dextrano (7,5 g) se añadió a una
solución acuosa obtenida mediante disolución de hidróxido sódico
(31,5 g) en agua (225 ml) y se disolvió a temperatura ambiente. A
esta solución, se añadió ácido monocloroacético (45 g) bajo
enfriamiento con hielo, se disolvió, y se dejó reaccionar la mezcla
a temperatura ambiente durante la noche. Esta mezcla de reacción se
ajustó a pH 8 con ácido acético y luego fue desalada mediante
ultrafiltración utilizando una membrana Biomax-50.
La solución restante que no había pasado a través de la membrana
fue liofilizada para obtener la sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (8,5 g). El peso molecular de esta sustancia
fue 274K (filtración de gel, estándar pululano), y el grado de
carboximetilación fue 0,4. Esta sal sódica de polialcohol
carboximetildextrano (2,0 g) se disolvió en agua, se aplicó a una
columna Bio-Rad AG 50W-X2 (trama
200-400, tipo H^{+}) (diámetro: 44 mm, longitud:
210 mm) y fue eluida con agua. Este efluente se añadió con
trietilamina (4 ml) y luego fue liofilizado para obtener el
compuesto del enunciado (2,2 g).
La sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 48 (200 mg) se disolvió
en N,N-dimetilformamida (7 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de la sal de ácido
trifluoroacético de
3'-N-(Gly-Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) obtenida en el
Ejemplo 45 (41 mg) en N,N-dimetilformamida (5 ml),
trietilamina (0,014 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(100 mg), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación. Cada una de las porciones de 5 mi
de esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de 10 ml de
etanol. La mezcla se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M (2,0 ml) y
éter dietilo (25 ml), y los precipitados depositados se recogieron
mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los precipitados se
disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M y se ajustaron a pH 9 con
hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo enfriamiento con hielo. La
solución acuosa resultante fue desalada mediante ultrafiltración
utilizando una membrana Biomax-50. La solución
restante que no había pasado a través de la membrana se filtró a
través de un filtro Millipore (0,22 \mum) y luego fue liofilizada
para obtener el compuesto del enunciado (190 mg). El contenido del
residuo del compuesto medicamentoso en este compuesto fue 4,5% (w/w)
cuando se determinó con base en la absorción a 362 nm en tampón
Tris 0,1 M (pH 9,0).
La sal sódica de polialcohol carboximetildextrano
obtenida en el Ejemplo 24 (2,5 g) se disolvió en agua, se aplicó a
una columna Bio-Rad AG 50W-X2 (trama
200-400, tipo Et_{3}N H^{+}) y fue eluida con
agua. Este efluente fue liofilizado para obtener sal trietilamónica
de polialcohol carboximetildextrano (2,5 g).
Esta sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano (200 mg) se disolvió en
N,N-dimetilformamida (12 ml). A esta solución, se
añadieron sucesivamente una solución de la sal de ácido
trifluoroacético de
3'-N-(Phe-Gly)-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) (42 mg)
obtenida en el Ejemplo 46 y trietilamina (0,016 ml) en
N,N-dimetilformamida (5 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(200 mg), y se dejó reaccionar la mezcla a temperatura ambiente
durante la noche con agitación y protección de luz. Esta mezcla de
reacción se añadió con agua (300 ml) y fue sometida a
ultrafiltración utilizando una membrana de ultrafiltración 10K
(Filtron). La solución restante que no había pasado a través de la
membrana se ajustó a pH 10 con hidróxido sódico acuoso 0,1 N, y se
pasó a través de una membrana de filtración (0,16 \mum, Filtron).
El filtrado fue desalado mediante ultrafiltración utilizando una
membrana Biomax-50, y entonces se filtró a través
de un filtro Millipore (0,22 \mum) y fue liofilizado para obtener
el compuesto del enunciado (180 mg). El contenido del residuo del
compuesto medicamentoso en este compuesto fue 6,1% (w/w) cuando se
determinó con base en la absorción a 362 nm en solución tampón Tris
0,1 M (pH 9,0).
La sal trietilamónica de polialcohol
carboximetildextrano obtenida en el Ejemplo 48 (370 mg) se disolvió
en N,N-dimetilformamida (10 ml). A esta solución,
se añadieron sucesivamente una solución de la sal de ácido
trifluoroacético de
3'-N-Gly-NH-A
(A-NH_{2} =DX-8951) obtenida en
el Ejemplo 47 (57 mg) en N,N-dimetilformamida (3
ml), trietilamina (0,027 ml), y
1-etoxicarbonil-2-etoxi-1,2-dihidroxiquinolina
(185 mg), y luego se dejó reaccionar la mezcla a temperatura
ambiente durante la noche con agitación. Cada una de las porciones
de 5 ml de esta mezcla de reacción se añadió por goteo a lotes de
10 ml de etanol. La mezcla se añadió con cloruro sódico acuoso 3 M
(2,0 ml) y éter dietilo (25 ml), y los precipitados depositados se
recogieron mediante centrifugación (3500 rpm, 8 minutos). Los
precipitados se disolvieron en cloruro sódico acuoso 0,5 M y se
ajustaron a pH 9 con hidróxido sódico acuoso 0,1 M bajo
enfriamiento con hielo. La solución acuosa resultante fue desalada
mediante ultrafiltración utilizando una membrana
Biomax-50. La solución restante que no había pasado
a través de la membrana se filtró a través de un filtro Millipore
(0,22 \mum) y luego fue liofilizada para obtener el compuesto del
enunciado (290 mg). El contenido del residuo del compuesto
medicamentoso en este compuesto fue 0,5% (w/w) cuando se determinó
con base en la absorción a 362 nm en tampón Tris 0,1 M (pH 9,0).
Se prepararon ratones portadores de tumor Meth A
(6 ratones por grupo) de acuerdo con una forma similar a la del
Ejemplo 11 y se examinó la actividad antitumoral del complejo
medicamentoso del Ejemplo 15 mediante administración simple, de una
manera similar a la del Ejemplo 12. Como resultado, el complejo
medicamentoso del Ejemplo 15 presentaba una actividad antitumoral
considerablemente mejorada y campo de dosificación efectiva más
amplio en comparación con el compuesto medicamentoso del Ejemplo 12
aislado.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon ratones desnudos portadores de
tumor SC-6 (5 ratones por grupo) mediante
trasplante subcutáneo de una porción de bloque de tumor gástrico
humano SC-6 en las regiones inguinales derechas de
ratones desnudos (BALB/c-nu/nu, machos). El 27º día
después del trasplante, el complejo medicamentoso del Ejemplo 15
disuelto en agua destilada para inyecciones, se inyectó como una
administración intravenosa simple y su actividad antitumoral fue
comparada con la del compuesto medicamentoso aislado. Como
resultado, el complejo medicamentoso del Ejemplo 15 presentó mayor
actividad antitumoral en comparación con el compuesto medicamentoso
aislado, mientras que no hubo muertes debidas a toxicidad.
\vskip1.000000\baselineskip
Se prepararon ratones desnudos portadores de
cáncer de pulmón humano QG-90 (5 ratones por grupo)
según una forma similar a la del Ejemplo 53. El 16º día después del
trasplante, el complejo medicamentoso del Ejemplo 15 disuelto en
agua destilada para inyecciones, se inyectó como una administración
intravenosa simple y su actividad antitumoral fue comparada con la
del compuesto medicamentoso por sí mismo. Como resultado, el
complejo medicamentoso del Ejemplo 15 presentó una actividad
antitumoral considerablemente mejorada y un campo de dosificación
efectiva más amplio en comparación con el compuesto medicamentoso
aislado.
Se prepararon ratones portadores de tumor Meth A
(6 ratones por grupo) de acuerdo con una forma similar a la del
Ejemplo 11, y se examinó la actividad antitumoral del complejo
medicamentoso del Ejemplo 41 en los casos de administración simple
de una manera similar a la del Ejemplo 12, y su actividad
antitumoral fue comparada con la del compuesto medicamentoso
aislado. Como resultado, el complejo medicamentoso del Ejemplo 41
presentó una actividad antitumoral considerablemente mejorada y un
campo de dosificación efectiva más amplio en comparación con el
compuesto medicamentoso aislado.
Se prepararon ratones portadores de tumor Meth A
(6 ratones por grupo) de acuerdo con una forma similar a la del
Ejemplo 11, y se examinó la actividad antitumoral de acuerdo con un
procedimiento similar al del Ejemplo 12 mediante administración
simple de los complejos medicamentosos de los Ejemplos 29, 43 y 44,
respectivamente. Como resultado, todos los complejos medicamentosos
presentaron mayor actividad antitumoral y campo de dosificación
efectiva más amplio.
Se prepararon ratones portadores de tumor Meth A
según una forma similar a la del Ejemplo 11. Se inyectó el complejo
medicamentoso del Ejemplo 15 como administración simple de una
manera similar a la del Ejemplo 12 (10 mg/kg: calculado como el
compuesto medicamentoso), y se determinó el cambio de concentración
del complejo medicamentoso en diversos tejidos. Como resultado, el
complejo medicamentoso del Ejemplo 15 se mostró poseedor de un nivel
de retención en sangre considerablemente más largo, mayor
distribución en tejidos tumorales, y más alta selectividad tumoral
en hígado e intestino delgado. Los resultados se representan en la
Figura 20.
La reacción entre el derivado de polisacárido que
presenta grupos carboxilo y el compuesto medicamentoso ligado con el
espaciador o similar puede ser realizada con alto rendimiento, y
cuando un compuesto medicamentoso que presenta un anillo lactona se
somete a la reacción, pueden reducirse las reacciones colaterales y,
por tanto, el procedimiento de la presente invención es
completamente útil como procedimiento para preparar el complejo
medicamentoso.
Claims (9)
1. Un procedimiento para la fabricación de un
complejo medicamentoso, en el cual un derivado de polisacárido que
presenta grupos carboxilo y un residuo de un compuesto medicamentoso
están ligados entre sí mediante un espaciador que comprende un
aminoácido o un espaciador que comprende 2 a 8 aminoácidos enlazados
peptídicamente, o en el cual un derivado de polisacárido que
presenta grupos carboxilo y un residuo de un compuesto medicamentoso
están ligados entre sí sin el espaciador, caracterizado
porque una sal de amina orgánica del derivado polisacárido que
presenta grupos carboxilo se hace reaccionar con el compuesto
medicamentoso o con el espaciador ligado al compuesto medicamentoso
en un sistema no acuoso.
2. Un procedimiento para la fabricación de un
complejo medicamentoso, en el cual un derivado de polisacárido que
presenta grupos carboxilo y un residuo de un compuesto medicamentoso
están ligados entre sí mediante un espaciador que comprende un
aminoácido o un espaciador que comprende 2 a 8 aminoácidos enlazados
peptídicamente, o en el cual un derivado de polisacárido que
presenta grupos carboxilo y un residuo de un compuesto medicamentoso
están ligados entre sí sin el espaciador, cuyo procedimiento
comprende las etapas de:
(1) convertir una sal de metal alcalino del
derivado polisacárido que presenta grupos carboxilo en una sal de
amina orgánica de dicho derivado, y
(2) hacer reaccionar la sal de amina orgánica con
el compuesto medicamentoso o con el espaciador ligado al compuesto
medicamentoso en un sistema no acuoso.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó
2, en el cual el derivado polisacárido que presenta grupos carboxilo
es un polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano.
4. El procedimiento según la reivindicación 3, en
el cual el polialcohol dextrano que constituye el polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano es un
polialcohol dextrano obtenido mediante tratamiento de un dextrano
bajo condiciones que permiten una polialcoholización sustancialmente
completa.
5. El procedimiento según la reivindicación 3 ó
4, en el cual el polialcohol
carboxi(C_{1-4})alquildextrano es un
polialcohol carboximetildextrano.
6. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el cual el compuesto medicamentoso es un
agente antineoplásico o un agente
anti-inflamatorio.
7. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el cual el compuesto medicamentoso es un
compuesto medicamentoso que puede formar un anillo lactona.
8. El procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el cual un compuesto medicamentoso que
presenta un anillo lactona formado o un espaciador ligado a un
compuesto medicamentoso que presenta un anillo lactona formado, se
utiliza para la reacción de la sal de amina orgánica con el
compuesto medicamentoso o con el espaciador ligado al compuesto
medicamentoso.
9. El procedimiento según la reivindicación 8, en
el cual el compuesto medicamentoso que puede formar un anillo
lactona descrito en la reivindicación 7 es
(1S,9S)-1-amino-9-etil-5-fluoro-2,3-dihidro-9-hidroxi-4-metil-1H,12H-benzo[de]pirano[3',4':6,7]indolizino[1,2-b]quinolina-10,13(9H,15H)-diona.
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