ES2229481T3 - Metodo para la eliminacion de virus a partir de soluciones de proteinas mediante nanofiltracion. - Google Patents

Metodo para la eliminacion de virus a partir de soluciones de proteinas mediante nanofiltracion.

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ES2229481T3 ES98908308T ES98908308T ES2229481T3 ES 2229481 T3 ES2229481 T3 ES 2229481T3 ES 98908308 T ES98908308 T ES 98908308T ES 98908308 T ES98908308 T ES 98908308T ES 2229481 T3 ES2229481 T3 ES 2229481T3
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Abstract

Procedimiento para eliminar virus, en particular virus pequeños sin envuelta, de un producto derivado de plasma, tal como Concentrado de Complejo de Protrombina. El procedimiento comprende una prefiltración para eliminar proteínas contaminantes de alto peso molecular, seguido de nanofiltración a través de una membrana con un tamaño medio de poros de 15 nm. El procedimiento es capaz de retirar > 5,1 log del parvovirus canino y > 6,0 log del virus de la Hepatitis A.

Description

Método para la eliminación de virus a partir de soluciones de proteína mediante nanofiltración.
Sector al que pertenece la invención
La presente invención se refiere a métodos para mejorar la seguridad vírica de las soluciones de proteína, particularmente de productos derivados de la sangre. Más específicamente, la invención da a conocer un método para eliminar los virus, en particular, virus pequeños sin envoltura, a partir de un producto derivado de plasma, tal como la Protrombina Compleja Concentrada (PCC).
Antecedentes de la invención
Las proteínas del plasma que dependen de la vitamina K, tales como factores de coagulación II, VII, IX y X, y Proteínas C y S, desempeñan un papel importante en el campo de la coagulación. Se han utilizado estos factores aislados de plasma desde principios de los años setenta para tratar pacientes que sufren una deficiencia congénita de las proteínas mencionadas anteriormente (por ejemplo, Hemofilia B) y pacientes que sufren una deficiencia adquirida (por ejemplo, la terapia cumarina desequilibrada). Se conoce también el producto que contiene las proteínas terapéuticas que dependen de la vitamina K, como la Protrombina Compleja Concentrada (PCC).
Los métodos ampliamente utilizados para mejorar la seguridad vírica de los productos sanguíneos son métodos químicos, tales como el método del detergente disolvente, y el tratamiento por calor tal como la pasteurización o el tratamiento de secado por calor. Estos métodos son muy eficaces para la eliminación o la desactivación de los virus con envoltura, tales como Virus de la Hepatitis B (HBV), Virus de la Hepatitis C (HCV) y Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV). Sin embargo, estos métodos son menos eficaces para los virus sin envoltura.
De modo convencional, se trata la PCC, que está en proceso, con productos químicos virúcidas (por ejemplo, 0,3% de TNBP y 1,0% de Tween 80) para desactivar los virus. Los virus desactivados mediante tal tratamiento son virus con envoltura tales como Virus de la Hepatitis B, Virus de la Hepatitis C y Virus de la Inmunodeficiencia Humana.
Desde el punto de vista de las autoridades regulatorias, existe una creciente demanda para prevenir la transmisión mediante productos sanguíneos de los virus sin envoltura, tales como Virus de la Hepatitis A (HAV) y Parvovirus B19 Humano (HPV). Estos virus muestran típicamente una resistencia química y al calor y tienen un tamaño pequeño de 25 y 20 nm, respectivamente. Los métodos existentes de la desactivación vírica no han sido ampliamente exitosos en la desactivación de Virus de la Hepatitis A y especialmente en Parvovirus B19 Humano.
Se ha aplicado con éxito la nanofiltración (15 nm) como técnica de eliminación del virus, para proteínas altamente purificadas con un peso molecular inferior a 150 kD (WO 96/00237, Pharmacia). Sin embargo, los intentos de utilizar la nanofiltración para eliminar Virus de la Hepatitis A y Parvovirus B19 de una solución, tal como concentrado de complejo de Protrombina, continuaron sin éxito.
La Protrombina Compleja Concentrada es un producto de pureza más bien baja que contiene varias proteínas (estimado en 20 a 30 aproximadamente) con un peso molecular de hasta 20000 kD aproximadamente. Los componentes terapéuticos en la Protrombina Compleja Concentrada tienen un peso molecular de solamente 70 kD aproximadamente. Se ha descubierto que la Protrombina Compleja Concentrada no puede pasar a través de un nanofiltro con un tamaño de poro de 15 nm por la presencia de estos contaminantes en el mismo que son proteínas de alto peso molecular. Se bloquea, de modo eficaz, el paso de las proteínas terapéuticas a través del nanofiltro mediante la obturación de la membrana por proteínas de alto peso molecular. La filtración de 35 nm es factible solamente para la Protrombina Compleja Concentrada, pero este tipo de filtración no elimina el Virus de la Hepatitis A ni el Parvovirus B19 Humano (J. Römisch y otros, Beitr. Infusions-ther. Transfusionsmed. Basel, Karger, 1996, Vol. 33, 220-224). Ver también M. Burnouf-Radoserisch y otros, Vox Sang. 67:132-138 (1994) y M. Poulle y otros, Blood Coagulation and Fibrinolysis 5:543-549 (1994)).
Un objetivo de la presente invención es dar a conocer un método que solucione este problema.
Un objetivo de la invención es dar a conocer un método para la eliminación o la desactivación de virus pequeños, tales como, en particular, virus sin envoltura como el HAV y los parvovirus, a partir de una mezcla compleja, particularmente productos derivados de plasma, tal como la Protrombina Compleja Concentrada.
Otro objetivo de la presente invención es dar a conocer un método eficaz para eliminar virus pequeños, particularmente los virus sin envoltura, mediante la nanofiltración de un suero sanguíneo o una mezcla derivada de plasma que contiene uno o más miembros del grupo que consiste en factores de coagulación II, VII, IX y X y Proteínas C y S, juntamente con proteínas de peso molecular más alto que tienen un peso molecular a partir de 200 kD aproximadamente, más particularmente, un peso molecular de 400 kD aproximadamente a 20000 kD aproximadamente.
Características de la invención
La invención consigue los objetivos citados anteriormente proporcionando un método en el que una mezcla compleja, particularmente la Protrombina Compleja Concentrada, se somete a un pretratamiento que mejora las propiedades de filtración de la solución de proteínas. Típicamente, el pretratamiento comprende una filtración, tal como la filtración a través de una membrana de 150 kD en un método de flujo tangencial a una presión transmembrana de menos de 0,5 bares. Después del pretratamiento, se puede filtrar la PCC a través de un nanofiltro de 15 nm.
Descripción detallada de la invención
Más específicamente, la presente invención da a conocer un método para la eliminación de los virus, en particular virus sin envoltura, de una solución de proteína, que comprende someter dicha mezcla a un pretratamiento que elimina las proteínas grandes, y someter el producto resultante a una nanofiltración que elimina los virus. Mediante la aplicación del método de la presente invención a una solución de proteínas que puede ser contaminada con virus (sin envoltura), se puede asegurar que el producto obtenido se encuentra sustancialmente libre de dichos virus. Por consiguiente, se puede reformular el objeto de la presente invención como un método para someter soluciones de proteínas a un tratamiento o un proceso que asegura su libertad sustancial de los virus (sin envoltura).
La solución de proteína es preferentemente una solución de proteína derivada de la sangre, particularmente una solución de proteína que contiene una o varias proteínas seleccionadas del grupo que consiste en factores de coagulación II, VII, IX, X, Proteína C, Proteína S, albúmina, antitrombina III, plasminógeno, cofactor II de heparina, inhibidor alfa-1-proteinasa, inhibidor C1, transferrina, proteína unida a la vitamina D e inmunoglobulina G. En la realización más preferente de la invención, dicha solución de proteína es la Protrombina Compleja Concentrada.
Generalmente, las proteínas grandes, que se deben eliminar mediante el pretratamiento, tendrán un peso molecular superior a 150 kD aproximadamente, más particularmente un peso molecular desde 400 kD aproximadamente hasta 20000 kD aproximadamente. Generalmente, las proteínas grandes están seleccionadas del grupo que consiste en fibrinógeno, fibronectina, inmunoglobulina M, factores de coagulación VIII, XIII, factor de von Willebrand y sus formas multiméricas, inhibidor de inter-alfa-(tripsina), alfa-2-macroglobulina, proteína de complemento C1q, proteína de complemento C4, apolipoproteína (a), apolipoproteína B-100 y ferritina.
En una realización particularmente preferente de la invención, el pretratamiento comprende una filtración de membrana a través de una membrana que tiene un valor de corte entre 100 y 250 kD aproximadamente, preferentemente de 150 kD aproximadamente. Es preferente que se lleve a cabo la filtración de membrana en un modo de filtración de flujo tangencial a una presión transmembrana inferior a 0,5 bares, y que durante la filtración se añada un tampón al retentado y que se detenga el proceso de filtración cuando la cantidad del filtrado es de 4 a 6 veces aproximadamente la cantidad del material de partida.
Generalmente, se llevará a cabo la nanofiltración en un nanofiltro que tiene un valor de corte entre 10 y 30 nm aproximadamente, preferentemente de 15 nm aproximadamente, en un modo de filtración final ("dead end"). Preferentemente, el nanofiltrato resultante (es decir, el filtrado obtenido en la nanofiltración) se concentra directamente mediante diafiltración o ultrafiltración, preferentemente en un cartucho de hemodiálisis.
Los virus que se deben eliminar, si están presentes, son generalmente virus sin envoltura, particularmente virus sin envoltura que tienen un diámetro de 20 nm o más, tales como, particularmente, Virus de la Hepatitis A, parvovirus tales como Parvovirus B19 Humano y Parvovirus Canino, y Virus Encefalomiocarditis.
El método puede incluir una desactivación del virus, preferentemente antes de dicho pretratamiento, calentando la solución de proteína con detergentes tales como detergentes iónicos y/o no iónicos en presencia de compuestos de fosfato de dialquilo o trialquilo tales como fosfato de tri-n-butilo. Adicionalmente, se puede liofilizar la solución de proteína obtenida.
Adicionalmente, la presente invención da a conocer un producto, más particularmente la Protrombina Compleja Concentrada, que es sustancialmente libre de virus (sin envoltura) y que se obtiene con el método de la presente invención.
El objeto de la invención, que comprende una combinación de una prefiltración seguida por una nanofiltración, es aplicable a cada proteína terapéutica presente en una solución con un compuesto complejo. Se podría derivar tal solución de proteína de un plasma sanguíneo, tejido corporal, extractos de fermentación u otros materiales de fuente biológica. Tal como se ha comentado anteriormente, el material de partida preferente de la presente invención es la PCC.
Los contaminantes de alto peso molecular que se eliminan típicamente mediante la etapa de prefiltración tienen un peso molecular de, por lo menos, 150 kD. En el caso de una solución de proteína derivada de la sangre, la prefiltración elimina particularmente proteínas tales como: fibrinógeno, fibronectina, inmunoglobulina M, factor de coagulación VIII, factor de coagulación XIII, factor de von Willebrand y sus formas multiméricas, inhibidor inter-alfa (= inhibidor inter-alfa-tripsina), alfa-2-macroglobulina, complemento de proteína C1q, complemento de proteína C4, apolipoproteína (a), apolipoproteína B-100 y ferritina.
La utilización de la nanofiltración está limitada a proteínas terapéuticas que tienen un peso molecular de hasta 150 kD. En el caso de las soluciones de proteína derivadas de la sangre, la nanofiltración está limitada a proteínas tales como factores de coagulación II, VII, IX y X, proteína S, proteína C, albúmina, antitrombina III, plasminógeno, cofactor II de heparina, inhibidor alfa-1-proteinasa, inhibidor C1, transferrina, proteína unida a la vitamina D e inmunoglobulina G.
El pretratamiento y la siguiente nanofiltración de PCC funcionan preferentemente de la manera siguiente:
A.
la primera etapa consiste en la filtración de PCC a través de una membrana de 150 kD en un modo de flujo tangencial a una presión transmembrana inferior a 0,5 bares. Se recoge el filtrado que pasa a través del prefiltro. Durante la filtración, se añade continuamente el tampón al retentado. La cantidad del tampón añadido es igual a la cantidad del filtrado obtenido. Luego, en la última etapa de este proceso de filtración, se detiene la adición del tampón. Después de que se haya finalizado el proceso de la prefiltración, la cantidad del filtrado es preferentemente de 4 a 6 veces la cantidad del material de partida.
Durante esta prefiltración, se eliminan de la solución de PCC las proteínas de alto peso molecular en un rango de peso de molecular de 400 kD o más. Se ha descubierto que un prefiltro similar con membranas de 300 kD no es adecuado para la eliminación esencial de estos componentes de alto peso molecular.
B.
La segunda etapa consiste en la filtración de la PCC prefiltrada a través de un nanofiltro de 15 nm en un modo de filtración final ("dead end"). Durante este proceso, el filtrado de 15 nm, es decir, el flujo que pasó a través del prefiltro, se concentra directamente utilizando cartuchos de hemodiálisis para traer los factores de coagulación a su concentración deseada. El método de filtración final ("dead end") es preferente para impedir una dilución adicional del producto y para impedir que las características del producto cambien, por ejemplo, que el producto llegue a ser turbio.
Los filtros utilizados para la prefiltración están disponibles en Pall-Filtron (filtros de unión baja de proteínas Omega de 150 kD). El nanofiltro de 15 nm está disponible en Asahi Chemical Corp. Ltd (Tokio, Japón). Los cartuchos de hemodiálisis adecuados están disponibles en varios fabricantes, por ejemplo, en Fresenius (HF 80).
Se ha estudiado la eficacia del método para eliminar virus sin envoltura alterando la solución con una cantidad conocida de un virus modelo. Para este estudio, se han utilizado el Parvovirus Canino (utilizado como modelo para el Parvovirus B19 Humano) y el Virus de la Hepatitis A. Se han realizado estos estudios en una escala de 0,2% de la escala de producción. La nanofiltración de PCC es capaz de eliminar los virus pequeños sin envoltura en una dimensión de 5,0 a 6,0 en una escala logarítmica de 10.
La composición bioquímica de la PCC nanofiltrada solamente se altera, de modo ligero, cuando se compara con la PCC no filtrada. El nivel de los factores de coagulación y la concentración de los excipientes de la PCC nanofiltrada secada en frío es similar a los de la PCC no filtrada secada en frío. Los ensayos in vivo e in vitro demostraron que la nanofiltración no tuvo efectos adversos en la calidad y las características del producto.
La invención se describirá más detalladamente mediante los siguientes ejemplos.
Ejemplo 1
El presente ejemplo describe un experimento realizado con 1000 ml de Protrombina Compleja Concentrada derivada de la producción convencional. Se ha obtenido Protrombina Compleja Concentrada a partir de plasma sanguíneo humano y se ha sometido, previamente a la prefiltración, a una secuencia de etapas que implican la utilización de cromatografía de intercambio iónico, desactivación química del virus con 0,3% (peso/peso) de fosfato de tri-n-butilo (TNBP) y 1% (peso/peso) de Tween 80, cromatografía de intercambio iónico y concentración.
Características de Protrombina Compleja Concentrada
Contenido en proteína: 25 mg por ml; Composición química: 10 mmol/l de citrato de Na_{3}, 500 mmol/l de NaCl; pH 7,0.
Características del prefiltro
Fabricante: Filtron; Tipo A: 200 kD de membrana de pantalla de canales de polietileno (PEAS); Área superficial efectiva: 0,07 m^{2}.
Composición del tampón de filtración
10 mmol/l de citrato de Na_{3}, 500 mmol/l de NaCl, pH 7,0.
Se ha concentrado la Protrombina Compleja Concentrada de 1000 ml a 250 ml aproximadamente utilizando el prefiltro tipo A. A continuación, se ha dejado el volumen del retentado a un nivel constante de 250 ml mediante la adición continua del tampón de filtración. Después de la adición de 1000 ml aproximadamente de tampón de filtración, se detuvo dicha adición y se continuó la concentración. Al final del proceso se han obtenido 2000 ml aproximadamente de Protrombina Compleja Concentrada prefiltrada.
La recuperación del factor IX en el filtrado utilizando el prefiltro tipo A fue de 73% aproximadamente. El flujo promedio del filtrado para el prefiltro tipo A durante el proceso fue de 9 litros por hora por m^{2}. Se ha llevado a cabo esta etapa a una presión prácticamente no transmembrana.
Ejemplo 2
Este ejemplo describe un experimento realizado con 1000 ml de Protrombina Compleja Concentrada derivada de la producción convencional. Se ha obtenido Protrombina Compleja Concentrada a partir de plasma sanguíneo humano y se ha pasado, previamente a la prefiltración, a través de una serie de tratamientos que implican la utilización de cromatografía de intercambio iónico, desactivación química del virus con 0,3% (peso/peso) de fosfato de Tri-n-butilto (TNBP) y 1% (peso/peso) de Tween 80, cromatografía de intercambio iónico y concentración.
Características de la Protrombina Compleja Concentrada
Contenido en proteína: 25 mg por ml; Composición química: 10 mmol/l de citrato de Na_{3}, 500 mmol/l de NaCl; pH 7,0.
Características del prefiltro
Fabricante: Filtron; Tipo B: 300 kD de membrana de pantalla de canales de polietersulfona (PES); Área superficial efectiva: 0,07 m^{2}.
Composición del tampón de filtración
10 mmol/l de citrato de Na_{3}, 500 mmol/l de NaCl, pH 7,0.
Se ha concentrado la Protrombina Compleja Concentrada de 1000 ml a 250 ml aproximadamente utilizando el prefiltro tipo B mencionado anteriormente. A continuación, se ha dejado el volumen del retentado a un nivel constante de 250 ml mediante la adición continua del tampón de filtración. Después de la adición de 1000 ml aproximadamente de tampón de filtración, se detuvo dicha adición y se continuó la concentración. Al final del proceso, se han obtenido 2000 ml aproximadamente de Protrombina Compleja Concentrada prefiltrada. Se ha realizado esta etapa a una presión prácticamente no transmembrana.
La recuperación del factor IX en el filtrado utilizando el prefiltro tipo B fue de 66%. El flujo promedio del filtrado para el prefiltro tipo B durante el proceso fue de 26 litros por hora y por m^{2} de área.
Ejemplo 3
Este ejemplo describe un experimento realizado con Protrombina Compleja Concentrada prefiltrada derivada del Ejemplo 1.
Características del nanofiltro
Fabricante: Asahi Chemical, Tokio, Japón; Tipo: 15 nm;
Material: fibras huecas de celulosa regenerada con cupramonio;
Área superficial efectiva: 0,03 m^{2}, Tipo de filtración: final ("dead end");
Configuración: un filtro simple.
Se ha pasado un volumen total de 2000 ml de Protrombina Compleja Concentrada prefiltrada a través del nanofiltro en un modo de filtración final ("dead end") a una presión transmembrana constante de 0,5 bares (recomendaciones del fabricante). Durante el experimento, el flujo del filtrado disminuyó de 14 a 10 litros por hora por m^{2}. La recuperación del factor IX en el nanofiltro fue de 79% en comparación con la Protrombina Compleja Concentrada prefiltrada.
Ejemplo 4
Este ejemplo describe un experimento realizado con Protrombina Compleja Concentrada prefiltrada derivada del Ejemplo 2.
Características del nanofiltro
Fabricante: Asahi Chemical, Tokio, Japón; Tipo: 15 nm;
Material: fibras huecas de celulosa regenerada con cupramonio;
Área superficial efectiva: 0,03 m^{2}, Tipo de filtración: final ("dead end");
Configuración: un filtro simple.
De los 2000 ml disponibles de Protrombina Compleja Concentrada prefiltrada, se ha podido pasar solamente 1000 ml aproximadamente del producto por el nanofiltro en un modo de filtración final ("dead end") a una presión transmembrana constante de 0,5 bares (recomendaciones del fabricante). El flujo del filtrado disminuye durante el experimento de 14 a 4 litros por hora por m^{2}. Esto indica una obturación en el nanofiltro. La recuperación del factor IX en el nanofiltro fue solamente de 35% debida a la finalización prematura del procedimiento de la filtración.
Ejemplo 5
Se han realizado cuatro experimentos idénticos con 1000 ml de Protrombina Compleja Concentrada derivada de la producción convencional. Se ha obtenido Protrombina Compleja Concentrada a partir de plasma sanguíneo humano y se ha sometido, previamente a la prefiltración, a una serie de tratamientos que implican la utilización de cromatografía de intercambio iónico, desactivación química del virus con 0,3% (peso/peso) de fosfato de Tri-n-butilo (TNBP) y 1% (peso/peso) de Tween 80, cromatografía de intercambio iónico y finalmente concentración.
Características de la Protrombina Compleja Concentrada
Contenido en proteína: 25 mg por ml; Composición química: 10 mmol/l de citrato de Na_{3}, 150 mmol/l de NaCl; pH 7,0.
Características del prefiltro
Fabricante: Filtron; Tipo A: 200 kD de membrana de pantalla de canales de polietersulfona (PES); Área superficial efectiva: 0,07 m^{2}.
Composición del tampón de filtración
10 mmol/l de citrato de Na_{3}, 500 mmol/l de NaCl, pH 7,0.
Se ha concentrado la Protrombina Compleja Concentrada por etapas sobre el prefiltro tipo A. Las etapas utilizadas, expresadas como porcentaje del volumen de partida, fueron: de 100 a 50%, de 50 a 40%, de 40 a 30% y de 30 a 20%. Después de cada etapa de concentración, se ha mantenido el volumen constante mediante la adición del tampón de filtración (250 ml aproximadamente por etapa). Se ha aplicado la concentración solamente cuando el retentado se concentró a 20% aproximadamente del volumen de partida. Al final del proceso, se han obtenido 3000 ml aproximadamente de filtrado. Se ha realizado esta etapa de filtración a una presión prácticamente no transmembrana.
La recuperación promedia del factor IX en el filtrado utilizando el prefiltro tipo A fue de 94%. El flujo del filtrado durante el proceso disminuye de 20 a 7 litros por hora por m^{2}.
Ejemplo 6
Este ejemplo describe un experimento realizado con un combinado de cuatro Protrombinas Complejas Concentradas prefiltradas (12 litros aproximadamente) derivadas del Ejemplo 5.
Características del nanofiltro
Fabricante: Asahi Chemical, Tokio, Japón; Tipo: 15 nm;
Área superficial efectiva: 0,03 m^{2}; Tipo de filtración: final ("dead end");
Configuración: dos nanofiltros conectados en serie.
Durante la nanofiltración, el flujo del filtrado disminuye linealmente de 16 a 11 litros por m^{2} por hora. La recuperación del factor IX fue de 96%.
Ejemplo 7
Este ejemplo describe un experimento realizado con la Protrombina Compleja Concentrada nanofiltrada derivada del Ejemplo 6.
Características del cartucho de Hemodiálisis
Fabricante: Fresenius, Bad Homburg, Alemania; Tipo: Hemoflow HF 80; Área superficial efectiva: 1,8 m^{2}; Configuración: un cartucho simple de Hemodiálisis.
Tampón de la diálisis
Composición: 10 mmol/l de citrato de Na_{3}, pH 7,0.
Durante las etapas descritas en los Ejemplos 5 y 6, se ha diluido la PCC de cuatro a cinco veces aproximadamente. Se ha concentrado esta Protrombina Compleja Concentrada nanofiltrada diluida utilizando un cartucho de hemodiálisis de fibra hueca. Después de la concentración, se ha utilizado el mismo cartucho de hemodiálisis para disminuir la proporción iónica de la solución mediante diálisis frente al tampón de la diálisis hasta conseguir una proporción iónica de 16 mS por cm. La recuperación del factor IX en esta etapa fue de 92%.
Ejemplo 8
Se han realizado cuatro experimentos idénticos con 18 litros de Protrombina Compleja Concentrada derivada de una producción convencional. Se ha obtenido Protrombina Compleja Concentrada a partir de plasma sanguíneo humano y se ha tratado, previamente a la prefiltración, con una serie de etapas que implican la utilización de cromatografía de intercambio iónico, desactivación química del virus con 0,3% (peso/peso) de fosfato de tri-n-butilo (TNBP) y 1% (peso/peso) de Tween 80, cromatografía de intercambio iónico y finalmente concentración.
Características de la Protrombina Compleja Concentrada
Contenido en proteína: 25 mg por ml; Composición química: 10 mmol/l de citrato de Na_{3}, 500 mmol/l de NaCl; pH 7,0.
Características del prefiltro
Fabricante: Filtron; Tipo A: 200 kD de membrana de pantalla de canales de poliétersulfona (PES); Área superficial efectiva: 3,6 m^{2}; Modo de flujo: tangencial.
Características del nanofiltro
Fabricante: Asahi Chemical, Tokio, Japón; Tipo: 15 nm; Área superficial efectiva: 1 m^{2}, Modo de flujo: final ("dead end"); Configuración: dos sistemas en paralelo de dos filtros Planova de 1 m^{2} conectados en serie.
Características del cartucho de la Hemodiálisis
Fabricante: Fresenius, Bad Homburg, Alemania, Hemoflow HF 80; Área superficial efectiva: 1,8 m^{2}; Configuración: dos cartuchos de hemodiálisis montados en paralelo.
Composición del tampón de filtración
10 mmol/l de citrato de Na_{3}, 500 mmol/l de NaCl, pH 7,0.
Composición del tampón de la diálisis
10 mmol/l de citrato de Na_{3}, pH 7,0.
Se han filtrado 18 litros aproximadamente de Protrombina Compleja Concentrada sobre el prefiltro con una presión transmembrana de 0,3 bares. Previamente a la prefiltración, se ha recirculado el producto iniciando con una presión transmembrana de 0,7 bares. Cada cinco minutos, se ha disminuido la presión transmembrana de 0,1 bares hasta llegar a una presión transmembrana final de funcionamiento de 0,3 bares. En esta fase de recirculación, se ha formado una capa de gel en la membrana que impidió "la producción" de las proteínas de alto peso molecular. Esto resultó en 60 litros aproximadamente de nanofiltrado prefiltrado que se pasó posteriormente sobre dos sistemas paralelos de dos nanofiltros conectados en serie. Se ha concentrado el filtrado derivado de la nanofiltración en línea 4 a 6 veces con dos cartuchos de Hemodiálisis montados en paralelo. A continuación, se ha reducido la proporción iónica a 16 mS/cm mediante diálisis frente al tampón de diálisis utilizando los mismos cartuchos de hemodiálisis. La recuperación del factor IX para estos cuatro experimentos a gran escala fue de 72% aproximadamente en comparación con el material de partida.
Ejemplo 9
Se han realizado tres experimentos idénticos con 20 litros de Protrombina Compleja Concentrada derivada de una producción convencional. Se ha obtenido Protrombina Compleja Concentrada a partir de plasma sanguíneo humano y se ha tratado, previamente a la prefiltración, con una serie de etapas que implican la utilización de cromatografía de intercambio iónico, desactivación química del virus con 0,3% (peso/peso) de fosfato de tri-n-butilo (TNBP) y 1% (peso/peso) de Tween 80, cromatografía de intercambio iónico y finalmente la concentración.
Características de la Protrombina Compleja Concentrada
Contenido en proteína: 15-25 mg por ml; Composición química: 10 mmol/l de citrato de Na_{3}, 500 mmol/l de NaCl; pH 7,0.
Características del prefiltro
Fabricante: Filtron; Tipo C: membrana de pantalla de canales de polietersulfona (PES) 150 kD; Área superficial efectiva: 3,6 m^{2}; Modo de flujo: tangencial.
Características del nanofiltro
Fabricante: Asahi Chemical, Tokio, Japón; Tipo: 15 nm; Área superficial efectiva: 1 m^{2}, Modo de flujo: final ("dead end"); Configuración: un sistema de dos filtros Planova de 1 m^{2} conectados en serie.
Características del cartucho de Hemodiálisis
Fabricante: Fresenius, Bad Homburg, Alemania, Hemoflow HF 80; Área superficial efectiva: 1,8 m^{2}; Configuración: dos cartuchos de hemodiálisis montados en paralelo.
Composición del tampón de filtración
10 mmol/l de citrato de Na_{3}, 500 mmol/l de NaCl, pH 7,0.
Composición del tampón de diálisis
10 mmol/l de citrato de Na_{3}, pH 7,0.
Se han filtrado 20 litros aproximadamente de Protrombina Compleja Concentrada sobre el prefiltro tal como se ha descrito en el Ejemplo 8. Esto resultó en 60 litros aproximadamente de nanofiltrado prefiltrado que se pasó posteriormente sobre dos nanofiltros conectados en serie. Se ha concentrado el filtrado derivado de la nanofiltración en línea 4 a 6 veces mediante dos cartuchos de hemodiálisis montados en paralelo. A continuación, se ha reducido la proporción iónica a 16 mS/cm mediante diálisis frente al tampón de diálisis utilizando los mismos cartuchos de hemodiálisis. La recuperación del factor IX para estos tres experimentos a gran escala fue de 50-70% aproximadamente en comparación con el material de partida.
Ejemplo 10 Estudios de la eliminación del virus con Planova 15N
Se ha estudiado la capacidad de la nanofiltración en eliminar el virus alterando la Protrombina Compleja Concentrada prefiltrada con virus revelantes tales como el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (HIV) y el Virus de la Hepatitis A (HAV), y virus modelo tales como el Virus de la Diarrea Vírica Bovina (BVDV), Virus pseudo Rabia (PSR), Virus Encefalomiocarditis (EMC), y Parvovirus Canino (CPV). EMC, HAV y CPV son virus que pertenecen a la clase de virus sin envoltura. EMC, HAV y CPV tienen un diámetro de 20 a 25 nm. CPV está considerado ser un virus modelo del Parvovirus B19 Humano.
Se han realizado estos estudios de alteración en una escala de 100 ml (que es 0,2% aproximadamente de la escala industrial) de Protrombina Compleja Concentrada derivada del Ejemplo 1. Se ha pasado el material alterado con los virus mencionados anteriormente sobre dos filtros Planova 15N conectados en serie, cada uno de ellos con un área superficial de 0,003 m^{2}. Se ha determinado la cantidad del virus en el material prefiltrado y en la Protrombina Compleja Concentrada nanofiltrada. La eliminación del virus se expresa como un factor de reducción logarítmico (en log-métrico de 10).
Se presentan los resultados de los estudios en la tabla 1.
TABLA 1
1
Estos datos muestran que la nanofiltración es capaz de reducir la carga del virus de la Protrombina Compleja Concentrada prefiltrada con un factor de 10^{5} - 10^{7} para virus con un tamaño de 20 a 25 nm y más.

Claims (18)

1. Método para eliminar virus de una mezcla compleja que contiene proteína derivada de la sangre, cuya mezcla comprende:
i.
Proteínas del grupo que consiste en los factores de coagulación II, VII, IX, X, Proteína C, Proteína S, albúmina, antitrombina III, plasminógeno, cofactor II de heparina, inhibidor alfa-1-proteinasa, inhibidor C1, transferrina, proteína unida a la vitamina D e inmunoglobina G, y
ii.
Proteínas del grupo que consiste en fibrinógeno, fibronectina, inmunoglobina M, factores de coagulación VIII, XIII, factor von Willebrand y sus formas multiméricas, inhibidor inter-alfa-(tripsina), alfa-2-macroglobulina, proteínas de complemento C1q, proteína de complemento C4, apolipoproteína (a), apolipoproteína B-100 y ferritina;
comprendiendo dicho método
(a)
someter la mezcla del complejo a un pretratamiento que elimina proteínas del grupo (ii), comprendiendo dicho pretratamiento una filtración de membrana a través de una membrana que tiene un valor de corte entre 100 y 250 kD, y
(b)
someter la mezcla resultante a una nanofiltración que elimina los virus, llevándose a cabo dicha nanofiltración sobre un nanofiltro que tiene un valor de corte entre 10 y 30 nm.
2. Método, según la reivindicación 1, en el que la mezcla del complejo contiene proteínas del grupo (i) que tienen un peso molecular hasta 150 kD aproximadamente.
3. Método, según la reivindicación 1, en el que la mezcla del complejo contiene proteínas del grupo (ii) que tienen un peso molecular superior a 150 kD aproximadamente.
4. Método, según la reivindicación 1, en el que la mezcla del complejo contiene proteínas del grupo (ii) que tienen un peso molecular superior a 200 kD aproximadamente.
5. Método, según la reivindicación 1, en el que la mezcla del complejo contiene proteínas del grupo (ii) que tienen un peso molecular de 400 kD aproximadamente a 20000 kD aproximadamente.
6. Método, según la reivindicación 1, en el que dicha solución de proteína contiene proteínas de plasma sanguíneo que dependen de la vitamina K.
7. Método, según la reivindicación 1, en el que dicha solución de proteína es Protrombina Compleja Concentrada.
8. Método, según la reivindicación 1, en el que dicho pretratamiento comprende una filtración de membrana a través de una membrana que tiene un valor de corte de 150 kD aproximadamente.
9. Método, según la reivindicación 1, en el que dicho pretratamiento comprende una filtración de membrana que se lleva a cabo en un modo de filtración de flujo tangencial a una presión transmembrana de menos de 0,5 bares.
10. Método, según la reivindicación 9, en el que durante la filtración se añade un tampón al retentado y se detiene el proceso de filtración cuando la cantidad del filtrado es de 4 a 6 veces la cantidad del material de partida.
11. Método, según la reivindicación 1, en el que dicha nanofiltración se lleva a cabo en un nanofiltro que tiene un valor de corte de 15 nm aproximadamente.
12. Método, según la reivindicación 1, en el que dicha nanofiltración se lleva a cabo en un modo de filtración final ("dead end").
13. Método, según la reivindicación 1, en el que el nanofiltrado se concentra mediante diafiltración o ultrafiltración, preferentemente en un cartucho de hemodiálisis.
14. Método, según la reivindicación 1, en el que dichos virus son virus sin envoltura.
15. Método, según la reivindicación 1, en el que dichos virus son virus sin envoltura que tienen un diámetro de 20 nm o más.
16. Método, según la reivindicación 1, en el que dichos virus son virus sin envoltura seleccionados del grupo que consiste en Virus de la Hepatitis A, parvovirus tales como Parvovirus B19 Humano y Parvovirus Canino, y Virus Encefalomiocarditis.
17. Método, según la reivindicación 1, en el que se incluye, adicionalmente, una desactivación del virus, preferentemente previa a dicho pretratamiento, mediante el tratamiento de la solución de proteína con detergentes tales como detergentes iónicos y/o no iónicos en presencia de compuestos de fosfato de di- o trialquilo tales como fosfato de tri-n-butilo.
18. Método, según la reivindicación 1, en el que se liofiliza la solución de proteína obtenida.
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