ES2229807T3 - Cepas bacterianas recombinantes para la produccion de nucleosidos naturales y analogos modificados de los mismos. - Google Patents
Cepas bacterianas recombinantes para la produccion de nucleosidos naturales y analogos modificados de los mismos.Info
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Abstract
Células huésped E. coli transformadas que tienen actividades enzimáticas de uridina fosforilasa y purina nucleósido fosforilasa 120-1000 veces superiores a las correspondientes células sin transformar, conteniendo dichas células huésped E. coli transformadas un vector de expresión plasmídico recombinante que comprende: (a) al menos una secuencia génica de una bacteria mesófila que codifica un polipéptido que tiene actividad enzimática de uridina fosforilasa y al menos una secuencia génica de una bacteria mesófila que codifica un polipéptido que tiene actividad enzimática de purina nucleósido fosforilasa; y (b) al menos una secuencia génica que codifica una resistencia a tetraciclina, kanamicina y/o ampicilina.
Description
Cepas bacterianas recombinantes para la
producción de nucleósidos naturales y análogos modificados de los
mismos.
La presente invención se refiere a nuevas cepas
bacterianas modificadas genéticamente capaces de expresar
polipéptidos con la misma actividad enzimática que las enzimas UdP y
PNP; las cepas en cuestión se pueden usar para catalizar reacciones
de transglicosilación entre un nucleósido donante y una base
aceptadora.
Los nucleósidos naturales o los análogos
modificados de los mismos tienen aplicaciones importantes,
directamente y como productos intermedios, en el campo de los
medicamentos que tienen una acción antiviral y antitumoral, así como
en la preparación de oligonucleótidos para uso terapéutico y
diagnóstico.
Los nucleósidos pueden prepararse usando
procedimientos de síntesis química que normalmente requieren
procesos con un número elevado de etapas para la protección y
desprotección de grupos lábiles y el uso de reactivos y condiciones
de funcionamiento que, a escala industrial, pueden ser difíciles de
aplicar y económicamente desfavorables. Además, generalmente, esas
reacciones no tienen rendimientos globales elevados debido también a
la formación de mezclas de estereoisómeros y regioisómeros de los
que debe separarse el compuesto de interés.
Un enfoque alternativo a la preparación de
nucleósidos y análogos modificados de los mismos se basa en la
interconversión entre un nucleósido donante de azúcar y una base
aceptadora por medio de enzimas que catalizan las reacciones
reversibles generales (Hutchinson, Trends Biotechnol. 8,
348-353, 1990) que se ofrecen a continuación en el
esquema 1:
Esquema
1
| pirimidina-\beta-(desoxi)ribonucleósido + Pi | |
| Reacción 1 | \shortuparrow\shortdownarrow |
| base pirimidínica + \alpha-(desoxi)ribosa-1-fosfato | |
| base purina + \alpha-(desoxi)ribosa-1-fosfato | |
| Reacción 2 | \shortuparrow\shortdownarrow |
| purina-\beta-(desoxi)ribonucleósido + Pi |
en la que Pi = fosfato
inorgánico
La enzima uridina fosforilasa o UdP (E.C.
2.4.2.3.) cataliza la reacción 1 mientras que la enzima purina
nucleósido fosforilasa o PNP cataliza la reacción 2 (E.C.
2.4.2.1.).
Las enzimas UdP y PNP pueden usarse
individualmente para catalizar reacciones de transglicosilación
entre un nucleósido de purina donante y una base de purina
aceptadora, respectivamente. Además, cuando las dos enzimas se usan
combinadas, es posible transferir el azúcar de un nucleósido
pirimidínico donante a una base aceptadora de pirimidinas o purina,
así como de un nucleósido de purina donante a una base aceptadora de
purinas o pirimidinas, dependiendo de los materiales de partida
usados. En cada caso, las reacciones de fosforolisis implican un
cambio de configuración en la posición 1 del azúcar para dar un
\alpha-azúcar-1-fosfato
que constituye el sustrato intermedio de las reacciones de
transglicosilación y que posteriormente se transfiere a la base
aceptadora, con la restauración de la configuración \beta
original.
Esas reacciones enzimáticas se pueden llevar a
cabo de forma ventajosa a partir de una mezcla de un nucleósido
donante y una base aceptadora en presencia simultánea de las dos
enzimas y sin aislar el fosfato del azúcar intermediario o en dos
etapas que comprenden fosforolisis con formación de un fosfato de
azúcar intermedio, su aislamiento y la posterior condensación con la
base aceptadora.
Respecto a la síntesis química, una ventaja
importante de las reacciones de transglicosilación catalizadas por
las fosforilasas es el mantenimiento de la estereoselectividad y de
la regioselectividad, como resultado de lo cual el producto final
retiene la configuración \beta de los nucleósidos naturales.
Las enzimas UdP y PNP que participan
fisiológicamente en el catabolismo y las reacciones de
interconversión de los nucleósidos son el producto de los genes
udp y deoD, respectivamente, muy frecuentes en la
naturaleza, y se han identificado y estudiado en microorganismos
procarióticos y eucarióticos (Parkas y Agarwal, Enzymes 7, 3ª ed.,
483-514, Academic Press, Nueva York;
Munch-Petersen, Metabolism of nucleotides,
nucleosides and nucleobases in microrganisms, Academic press,
Londres, 1982).
Desde el punto de vista del uso como
catalizadores para la síntesis de nucleósidos y análogos modificados
de los mismos, en general, de prefieren las enzimas de los
microorganismos procarióticos porque tienen una especificidad de
sustrato menor y pueden catalizar las reacciones de
transglicosilación también a partir de nucleósidos donantes que
contienen azúcares modificados y de bases aceptadoras que comprenden
estructuras púricas o pirimidínicas y varios sistemas heterocíclicos
que contienen nitrógeno (Stoeckler y col., Biocehmistry 19,
102-107, 1980; Browska y col., Z.
Naturforsch, 45, 59-70, 1990).
Las reacciones de transglicosilación se pueden
llevar a cabo usando preparaciones enzimáticas purificadas o
parcialmente purificadas (Krenitsky y col., Biochemistry 20,
3615-3621, 1981; EP-002192) o, como
alternativa, usando células bacterianas enteras de microorganismos
seleccionados porque contienen las enzimas necesarias (Utagawa y
col., Agric. Biol. Chem. 49, 3239-3246, 1985;
Zimtchenko y col., Nucleic Acids Research Symposium Series
18, 137-160, 1987) o células enteras cultivadas en
presencia de inductores de la producción de esas enzimas (Doskocil
y col., Collect. Czech. Chem. Commun. 42,
370-383, 1977).
Para las reacciones de biocatálisis llevadas a
cabo a escala preparativa, el uso de células enteras obvia la
necesidad de extraer y purificar las enzimas y permite la fácil
recuperación de las células al final de la reacción, por ejemplo
mediante centrifugación o ultrafiltración, y u reutilización para
otros, posteriores, ciclos de reacción; como alternativa, es posible
usar las enzimas UdP y PNP extraídas de las células en forma de una
fracción celular soluble bruta o purificada. Tanto la UdP como la
PNP son enzimas que se caracterizan por una buena estabilidad
térmica, lo que permite que las reacciones de transglicosilación se
lleven a cabo a temperaturas de hasta aproximadamente 60ºC sin que
se produzcan pérdidas significativas de actividad, y permite la
reutilización de las preparaciones de enzimas recuperadas. También
se han descrito enfoques en los que el reciclaje de las células
usadas como catalizadores se llevó a cabo mediante
microencapsulación en geles hidrófilos (Votruba y col.,
Collect. Czech. Chem. Commun. 59, 2303-2330, 1994) y
geles hidrófobos (Yokozeki y col., Eur. J. Appl. Microbiol.
Biotechnol., 14, 225-231, 1982).
Las principales limitaciones de los
procedimientos conocidos hasta ahora para la preparación de
nucleósidos naturales y de análogos modificados de los mismos
mediante reacciones de transglicosilación usando células bacterianas
residen en la obtención de una concentración enzimática baja,
incluso tras inducción, y en la imposibilidad de usar cantidades
optimizadas de las dos actividades enzimáticas requeridas para
catalizar la transferencia del azúcar de un nucleósido donante a una
base aceptadora.
Tanto en el caso de la selección de cepas
bacterianas de tipo salvaje como en el caso del cultivo de cepas en
condiciones de inducción, se obtienen células que contienen niveles
de UdP y PNP que, en general, no son superiores a 10 veces los
niveles basales (F. Ling y col., Process Biochem. 29,
355-361, 1994) y que están en proporciones que no se
pueden predeterminar. Además, dado que una de las dos enzimas
(generalmente PNP) está presente en las células inducidas en bajas
cantidades, normalmente es necesario usar un exceso de células para
garantizar la presencia de la enzima limitante a niveles compatibles
con la cinética global aceptable de la reacción de interconversión.
Desde un punto de vista de funcionamiento, esto significa que una
porción significativa de la mezcla de reacción está constituida por
la suspensión celular, con la consiguiente restricción del volumen
que se pueda usar para solubilizar los sustratos y, por último, con
un rendimiento volumétrico menor del producto final.
Por tanto, la presente invención se refiere a la
construcción de cepas bacterianas genéticamente modificadas capaces
de resolver los problemas descritos anteriormente y, en particular,
de las reacciones de transglicosilación entre un nucleósido donante
y una base aceptadora con rendimientos elevados que son predecibles
y, por encima de todo, reproducibles a escala industrial y con
cinéticas enzimáticas particularmente rápidas.
En la bibliografía se ha descrito la clonación y
la expresión de algunas fosforilasas recombinantes, tales como, por
ejemplo, UdP humana (Watanabe y Uchida, Biochem. Biophys. Res.
Commun. 216, 265-272, 1996), UdP murina (Watanabe
y col. J. Biol. Chem. 270, 12191-12196,
1995), de Escherichia coli (Mikhailov y col., Biochem.
Internat. 26, 607-615, 1992) y ONO humana (ERion y
co., Biochemistry 36, 11725-11734, 1997) del
microorganismo termófilo Bacillus stearothermophilus
(Hamamoto y col., Biosci. Biotech. Biochem 61,
272-275, 1997; Hamamoto y col., Biosci.
Biotech. Biochem. 61, 276-280, 1997) además de UdP y
PNP de Klebsiella sp (Takehara y col., Biosci.
Biotech. Biochem. 59, 1987-1990,1995). En
particular, la solicitud de patente japonesa
JP-06-253854 describe la expresión
en E. coli de plásmidos bacterianos que contienen las
secuencias génicas de las enzimas purina y/o pirimidina nucleósido
fosforilasa derivadas únicamente de bacterias termófilas, es decir,
bacterias que tienen un crecimiento óptimo a temperaturas de entre
50ºC y 60ºC, tales como, por ejemplo, Bacillus
stearothermophilus.
En la actualidad, se han encontrado nuevas cepas
bacterianas modificadas genéticamente que contienen los genes que
codifican los polipéptidos con la actividad enzimática de las
enzimas uridina fosforilasa (UdP) y/o purina nucleósido fosforilasa
(PNP) y constituyen una parte de la materia objeto de la presente
invención. El cultivo de estas nuevas cepas permite niveles elevados
de biomasa y niveles elevados de expresión de las enzimas
recombinantes que se van a obtener; las nuevas cepas descritas en el
presente documento también pueden usarse bien directamente bien
después de la extracción de la fracción celular soluble como
catalizadores de la producción de nucleósidos naturales y análogos
modificados de los mismos con mejoras sustanciales en el
procedimiento en comparación con la técnica anterior.
En contraste con lo que se ha descrito en el
documento JP-06-253854, los vectores
plasmídicos según la presente invención se pueden obtener mediante
clonación por separado y simultáneamente de los genes udp y
deoD de bacterias mesófilas, es decir, bacterias que tienen
un crecimiento óptimo a temperaturas de 30ºC a 37ºC, tales como, por
ejemplo, E. coli. Para mayor exactitud, las secuencias
génicas preferentemente usadas para los propósitos de la presente
invención son las secuencias de E. coli que codifican los
genes udp y deoD y que están depositadas en el banco
de datos del EMBL con los números de registro X15689 (udp) y
M60917 (deoD); sin embargo, también es posible usar otras
secuencias ampliamente disponibles, tales como, por ejemplo,
ACCG01747 (udp) y ACGC00327 (deoD).
Por tanto, los vectores plasmídicos de expresión
que pueden usarse para los propósitos de la invención se
caracterizan porque comprenden:
al menos una secuencia génica de
una bacteria mesófila que codifica un polipéptido que tiene las
actividades enzimáticas de UdP y de PNP;
y
al menos una secuencia génica que
codifica una resistencia
antibiótica.
La al menos una secuencia que codifica una
resistencia a antibióticos es una secuencia que codifica resistencia
a tetraciclina, kanamicina y/o a ampicilina. Los vectores
plasmídicos de la presente invención se pueden obtener mediante
clonación de la secuencia que codifica el gen udp y la
secuencia que codifica el deoD u, opcionalmente, la secuencia que
codifica resistencia a tetraciclina y/o a kanamicina en el plásmido
pUC18 (Yanish y Perron, Gene 33, 103-119, 1985;
número de acceso en el EMBL L08752), que ya contiene el gen de
resistencia a ampicilina.
Sin embargo, la posición relativa de las
secuencias que codifican udp y deoD no es relevante
para los propósitos de la invención, es decir, la secuencia que
codifica udp puede estar en posición 3' o 5' de la secuencia
que codifica deoD. Además, y como se apreciará a partir de
los siguientes ejemplos, las secuencias génicas que codifican
udp y deoP también se pueden condensar para expresar
nuevas proteínas de fusión de fórmula UdP-(L)-PNP,
en la que L es un polipéptido de unión de más de una unidad
aminoacídica. En estas nuevas proteínas de fusión, sin embargo, la
posición relativa de los dos componentes no es relevante para los
propósitos de la invención, es decir, el componente PNP puede estar
en el extremo NH_{2} o en el extremo COOH de las proteínas
fusionadas. Las nuevas proteínas que se pueden obtener de este modo,
que además son objeto de la presente invención, se caracterizan por
tener una actividad bifuncional ya que son capaces de realizar la
actividad de la enzima UdP y la de la enzima PNP.
Otro objeto de la presente invención se
representa entonces mediante el procedimiento para producir las
proteínas de fusión mencionadas anteriormente, comprendiendo dicho
procedimiento:
producir un vector de expresión
plasmídico como se ha indicado
antes;
transformar una célula bacteriana
huésped con dicho vector de expresión;
y
aislar y purificar la proteína de
fusión de la célula bacteriana
transformada.
Los procedimientos para transformar una célula
bacteriana huésped con un vector de expresión y para aislar y
purificar el péptido expresado son muy conocidos para cualquier
experto en esta técnica y, por ejemplo, se describen en Swartz JR,
Escherichia coli recombinant DNA technology y en Neidahrt FC
y col. (eds), Escherichia coli and Salmonella
typhimurium: Cellular and molecular biology; 2ª edición, págs.
1693-1711, ASM, Washington, incorporadas en el
presente documento como referencia.
Los huéspedes preferentemente usados para la
expresión de las enzimas recombinantes según la presente invención
son células bacterianas de Escherichia coli; las cepas K12
(preferentemente DH5\alpha o MG1655) son de interés particular.
Sin embargo, como alternativa, es posible usar células de otros
microorganismos procarióticos que son aceptables para uso industrial
porque no son peligrosos para sus manipuladores y para el ambiente y
pueden cultivarse con facilidad para obtener niveles elevados de
biomasa.
Como también se verá a partir de los ejemplos, la
presencia de un promotor bacteriano, y en particular el promotor
lac, no es un elemento esencial para los propósitos de la
presente invención porque se ha encontrado que el crecimiento
celular y la expresión de los polipéptidos no dependen de la
presencia de un inductor (IPTG). Para facilitar el funcionamiento,
la secuencia génica que codifica un polipéptido que tiene una
actividad enzimática de UdP y/o una actividad enzimática de PNP se
clona en el plásmido pUC18 en el marco de lectura relacionado con el
promotor lac.
Finalmente, la secuencia que codifica la
resistencia a tetraciclina es preferentemente el gen Tet de pBR322;
la secuencia que codifica la resistencia a kanamicina es el gen kan
de pET29c.
Por tanto, de acuerdo con los procedimientos muy
conocidos que se harán evidentes a partir de los Ejemplos, se
construyeron los siguientes plásmidos, que se representan en las
figuras 1, 3 y 4:
\bullet pGM679: gen udp clonado en el
plásmido pUC18 (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº 1). En la numeración
de la secuencia, el coordinado 1 de pGM679 coincide con el de la
secuencia del vector pUC18; desde el nucleótido 1 al 242: secuencia
pUC18; desde el 243 al 1021: secuencia del gen udp de E.
coli; del 1022 al 3444: secuencia de pUC18.
\bullet pGM708: gen udp clonado en el
plásmido pUC18 junto con el gen de resistencia a tetraciclina
(IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº 2). En la numeración de la secuencia,
el coordinado 1 de pGM708 coincide con el de la secuencia del vector
pUC18; desde el nucleótido 1 al 242: secuencia de pUC18; desde el
243 al 1021: secuencia del gen udp de E. coli; desde
el 1022 al 1039: secuencia de pUC18; desde el 1040 al 1482:
secuencia pHP45\Omega; desde el 1483 al 2883: secuencia del gen
Tet de pBR322; desde el 2884 al 3151: secuencia de pHP45\Omega;
desde el 3152 al 5556: secuencia de pUC18.
\bullet pGM678: gen deoD clonado en el
plásmido pUC18 (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº 3). En la numeración
de la secuencia, el coordinado 1 de pGM678 coincide con el de la
secuencia del vector pUC18; desde el nucleótido 1 al 230: secuencia
de pUC18; desde el 231 al 960: secuencia del gen deoD de
E. coli; desde el 961 al 3383: secuencia de pUC18.
\bullet pGM707: gen deoD clonado en el
plásmido pUC18 junto con el gen de resistencia a tetraciclina
(IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº 4). En la numeración de la secuencia,
el coordinado 1 de pGM707 coincide con el de la secuencia del vector
pUC18; desde el nucleótido 1 al 230: secuencia de pUC18; desde el
231 al 960: secuencia del gen deoD de E. coli; desde
el 961 al 978: secuencia de pUC18; desde el 979 al 1422: secuencia
pHP45\Omega; desde el 1423 al 2822: secuencia del gen Tet de
pBR322; desde el 2823 al 3090: secuencia de pHP45\Omega; desde el
3091 al 5495: secuencia de pUC18.
\bullet pGM712: genes udp y deoD
clonados en el plásmido pUC18 (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº5). En
la numeración de la secuencia, el coordinado 1 de pGM712 coincide
con el de la secuencia del vector pUC18; desde el nucleótido 1 al
242: secuencia de pUC18; desde el 243 al 1021: secuencia del gen
udp de E. coli; desde el 1022 al 1025: secuencia de
pUC18; desde el 1026 al 1036: secuencia pBAD24; desde el 1037 al
1766: secuencia del gen deoD de E. coli; desde el 1767
al 1792: secuencia de pBAD24; desde el 1793 al 4189: secuencia de
pUC18.
\bullet pGM716: genes udp y deoD
clonados en el plásmido pUC18 junto con el gen de resistencia a
tetraciclina (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº6). En la numeración de
la secuencia, el coordinado 1 de pGM716 coincide con el de la
secuencia del vector pUC18; desde el nucleótido 1 al 242: secuencia
de pUC18; desde el 243 al 1021: secuencia del gen udp de
E. coli; desde el 1022 al 1025: secuencia de pUC18; desde el
1026 al 1036: secuencia pBAD24; desde el 1037 al 1766: secuencia del
gen deoD de E. coli; desde el 1767 al 1792: secuencia
de pBAD24; desde el 1793 al 1794: secuencia de pUC18; desde 1795 al
2228: secuencia de pH45\Omega; desde el 229 al 3628: secuencia del
gen Tet de pBR322; desde el 3629 al 3896: secuencia de pH45\Omega;
desde el 3897 al 6301: secuencia de pUC18.
\bullet pGM709: gen deoD clonado en
pBAD24(IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº7). En la numeración de
la secuencia, el coordinado 1 de pGM709 coincide con el de la
secuencia del vector Pbad24; desde el nucleótido 1 al 1311:
secuencia de pbad24; desde el 1312 al 2042: secuencia
correspondiente a la de 230-960 de pGN678; desde el
2043 al 5241: secuencia de pBAD24.
\bullet pGM769: pGN716 con deleción del
fragmento HpaI (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº8). En la numeración de
la secuencia, el coordinado 1 de pGM769 coincide con el de la
secuencia de pGN716; desde el nucleótido 1 al 914: secuencia de
pGM716; desde el nucleótido 915 al 5822: secuencia correspondiente a
la del 1394-6301 de pGM716.
\bullet pGM771: genes udp y deoD
clonados en pUC18 para crear una fusión entre las dos proteínas; el
plásmido también porta el gen de resistencia a tetraciclina
(IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº9). En la numeración de la secuencia,
el coordinado 1 de pGM771 coincide con el de la secuencia de pGM716;
desde el nucleótido 1 al 1011: secuencia de pGM716; desde el 1012 al
6269: secuencia correspondiente a la de 1044-6301 de
pGM716.
\bullet pGM795: genes udp y deoD
clonados en pUC18 para crear una fusión entre las dos proteínas
unidas entre sí a través de un ligador aminoacídico; el plásmido
también porta el gen de resistencia a tetraciclina (IDENTIFICADOR DE
SECUENCIA Nº10). En la numeración de la secuencia, el coordinado 1
de pGM795 coincide con el de la secuencia de pGM716; desde el
nucleótido 1 al 1011: secuencia de pGM771; desde el 1012 al 1041:
secuencia del ligador; desde el 1042 al 6299: secuencia
correspondiente a la de 1044-6301 de pGM716.
\bullet pGM746: vector de clonación de pUC18
(IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº11). En la numeración de la secuencia,
el coordinado 1 de pGM746 coincide con el de la secuencia del vector
pUC18; desde el nucleótido 1 al 54: secuencia de pUC18; desde el 55
al 109: secuencia del poliligador de pUC18; desde el 110 al 2297:
secuencia de pUC18.
\bullet pGM747: gen deoD clonado en
pGM746 sin un promotor en 5' (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº12. En la
numeración de la secuencia, el coordinado 1 de pGM747 coincide con
el de pGM746; desde el nucleótido 1 al 79: secuencia de pGM746;
desde el 80 al 837: secuencia correspondiente a la de
1301-2058 de pGM709; desde el 838 al 3031: secuencia
de pGM746.
\bullet pGM751: gen deoD clonado en 3'
del promotor plac (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº13). En la
numeración de la secuencia, el coordinado 1 de pGM751 coincide con
el de pGM747; desde el nucleótido 1 al 72: secuencia de pGM747;
desde el 73 al 171: secuencia plac de pGZ119; desde el 172 al
3128: secuencia de pGM747.
\bullet pGM800: genes udp y deoD
clonados en 3' del promotor plac en un vector derivado de
pUC18 (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA Nº14). En la numeración de la
secuencia, el coordinado 1 de pGM800 coincide con el de pGM751;
desde el nucleótido 1 al 923: secuencia de pGM751; desde el 924 al
1741: secuencia udp correspondiente a la de
203-1020 de pGM679; desde el 1742 al 3934: secuencia
de pGM751.
\bullet pGM807: genes udp y deoD
clonados en 3' del promotor plac en un vector que contiene el
gen de la resistencia a tetraciclina (IDENTIFICADOR DE SECUENCIA
Nº15). En la numeración de la secuencia, el coordinado 1 de pGM807
coincide con el de pGM800; desde el nucleótido 1 al 1742: secuencia
de pGM800; desde el 1743 al 3855: secuencia Tc de pHP45\alpha;
desde el 3856 al 6046: secuencia de pGM800.
Las cepas recombinantes obtenidas de este modo
expresan polipéptidos que tienen las actividades enzimáticas de UdP
y PNP en grandes cantidades, minimizando cualquier compatibilidad
y/o problemas de solubilidad que puedan producirse a causa de la
presencia de proteínas heterólogas.
En particular, se construyeron las cepas
bacterianas denominadas DH5\alpha/pGM678, MG1655/pGM678,
DH5\alpha/
pGM707 y MG1655/pGM707, que sobreexpresan la enzima PNP; las cepas DH5\alpha/pGM679, MG1655/pGM679, DH5\alpha/pGM708 y MG1655/pGM708 que sobreexpresan la enzima UdP; las cepas DH5\alpha/pGM712, DH5\alpha/pGM716, MG1655/pGM716, DH5\alpha/pGM800 y DH5\alpha/pGM807 que sobreexpresa las enzimas PNP y UdP simultáneamente en la misma células; y las cepas DH5\alpha/pGM771, MG1655/pGM771, DH5\alpha/pGM795, MG1655/pGM795, que sobreexpresan las proteínas de fusión bifuncionales UdP-(L)-PNP. La eficacia de estas nuevas cepas, como productores de las enzimas PNP y UdP y como biocatalizadores para la preparación de nucleósidos mediante reacciones de bioconversión, se comparó con una preparación de células de Enterobacter aerogenes cultivadas en presencia de inductores porque, hasta la fecha, ese microorganismo, según los datos disponibles en la bibliografía, se ha considerado como uno de los mejores para catalizar las reacciones de transglicosilación (Utagawa y col., Agric. Biol. Chem. 49, 1053-1058, 1985; Utagawa y col., Agric. Biol. Chem. 49; 2711-2717, 1985). La presente invención también se refiere al uso de las nuevas cepas recombinantes en la producción de polipéptidos que tienen la actividad de la enzima UdP y la actividad de la enzima PNP y/o como catalizadores de las reacciones de transglicosilación entre un nucleósido donante y una base aceptadora.
pGM707 y MG1655/pGM707, que sobreexpresan la enzima PNP; las cepas DH5\alpha/pGM679, MG1655/pGM679, DH5\alpha/pGM708 y MG1655/pGM708 que sobreexpresan la enzima UdP; las cepas DH5\alpha/pGM712, DH5\alpha/pGM716, MG1655/pGM716, DH5\alpha/pGM800 y DH5\alpha/pGM807 que sobreexpresa las enzimas PNP y UdP simultáneamente en la misma células; y las cepas DH5\alpha/pGM771, MG1655/pGM771, DH5\alpha/pGM795, MG1655/pGM795, que sobreexpresan las proteínas de fusión bifuncionales UdP-(L)-PNP. La eficacia de estas nuevas cepas, como productores de las enzimas PNP y UdP y como biocatalizadores para la preparación de nucleósidos mediante reacciones de bioconversión, se comparó con una preparación de células de Enterobacter aerogenes cultivadas en presencia de inductores porque, hasta la fecha, ese microorganismo, según los datos disponibles en la bibliografía, se ha considerado como uno de los mejores para catalizar las reacciones de transglicosilación (Utagawa y col., Agric. Biol. Chem. 49, 1053-1058, 1985; Utagawa y col., Agric. Biol. Chem. 49; 2711-2717, 1985). La presente invención también se refiere al uso de las nuevas cepas recombinantes en la producción de polipéptidos que tienen la actividad de la enzima UdP y la actividad de la enzima PNP y/o como catalizadores de las reacciones de transglicosilación entre un nucleósido donante y una base aceptadora.
La actividad enzimática de las cepas
recombinantes se determinó mediante la incubación directa de la
suspención celular, o de los extractos celulares obtenidos mediante
lisis mecánica y/o enzimática, en tampón fosfato con un nucleósido
pirimidínico (por ejemplo, uridina) para detectar la actividad UdP o
con un nucleósido de purina (por ejemplo, inosina) para detectar la
actividad PNP y mediante la determinación de la formación de la base
pirimidínica (uracilo) o la base de purina (hipoxantina),
respectivamente, a través de cromatografía líquida de presión
elevada de fase inversa (RP-HPLC), como se indica en
el Ejemplo 7.
Mediante la aplicación de esta prueba, las
actividades enzimáticas de Udp y PNP se midieron en las cepas
bacterianas recombinantes a las que se refiere la presente invención
y en la cepa de comparación de E. aerogenes, para dar los
resultados que se indican en las Tablas 1 y 2, que muestran que las
cepas recombinantes de la presente invención tienen actividades
enzimáticas de hasta aproximadamente 10-30 veces
superiores a las de la cepa de comparación cultivada en condiciones
de inducción y hasta aproximadamente 120-1000 veces
mayores que las de la cepa huésped de E. coli no
transformada.
\vskip1.000000\baselineskip
El nivel de actividad enzimática
sorprendentemente elevado de estas nuevas cepas recombinantes se
confirma mediante una comparación indirecta con las cepas descritas
en el documento JP-06-253854: las
cepas consideradas en la presente invención permiten actividades
enzimáticas desde 340 a 1040 veces (en cuanto a la actividad de UdP)
y de 120 a 200 veces (en cuanto a la actividad de PNP) mayores que
las actividades enzimáticas de las cepas salvajes no transformadas;
por otro lado, las cepas descritas en el documento
JP-06-253854 tienen una actividad
enzimática en E. coli 150 y 91 veces superior,
respectivamente, a la de la correspondiente cepa salvaje. También se
debe mencionar que la actividad enzimática de las cepas de la
presente invención se determinó a 30ºC, mientras que la de las cepas
del documento JP-06-253854 se
estableció en funcionamiento a 70ºC o a una temperatura que permita
una cinética marcadamente más elevada.
Este nivel elevado de actividad enzimática
también se confirma por la sobreexpresión de las enzimas UdP y PNP,
que se puede demostrar mediante análisis electroforético (figura 5)
y mediante determinación cuantitativa por análisis
RP-HPLC, que demostró niveles de expresión
específica de 55 a 120 miligramos de UdP/gramo de pasta celular
húmeda y/o de 15 a 65 miligramos de PNP/gramo de pasta celular
húmeda, como se indica en el ejemplo de la tabla 3.
Las células enteras de las cepas recombinantes
descritas en el presente documento, o sus extractos purificados o
brutos, pueden usarse de forma ventajosa como biocatalizadores para
la preparación de nucleósidos naturales y análogos modificados de
los mismos a partir de un nucleósido donante de azúcar y de una base
aceptadora por medio de reacciones de bioconversión que requieren la
presencia de sólo un tipo de fosforilasa (UdP o PNP) o la presencia
simultánea de UdP y PNP según los siguientes esquemas generales:
- a)
- nucleósido de pirimidina P1 + base de pirimidina P2 \rightarrow nucleósido de pirimidina P2 + base de pirimidina P1, en presencia de células recombinantes que sobreexpresan UdP;
- b)
- nucleósido de purina P1 + base de purina P2 \rightarrow nucleósido de purina P2 + base de purina P1, en presencia de células recombinantes que sobreexpresan PNP;
- c)
- nucleósido de pirimidina + base de purina \rightarrow nucleósido de purina + base de pirimidina, en presencia de una mezcla de células recombinantes que sobreexpresan UdP y PNP por separado o de células de una única cepa recombinante que coexpresa UdP y PNP;
- d)
- nucleósido de purina + base de pirimidina \rightarrow nucleósido de pirimidina + base de pirimidina, en presencia de una mezcla de células recombinantes que sobreexpresan UdP y PNP por separado o de células de una única cepa recombinante que coexpresa UdP y PNP.
Según la información proporcionada en la
bibliografía, en las reacciones de bioconversión catalizadas por UdP
y PNP, se tienen en cuenta como nucleósidos donantes tanto los
nucleósidos naturales como los modificados que contienen
D-ribosa y 2'-desoxirribosa, y los
nucleósidos que contienen el grupo ribosa modificado en las
posiciones 2', 3' y/o 5' y, en particular, los nucleósidos en los
que el azúcar está constituido por
\beta-D-arabinosa,
\alpha-L-xilosa,
3'-desoxirribosa,
3',5'-didesoxirribosa,
2',3'-didesoxirribosa,
5'-desoxirribosa,
2',5'-didesoxirribosa,
2'-amino-2'-desoxirribosa,
3'-amino-3'-desoxirribosa,
2'-fluoro-2'-desoxirribosa.
Las bases aceptadoras que se pueden usar en las reacciones de
bioconversión catalizadas por UdP y PNP son bases de pirimidina y de
purina naturales o sustituidas, en particular, bases de purina
sustituidas en las posiciones 1, 2 y/o 6, bases de pirimidina
sustituidas en las posiciones 3 y/o 5 y también otros sistemas
heterocíclicos que contienen uno o más átomos de nitrógeno, tales
como, por ejemplo, purina, 2-azapurina,
8-azapurina y análogos sustituidos de los mismos,
1-desazapurina (imidazopiridina),
3-desazapurina, 7-desazapurina y
análogos sustituidos de los mismos, triazol y análogos sustituidos
de los mismos, pirazol y análogos sustituidos del mismo, compuestos
de imidazol y análogos sustituidos de los mismos.
Otro procedimiento para preparar nucleósidos
naturales y modificados para usar células recombinantes o los
correspondientes extractos celulares brutos o purificados para
catalizar la reacción de fosforilación de un nucleósido donante
(usando UdP o PNP, dependiendo de la base presente en el nucleósido
donante) y obtener
\alpha-azúcar-1-fosfato
que puede, opcionalmente, aislarse mediante técnicas de
cromatografía, extracción o precipitación y usarse en la siguiente
reacción de transferencia del azúcar a una base aceptadora adecuada
en presencia de UdP o PNP (en función de la naturaleza de la base
aceptadora).
La disponibilidad de las cepas bacterianas
recombinantes que sobreexpresan las enzimas UdP y PNP por separada,
también permite las condiciones de las reacciones de
transglicosilación para fijarse, en términos de actividad óptima de
cada una de las dos enzimas, por medio de pruebas preliminares en
las que la reacción se lleva a cabo en presencia de mezclas que
contienen proporciones variables de células de cada una de las dos
cepas. Por tanto, para cada reacción de transglicosilación es
posible definir, en una escala analítica, las proporciones óptimas
de las actividades enzimáticas UdP y PNP, mientras que en una
posterior escala creciente preparativa, es posible usar una mezcla
de células de las dos cepas que expresan UdP y PNP de forma
individual, o sólo la cepa que coexpresa UdP y PNP si sus
proporciones ya son óptimas, u opcionalmente la cepa que coexpresa
Udp y PNP, integrados con células de cepas que expresan Udp o
PNP.
Como ejemplo de optimización de las reacciones de
bioconversión en la presente invención, se proporciona una
descripción detallada de los procedimientos en relación con la
preparación de
9-\beta-D-arabinofuranosiladenina
(Ara-A) y
1-\beta-D-ribofuranosil-1,2,4-triazol-3-carboxiamida
(ribavirina),en la que indicó que los mejores resultados se
obtuvieron con unas proporciones entre las actividades UdP/PNP de
2:1 y 1:1, respectivamente y con una concentración de 10 unidades/ml
de UdP y 5 unidades/ml de PNP para Ara-A y 10
unidades/ml de UdP o de PNP para ribavirina. Estas proporciones de
la actividad enzimática, u otras que se encuentre que son óptimas
para la reacción a la que se hace referencia, se pueden aplicar con
facilidad usando las cepas recombinantes descritas en la presente
invención para optimizar la concentración de células que se van a
usar como biocatalizadores, mientras al mismo tiempo se obtiene el
máximo rendimiento de bioconversión compatible con las constantes de
equilibrio de las reacciones enzimáticas y una reducción en los
tiempos de reacción. De forma análoga, es posible optimizar todas
las reacciones de transglicosilación para la preparación de
nucleósidos y análogos modificados de los mismos.
Cuando las nuevas cepas de recombinación que
expresan las proteínas de fusión UdP-(L)-PNP (o los
correspondientes extractos brutos o purificados) se usan para las
reacciones de bioconversión, existe la ventaja de usar polipéptidos
bifuncionales en los que los componentes que tienen la actividad de
las enzimas UdP y PNP están presentes en la proporción
estequiométrica 1:1. Además, dado que la producción de nucleósidos a
través de la bioconversión se lleva a cabo mediante dos reacciones
sucesivas catalizadas respectivamente por UdP y PNP, el uso de
biocatalizadores basados en las proteínas de fusión bifuncionales
UdP-(L)-PNP según la presente invención puede
mejorar la cinética global de las reacciones gracias a una
transferencia más eficaz de los productos intermedio de un sitio de
reacción a otro.
Las nuevas cepas recombinantes descritas en la
presente invención permiten la preparación de nucleósidos naturales
y nucleósidos modificados con resultados significativamente mejores
que los obtenidos mediante las técnicas enzimáticas conocidas hasta
ahora basadas en el uso de enzimas aisladas o en el uso de células
bacterianas de cepas de microorganismos tipo salvaje y cepas de
microorganismos cultivados en condiciones para inducir las
actividades de las enzimas fosforilasas.
Una comparación de varias reacciones de
transglicosilación que se llevaron a cabo usando proporciones
constantes entre la concentración del nucleósido donante (60 mM) y
la base aceptadora (20 mM) y en las que se calculó un parámetro de
productividad (Simon y col., Angew. Chem. 24,
539-553, 1985) que, además de la actividad
específica, también considera factores de funcionamiento tales como,
por ejemplo, fenómenos de transporte intra y extracelular y la
concentración volumétrica de los productos finales, indica que el
uso de las cepas recombinantes o de los correspondientes extractos
brutos o purificados a los que se refiere la presente invención,
siempre se caracteriza por una mayor eficacia de la bioconversión y
mayor productividad por unidad de tiempo y de volumen en comparación
con el uso de microorganismos convencionales (Tabla 4).
\newpage
Las reacciones se llevaron a cabo a 60ºC durante
el tiempo indicado, usando las mismas concentraciones de nucleósido
donantes (60 mM) y de base aceptadora (20 mM). El rendimiento de la
bioconversión se calculó en relación con la base aceptadora mediante
análisis RP-HPLC de la mezcla de reacción. La
eficiencia de la reacción se expresa mediante el índice de
productividad P, calculado por la siguiente fórmula P=
n\cdotm^{-t}\cdott^{-t}\cdot1000, donde n= concentración
del producto final (g/l); m= pasta celular (g/l de la mezcla de
reacción y t= tiempo de reacción en
horas.
horas.
\newpage
En particular, como se muestra en el ejemplo de
la tabla 5 respecto a la preparación de Ara-A a
partir de Ara-U y adenina, el uso de las cepas
recombinantes permite que los procedimientos convencionales de
bioconversión mejoren desde el punto de vista técnico y desde el
punto de vista económico, y permite rendimientos de la bioconversión
más elevados, tiempos de reacción más cortos y mayores rendimientos
volumétricos de los productos finales que se van a obtener usando
una concentración menor de células o de los correspondientes
extractos purificados o brutos.
Otra ventaja derivada del uso de las cepas
recombinantes a las que se refiere la presente invención es la
simplificación de los procedimientos para recuperar y reutilizar la
biomasa celular o el correspondiente extracto bruto o purificado
resultante de la presencia de una concentración celular menor; por
tanto, por ejemplo, cualquier recuperación de las células o del
extracto mediante filtración o ultrafiltración y su posterior
reciclaje es considerablemente más rápido cuando se usan las cepas
recombinantes descritas en la presente invención. En algunos casos,
en particular cuando se usan los sustratos que tienen una afinidad
elevada por las enzimas, la concentración de células recombinantes o
del correspondiente extracto celular bruto o purificado se reduce a
valores tales que puede ser económicamente ventajoso evitar tener
que recuperarlas, con posterior simplificación del procedimiento de
producción.
El propósito de los siguientes Ejemplos es
ilustrar la presente invención sin que constituyan una limitación
del campo de aplicación de la misma.
La secuencia del gen udp de E. coli
se encontró en el banco de datos del EMBL con número de acceso
X15689. El gen se amplificó mediante PCR con los oligonucleótidos
5'-ATCGGTACCATCCATGTCCAAGTCTGATGTTTTT
CATCTC-3' y 5'-AGACGGTCGACAAGAGAATTACAGCAGACGACGC-3' de la cepa K12 de E. coli MG1655 (Singer y col., Microbiol. Rev. 53, 1-24, 1989). La región amplificada comprende la secuencia completa del gen udp desde el codón de iniciación ATG hasta 7 pb en dirección 3' del codón de terminación TAA. En dirección 5' del gen se insertó un sitio de restricción KpnI, seguido por cuatro bases seleccionadas al azar. En dirección 3' del gen hay un sitio SalI. El fragmento amplificado, digerido con KpnI y SalI, se clonó en la región poliligador del vector pUC18 que porta el gen de resistencia a ampicilina (Yanish y Perron, Gene 33, 103-119, 1985; número de acceso en el EMBL L08752). Después de la transformación de la cepa DH5\alpha (Hanahan, J. Mol. Biol. 166, 557-580, 1983), se obtuvo el plásmido pGM679 (Figura 1). En el constructo, se crea una fusión entre los primeros codones del gen lacZ de pUC18 y la secuencia udp completa (figura 2) y la transcripción está controlada por el promotor lac del vector.
CATCTC-3' y 5'-AGACGGTCGACAAGAGAATTACAGCAGACGACGC-3' de la cepa K12 de E. coli MG1655 (Singer y col., Microbiol. Rev. 53, 1-24, 1989). La región amplificada comprende la secuencia completa del gen udp desde el codón de iniciación ATG hasta 7 pb en dirección 3' del codón de terminación TAA. En dirección 5' del gen se insertó un sitio de restricción KpnI, seguido por cuatro bases seleccionadas al azar. En dirección 3' del gen hay un sitio SalI. El fragmento amplificado, digerido con KpnI y SalI, se clonó en la región poliligador del vector pUC18 que porta el gen de resistencia a ampicilina (Yanish y Perron, Gene 33, 103-119, 1985; número de acceso en el EMBL L08752). Después de la transformación de la cepa DH5\alpha (Hanahan, J. Mol. Biol. 166, 557-580, 1983), se obtuvo el plásmido pGM679 (Figura 1). En el constructo, se crea una fusión entre los primeros codones del gen lacZ de pUC18 y la secuencia udp completa (figura 2) y la transcripción está controlada por el promotor lac del vector.
La región clonada se secuenció por completo y se
encontró que era completamente idéntica a la secuencia de la base de
datos. La secuencia del plásmido pGM679 se encuentra en la
lista.
El gen Tet de pBR322, que confiere resistencia a
tetraciclina (Bolivar y col., Gene 2, 95-113,
1977; número de acceso del EMBL J01749), se insertó en el plásmido
pGM679. El gen, precedido por su promotor, se obtuvo mediante
digestión con HindIII del interposón
pHP45W708-Tet (Fellay y col., Gene 52,
147-154, 1987) y se clonó en el sitio HindIII
de pGM679. El plásmido resultante se denominó pGM708 (figura 1). Su
secuencia completa se recoge en la lista.
La secuencia del gen deoD se encontró en
el banco de datos del EMBL con número de acceso M60917. El gen se
amplificó mediante PCR con los oligonucleótidos
5'-CTGAATTCTTCCATGGCTACCCCACACATTAATGCAG-3'
y
5'-TCATGGTCGACTTACTCTTTATCGCCCAGCAGAACG-3'
de la cepa K12 de E. coli MG1655 (Singer y col.,
Microbiol. Rev. 53, 1-24, 1898). La región
amplificada comprende la secuencia completa del gen deoD
desde el codón de iniciación ATG hasta el codón de terminación TAA.
En dirección 5' del gen se insertó un sitio de restricción
EcoRI, seguido por cuatro bases seleccionadas al azar. En
dirección 3' del gen hay un sitio SalI. El fragmento
amplificado, digerido con EcoRI y SalI, se clonó en la
región poliligador del vector pUC18 que porta el gen de resistencia
a ampicilina (Yanish y Perron, Gene 33, 103-119,
1985; número de acceso en el EMBL L08752). Después de la
transformación de la cepa DH5\alpha (Hanahan, J. Mol. Biol. 166,
557-580, 1983), se obtuvo el plásmido pGM678 (Figura
1). En el constructo, se crea una fusión entre los primeros codones
del gen lacZ de pUC18 y la secuencia deoD completa
(figura 2) y la transcripción está controlada por el promotor
lac del vector. La región clonada se secuenció completamente
y se encontró que era completamente idéntica a la secuencia del
banco de datos. La secuencia del plásmido pGM678 se recoge en la
lista.
El gen Tet, que confiere resistencia a
tetraciclina se insertó en el plásmido pGM678 de forma análoga a la
descrita en el ejemplo nº 1. El plásmido resultante se denominó
pGM797 (figura 1). Su secuencia completa se recoge en la lista.
El gen deoD también se clonó en un vector
diferente como se comunica a continuación.
La región PvuII-NdeI del
plásmido pUC18 (rematado en su extremo con el fragmento Klenow) que
contiene el origen de la replicación unido al fragmento EcoRI
(rematado)-HindIII (rematado) con el poliligador para obtener
el plásmido resultante pGM746 cuya secuencia se encuentra en la
lista. El pGM746 se digirió posteriormente con BamHI
(rematado)-SphI y se unió al fragmento NheI
(rematado)-SphI de plásmido pGM709 en el que está contenido
el gen deoD precedido por una secuencia
Shine-Dalgarno para el sitio de unión al ribosoma
(véase el ejemplo 3). El plásmido resultante se denominó pGM747 y
también se encuentra en la lista.
La región que contiene el promotor tac se obtuvo
mediante amplificación por PCR con los oligonucleótidos
5'-ATTGAGCTCGACATCATAACGGTTCTGGC y
5'-ATTGGATCCTGTGTGAAATTGTTATCCGC del plásmido pGZ119
(Lessl y col., J. Bacteriol. 174, 2493-2500,
1992), digestión del fragmento con BamHI-SacI
e inserción en BamHI-SacI de pGM747 en 5' de
deoD. El plásmido resultante pGM751 (figura 3) contiene el
gen deoD desde el promotor tac y expresa la enzima PNP
idéntica a la de tipo salvaje. La secuencia de pGM751 se recoge en
la lista.
Los genes udp y deoD se clonaron en
el mismo vector para expresar las enzimas UdP y PNP en la misma
célula de forma simultánea. Esto se realizó mediante la inserción
del gen deoD en el plásmido pGM679, en dirección 3' de
udp. Para la construcción, el fragmento
EcoRI-SalI de pGM678, que contenía el gen
deoD, se clonó en el vector pBAD24 (Guzmán y col., J.
Bacteriol. 177, 4121-4230; nº de registro del EMBL
X81838), obteniéndose el plásmido pGM709. El fragmento NheI
(rematado en los extremos), se clonó el SphI de este
constructo en pGM679, se digirió con SalI
(rematado)-SphI, para dar pG712 (figura 1). En pGM712, los
genes udp y deoD se transcriben desde el promotor
lac, pero la traducción de deoD es independiente de la
de udp porque en 5' de deoD hay una secuencia para la
unión de los ribosomas (figura 2). Debe apreciarse que la proteína
PNP expresada por pGM712 es idéntica a la proteína salvaje porque se
eliminó la fusión con los primeros codones de lacZ en 5' del
gen (figura 2). La secuencia completa de pGM712 se recoge en la
lista.
El gen Tet, que confiere resistencia a
tetraciclina, se insertó posteriormente en el plásmido pGM712 como
se describe en el ejemplo nº 1. El plásmido resultante se denominó
pGM716 (figura 1). Su secuencia completa está en la lista.
Los genes udp y deoD también se
clonaron en un vector diferente en el que se expresan de forma
simultánea en este orden, desde el promotor lac, como se
comenta a continuación.
El fragmento SalI-HindIII,
obtenido mediante amplificación por PCR usando el ADN de pGM679 como
molde y los oligonucleótidos
5'-TCCAGTCGACACAGGAAACAGCTATGA y
5'-TACGAAGCTTA AGAGAATTACAG
CAGACG, se insertó en el plásmido pGM751, se digirió con SalI-HindIII, para obtener el plásmido GM800 que porta el gen udp clonado en 3' a deoD. Ambos genes se transcriben desde plac pero la traducción es independiente. La secuencia completa de pGM800 se recoge en la lista.
CAGACG, se insertó en el plásmido pGM751, se digirió con SalI-HindIII, para obtener el plásmido GM800 que porta el gen udp clonado en 3' a deoD. Ambos genes se transcriben desde plac pero la traducción es independiente. La secuencia completa de pGM800 se recoge en la lista.
Posteriormente, el gen Tc de resistencia a
tetraciclina se insertó en pGM800 según un procedimiento análogo al
descrito en el ejemplo 1, obteniendo de este modo el plásmido pGM807
(figura 3), cuya secuencia también se recoge en la lista.
La secuencia que codifica UdP y PNP se han
fusionado entre sí bien directamente o bien separadas por un corto
ligador aminoacídico. Los plásmidos se obtuvieron mediante
posteriores etapas comenzando a partir de pGM716. En particular, se
digirió el plásmido pGM716 con HpaI y se cerró de nuevo de forma que
tenga una deleción en la parte terminal del gen udp y en la
parte inicial del deoD y crear el plásmido pGM 769 con un
sitio único HpaI. La porción 3' de udp se amplificó mediante
PCR con los oligonucleótidos
5'-GGCCGTTAACCGCACCCAGCAAGAG y
5'-AGC
CATGGACAGCAGACGACGCGCC; la porción 5' del deoD se amplificó del mismo modo con los oligonucleótidos 5'-GCTGTCCATGGCTACCCCACACATTAAT y 5'-CCGGGTTAACTTTGGAATCGGTGCAGG. Posteriormente, usando el producto de las dos PCR como molde y las dos secuencias terminales se amplificó la región completa; el fragmento obtenido crea una fusión entre udp y deoD, sustituyendo el codón de terminación de udp con un codón para serina, seguido por el codón ATG de deoD. El fragmento se digirió con HpaI (sitio presente en los dos extremos) y se clonó en el sitio HpaI de pGM769. El plásmido resultante se denomina pGM771 (figura 4). Después, en pGM771, la proteína fusionada UdP-PNP se transcribe a partir del promotor lac. La secuencia del plásmido se recoge en la lista.
CATGGACAGCAGACGACGCGCC; la porción 5' del deoD se amplificó del mismo modo con los oligonucleótidos 5'-GCTGTCCATGGCTACCCCACACATTAAT y 5'-CCGGGTTAACTTTGGAATCGGTGCAGG. Posteriormente, usando el producto de las dos PCR como molde y las dos secuencias terminales se amplificó la región completa; el fragmento obtenido crea una fusión entre udp y deoD, sustituyendo el codón de terminación de udp con un codón para serina, seguido por el codón ATG de deoD. El fragmento se digirió con HpaI (sitio presente en los dos extremos) y se clonó en el sitio HpaI de pGM769. El plásmido resultante se denomina pGM771 (figura 4). Después, en pGM771, la proteína fusionada UdP-PNP se transcribe a partir del promotor lac. La secuencia del plásmido se recoge en la lista.
El plásmido pM771 se modificó posteriormente
mediante la inserción del ligador
5'-CATGGGCGGTGGCAGCCC
GGGCATTCTGGCCATG en el sitio único NcoI inmediatamente en 5' del ATG iniciador de deoD. El plásmido resultante, denominado pGM795 (figura 4) expresa una proteína de fusión formada por UdP + un ligador de 11 aminoácidos (ser-met-gly-gly-gly-ser-pro-gly-ile-leu-ala) + PNP. La secuencia de pGM795 se recoge en la lista.
GGGCATTCTGGCCATG en el sitio único NcoI inmediatamente en 5' del ATG iniciador de deoD. El plásmido resultante, denominado pGM795 (figura 4) expresa una proteína de fusión formada por UdP + un ligador de 11 aminoácidos (ser-met-gly-gly-gly-ser-pro-gly-ile-leu-ala) + PNP. La secuencia de pGM795 se recoge en la lista.
La cepa K12 de E. coli DH5\alpha, que
porta la mutación recA1 (Hanahan, J. Mol. Biol. 166,
557-580, 1983) y la cepa salvaje MG1655 (Singer y
col., Microbiol. Rev. 53, 1-24, 1989) se
transformaron con plásmidos pGM1655, pGM679, pGM707, pGM708, pGM712,
pGM716, pGM771, pGM795, pGM751, pGM800 y pGM807. El genotipo de las
cepas y algunas características de las cepas recombinantes se
exponen en las tablas 6 y 7. Los transformantes pGM678, pGM679,
pGM712, pGM751 y pGM807 se seleccionaron en medio con ampicilina (50
\mug/ml) y los transformantes pGM707, pGM708, pGM716, pGM771,
pGM795 y pGM907. pGM771,pGM795 y pGM807 se seleccionaron en medio
con tetraciclina (12,5 \mug/ml).
La presencia del plásmido en las cepas
transformadas se confirmó mediante extracción del ADN plasmídico y
análisis en gel de agarosa al 0,6%.
El crecimiento de las cepas transformadas en
caldo LD (composición por litro: 10 g de Bactotriptona (Difco), 5 g
de extracto de levadura (Difco), 5 g de NaCl) o en medio sólido (LD
+ 10 g/l de agar), al cual se añadió ampicilina (50 \mug/ml, sólo
para las cepas transformadas con pGM707, pGM708, pGM716, oGM771,
pGM795 y pGM807) es comparable con el de las cepas control
transformadas con el vector pUC18. Además, en las cepas
transformadas con los plásmidos pGM707, pGM708, pGM716, pGM771,
pGM795 y pGM807, portadores de ambos genes de resistencia, no se ha
demostrado la existencia de diferencias en el crecimiento en
presencia de ampicilina y tetraciclina.
Se obtuvieron precultivos de las cepas
recombinantes mediante la inoculación de clones únicos en el medio
LD al que se había añadido un antibiótico y mediante incubación sin
agitar a 37ºC durante la noche. Los cultivos se diluyeron a 1:20 en
medio LD + antibiótico en un matraz de fondo plano y se incubaron a
37ºC con agitación hasta que se alcanzó la fase de equilibrio, que
correspondía a valores de densidad celular de aproximadamente 2
unidades de densidad óptica a 600 nm. Las proteínas totales
extraídas de 1 ml de cultivo se separaron en gel de poliacrilamida
al 15% en condiciones reductoras (SDS-PAGE) y las
proteínas se visualizaron con tinción con Azul de Coomassie. Las
proteínas PNP y UdP se identificaron sobre la base del peso
molecular de aproximadamente 26,6 kDa para PNP y 28,2 kDa para UdP.
El resultado obtenido de los extractos de las cepas MG1655/pGM707,
pGM708 y pGM716 se recoge en la figura 5, El análisis
electroforético muestra que, en todas las muestras estudiadas, se ha
producido sobreexpresión de PNP y de UdP, ya que las
correspondientes bandas proteicas representan un porcentaje
significativo de las proteínas celulares totales; este resultado se
confirma mediante determinación cuantitativa de las actividades
enzimáticas, que se expone en las tablas 1 y 2, y mediante
determinación cuantitativa de la expresión de UdP y PNP realizada
por cromatografía líquida de alta presión de fase inversa
(RP-HPLC). Para ese propósito, se analizó el
extracto soluble en una columna de análisis
C4-Vydac, de dimensiones 4,6 x 250 mm, usando una
fase móvil constituida por acetonitrilo-H_{2}O que
contiene ácido trifluoroacético al 0,1% y que funciona de acuerdo
con los siguientes parámetros: caudal de 0,75 ml/minuto; elución por
gradiente de acetonitrilo al 40% a acetonitrilo al 65% en 30
minutos; temperatura de 45ºC; detección UV a una longitud de onda de
215 mm. En las condiciones de análisis aplicadas, los tiempos de
elución para UdP y PNP fueron, aproximadamente, 13 minutos y 15
minutos, respectivamente. LA determinación cuantitativa se llevó a
cabo comparando el área del pico de interés con el área del pico de
las preparaciones estándar de UdP y PNP separadas en las mismas
condiciones que las
muestras.
muestras.
Dado que, en las cepas recombinantes, los genes
deoD y udp se clonan bajo el control del promotor
lac, el crecimiento de las células y la expresión de las
proteínas UdP y PNP se controlaron en ausencia y en presencia de 40
mg/l de IPTG como inductor de la transcripción. Los resultados
obtenidos indican que la presencia de IPTG no modifica el
crecimiento celular y no aumenta el nivel de expresión de UdP y PNP
posiblemente a causa de la insuficiente cantidad de represor
presente en esas cepas). Este último resultado indica que, en las
cepas recombinantes a las que se refiere la presente invención, la
expresión de los genes deoD y udp es constitutiva y
alcanza niveles muy elevados sin que se produzcan fenómenos de
lesión celular o de disminución de la vitalidad de las células.
Las cepas se cultivaron como se describe en el
ejemplo nº 5. Las células se recogieron mediante centrifugación, se
pesaron en forma de pasta celular mojada y se almacenaron a -20ºC
hasta el momento de realizar el análisis enzimático.
La actividad de la enzima UdP se determinó en una
prueba de fosforolisis mediante incubación durante 5 minutos a 30ºC
de la fracción soluble (extracto celular) obtenida mediante
sonicación de una cantidad conocida de una suspensión de la pasta
celular y mediante centrifugación del homogeneizado en tampón
fosfato 100 mM a pH 7 con 60 mM del sustrato uridina. La reacción
enzimática se bloqueó mediante acidificación con HCl 0,1N; la
suspensión se filtró y se analizó mediante RP-HPLC
en una columna C18 (Hypersyl 100; 4,6 x 250 mm), eluyendo en
condiciones isocráticas con un fase4 móvil constituida por
K_{2}PO_{4} 0,02M en metanol-H_{2}O (4:96 v/v)
y se ajustó a un pH 4,5 con NH_{4}OH. La cantidad de uracilo
formado en la reacción se determinó por referencia con una curva
estándar y la actividad enzimática de la preparación celular se
calculó en \mumol de uracilo/min/g de pasta celular mojada
(unidades/g). La actividad de la enzima PNP se determinó en una
prueba de fosforolisis mediante incubación durante 10 minutos a 30ºC
de la fracción soluble (extracto celular) obtenida mediante
sonicación de una cantidad conocida de una suspensión de la pasta
celular y mediante centrifugación del homogeneizado en tampón
fosfato 100 mM a pH 7 con 50 mM del sustrato inosina. La reacción
enzimática se bloqueó mediante acidificación con HCl 0,1N; la
suspensión se filtró y se analizó mediante RP-HPLC
en una columna C18 (Hypersyl 100; 4,6 x 250 mm), eluyendo en
condiciones isocráticas con un fase móvil constituida por
K_{2}PO_{4} 0,02M en metanol-H_{2}O (4:96 v/v)
y se ajustó a un pH 4,5 con NH_{4}OH. La cantidad de hipoxantina
formada en la reacción se determinó por referencia con una curva
estándar y la actividad enzimática de la preparación celular se
calculó en \mumol de hipoxantina/min/g de pasta celular mojada
(unidades/g).
Las cepas recombinantes a las que se refiere la
presente invención se cultivaron a alta biomasa en condiciones de
fermentación en modo discontinuo o discontinuo con alimentación
Las fermentaciones en modo discontinuo se
llevaron a cabo usando un fermentador con un volumen de trabajo de
10 litros, que se cargó con 9 litros de medio con la siguiente
composición (por litro): 0,6 g de KH_{2}PO_{4}; 3,2 g de
K_{2}HPO_{4}; 20 g de Soytone (Difco); 36 g de extracto de
levadura (Difco); 1 g de MgSO_{4}-7H_{2}O;
0,0125 g de tetraciclina (u otro antibiótico usado como marcador de
selección) y que se inoculó con 1 litro de una suspensión bacteriana
previamente cultivada durante 20 horas a 30ºC en medio con la
siguiente composición, por litro: 20 g de triptona; 10 g de extracto
de levadura; 10 g de NaCl; 0,0125 g de tetraciclina.
La fermentación se llevó a cabo según los
siguientes parámetros de funcionamiento: 30ºC; flujo de aire de 1
litro/litro de cultivo/minuto; agitación inicial 250 rev/min
modificada automáticamente para mantener un nivel de O_{2} al 20%
de la concentración de saturación; pH mantenido a 7 mediante
adiciones de H_{3}PO_{4} o NH_{4}OH; tiempo 24 horas. Cuando
se completó la fermentación, se centrifugó el medio de cultivo, se
lavó el sedimento celular en tampón fosfato 30 mM a pH7. La biomasa
obtenida (40-50 gramos de pasta celular mojada/litro
de medio de cultivo) se almacenó a -20ºC hasta que se usó.
Las fermentaciones en modo discontinuo con
alimentación se llevaron a cabo usando un fermentador con un volumen
de trabajo de 10 litros que se cargó con 7 litros de medio a pH
6,8-7 con la siguiente composición, por litro: 13,3
g de KH_{2}PO_{4}; 4 g de (NH_{4})2_{H}PO_{4}; 1,25
g de Soytone (Difco), 0,125 g de extracto de levadura (Difco); 1,7 g
de ácido cítrico; 2,5 g de glicerol; 1,5 g de
MgSO_{4}-7H_{2}O; 0,08 g de CaCl_{2}; 0,01 g
de tiamina; 0,0125 g de tetraciclina (u otro antibiótico marcador de
selección); 0,08 g de FeSO_{4}-7H_{2}O; 0,02 g
de MnSO_{4}-H_{2}O; 0,03 g de
ZnSO_{4}-7H_{2}O; 0,003 g de H_{2}BO_{3};
0,06 g de CuSO_{4}-5H_{2}O; 0,08 g de
CaCl_{2}-6H_{2}O; 0,04 g de
NaMoO_{4}-2H_{2}O. El fermentador se inoculó con
1 litro de suspensión bacteriana previamente cultivada durante
18-20 horas a 30ºC en medio con la siguiente
composición, por litro: 13,3 g de KH_{2}PO_{4}; 4 g de
(NH_{4})_{2}HPO_{4}; 5 g de Soytone (Difco); 1,7 g de
ácido cítrico; 10 g de glicerol; 0,01 g de tiamina; 0,0125 g de
tetraciclina; 0,05 g de CaCl_{2}-2H_{2}O; 1 g de
MgSO_{4}-7H_{2}O; 0,03 g de
FeSO_{4}-7H_{2}O; 0,01 g de
MnSO_{4}-H_{2}O; 0,01 g de
ZnSO_{4}-7H_{2}O; 0,03 g de H_{3}BO_{3};
0,02 g de CuSO_{4}-5H_{2}O; 0,002 g de
CaCl_{2}-6H_{2}O; 0,002 g de
NaMoO_{4}-2H_{2}O.
La fermentación se llevó a cabo según los
siguientes parámetros de funcionamiento: 30ºC; flujo de aire de
1-1,2 litros/litro de cultivo/minuto; agitación
inicial 150 rev/min modificada automáticamente para mantener un
nivel de O_{2} al 20% de la concentración de saturación durante
aproximadamente 8-10 horas (fase discontinua) y
después un nivel de O_{2}al 10% de la concentración de saturación
(fase discontinua con alimentación); pH mantenido a
6,8-7 mediante adiciones de H_{3}PO_{4} o
NH_{4}OH. Durante La fase discontinua con alimentación, se
suministró de forma automática a la fermentación un total de 2
litros de una solución de la siguiente composición por litro: 400 g
de glicerol; 200 g de Sytone; 20 g de extracto de levadura; 3 g de
MgSO_{4}-7H_{2}O; 0,0125 g de tetraciclina.
Cuando se completó la fermentación (tras aproximadamente 50 horas),
se centrifugó el medio de cultivo, se lavó el sedimento celular en
tampón fosfato 30 mM a pH7. La biomasa obtenida
(150-200 gramos de pasta celular mojada/litro de
medio de cultivo) se almacenó a -20ºC hasta que se usó.
Las reacciones de transglicosilación se llevaron
a cabo usando varios nucleósidos donantes de azúcar a una
concentración de 60 mM (uridina, 2'-desoxiuridina,
Ara-U) y varias bases aceptadora a una concentración
de 20 mM
(1,2,4-triazol-3-carboxamida,
guanina, adenina, timina, 2,6-diaminopurina) a pH 7
en tampón fosfato (30 mM) en presencia de varias concentraciones de
pasta celular o del correspondiente extracto bruto o purificado,
bien de cultivos del microorganismo control E.aerogenes o de
cultivos de la cepa E.coli recombinante MG1655/pGM716 que
sobreexpresa las enzimas UdP y PNP. Las reacciones se llevaron a
cabo a 60ºC durante varios periodos de tiempo (de 1 hora a 25 horas)
y el porcentaje de bioconversión, respecto a la concentración
inicial de la base aceptadora, se determinó mediante análisis
RP-HPLC de la mezcla de reacción diluida. Los
resultados obtenidos se exponen en la tabla 2.
El índice P de productividad se calculó para cada
reacción mediante la aplicación de la siguiente fórmula:
P= n m^{-t}
t^{-t}
1000
en la que n= concentración del
producto final
(g/l)
m= pasta celular mojada (g/l de la mezcla de
reacción)
t= tiempo de reacción en horas.
El índice de productividad representa una medida
global de la eficiencia de la reacción porque tiene en cuenta las
características de la interacción enzima-sustrato y
los parámetros de funcionamiento, tales como el tiempo de reacción,
la cantidad de células usadas y el rendimiento volumétrico del
producto final.
La preparación de ribavirina a partir de uridina
(60 mM) y
1,2,4-triazol-3-carboxamida
(40 mm) y de Ara-A a partir de Ara-U
(40 mM) y adenina (40 mM) se estudiaron como ejemplos de
optimización del uso de células de E.coli recombinantes en
las reacciones de bioconversión. En cada caso, las reacciones se
llevaron a cabo a 60ºC en presencia de fosfato potásico 30 mM a pH 7
y en presencia de varias cantidades de pasta celular obtenida
mediante fermentación de las cepas MG1655/pGM707 (que sobreexpresa
la enzima UdP) yMG1655/pGM708 (que sobreexpresa la enzima PNP). A
intervalos predeterminados, se tomaron alícuotas de la mezcla de
reacción y se analizaron mediante RP-HPLC para
determinar la bioconversión porcentual (calculada respecto a la
concentración de la base aceptadora).
Inicialmente, el estudio se llevó a cabo mediante
la incubación de la mezcla de reacción durante 20 horas en presencia
de una concentración limitante de pasta celular (con la actividad
enzimática total igual o inferior a 2 unidades/ml) y funcionando de
modo tal las relaciones entre las unidades de la enzima UdP y las
unidades de la enzima PNP varíen en las siguientes proporciones 5:1;
2:1; 1:1; 1:2; 1:5.
Los resultados obtenidos en las dos reacciones de
bioconversión se exponen en la tabla 8.
\newpage
Las reacciones se llevaron a cabo durante 20
horas a 60ºC en presencia de concentraciones limitantes de pasta
celular.
Los resultados expuestos en la tabla demuestran
que las proporciones óptimas de las actividades UdP y PNP son 1:1 y
1:0,5, respectivamente, para la reacción de formación de ribavirina
y Ara-A.
Estos datos se confirmaron en el siguientes
estudio en el que se usaron concentraciones enzimáticas 10 veces
superiores, manteniéndose las mismas proporciones entre las unidades
de UdP y las unidades de PNP; en este estudio, también se
determinaron las cinéticas de la reacción mediante la obtención de
muestras de la mezcla de reacción a intervalos de 1 hora para su
análisis con RP-HPLC y el cálculo de la
bioconversión porcentual.
Las tablas 9 y 10 muestran, para las reacciones
de preparación de ribavirina y de Ara-A,
respectivamente, los parámetros óptimos en términos de bioconversión
porcentual y tiempo de reacción para las diversas proporciones de
UdP y PNP estudiadas.
Los resultados del estudio de optimización
indican que la ribavirina se puede obtener en dos horas con un
rendimiento de bioconversión del 91% usando 10 unidades/ml de UdP o
de PNP, mientras que Ara-A se puede obtener en dos
horas con un rendimiento de bioconversión de aproximadamente un 71%
usando 10 unidades/ml de UdP y 5 unidades/ml de PNP.
Sobre la base del título de la actividad
enzimática de las cepas de E. coli recombinantes descrita en
la presente invención, es, por tanto posible calcular la cantidad de
pasta celular necesaria para preparar ribavirina y
Ara-A en condiciones óptimas. En el caso de, por
ejemplo, las cepas MG1655/pGM707 y MG1655/pGM716 con las actividades
específicas que se exponen en la tabla 1, se usarán 0,4 y 0,2 gramos
de pasta celular/100 ml de mezcla de reacción, respectivamente, para
la preparación de ribavirina y Ara-A.
El procedimiento para la preparación de
Ara-A mediante transglicosilación catalizada por
células de E. aerogenes o por células de E. coli
recombinantes MG1655/pGM716 o DH5\alpha/pGM716 que sobreexpresan
UdP y PNP se estudió a una escala de la reacción de 1000 litros.
En aproximadamente 200 litros de tampón fosfato
30 mM a pH 7 se resuspendieron 50 kg de pasta celular obtenida
mediante fermentación de E. aerogenes y se mezclaron con 800
litros de tampón fosfato en el que se habían disuelto a temperatura
elevada 5,4 kg de adenina (concentración final de 40 mM) y 8,9 kg de
Ara-U (concentración final de 40 mM). La mezcla se
mantuvo a 60ºC, con agitación, durante 20 horas, se diluyó a
aproximadamente 3000 litros con H2O caliente y se sometió a
diafiltración en membrana, recogiéndose aproximadamente 5000 litros
del ultrafiltrado. El rendimiento de bioconversión determinado por
RP-HPLC fue de aproximadamente el 55%. El residuo
que contiene la pasta celular se usa para la siguiente reacción. El
ultrafiltrado se concentró a aproximadamente 1000 litros y se
enfrió, para recoger el precipitado constituido por
Ara-A contaminado con adenina sin reaccionar
(Aproximadamente 30 g de adenina por 100 g de
Ara-A). Finalmente, tras cristalización con H2O, se
obtuvieron 5 kg de Ara-A (rendimiento total
aproximado de 46%) con un grado de pureza superior a 99,5%.
En aproximadamente 20 litros de tampón fosfato 30
mM a pH 7 se resuspendieron 5 kg de pasta celular mojada o del
extracto correspondiente bruto o purificado obtenidos mediante
fermentación de la cepa NG1655/pGM716 o la cepa DH5\alpha/pGM716 y
se mezclaron con 980 litros de tampón fosfato en el que se habían
disuelto, a temperatura elevada, 10,1 kg de adenina (concentración
final de aproximadamente 74,6 mM) y 18,3 kg de Ara-U
(concentración final de aproximadamente 74,6 mM). La mezcla se
mantuvo a 60ºC, con agitación, durante 4 horas hasta obtener un
rendimiento de bioconversión de aproximadamente 70%. La pasta
celular se recuperó con el fin de volverla a usar en reacciones
posteriores mediante dilución a temperatura elevada y diafiltración
de acuerdo con el procedimiento descrito anteriormente. El
ultrafiltrado se concentró hasta un volumen de aproximadamente 1000
litros, se enfrió para recoger el precipitado formado por
Ara-A, que posteriormente se cristalizó en agua para
obtener aproximadamente 14 kg de Ara-A con un grado
de pureza superior a 99,5%. De acuerdo con un procedimiento
alternativo, en el que las células no se recuperaron y se omitió la
etapa de diafiltración, al final de la reacción la mezcla se calentó
hasta aproximadamente 90ºC y se filtró temperatura elevada para
eliminar las células y el filtrado se enfrió para precipitar el
Ara-A contaminada con adenina sin reaccionar
(aproximadamente 20 g de adenina por 100 g de
Ara-A). Finalmente, tras cristalización de la
reacción de 1000 litros, se obtuvieron 14 kg de
Ara-A (rendimiento total 65%) con un grado de pureza
superior a 99,5%.
<110> NORPHARMA SPA
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Cepas bacterianas recombinantes para
la producción de nucleósidos naturales y análogos modificados de los
mismos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 99DC26E
\vskip0.400000\baselineskip
<140> PCT/EP99/10416
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
23-12-1999
\vskip0.400000\baselineskip
<150> MI98A002792
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
23-12-1998
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 2.1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3444
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Plásmido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (243)... (1021)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> udp
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 556
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Plásmido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (243)..(1021)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> udp
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1483)..(2883)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> resistencia a tetraciclina
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3383
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Plásmido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (231)..(960)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> deoD
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5495
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Plásmido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (231)..(960)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> deoD
\vskip0.400000\baselineskip
<220> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1423)..(2822)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> resistencia a tetraciclina
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 4189
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Plásmido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (243)..(1021)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> udp
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1037)..(1766)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> deoD
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6301
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<212> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Plásmido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (243)..(1021)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> udp
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1037)..(1766)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> deoD
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2229)..(3628)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> resistencia a tetraciclina
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5241
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: Plásmido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> Gen
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1312) (2042)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> deoD
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5822
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: pGM716 con deleción de un fragmento HpaI
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6269
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: udp y deoD clonados en pUC18 para crear
una fusión entre las dos proteínas
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6299
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: udp y deoD clonados en pUC18 para crear una
fusión entre las dos proteínas unidas entre sí a través de un
ligador aa
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 2297
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: vector de clonación derivado de pUC18
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3031
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: udp y deoD clonados en pGM746 sin un
promotor ptac en 5'
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3128
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: deoD clonados en 3' del promotor ptac
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3934
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: udp y deoD clonados en 3' del promotor
ptac
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6046
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción de la secuencia
artificial: udp y deoD clonados en 3' del promotor
ptac
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
Claims (22)
1. Células huésped E. coli transformadas
que tienen actividades enzimáticas de uridina fosforilasa y purina
nucleósido fosforilasa 120-1000 veces superiores a
las correspondientes células sin transformar, conteniendo dichas
células huésped E. coli transformadas un vector de expresión
plasmídico recombinante que comprende:
- (a)
- al menos una secuencia génica de una bacteria mesófila que codifica un polipéptido que tiene actividad enzimática de uridina fosforilasa y al menos una secuencia génica de una bacteria mesófila que codifica un polipéptido que tiene actividad enzimática de purina nucleósido fosforilasa; y
- (b)
- al menos una secuencia génica que codifica una resistencia a tetraciclina, kanamicina y/o ampicilina.
2. Células huésped según la reivindicación 1,
caracterizadas porque la al menos una secuencia génica de una
bacteria mesófila que codifica un polipéptido que tiene actividad
enzimática de uridina fosforilasa y la al menos una secuencia génica
de una bacteria mesófila que codifica un polipéptido que tiene
actividad enzimática de purina nucleósido fosforilasa y la secuencia
génica que codifica una resistencia a tetraciclina, kanamicina y/o
ampicilina se clonan en el plásmido pUC18.
3. Células huésped según la reivindicación 1,
caracterizadas porque la bacteria mesófila es E.
coli.
4. Células huésped según la reivindicación 3,
caracterizadas porque la secuencia que codifica un
polipéptido que tiene actividad enzimática de uridina fosforilasa es
la secuencia udp.
5. Células huésped según la reivindicación 4,
caracterizadas porque la secuencia es la secuencia del EMBL
con número de acceso X15689, como se comprende en el identificador
de secuencia nº 1.
6. Células huésped según la reivindicación 3,
caracterizadas porque la secuencia que codifica un
polipéptido que tiene actividad enzimática de purina nucleósido
fosforilasa es la secuencia deoD.
7. Células huésped según la reivindicación 6,
caracterizadas porque la secuencia es la secuencia del EMBL
con número de acceso m60917, como se comprende en el identificador
de secuencia nº 3.
8. Células huésped según la reivindicación 1,
caracterizadas porque la secuencia que codifica la
resistencia a tetraciclina es el gen Tet de pBR322.
9. Células huésped según la reivindicación 1,
caracterizadas porque la secuencia que codifica la
resistencia a kanamicina es el gen kan de pET29c.
10. Células huésped según las reivindicaciones 1
a 9, caracterizadas porque dicha secuencia génica que
codifica un polipéptido que tiene actividad enzimática de uridina
fosforilasa y dicha secuencia génica que codifica un polipéptido que
tiene actividad enzimática de purina nucleósido fosforilasa se
fusionan para expresar una proteína de fusión en la que las enzimas
uridina fosforilasa y purina nucleósido fosforilasa están unidas por
un ligador polipeptídico de más de una unidad aminoacídica.
11. Células huésped según la reivindicación 1,
caracterizadas porque el vector plasmídico se selecciona de
entre los que tienen las secuencias: identificador de secuencia nº
5, identificador de secuencia nº 6, identificador de secuencia nº
10, identificador de secuencia nº 14 y identificador de secuencia nº
15.
12. Células huésped según las reivindicaciones
1-11, caracterizadas porque son células de la
cepa K12.
13. Uso de células huésped según las
reivindicaciones 1 a 12 en la producción de polipéptidos que tienen
la actividad enzimática uridina fosforilasa y/o la actividad
enzimática purina nucleósido fosforilasa.
14. Uso de células huésped según las
reivindicaciones 1 a 12 como catalizadores de las reacciones de
transglicosilación entre un nucleósido donante y una base
aceptadora.
15. Uso según la reivindicación 14,
caracterizado porque la base aceptadora es una base de purina
y/o de pirimidina.
16. Uso según la reivindicación 15,
caracterizado porque las bases de purina y/o de pirimidina se
seleccionan de entre bases de pirimidina y de purina naturales o
sustituidas; las bases de purina sustituidas en las posiciones 1, 2
y/o 6 del anillo de purina; las bases de pirimidina sustituidas en
las posiciones 3 y/o 5 del anillo de pirimidina; purina,
2-azapurina, 8-azapurina,
8-azapurina, 1-desazapurina
(imidazopiridina), 3-desazapurina,
7-desazapurina.
17. Uso según la reivindicación 14,
caracterizado porque las bases aceptadoras están constituidas
por compuestos heterocíclicos que contienen al menos un átomo de
nitrógeno, tales como, por ejemplo, imidazoles, triazoles y
pirazoles.
18. Uso según la reivindicación 14,
caracterizado porque el nucleósido donante se selecciona de
entre nucleósidos naturales y/o modificados que contienen
D-ribosa y 2'-desoxirribosa;
nucleósidos que contienen el grupo ribosa modificado en las
posiciones 2', 3' y/o 5'; nucleósidos en los que el azúcar es
\beta-D-arabinosa,
\alpha-L-xilosa,
3'-desoxirribosa,
3',5'-didesoxirribosa,
2',3'-didesoxirribosa,
5'-desoxirribosa,
2',5'-didesoxirribosa,
2'-amino-2'-desoxirribosa,
3'-desoxirribosa,
2'-fluoro-2'-desoxirribosa.
19. Uso según la reivindicación 14 en la
preparación de nucleósidos que contienen sistemas heterocíclicos que
tienen bases de purina y/o de pirimidina sustituidas en uno o más
átomos de nitrógeno.
20. Uso según la reivindicación 14 en la
preparación de azúcares
\alpha-pentosa-1-fosfato
mediante reacciones de fosforolisis.
21. Uso según la reivindicación 14 en la
producción de nucleósidos.
22. Uso de los extractos brutos o purificados de
células huésped según la reivindicación 10 como catalizadores de las
reacciones de transglicosilación entre un nucleósido donante y una
base aceptadora.
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