ES2230496T3 - Procedimiento para determinar la especificidad de sustrato de una actividad enzimatica y dispositivo para ello. - Google Patents

Procedimiento para determinar la especificidad de sustrato de una actividad enzimatica y dispositivo para ello.

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ES2230496T3 ES02735267T ES02735267T ES2230496T3 ES 2230496 T3 ES2230496 T3 ES 2230496T3 ES 02735267 T ES02735267 T ES 02735267T ES 02735267 T ES02735267 T ES 02735267T ES 2230496 T3 ES2230496 T3 ES 2230496T3
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Abstract

Procedimiento para la determinación de la especificidad de sustrato de una actividad enzimática que comprende las siguientes etapas: - preparación de una disposición que comprende una pluralidad de secuencias de aminoácidos sobre una superficie plana de un material vehiculante, estando inmovilizadas ordenadamente las secuencias de aminoácidos, - puesta en contacto y/o incubación de una actividad enzimática con la disposición, y - análisis de una reacción entre una o varias de las secuencias de aminoácidos inmovilizadas en la disposición y la actividad enzimática. caracterizado porque en la reacción de la actividad enzimática con la disposición se realiza un cambio del peso molecular de al menos unas de las secuencias de aminoácidos y la superficie es una superficie no porosa.

Description

Procedimiento para determinar la especificidad de sustrato de una actividad enzimática y dispositivo para ello.
La presente invención se refiere a disposiciones de una pluralidad de secuencias de aminoácidos sobre una superficie, a vehículos que comprenden éstas así como a disposiciones de vehículos, a procedimientos para la preparación de una de dichas disposiciones, a procedimientos para la determinación de la especificidad de sustrato de una actividad enzimática y al uso del procedimiento para la determinación del patrón de actividad enzimática de una muestra.
Con la creciente disponibilidad de informaciones de secuencia de los distintos proyectos Genoma, la disposición de fragmentos de ácidos nucleicos de alta densidad sobre un material vehiculante, los denominados chips o biochips, ha cobrado una gran importancia, pero su potencial total no podía agotarse sólo con la disponibilidad de nuevas técnicas de síntesis así como la miniaturización, y ha conducido a una pluralidad de usos. Además de ácidos nucleicos, se han aplicado sustancias naturales o bibliotecas, pero también disposiciones de oligopéptidos y proteínas sobre dichos chips. Como materiales vehiculantes para estas disposiciones, se utilizaron a este respecto celulosa, vidrio, nitrocelulosa, membranas de PTFE y agar especial.
Con la creciente importancia de la proteómica y su uso biotecnológico, los péptidos y proteínas avanzan al primer plano de interés. En general son las proteínas, y principalmente sus actividades enzimáticas, las que posibilitan casi todas las reacciones bioquímicas dentro y fuera de la célula. El uso de disposiciones de ácidos nucleicos que se analizan mediante los ARN mensajeros (ARNm) que se generaron directamente mediante los genes activos en la célula, o copias de ADN de estos ARNm, es por supuesto muy importante, pero la información así obtenible no es suficiente por una serie de razones para comprender los procedimientos de los procesos tanto intracelulares como extracelulares y ser así útil en el marco de distintos usos biotecnológicos. Una razón para ello consiste en que la cantidad de ARNm en una célula a menudo no se correlaciona con la correspondiente cantidad de proteína producida en la célula. Además, las proteínas una vez preparadas pueden verse afectadas en gran medida por modificaciones químicas mínimas en la célula (modificaciones postraduccionales) en su actividad enzimática (y por tanto en su función biológica). Por tanto, existe la necesidad de llevar a cabo un análisis paralelo de la actividad enzimática de todas las proteínas posibles, especialmente enzimas. Dicha preparación permite, entre otras cosas, la determinación mucho más rápida de la especificidad de sustrato de una enzima definida, lo que por otra parte es una importante ventaja para el diseño de inhibidores con base científica, o el ensayo selectivo de fármacos o candidatos a fármacos, especialmente en el marco de la predicción de efectos secundarios.
En el estado de la técnica se inmovilizaron disposiciones de péptidos o proteínas sobre distintas superficies como vidrio (J. Robles, M. Beltrán, V. Marchán, Y. Pérez, I. Travesset, E. Pedroso, A. Grandas; 1999, "Towards nucleopeptides containing any trifunctional amino acid", Tetrahedron, 55, 13251-13264), celulosa (D.R. Englebretsen, D.R.K. Harding; 1994, "High yield, directed immobilization of a peptide-ligand onto a beaded cellulose support", Pept. Res., 7, 322-326), nitrocelulosa (S.J. Hawthorne, M. Pagano, P. Harriott, D.W. Halton, B. Walker, 1998, "The synthesis and utilization of 2,4-dinitrophenyl-labeled irreversible peptidyl diazomethyl ketone inhibitors", Anal. Biochem., 261, 131-138), membranas de PT-FE (T.G. Vargo, E.J. Bekos, Y.S. Kim, J.P. Ranieri, R. Bellamkonda, P. Aebischer, D.E. Margevich, P.M. Thompson, F.V. Bright, J.A. Gardella; 1995, "Synthesis and characterization of fluoropolymeric substrata with immobilized minimal peptide sequences for cell adhesion studies 1", J. Biomed. Mat. Res., 29, 767-778), óxido de titanio (S.J. Xiao, M. Textor, N.D. Spencer, M. Wieland, B. Keller, H. Sigrist; 1997, "Immobilization of the cell-adhesive peptide ARG-GLY-ASP-CYS (RGDC) on titanium surfaces by covalent chemical attachment", J. Materials Science-Materials in Medicine, 8, 867-872), óxido de silicio (T. Koyano, M. Saito, Y. Miyamoto, K. Kaifu, M. Kato; 1996, "Development of a technique for microimmobilization of proteins on silicon wafers by a streptavidin-biotin reaction", Biotech. Progress, 12, 141-144) u oro (B.T. Houseman, M. Meksich; 1998, "Efficient solid-phase synthesis of peptide-substituted alkanethiols for the preparation of substrates that support the adhesion of cells", J. Org. Chem., 63, 7552-7555) o se realizó la síntesis por etapas de los péptidos directamente sobre las correspondientes superficies de vidrio (S.P.A. Fodor, J.L. Read, M.C. Pirrung, L. Stryver, A.T. Lu, D. Solas, 1991, "Light-directed, spatially addressable parallel chemical synthesis", Science, 251, J.P. Pellois, W. Wang, X.L. Gao; 2000, "Peptide synthesis based on t-Boc chemistry and solution photogenerated acids", J. Comb. Chem., 2, 355-360) o sobre celulosa (R. Frank, 1992, "Spot synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support", Tetrahedron, 48, 9217-9232; A. Kramer y J. Schneider-Mergener, "Methods in Molecular Biology", vol. 87: "Combinatorial Peptide Library Protocols", pág. 25-39, editado por: S. Cabilly; Humana Press Inc., Totowa, NJ; Töpert, F., Oires, C., Landgraf, C., Oschkinat, H. y Schneider-Mergener, J., 2001, "Synthesis of an array comprising 837 variants of the hYAP WW protein domain", Angew. Chem. Int. Ed., 40, 897-900) o sobre polipropileno (M. Stankova, S. Wade, K.S. Lam, M. Lebl; 1994, "Synthesis of combinatorial libraries with only one representation of each structure", Pept. Res., 7, 292-298, F. Rasoul, F. Ercole, Y. Pham., C.T. Bui, Z.M. Wu, S.N. James, R.W. Trainor, G. Wickham, N.J. Maeji; 2000, "Grafted supports in solid-phase synthesis", Biopolymers, 55, 207-216, H. Wenschuh, R. Volkmer-Engert, M. Schmidt, M. Schulz, J. Schneider-Mergener, U. Reineke; 2000, "Coherent membrane supports for parallel microsynthesis and screening of bioactive peptides", Biopolymers, 55, 188-206) o sobre quitina W. Neugebauer, R.E. Williams, J.R. Barbier, R. Brzezinski, G. Willick; 1996, "Peptide synthesis on chitin", Int. J. Pept. Prot. Res., 47, 269-275) o sobre sefarosa (W. Tegge, R. Frank, 1997, "Peptide synthesis on Sepharose beads", J. Peptides Res., 49, 355-362, R. Gast, J. Glokler, M. Hoxter, M. Kiess, R. Frank, W. Tegge; 1999, "Method for determining protein kinase substrate specificities by the phosphorylation of peptide libraries on beads, phosphate-specific staining automated sorting, and sequencing", Anal. Biochem., 276, 227-241).
Reinecke et al., Current Opinion in Biotechnology 2001, 12, 1, 59-64 dan a conocer además el uso de membranas basadas en celulosa que presentan todas superficies porosas, y en MacBeath et al., Science 2000, 289, 5485, 1760-1763, se describen péptidos que se inmovilizan sobre una capa de moléculas de BSA, activándose a continuación químicamente las moléculas de BSA para posibilitar un acoplamiento de péptidos o proteínas pequeñas.
La presente invención se basa en el cometido de preparar un agente para el ensayo de especificidades de sustrato de actividades enzimáticas que sea adecuado por un lado para utilizar en un sistema de alto caudal y por otro lado con cantidades extremadamente pequeñas de actividad enzimática o volumen de muestra. Por consiguiente, es especialmente un cometido que el agente presente una relación mejorada señal-ruido frente a los agentes del estado de la técnica, especialmente las disposiciones de péptidos y proteínas allí descritas, designadas también como "matrices".
Otro cometido de la presente invención consiste en preparar un procedimiento para la preparación de dicho agente así como un procedimiento para la determinación de la especificidad de sustrato de una actividad enzimática y un procedimiento para la determinación de la selectividad de un principio activo.
Este cometido se consigue según la invención mediante un procedimiento para la determinación de la especificidad de sustrato de una actividad enzimática que comprende las siguientes etapas:
-
preparación de una disposición que comprende una pluralidad de secuencias de aminoácidos sobre una superficie plana de un material vehiculante, estando inmovilizadas ordenadamente las secuencias de aminoácidos,
-
puesta en contacto y/o incubación de una actividad enzimática con la disposición, y
-
análisis de una reacción entre una de las secuencias de aminoácidos inmovilizadas en la disposición y la actividad enzimática.
en el que se prevé que en la reacción de la actividad enzimática con la disposición se realice un cambio del peso molecular de al menos una de las secuencias de aminoácidos.
En una forma de realización, se prevé que el análisis de la reacción se realice en o utilizando la secuencia de aminoácidos inmovilizada sobre la superficie del material vehiculante.
En otra forma de realización, se prevé que el cambio de peso molecular se realice mediante la formación o escisión de un enlace covalente en una de las secuencias de aminoácidos, preferiblemente en aquella secuencia de aminoácidos que reacciona con la actividad enzimática.
En aún otra forma de realización, se prevé que el análisis de la reacción se realice mediante la detección del cambio de peso molecular.
Finalmente, se prevé en una forma de realización que el análisis se realice mediante un procedimiento de análisis que se selecciona del grupo que comprende autorradiografía, espectroscopia de resonancia de plasmón y espectroscopia de fluorescencia.
En una forma de realización, se prevé que al menos una de las secuencias de aminoácidos sea un sustrato para una actividad enzimática.
En otra forma de realización, se prevé que la disposición de secuencias de aminoácidos presente al menos un sustrato respectivamente para al menos dos actividades enzimáticas distintas.
En una forma de realización preferida, se prevé que la actividad enzimática seleccionada sea del grupo que comprende quinasas, sulfotransferasas, glicosiltransferasas, acetiltransferasas, farnesiltransferasas, palmitiltransferasas, fosfatasas, sulfatasas, esterasas, lipasas, acetilasas y proteasas.
En otra forma de realización, se prevé que el análisis de una reacción entre las secuencias de aminoácidos inmovilizadas sobre la disposición y la actividad enzimática se repita varias veces, preferiblemente en momentos separados.
En aún otra forma de realización, se prevé que se determine la actividad enzimática en una muestra, y la muestra se selecciona preferiblemente del grupo que comprende orina, líquido cefalorraquídeo, esputo, heces, líquido linfático, lisados celulares, lisados de tejido, lisados de órgano, extractos, extractos brutos, preparados purificados y preparados no purificados.
Para la consecución del cometido según la invención es necesario que la superficie sea una superficie no porosa
En otra forma de realización, se prevé que el material vehiculante sea vidrio.
En aún otra forma de realización, se prevé que la secuencia de aminoácidos esté inmovilizada sobre la superficie mediante un grupo que comprende azufre.
En un segundo aspecto, se consigue el cometido mediante una disposición de una pluralidad de secuencias de aminoácidos sobre una superficie, preferiblemente sobre la superficie de un vehículo en fase sólida, en la que las secuencias de aminoácidos están inmovilizadas ordenadamente sobre la superficie plana de un material vehiculante, representando al menos una de las secuencias de aminoácidos un sustrato para una actividad enzimática, en la que se realiza un cambio del peso molecular en el sustrato mediante la actividad enzimática.
En una forma de realización, se prevé que el cambio del peso molecular se realice mediante la formación o escisión de un enlace covalente en el sustrato.
En otra forma de realización, se prevé que la disposición de secuencias de aminoácidos presente al menos respectivamente un sustrato para al menos dos actividades enzimáticas distintas.
En aún otra forma de realización, se prevé que la superficie plana sea una superficie no porosa.
En una forma de realización, se prevé que el material vehiculante se seleccione del grupo que comprende silicatos, cerámica, vidrio, metal y materiales vehículo orgánicos.
En otra forma de realización, se prevé que las secuencias de aminoácidos se seleccionen del grupo que comprende péptidos, oligopéptidos, polipéptidos y proteínas, así como sus respectivos derivados.
En aún otra forma de realización, se prevé que cada secuencia de aminoácidos o grupo de secuencias de aminoácidos se disponga definidamente con respecto a otra secuencia de aminoácidos o grupos de secuencias de aminoácidos.
En otro aspecto, se consigue el cometido según la invención mediante un vehículo que comprende una disposición según la invención.
En una forma de realización, se prevé que el vehículo comprenda un material vehiculante básico.
En otra forma de realización, se prevé que la disposición de una pluralidad de secuencias de aminoácidos esté dispuesta sobre una o varias de las superficies del vehículo.
En otro aspecto, se consigue el cometido según la invención mediante una disposición vehiculante que comprende al menos dos de los vehículos según la invención, estando separados respectivamente los dos vehículos por un intersticio.
En una forma de realización, se prevé que al menos una disposición sobre un primer vehículo esté enfrentada con una disposición sobre un segundo vehículo.
En otra forma de realización, se prevé que el intersticio presente una anchura de aproximadamente 0,01 mm a 10 mm, preferiblemente de aproximadamente 0,1 mm a 2 mm, y preferiblemente de aproximadamente 0,5 mm a 1 mm.
En aún otro aspecto, se consigue el cometido según la invención mediante el uso de la disposición según la invención y/o un vehículo según la invención y/o una disposición vehiculante según la invención en un procedimiento según la invención.
La presente invención se basa en el sorprendente descubrimiento (véase la Fig. 12A) de que con una disposición de una pluralidad de secuencias de aminoácidos (Fig. 12A, B_{1}-B_{3}) sobre una superficie, previéndose especialmente que las secuencias de aminoácidos estén inmovilizadas ordenadamente sobre la superficie y que la superficie sea una superficie plana, la puesta en contacto de la disposición con una muestra que contiene un asociado de interacción potencial (Fig. 12A, C) para una o varias de las secuencias de aminoácidos comprendidas en la disposición, son suficientes cantidades muy pequeñas del asociado de interacción potencial, expresadas como unidades internacionales/volumen de líquido, para poder analizar un suceso de unión entre una o varias de las secuencias de aminoácidos y el asociado de interacción potencial. En el asociado de interacción potencial se trata preferiblemente de una actividad enzimática, y en el suceso de unión se trata de la formación del complejo necesario para una reacción catalítica de proteína activa enzimática y sustrato potencial. Con otras palabras, la disposición según la invención permite una mejora de la relación señal-ruido para dimensiones mayores frente a las disposiciones según el estado de la técnica, que se basan en la combinación especial de características de inmovilización ordenada en presencia de una superficie plana.
En el uso de superficies porosas, como es el caso por ejemplo del uso de celulosa o vidrio poroso, puede inmovilizarse por supuesto una cantidad muy grande de material en los presentes casos de secuencias de aminoácidos por unidad de superficie, lo que conduce a buenas intensidades de señal y a amplios intervalos con una señal de medida proporcional, pero al mismo tiempo la disponibilidad de una gran superficie causa una interacción inespecífica de las secuencias de aminoácidos con el material vehiculante, lo que conduce a señales de fondo más altas. Además, dichas superficies porosas necesitan esencialmente más material para la formación de la disposición o para el recubrimiento de uno de los materiales vehiculantes que portan la disposición, es decir, mayores cantidades de cada una de las distintas secuencias de aminoácidos. Igualmente, la superficie porosa causa que sea necesario más material de muestra para el propio proceso de análisis. En el material de muestra se trata de un material tal que contenga un posible asociado de interacción para una o varias de las secuencias de aminoácidos. Pero este aumento de material de muestra no va a compensarse en todos los casos aplicando un volumen de muestra mayor, sino que muchas veces puede ser necesario tener que aumentar la cantidad específica del asociado de interacción potencial en la muestra que se pone en contacto o debe ponerse en contacto con la disposición. Esto requeriría una purificación del material de muestra a analizar, pero con dichas purificaciones aparecen a menudo pérdidas no desdeñables, de modo que el uso de superficies porosas en disposiciones de moléculas sobre superficies no es adecuado para analizar asociados de interacción cuya concentración en una muestra sea comparativamente baja. En el asociado de interacción potencial se trata de una actividad enzimática (incluyendo en la presente memoria en general enzimas y cualquier molécula activa catalítica, por ejemplo también ácidos nucleicos activos catalíticos), de modo que puede darse la situación de que determinadas actividades enzimáticas no puedan determinarse utilizando disposiciones según el estado de la técnica por la influencia de la purificación o concentración necesarias del material de muestra o del asociado de interacción, es decir de la actividad enzimática específica. Esto representa una limitación elevada del uso de disposiciones que comprenden secuencias de aminoácidos en cuanto que a menudo aquellas actividades enzimáticas que son de importancia biológica crucial cuantitativamente en una muestra no son necesariamente predominantes. Con la disposición según la invención, pueden analizarse por tanto por ejemplo disgregados celulares sin tratamiento adicional en el sentido de un procesamiento, y determinarse el asociado de interacción enzimática así obtenido con una baja actividad específica.
Una desventaja adicional del uso de superficies porosas consiste en que en ellas actúan fuerzas capilares forzadas que impiden la miniaturización, como es necesario especialmente para sistemas de alto rendimiento. Con otras palabras, con el uso de sistemas de vehículo poroso es alcanzable sólo una densidad determinada de secuencias de aminoácidos en una disposición. En este momento, estos límites parecen encontrarse en el caso de la celulosa a 100/cm^{2} a consecuencia de las propiedades fisicoquímicas basadas en la porosidad.
Pero, por otro lado, el uso de superficies planas solas no es en cambio adecuado para preparar una disposición que destaque en el intervalo de las intensidades de señal y especialmente las relaciones señal-ruido alcanzables con la disposición según la invención, puesto que aquí la capacidad de carga es a menudo el factor limitante. Los intentos de evitar estas limitaciones aplicando geles de poliacrilamida a superficies planas no porosas con anchura de poro definida no condujeron al éxito deseado, puesto que aquí se introdujeron de nuevo adicionalmente las citadas desventajas de las membranas porosas.
Con la presente invención, se abre un camino en la construcción de disposiciones de una pluralidad de secuencias de aminoácidos sobre una superficie que no solo prescinde del aspecto de la superficie, sino también del tipo específico de inmovilización de las secuencias de aminoácidos contenidas en la disposición, y explica así su sorprendente rendimiento. A este respecto, la superficie plana necesita únicamente una cantidad comparativamente pequeña de las distintas secuencias de aminoácidos, que además representan a consecuencia de su inmovilización orientada sobre la superficie asociados de interacción óptimos, especialmente sustratos para actividades enzimáticas, de modo que pesar de la capacidad de carga comparativamente menor a consecuencia de las superficies lisas, es decir preferiblemente no porosas, se consiguen sin embargo señales significativas y, causado igualmente por las superficies planas, no aparece absorción inespecífica ni por tanto un empeoramiento de la relación señal-ruido. Como se representa mediante el cálculo del modelo dado en los ejemplos, mediante la combinación de estas dos características de la disposición según la invención se consigue una mejora de la relación señal-ruido por un factor de 3000, como se observa también en las Fig. 3 y 4.
En la disposición según la invención de una pluralidad de secuencias de aminoácidos sobre una superficie, la superficie funciona en cierto modo como sustrato sobre el que se inmovilizan las secuencias de aminoácidos. La inmovilización puede realizarse de modo que se realice covalentemente. Además de la inmovilización covalente, son sin embargo posibles otras formas de inmovilización, especialmente la inmovilización adsortiva o la inmovilización mediante sistemas de interacción específicos. En la inmovilización se prefiere especialmente la inmovilización covalente, realizándose aquí una unión quimioselectiva de la secuencia de aminoácidos en la superficie del material vehiculante. Para ello, pueden utilizarse una serie de reacciones que son conocidas como tales por el experto en este campo (Lemieux, G.A. y Bertozzi, C.R., 1998, "Chemoselective ligation reactions with proteins, oligosaccharides and cells", TIBTECH, 16, 506-513, véase para ello la Fig. 11). En general, con vistas a la inmovilización orientada necesaria, debe asegurarse que se prepara en las respectivas condiciones de reacción esencialmente sólo un enlace especial entre la secuencia de aminoácidos y la superficie (Fig. 12, engarce A). La selección de los grupos reactivos a los lados de las secuencias de aminoácidos depende por tanto esencialmente de la secuencia individual. Es una alternativa en el campo de la presente invención que una de todas las secuencias de aminoácidos presente una estructura terminal individual, y que esta estructura terminal ponga a disposición la reacción específica con la superficie, especialmente una superficie activada (Fig. 12, engarce A). Típicamente, no afectan a las reacciones quimioselectivas en la secuencia de aminoácidos que contiene grupos amino o carboxilo. Son ejemplos de reacciones adecuadas la formación de tioéteres a partir de ácidos halocarboxílicos y tioles, de tioéteres a partir de tioles y maleinimidas, de enlaces amida a partir de tioésteres y 1,2-aminotioles, de enlaces tioamida a partir de ditioésteres y 1,2-aminotioles, de tiazolidinas a partir de aldehídos y 1,2-aminotioles, de oxazolidinas a partir de aldehídos/cetonas y 1,2-aminoalcoholes, de imidazoles a partir de aldehídos/cetonas y 1,2-diaminas (véase para ello también la Fig. 11), de tiazoles a partir de tioamidas y alfa-halocetonas, de aminotiazoles a partir de compuestos aminooxi y alfaisotiocianatocetonas, de oximas a partir de compuestos aminooxi y cetonas, de hidrazonas a partir de hidrazinas y aldehídos, de hidrazonas a partir de hidrazidas y cetonas. A este respecto, los restos R1-R5 mostrados en la Fig. 11 o los restos en las reacciones quimioselectivas citadas anteriormente pueden ser restos alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo o arilo o heterociclos, representando alquilo restos alquilo C_{1-20} ramificado y no ramificado o cicloalquilo C_{3-20}, preferiblemente alquilo C_{1-12} ramificado y no ramificado o cicloalquilo C_{3-12}, y de forma especialmente preferida alquilo C_{1-6} ramificado y no ramificado o cicloalquilo C_{3-6}. Alquenilo representa restos alquenilo C_{2-20} ramificado y no ramificado, alquil C_{1-20}-O-alquenilo C_{2-20} ramificado y no ramificado, alquenil C_{1-20}(-O/S-C_{2-20})_{2-20}, arilalquenilo C_{2-20}, heterociclilalquenilo C_{2-20} ramificado y no ramificado o cicloalquenilo C_{3-20}, preferiblemente alquenilo C_{2-12} ramificado y no ramificado o alquenil C_{1-12}(-O/S-C_{2-12})_{2-12} ramificado y no ramificado, de forma especialmente preferida alquenilo C_{2-6} ramificado y no ramificado o alquenil C_{1-6}(-O/S-C_{2-8})_{2-8} ramificado y no ramificado; alquinilo representa restos alquinilo C_{2-20} ramificado y no ramificado o alquinil C_{1-20}(-O/S-C_{2-20})_{2-20}, preferiblemente alquinilo C_{2-12} ramificado y no ramificado o alquinil C_{1-12}(-O/S-C_{2-12})_{2-12} ramificado y no ramificado, de forma especialmente preferida alquinilo C_{2-6} ramificado y no ramificado o alquinil C_{1-6}(-O/S-C_{2-8})_{2-8} ramificado y no ramificado; cicloalquilo representa restos cicloalquilo C_{3-40} con puente y sin puente, preferiblemente cicloalquilo C_{3-26} con puente y sin puente, de forma especialmente preferida cicloalquilo C_{3-15} con puente y sin puente; arilo representa restos fenilo, pentalenilo, azulenilo, antracenilo, indacenilo, acenaftilo, fluorenilo, fenalenilo, fenantrenilo sustituidos y no sustituidos, mono- o multi-enlazados, preferiblemente fenilo, pentalenilo, azulenilo, antracenilo, indenilo, indacenilo, acenaftilo, fluorenilo sustituidos y no sustituidos, mono- o multi-enlazados, de forma especialmente preferida fenilo, pentalenilo, antracenilo sustituidos y no sustituidos, mono- o multi-enlazados, así como sus derivados parcialmente hidrogenados. Los heterociclos pueden ser anillos mono-, bi- y tricíclicos de 3-15 miembros insaturados y saturados con 1-7 heteroátomos, preferiblemente anillos mono-, bi- y tricíclicos de 3-10 miembros con 1-5 heteroátomos, y de forma especialmente preferida: anillos mono-, bi- y tricíclicos de 5, 6 y 10 miembros con 1-3 heteroátomos.
Además, pueden presentarse en alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, heteroátomos, heterociclos, biomoléculas o sustancias naturales de 0 a 30 (preferiblemente de 0 a 10, de forma especialmente preferida de 0 a 5) de los siguientes sustituyentes individualmente o en combinación entre sí: flúor, cloro, bromo, yodo, hidroxilo, amida, éster, ácido, amina, acetal, cetal, tiol, éter, fosfato, sulfato, sulfóxido, peróxido, ácido sulfónico, tioéter, nitrilo, urea, carbamato; prefiriéndose los siguientes: flúor, cloro, bromo, hidroxilo, amida, éster, ácido, amina, éter, fosfato, sulfato, sulfóxido, tioéter, nitrilo, urea, carbamato; y de forma especialmente preferida: cloro, hidroxilo, amida, éster, ácido, éter, nitrilo.
Por inmovilización orientada debe entenderse aquí especialmente que cada secuencia de aminoácidos está unida mediante un grupo reactivo definido o un conjunto de grupos reactivos a la superficie. A consecuencia de esta especificidad de unión, se consigue que en el marco de la entropía convencional las secuencias de aminoácidos individuales se encuentren en un estado energético preferido, de modo que dichas secuencias de aminoácidos inmovilizadas presenten estructuras secundarias y terciarias en gran parte similares.
Por la expresión "disposición de una pluralidad de secuencias de aminoácidos" se entiende aquí especialmente que cada una de esas secuencias de aminoácidos se inmoviliza en un lugar determinado sobre una superficie. Preferiblemente, a este respecto puede identificarse cada uno de estos lugares. Por lugares, se trata por tanto de lugares distintos de en los que esencialmente se inmoviliza respectivamente una especie de secuencia de aminoácidos. Con otras palabras, existe un mapa del que pueden extraerse los sitios de cada secuencia de aminoácidos inmovilizada sobre la superficie. La secuencia de aminoácidos individual puede representar a este respecto una pluralidad de moléculas, pero respecto a su secuencia de aminoácidos, es decir el tipo y orden de los aminoácidos que las forman, son esencialmente idénticas. La identidad de las secuencias de aminoácidos se determina esencialmente mediante el procedimiento de preparación de secuencias de aminoácidos. Está en el marco de la presente invención que las secuencias de aminoácidos se sinteticen in situ sobre la superficie de la disposición, siendo aquí concebibles todas las formas posibles, es decir, adiciones secuenciales de los aminoácidos individuales que forman la secuencia de aminoácidos, así como el uso de técnicas de síntesis en bloque en las que se unen agrupaciones de aminoácidos y después se yuxtaponen secuencialmente los bloques individuales y se inmovilizan los bloques o yuxtaposiciones después, o se añaden a secuencias de aminoácidos ya inmovilizadas.
Es comprensible para el experto que, a consecuencia de los rendimientos no siempre completos de las etapas de síntesis o etapas de acoplamiento individuales, puedan crearse heterogeneidades conocidas en las distintas secuencias de aminoácidos en el sentido descrito anteriormente. Especialmente en las síntesis que necesitan muchas etapas de reacción, como es el caso de la síntesis de secuencias de aminoácidos (una reacción de acoplamiento y una escisión de grupo protector por unidad de aminoácido y al final de la síntesis en general una reacción para la escisión simultánea de todos los grupos protectores de las funciones de las cadenas laterales), puede representar un problema. Así, por ejemplo, en la síntesis de una secuencia de aminoácidos que está compuesta por 20 unidades de aminoácido o 40 unidades de aminoácido, y un rendimiento medio admitido de un 95% para las 41 u 81 etapas de reacción necesarias, el rendimiento teórico esperable es sólo de 0,95^{41} = 0,122 (12,2%) o de 0,95^{81} = 0,0157 (1,57%). Incluso con un rendimiento medio admitido de un 99%, para los ejemplos citados anteriormente proporciona sólo un 66,2% o un 44,3%. Por tanto resulta evidente que en las reacciones enzimáticas a investigar, a consecuencia de estas limitaciones, se presentan en gran cantidad además de la secuencia de aminoácidos deseada otras secuencias de aminoácidos que se caracterizan por la falta de una o más unidades de aminoácido. Precisamente estos productos secundarios conocidos por el experto como secuencias incompletas o troncales, en ciertas circunstancias pueden falsear en gran medida el resultado de la incubación de la actividad enzimática modificante de una de las secuencias de aminoácidos dispuestas sobre la superficie o dificultar la interpretación de los resultados. Por ejemplo, en la inmovilización de un sustrato para una quinasa sobre o en una superficie utilizando los grupos amino contenidos en este sustrato, pueden existir varias posibilidades de reacción (dependiendo del número de grupos amino presentes en el compuesto a inmovilizar), y por tanto de orientación válida final del compuesto sobre la superficie. A este respecto, si en la incubación conectada a continuación de este compuesto inmovilizado (sustrato de quinasa) con un fluido biológico que contiene al menos una actividad quinasa, es necesario precisamente uno o varios de estos grupos amino para la formación eficaz de un complejo enzima/sustrato, dicha inmovilización inespecífica puede conducir a que sólo una pequeña población del sustrato inmovilizado esté anclado del modo correcto, y por tanto la señal de medida se encuentre por debajo del límite de detección. Así, una inmovilización específica o también orientada es una gran ventaja. Aquí, en un suceso de inmovilización se realiza el contacto entre el compuesto a inmovilizar y la superficie sobre o en la que se inmoviliza el compuesto respectivamente del mismo modo, y todos los compuestos están unidos con una orientación definida y previsible sobre o en la superficie.
La pluralidad de secuencias de aminoácidos está constituida por al menos dos secuencias de aminoácidos diferentes. Puede preverse que la secuencia de aminoácidos inmovilizada en un sitio distinto se encuentre en otro sitio de la superficie. Esto puede realizarse por ejemplo con fines de control.
En la superficie plana puede tratarse de aquella que se orienta esencialmente en dos dimensiones. Especialmente, según la presente invención no se prevé que la superficie que porta una pluralidad de secuencias de aminoácidos presente una superficie esférica o una parte esencial de una de ellas. En la formación de la superficie plana se prefiere a este respecto que los distintos lugares en los que se inmoviliza una secuencia de aminoácidos individual no estén separados, o al menos no esencialmente, mediante una estructura tridimensional de otros lugares distintos de la superficie.
Como materiales para la superficie, o como materiales vehiculantes que pueden portar las disposiciones según la invención, pueden utilizarse en el marco de la presente invención todos los materiales biocompatibles, funcionalizados o funcionalizables. Estos materiales pueden presentarse por ejemplo en forma de placas vehiculantes (bloques monolíticos), membranas, películas o laminados. Son materiales adecuados a este respecto poliolefinas, como por ejemplo polietileno, polipropileno, poliolefinas halogenadas (PVDF, PVC, etc.) así como politetrafluoroetileno. Como parte de los materiales inorgánicos pueden utilizarse por ejemplo cerámica, silicato, silicio y vidrio. Aunque se prefieren placas vehiculantes no metálicas, está también dentro del alcance de la presente invención utilizar materiales vehiculantes metálicos, a pesar de su tendencia a la formación de efectos de adsorción inespecífica potenciales. Son ejemplos de dichos materiales oro u óxidos metálicos, como por ejemplo óxido de titanio.
Independientemente del material seleccionado realmente, prefiriéndose especialmente el vidrio, es esencial para la presente invención que la superficie sea de naturaleza no porosa y que no aparezcan, o no esencialmente, fuerzas capilares en la superficie.
En la formación de la disposición, existen una serie de posibilidades en la configuración de la superficie propiamente dicha, es decir la superficie plana que porta la pluralidad de secuencias de aminoácidos. Básicamente es posible que la superficie en la que se realiza la inmovilización orientada de las secuencias inmovilizadas represente al mismo tiempo el material vehiculante. Pero también es posible que la superficie reactiva sea distinta del material vehiculante. Se da por ejemplo uno de dichos escenarios cuando el material formado de superficie (plana) se presenta en forma de una película que, después, se aplica a otro material vehiculante básico no en último lugar con fines de estabilización.
Con fines de inmovilización orientada, especialmente cuando ésta se realiza mediante unión covalente de las secuencias de aminoácidos a un material vehiculante, la superficie de la placa vehiculante puede funcionalizarse. Básicamente, son posibles varias funcionalizaciones sucesivas, pero también puede no tener lugar una funcionalización dependiendo del material vehiculante seleccionado.
Puede realizarse una primera funcionalidad, que ya es adecuada para efectuar una unión covalente de las secuencias de aminoácidos a la superficie, en la preparación de grupos amino y/o carboxilo como grupos reactivos. Una de dichas funcionalizaciones se designa aquí también como primera funcionalización, independientemente de la naturaleza química de los grupos reactivos aplicados. La obtención de grupos carboxilo puede realizarse, por ejemplo partiendo de poliolefinas como el material de superficie a preparar, mediante oxidación con ácido crómico. Como alternativa, esto puede efectuarse por ejemplo mediante reacción a alta presión con cloruro de oxalilo así como oxidación plasmática, adición radicálica o fotoinducida de ácido acrílico y similares. Los materiales halogenados como poliolefinas halogenadas pueden conducir, mediante procesos de eliminación catalizados por bases que conducen a dobles enlaces en la superficie, tanto a la obtención de grupos reactivos amino como carboxi, funcionalizándose a continuación los dobles enlaces reactivos con carboxi o amino.
La cerámica, los vidrios, el óxido de silicio y el óxido de titanio pueden funcionalizarse fácilmente con una pluralidad de silanos sustituidos obtenibles comercialmente, como por ejemplo aminopropiltrietoxisilano. Las placas vehiculantes con grupos hidroxilo sobre la superficie se modifican mediante una pluralidad de reacciones. Se prefieren ventajosamente reacciones con biselectrófilos, como por ejemplo la carboximetilación directa con ácido bromoacético; la acilación con un derivado de aminoácido correspondiente, como por ejemplo el acoplamiento de carbodiimida catalizado con dimetilaminopiridina con ácido fluorenilmetoxicarbonil-3-aminopropanoico o la generación de iso(tio)cianatos mediante monorreacción con los correspondientes bisiso(tio)cianatos. Es un procedimiento especialmente ventajoso la reacción con carbonildiimidazol o fosgeno o trifosgeno o cloroformiato de p-nitrofenilo o tiocarbonildiimidazol, seguido por la reacción con diamina o diaminas protegidas una vez, para fijar funciones amino mediante un enlace uretano estable sobre la superficie de los materiales vehiculantes.
Según la presente invención, puede preverse que las secuencias de aminoácidos inmovilizadas sobre la superficie presenten un separador. Dichos separadores son especialmente preferidos cuando las secuencias de aminoácidos son el sustrato de actividades enzimáticas que deben ocupar una estructura espacial determinada para así ser accesibles a la actividad enzimática. A consecuencia del uso de dicho separador, referido aquí también como "espaciador", las secuencias de aminoácidos consiguen que el sustrato mismo pueda presentar ante la actividad o actividades indicadas grados de libertad adicionales, y aparecen fenómenos de superficie como adsorción, cambio del grado de libertad termodinámico, etc. Un separador puede ser esencialmente cualquier molécula, especialmente aquella molécula biocompatible que contiene al menos dos grupos funcionales o funcionalizables. El separador se introduce como elemento entre la superficie y la secuencia de aminoácidos en las condiciones utilizadas.
Como separadores son adecuadas las siguientes clases de compuesto:
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Alcanos, ramificados o no ramificados, especialmente aquellos con una longitud de cadena de C2 a C30, especialmente de C4 a C8.
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Poliéteres, es decir, polímeros de poli(óxido de etileno) o de poli(óxido de propileno), estando compuesto preferiblemente el poliéter por 1 a 5 unidades de poli(óxido de etileno) o unidades de poli(óxido de propileno).
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Polialcoholes, ramificados o no ramificados, como poliglicol y derivados del mismo, como por ejemplo O,O'-bis-(2-aminopropil)polietilenglicol 500 y 2,2'-(dióxido de etileno)dietilamina,
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Poliuretanos, polihidroxiácidos, policarbonatos, poliimidas, poliamidas, poliésteres, polisulfonas, especialmente aquellos compuestos por 1-100 unidades monoméricas, de forma muy especialmente preferida, compuestos por 1-10 unidades monoméricas,
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Combinaciones de los alcanos citados anteriormente con los poliéteres citados anteriormente: poliéteres, poliuretanos, polihidroxiácidos, policarbonatos, poliimidas, poliamidas, poliaminoácidos, poliésteres y polisulfonas,
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Diaminoalcanos, ramificados o no ramificados, preferiblemente aquellos con una longitud de cadena de C2 a C30, de forma muy especialmente preferida aquellos con una longitud de cadena de C2 a C8; se citan como ejemplos 1,3- diaminopropano, 1,6-diaminohexano y 1,8-diaminooctano, así como sus combinaciones con poliéteres, preferiblemente con los poliéteres citados anteriormente, como por ejemplo 1,4-bis(3-aminopropoxi)butano,
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Acidos dicarboxílicos y sus derivados, como por ejemplo ácidos hidroxi-, mercapto- y aminodicarboxílicos, saturados o insaturados, ramificados o no ramificados, especialmente ácidos dicarboxílicos C2 a C30, preferiblemente aquellos con una longitud de cadena de C2 a C10, de forma muy especialmente preferida aquellos con una longitud de cadena de C2 a C6, como por ejemplo ácido succínico y ácido glutárico; y
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Aminoácidos y péptidos, preferiblemente con una longitud de 1-20 restos aminoácidos, de forma muy especialmente preferida con una longitud de 1-3 restos aminoácidos, por ejemplo trímeros de lisina, dímeros de ácido 3-aminopropiónico y ácido 6-aminocaproico monomérico.
Básicamente, es posible que el separador presente dos extremos funcionales a consecuencia de los hechos, seleccionándose estas funcionalidades de modo que las secuencias de aminoácidos a inmovilizar sobre la superficie se inmovilicen mediante su extremo C o su extremo N o mediante otra agrupación funcional dentro de la secuencia de aminoácidos a inmovilizar. En el caso de realizarse una inmovilización mediante el extremo C, el grupo funcional que ataca al extremo C del separador es preferiblemente un grupo amino. En el caso de inmovilizarse las secuencias de aminoácidos mediante el extremo N a la superficie, el grupo funcional correspondiente del separador es un grupo carboxilo.
En la disposición según la invención, puede preverse que el separador sea un separador ramificado. Dichos separadores ramificados se designan también como estructuras dendriméricas o resumiendo dendrímeros, y son conocidas por el experto en el campo. Las estructuras dendriméricas para inmovilización de ácidos nucleicos se describen por ejemplo en Beier M. y Hoheisel, J.D., 1999, "Versatile derivatisation of solid support media for covalent bonding on DNA-microchips", 9, 1970-1977. La función de dichas estructuras dendriméricas consiste en aumentar el número de grupos reactivos por unidad de superficie y por tanto la intensidad de señal. Las estructuras dendriméricas pueden proporcionarse con casi todos los grupos funcionales o funcionalizables que permitan después una inmovilización de las secuencias de aminoácidos. Como consecuencia del uso de dichas estructuras dendriméricas, el número de grupos reactivos por unidad de superficie de la superficie plana puede aumentar por un factor de 2 a 100, preferiblemente por un factor de 2 a 20, y preferiblemente por un factor de 2 a 10.
La formación de una estructura dendrimérica puede efectuarse, por ejemplo en el caso de presencia en la superficie de una funcionalidad amino, mediante una serie de reacciones que se preparan mediante una acilación con ácido acrílico o derivados de ácido acrílico como por ejemplo cloruro de ácido acrílico, o ácidos alfabromocarboxílicos o derivados de ácidos alfabromocarboxílicos como por ejemplo bromuro de bromoacetilo, poliaminas adecuadas para la adición de Michael como por ejemplo tetraetilpentamina, a continuación una nueva acilación con ácido acrílico o derivados de ácido acrílico como por ejemplo cloruro de ácido acrílico o ácidos alfabromocarboxílicos o derivados de ácidos alfabromocarboxílicos como por ejemplo bromuro de bromoacetilo, y de nuevo adición de Michael de poliaminas. Las poliaminas se seleccionan preferiblemente de modo que sean ellas mismas hidrófilas para aumentar la hidrofilia de la superficie. Es un ejemplo de dicha poliamina el 1,4-bis-(3-aminopropoxi)butano.
Además de la primera funcionalización de la superficie, puede realizarse una segunda funcionalización que se dispone sobre la primera funcionalización. Con otras palabras, el grupo reactivo de la superficie se funcionaliza de nuevo mediante medidas adicionales. Esta segunda funcionalización puede realizarse a este respecto directamente en la superficie funcionalizada, en la superficie provista de un separador o en una estructura dendrimérica.
Puede observarse una razón para la segunda funcionalización porque, a consecuencia de los grupos amino y carboxilo, funciones tiol, funciones imidazol y funciones guanido presentes también en las secuencias de aminoácidos, no se consigue ninguna inmovilización individual respecto a la orientación de la secuencia de aminoácidos sobre la superficie. Una segunda funcionalización ofrece el acceso a otras reacciones quimioselectivas para alcanzar una inmovilización orientada.
Para esta segunda funcionalización son adecuados todos aquellos compuestos que se caractericen por la presencia de grupos funcionales no proteinogénicos. Se citan por ejemplo los siguientes compuestos: compuestos maleinimido como maleinimidoamina o ácidos maleinimidocarboxílicos; alfahalocetonas como ácido bromopirúvico o 4-carboxialfabromoacetofenona; alfaisotiocianatocetonas como 4-carboxialfaisotiocianatoacetofenona; aldehídos como carboxibenzaldehído; cetonas como ácido lavulánico; tiosemicarbazidas; tioamidas como monotioamida de ácido succínico; ácidos alfabromocarboxílicos como ácido bromoacético; hidrazinas como ácido 4-hidrazinobenzoico; O-alquilhidroxilaminas como ácido aminooxiacético e hidrazidas como monohidrazida de ácido glutárico.
Como otras medidas, puede preverse en la formación de la disposición según la invención que se bloqueen aquellos sitios o intervalos de superficie que no estén provistos con una secuencia de aminoácidos. Mediante el bloqueo se asegura que, durante o después de la reacción quimioselectiva de las secuencias de aminoácidos con las superficies eventualmente funcionalizadas todavía no reaccionadas, se inactiven agrupaciones o grupos todavía reactivos sobre la superficie. Esta reacción de bloqueo es necesaria, puesto que si no la actividad enzimática añadida u otros componentes de la muestra biológica utilizada reaccionan inespecíficamente con estos grupos reactivos todavía no bloqueados sobre la superficie y pueden proporcionar así eventualmente una alta señal de fondo. Dichas reacciones inespecíficas con las superficies son una causa frecuente de relación señal-ruido inadecuada en análisis bioquímicos. Para este bloqueo son adecuados aquellos compuestos que no tienen impedimentos estéricos, que reaccionan muy bien con los grupos a bloquear y que generan las propiedades de superficie más adecuadas posibles. La selección de estos compuestos depende del tipo de muestra o del asociado de interacción que entra en interacción con una de las secuencias de aminoácidos. El compuesto se forma hidrófilo cuando es conocido que la actividad enzimática se une preferiblemente inespecíficamente a superficies hidrófobas, e hidrófobo cuando es conocido que la actividad enzimática se une preferiblemente inespecíficamente a superficies hidrófilas. Así, es conocido por el experto que una biomolécula como por ejemplo una proteína necesita una estructura tridimensional definida exactamente para su correcta función biológica. Esta estructura terciaria depende claramente del entorno. Así, una proteína en agua como disolvente hidrófilo, posee la tendencia de ocultar todas o las más posibles de las agrupaciones hidrófobas en el interior. Si se dispone dicha proteína en un entorno hidrófobo (superficie hidrófoba), puede llegarse por tanto al desplegamiento o plegamiento de la proteína y así a su inactivación. Por otro lado, son conocidas proteínas que en su medio natural se presentan en el interior de biomembranas (hidrófobas). Dichas proteínas se desplegarían en contacto con una superficie hidrófila y por tanto se desnaturalizan o inactivan. En dicho caso, es deseable una superficie hidrófoba.
Los componentes de las secuencias de aminoácidos de la disposición según la invención son aminoácidos que se seleccionan preferiblemente del grupo que comprende L- y D-aminoácidos. Además, los aminoácidos pueden seleccionarse del grupo que comprende los aminoácidos naturales y no naturales. Son un grupo preferido dentro de cualquiera de los grupos anteriores de aminoácidos los correspondientes alfa-aminoácidos. Las secuencias de aminoácidos pueden estar compuestas por una serie de aminoácidos de cualquiera de los grupos anteriores. Así, por ejemplo una combinación de D- y L-aminoácidos está dentro del alcance de la invención, así como secuencias de aminoácidos que están compuestas exclusivamente por D- o L-aminoácidos. Los componentes de las secuencias de aminoácidos pueden comprender además otras moléculas como aminoácidos. Son ejemplos de ellos tioxoaminoácidos, hidroxiácidos, mercaptoácidos, ácidos dicarboxílicos, diaminas, ácidos ditioxocarboxílicos, ácidos y aminas. Son una forma adicional de secuencias de aminoácidos derivatizadas los denominados PNA (ácidos nucleicos peptídicos en inglés).
La densidad de las secuencias de aminoácidos es de 1/cm^{2} a 2000/cm^{2}, siendo preferiblemente la densidad de 5/cm^{2} a 1000/cm^{2}, y siendo muy preferiblemente de 10/cm^{2} a 400/cm^{2}. Dichas densidades de distintos lugares sobre una superficie que pueden contener correspondientemente una especie aminoacídica se consiguen utilizando distintas técnicas, por ejemplo con pipetas automatizadas accionadas piezoeléctricamente, con agujas finas de distintos materiales como polipropileno, acero fino o volframio o las correspondientes aleaciones, con las denominadas "herramientas de aguja" que representan agujas escindidas o están compuestas por un anillo que contiene la mezcla de sustancias a aplicar y una aguja mediante la que se deposita la mezcla de sustancias contenida en este anillo sobre la correspondiente superficie. Pero también son adecuados para ello capilares unidos a una jeringuilla accionada a motor (punteador). Otra posibilidad consiste en aplicar la muestra a inmovilizar mediante un punzonado adecuado. Pero también es posible la aplicación de las secuencias de aminoácidos a inmovilizar mediante pipetas adecuadas o las denominadas multipipetas a mano. Además, es posible obtener las densidades dadas anteriormente en distintos lugares mediante la síntesis directa in situ de las secuencias de aminoácidos sobre la superficie (M. Stankova, S. Wade, K.S. Lam, M. Lebl; 1994; "Synthesis of combinatorial libraries with only one representation of each structure", Pept. Res., 7, 292-298, F. Rasoul, F. Ercole, Y. Pham., C.T. Bui, Z.M. Wu, S.N. James, R.W. Trainor, G. Wickham, N.J. Maeji; 2000, "Grafted supports in solid-phase synthesis", Biopolymers, 55, 207-216, H. Wenschuh, R. Volkmer-Engert, M. Schmidt, M. Schulz, J. Schneider-Mergener, U. Reineke; 2000, "Coherent membrane supports for parallel microsynthesis and screening of bioactive peptides", Biopolymer, 55, 188-206, R. Frank, 1992, "Spot synthesis: an easy technique for the positionally addressable, parallel chemical synthesis on a membrane support", Tetrahedron, 48, 9217-9232; A. Kramer y J. Schneider-Mergener, Methods in Molecular Biology, vol. 87: "Combinatorial Peptide Library Protocols", pág. 25-39, editado por: S. Cabilly; Humana Press Inc., Totowa, NJ; Töpert, F., Oires, C., Landgraf, C., Oschkinat, H. y Schneider-Mergener, J., 2001, "Synthesis of an array comprising 837 variants of the hYAP WW protein domain", Angew. Chem. Int. Ed., 40, 897-900, S.P.A. Fodor, J.L. Read, M.C. Pirrung, L. Stryer, A.T. Lu, D. Solas; 1991, "Light-directed, spatially addressable chemical synthesis", Science, 251, J.P. Pellois, W. Wang, X.L. Gao; 2000, "Peptide synthesis based on t-Boc chemistry and solution photogenerated acids", J. Comb. Chem., 2, 355-360).
En una forma de realización preferida de la disposición según la invención y sus distintos usos y empleos, se prevé que las distintas secuencias de aminoácidos sean sustratos o posibles sustratos de actividades enzimáticas que están contenidas como asociados de interacción en muestras frente a las que se expone la disposición según la invención. Por actividades enzimáticas se entienden en general aquí aquellas actividades enzimáticas que se caracterizan porque transfieren un grupo atómico, una molécula o un grupo molecular a una molécula. A este respecto, han de entenderse aquí como actividades enzimáticas especialmente quinasas, sulfotransferasas, glicosiltransferasas, acetiltransferasas, farnesiltransferasas, palmitiltransferasas, fosfatasas, sulfatasas, esterasas, lipasas, acetilasas y proteasas. La actividad enzimática cambia correspondientemente eventualmente una o varias de las secuencias de aminoácidos de la disposición, así como uno o varios de los aminoácidos del chip, respecto al peso molecular. Dicho cambio del peso molecular puede consistir en sí en una reducción o un aumento, y ocasiona otros cambios de las propiedades fisicoquímicas de las secuencias de aminoácidos o de los distintos lugares en los que se encuentra respectivamente una especie de secuencia de aminoácidos.
El análisis de que se realice un suceso de unión en una o varias de las distintas especies de secuencias de aminoácidos y, en el caso de que el asociado de interacción de la secuencia de aminoácidos sea una actividad enzimática o porte ésta, una reacción enzimática en la secuencia de aminoácidos correspondiente, puede realizarse a este respecto utilizando distintas técnicas que son conocidas por el experto. Así, es posible seguir una reacción de escisión, por ejemplo mediada por una proteasa, mediante el cambio de fluorescencia de una molécula sustrato unida a la superficie adecuada. Principalmente, pueden seguirse todas las reacciones en las que cambie el peso molecular de la molécula unida a la superficie mediante la transferencia de otras moléculas (cosustratos) mediante la introducción de un marcador radiactivo en el cosustrato. Para ello, debe cuantificarse la radiactividad introducida en la molécula modificada unida a la superficie después de realizada la reacción. Con ayuda de dichos marcadores radiactivos, pueden caracterizarse todas las transferasas, como por ejemplo quinasas, acetiltransferasas, farnesiltransferasas y glicosiltransferasas, respecto a su actividad enzimática. Como alternativa, pueden analizarse mediante reacciones específicas acopladas grupos reactivos no presentes anteriormente procedentes de la secuencia de aminoácidos respectiva por la reacción enzimática respectiva. Por ejemplo, puede analizarse mediante una reacción acoplada con reactivo de Ellman una función mercapto obtenida después de una reacción enzimática.
Está en el marco de la presente invención que la disposición comprende un número conocido de distintas especies aminoacídicas. A este respecto, puede preverse que se proporcionan las mismas especies aminoacídicas en varios lugares distintos sobre la superficie o el material vehiculante. Así, puede realizarse por un lado un patrón interno, pero por otro lado se representan e incluyen también los posibles efectos de contorno.
Otra formación de la disposición según la invención prevé que al menos dos o más de las disposiciones se ensamblan de modo que entre ambas disposiciones queda sólo un intersticio muy pequeño en el que se extienden las secuencias de aminoácidos de ambas disposiciones (véase la Fig. 12B). Esta formación se caracteriza también aquí como disposición vehiculante. Así, se abre una posibilidad de llevar a cabo una pluralidad de ensayos con un volumen de muestra muy pequeño. La anchura del intersticio es a este respecto de 2 mm, preferiblemente de 0,5 mm y preferiblemente menor de 0,1 mm. Así, se produce un volumen de líquido menor de 100 nl referido a una superficie base de 1 mm^{2}. Está en el marco de la presente invención que las disposiciones que configuran la disposición vehiculante son distintas respecto a la formación. Estas diferencias pueden consistir en que las secuencias de aminoácidos son total o parcialmente distintas. Además, es posible que las secuencias de aminoácidos en las distintas disposiciones estén dispuestas total o parcialmente en otros lugares distintos.
La disposición según la invención ofrece una serie de posibilidades de uso. Una de dichos usos representa la determinación de la especificidad de sustrato de una actividad enzimática (Fig. 12, compuesto C). A este respecto, ocurre que en una primera etapa se prepara una disposición o chip según la invención, se pone éste en contacto con una muestra que contiene la actividad enzimática respectiva, y eventualmente se incuba. A continuación, se realiza el análisis de la reacción entre una o varias de las secuencias de aminoácidos presentes en la disposición (Fig. 12A, compuestos B_{1}-B_{3}, o Fig. 12B, compuestos B_{1}-B_{5}) y la actividad enzimática (Fig. 12, compuesto C), pudiendo recurrirse al procedimiento de análisis anteriormente descrito. Como consecuencia de la disposición de las distintas especies aminoacídicas en distintos lugares, puede asignarse por tanto claramente un suceso de reacción realizado en un lugar determinado a una secuencia de aminoácidos o especie de secuencia de aminoácidos determinada (ambos términos se utilizan aquí como sinónimos) y determinarse así la especificidad de sustrato de la actividad enzimática (véanse para ellos las Fig. 8, 9 y 10).
A partir de la especificidad de sustrato, puede investigarse después por ejemplo también la influencia de distintas sustancias sobre la reacción respectiva. Por ejemplo, puede experimentarse, dependiendo del sustrato respectivo de una actividad enzimática, una modificación determinada mediante uno de los factores añadidos a la preparación de reacción que contiene la actividad enzimática, por ejemplo un compuesto de bajo peso molecular.
La disposición según la invención encuentra otro uso en la representación de los análisis diferenciales de las actividades enzimáticas de una muestra. Una muestra especialmente significativa en este sentido representa el proteoma de una célula, ilustrándose mediante éste a continuación este aspecto de la invención. A este respecto, a diferencia del uso anteriormente descrito, no se pone a disposición la especificidad de una actividad enzimática individual respecto a la especie aminoacídica presente sobre la superficie, sino que más bien es en cierto modo una captación momentánea de las actividades enzimáticas en una muestra respecto a las distintas especies de secuencia de aminoácidos de la disposición. Esta captación momentánea se realizó en determinadas condiciones que regían el punto temporal en que se tomó la muestra. En el caso del proteoma, éste puede ser por ejemplo el estado después de la exposición de la célula de la que se obtuvo la muestra frente a un compuesto determinado. Pueden tomarse después una o más muestras adicionales cambiándose las condiciones que rigen el punto temporal de toma de muestra, por ejemplo la célula no se exponía ya frente al compuesto citado y después se realizaba un análisis. Según el procedimiento de análisis seleccionado, se compara después el resultado del suceso de reacción en las distintas condiciones y se reconoce si y cuando ha cambiado el patrón en qué entorno a partir del suceso de reacción respectivo. Por otro lado, puede emplearse también una disposición de las secuencias de aminoácidos tal que se comparen muestras biológicas como por ejemplo lisados celulares o fluidos biológicos de una especie o distintas especies mediante una identificación del patrón o se cataloguen estas muestras biológicas mediante el patrón obtenido. Dicho patrón sirve después en sentido figurado como huella dactilar de la sonda biológica ensayada. Por tanto, puede representarse el procedimiento según la invención para identificación o individualización. La identificación puede realizarse a este respecto a distintos niveles sistemáticos, es decir, la asignación de una muestra investigada correspondiente a una cepa, una clase, una orden, una familia, un género, un tipo. Además, la identificación puede realizarse también al nivel de tipo entre individuos del mismo tipo o raza. Por ejemplo, este procedimiento puede utilizarse en la medicina forense. Puede observarse otro uso del procedimiento para determinar estados patológicos como cáncer o un patrón de actividad enzimática cambiado frente a la norma (tanto cuantitativa como cualitativamente), para diagnosticar o para
pronosticar.
La presente invención se ilustra adicionalmente ahora mediante las siguientes figuras y ejemplos, de los que pueden deducirse otras características, ejemplos de realización y ventajas. A este respecto, muestran:
Fig. 1. el resultado de la incubación de una superficie de vidrio modificada distintamente con distintas quinasas;
Fig. 2 el resultado de la incubación de distintas superficies modificadas distintamente con proteína quinasa A;
Fig. 3 el resultado de la incubación dependiente del tiempo de distintas superficies modificadas distintamente con proteína quinasa A;
Fig. 4 el resultado de la incubación de una superficie de vidrio modificada distintamente con distintas concentraciones de proteína quinasa A;
Fig. 5 el resultado de la incubación de una superficie de vidrio modificada con proteína quinasa A;
Fig. 6 el resultado de la incubación de una superficie de vidrio modificada (11760 puntos) con una quinasa;
Fig. 7 el resultado de la incubación de una superficie de vidrio modificada (960 puntos) con una quinasa;
Fig. 8 el resultado de la incubación de una superficie de vidrio modificada con una preparación del péptido sustrato potencial y los correspondientes péptidos control con proteína quinasa C;
Fig. 9 el resultado de la incubación de una superficie de vidrio modificada con una preparación del péptido sustrato potencial y los correspondiente péptidos control con proteína quinasa A;
Fig. 10 el resultado de la incubación de una superficie de vidrio modificada con una preparación del péptido sustrato potencial con proteína quinasa A;
Fig. 11 una visión general de distintas reacciones quimioselectivas; y
Fig. 12 la configuración esquemática de distintas formas de realización de una disposición de compuestos inmovilizados orientados sobre una superficie vehiculante.
Se da a continuación una descripción más exacta de las Figuras.
Fig. 1. Se acoplaron los sustratos de quinasa dados entre corchetes (modificados en el extremo N con el dipéptido cisteinil-\beta-alanina) mediante una adición de Michael con una superficie de vidrio funcionalizada con maleinimido (ejemplo 1). Como controles negativos se utilizaron péptidos en los que se intercambió el aminoácido a fosforilar serina por el aminoácido no fosforilable alanina. La superficie de vidrio se preincubó primero con 10 ml de solución de ATP 100 \muM en tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, durante 10 minutos. A continuación, se pipetearon las correspondientes quinasas junto con una mezcla de ATP/\gamma^{32}P-ATP (respectivamente 1 \mul, 5 U/ml) y se incubó durante 30 minutos a 25ºC (ejemplo 29). La fosforilación de los péptidos correspondientes se detectó mediante un PhosphorImager de FUJIFILM.
Fig. 2. Se acoplaron el péptido Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH_{2} y el péptido control Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH_{2}, respectivamente modificados en el extremo N con el dipéptido cisteinil-\beta-alanina, mediante una adición de Michael en una superficie funcionalizada con maleinimido (ejemplo 1; celulosa funcionalizada con maleinimidobutiril-\beta-alaninina así como membranas de polipropileno modificadas funcionalizadas con maleinimidobutiril-\beta-alaninina). Se preincubaron las superficies así modificadas primero con 10 ml de una solución de ATP 100 \muM en tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, durante 10 minutos. A continuación, se pipeteó la proteína quinasa A junto con una mezcla de ATP/\gamma^{32}P-ATP (100 \muM/ml; 100 \muCi/ml) (respectivamente 1 \mul, 2 U/ml) y se incubó durante 30 minutos a 25ºC (ejemplo 30). La fosforilación de los péptidos correspondientes se detectó mediante un PhosphorImager de FUJIFILM. Bajo las figuras se da la intensidad de señal de los puntos respectivos. Resulta evidente que en las condiciones de ensayo seleccionadas en el caso de superficies de celulosa o polipropileno modificadas, se mide en principio sólo unión inespecífica de ATP o quinasa a los péptidos. En el caso de superficies de vidrio modificadas, en cambio, la señal para la secuencia de aminoácidos sustrato es mayor por un factor de 4-5 que la señal para la secuencia de aminoácidos control correspondiente.
Fig. 3. Se acopló el péptido Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH_{2}, modificado en el extremo N con el dipéptido cisteinil-\beta-alanina, mediante una adición de Michael a superficies funcionalizadas con maleinimido (superficies de vidrio funcionalizadas con maleinimido, Sigma, Silane-Prep™, S4651; así como membranas de polipropileno modificadas funcionalizadas con maleinimidobutiril-\beta-alaninina). Las superficies de vidrio modificadas se preincubaron primero con 20 ml de una solución de ATP 100 \muM en tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5 durante 10 minutos. A continuación, se pipeteó la proteína quinasa A junto con una mezcla de ATP/\gamma^{32}P-ATP (100 \muM/ml, 100 \muCi/ml) (respectivamente 1 \mul, 2 U/ml) y se incubó durante el tiempo dado a 25ºC (ejemplo 31). La fosforilación de los correspondientes péptidos se detectó mediante un PhosphorImager de FUJIFILM. Bajo las figuras se da la intensidad de señal de los puntos respectivos. Resulta evidente que en las condiciones de ensayo elegidas en el caso de superficies de polipropileno modificadas, en principio se mide sólo unión inespecífica del ATP o quinasa al péptido. En el caso de superficies de vidrio modificadas, en cambio, debe reconocerse una clara dependencia del tiempo para la incorporación mediada por quinasa de radiactividad en la secuencia de aminoácidos sustrato.
Fig. 4. Se acoplaron el péptido control Leu-Arg-Arg-Ala-Ala-Leu-Gly-NH_{2}, el péptido Leu-Arg-Arg-Ala-Ala-Leu-Gly-NH_{2} después de purificación por HPLC y el producto bruto de síntesis Leu-Arg-Arg-Ala-Ala-Leu-Gly-NH_{2}, respectivamente modificados en el extremo N con el dipéptido cisteinil-\beta-alanina, mediante una adición de Michael a una superficie de vidrio funcionalizada con maleinimido (ejemplo 1). La superficie de vidrio modificada se preincubó primero con 10 ml de solución de ATP 100 \muM en tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, durante 10 minutos. A continuación, se cubrió la superficie de vidrio modificada con un cubreobjetos y se aplicó al espacio intermedio creado proteína quinasa A (1 U/ml o 10 U/ml) junto con una mezcla de ATP/\gamma^{32}P-ATP (100 \muM/ml, 100 \muCi/ml) mediante fuerza capilar (ejemplo 25). Después de 30 minutos de incubación a 25ºC, se detectó la fosforilación del péptido correspondiente mediante un PhosphorImager de FUJIFILM. Bajo las figuras se da la intensidad de señal de los puntos respectivos. Resulta evidente que en las condiciones de ensayo elegidas la intensidad de señal para la secuencia de aminoácidos purificada es un 500% mayor que para el producto bruto de síntesis. La intensidad de señal para la secuencia de aminoácidos sustrato purificada es aproximadamente 300 veces mayor que para la secuencia de aminoácidos control correspondiente. Junto con una cantidad de actividad aproximadamente 10 veces menor, que es necesaria para una señal comparable (en comparación con superficies de celulosa), se proporciona por tanto una mejora de la señal por un factor de 3000.
Fig. 5. Se acoplaron el péptido control Leu-Arg-Arg-Ala-Ala-Leu-Gly-NH_{2} y el péptido Leu-Arg-Arg-Ala-Ala-Leu-Gly-NH_{2}, modificados respectivamente en el extremo N con el dipéptido cisteinil-\beta-alanina, mediante una adición de Michael a una superficie de vidrio funcionalizada con maleinimido (ejemplo 1). Las superficies de vidrio modificadas se preincubaron primero con 10 ml de una solución de ATP 100 \muM en tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5 durante 10 minutos. A continuación, se recubrió la superficie de vidrio modificada con un cubreobjetos y se aplicó al espacio intermedio creado proteína quinasa A (10 U/ml) junto con una mezcla de ATP/\gamma^{32}P-ATP (100 \muM/ml, 100 \muCi/ml) mediante fuerza capilar. Después de 30 minutos de incubación a 25ºC, se detectó la fosforilación del péptido correspondiente mediante un PhosphorImager de FUJIFILM. Bajo las figuras se da la intensidad de señal de los puntos respectivos. Resulta evidente que en las condiciones de ensayo elegidas la intensidad de señal para la secuencia de aminoácidos sustrato es 800 veces mayor que para el péptido control correspondiente.
Fig. 6. Se aplica una superficie de vidrio modificada con el péptido Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-tioamida (véase el ejemplo 24) (la secuencia de aminoácidos se disolvió en tampón fosfato de sodio 200 mM, pH 5,5 y se aplicó a TA respectivamente 1 nl de esta solución a una disposición de 70 filas y 168 columnas (en total 11760 puntos)) sobre superficies de vidrio funcionalizadas con bromocetona (ejemplo 10) mediante un NanoPlotter de la compañía Gesim. A este respecto, la distancia punto a punto era de 0,3 mm. A continuación, se trataron las superficies de vidrio así tratadas durante 2 minutos con microondas, y después se incubaron durante 3 h a TA. A continuación, se preincubó primero con 10 ml de solución de ATP 100 \muM en tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5 durante 10 minutos. A continuación, se recubrió la superficie de vidrio modificada con una segunda superficie de vidrio y se aplicó en el espacio intermedio creado proteína quinasa A (10 U/ml) junto con una mezcla de ATP/\gamma^{32}P-ATP (100 \muM/ml, 100 \muCi/ml) mediante fuerza capilar (véase el ejemplo 31). Después de 30 minutos de incubación a 25ºC, se detectó la fosforilación del péptido correspondiente mediante un PhosphorImager de FUJIFILM. Resulta evidente que por un lado se tolera la unión del sustrato de quinasa inmovilizado de la proteína quinasa A y que por otro lado la modificación de las superficies de vidrio se desarrolla homogéneamente y sin grandes variaciones en la densidad de inmovilización. Además, resulta evidente que la resolución del PhosphorImager aquí utilizado es suficiente para analizar incluso más de 11.000 puntos de medida por biochip.
Fig. 7. Se preincubó una superficie de vidrio modificada con el péptido Dpr(Aoa)-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH_{2} (véase el ejemplo 22) primero con 10 ml de una solución de ATP 100 \muM en tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, durante 10 minutos. A continuación, se recubrió la superficie modificada con vidrio con una segunda superficie de vidrio y se aplicó en el espacio intermedio creado proteína quinasa A (10 U/ml) junto con una mezcla de ATP/\gamma^{32}P-ATP (100 \muM/ml, 100 \muCi/ml) mediante fuerza capilar. Después de 30 minutos de incubación a 25ºC, se detectó la fosforilación del péptido correspondiente mediante un PhosphorImager de FUJIFILM (véase el ejemplo 14). Resulta evidente que por un lado se tolera la unión del sustrato de quinasa inmovilizado de la proteína quinasa A, y por otro lado la modificación de las superficies de vidrio se desarrolla homogéneamente y sin grandes variaciones en la densidad de inmovilización. Además, resulta evidente que la resolución del PhosphorImager utilizado es suficiente para analizar más de 950 puntos de medida por biochip.
Fig. 8. Se acoplaron exactamente 43 péptidos que contienen serina y/o treonina (péptidos sustrato potenciales para quinasas) y los péptidos control correspondientes, modificados respectivamente en el extremo N con el dipéptido cisteinil-\beta-alanina, mediante una adición de Michael, a una superficie de vidrio funcionalizada con maleinimido (ejemplo 18). En los péptidos control, se sustituyen los restos de serina y/o treonina por alanina en secuencias por lo demás semejantes. La aplicación se realizó mediante un NanoPlotter de la compañía Gesim. A este respecto, la distancia punto a punto era de 1 mm, se aplicaron 0,8 nl por punto de una solución peptídica en tampón PBS 100 mM, pH 7,8 que contenía 20% de glicerina. Se representa la disposición del péptido en la Fig. 8A. A este respecto, un circulo negro representa una péptido sustrato potencial que contiene serina y/o treonina, un círculo blanco representa un péptido control. Se aplicaron tres subconjuntos idénticos sobre la superficie de vidrio. La numeración de los puntos se observa en la Fig. 8C, las secuencias de los péptidos utilizados proceden del ejemplo 18. La superficie de vidrio modificada se preincubó después de la aplicación del péptido primero con 10 ml de una solución de ATP 100 \muM en tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, durante 10 minutos. A continuación, se recubrió la superficie de vidrio modificada con un cubreobjetos y se aplicó al espacio intermedio creado proteína quinasa C (10 U/ml) junto con una mezcla de ATP/\gamma^{32}P-ATP (100 \muM/ml, 100 \muCi/ml) mediante fuerza capilar. Después de 30 minutos de incubación a 25ºC, se detectó la fosforilación de los péptidos correspondientes mediante un PhosphorImager de FUJIFILM (ejemplo 38). La figura resultante se representa en la Fig. 8B. Los puntos con mayor intensidad de señal en los tres subconjuntos se asignaron a los correspondientes péptidos fosforilados con proteína quinasa C. Sus estructuras primarias se muestran en la Fig. 8D. Resulta evidente que los péptidos conocidos como sustratos de proteína quinasa C (péptido sustrato nº 3, 23, 27, 41, 43) y otros no descritos como sustratos de proteína quinasa C se reconocieron por esta quinasa en la superficie de vidrio modificada, y se fosforilaron. Así, resulta evidente que dicha disposición es adecuada para caracterizar la especificidad de sustrato de una quinasa, como por ejemplo proteína
quinasa C.
Fig. 9. Se acoplaron exactamente 43 péptidos que contienen serina y/o treonina (péptidos sustrato potenciales para quinasas) y los péptidos control correspondientes, modificados respectivamente en el extremo N con el dipéptido cisteinil-\beta-alanina, mediante una adición de Michael, a una superficie de vidrio funcionalizada con maleinimido (ejemplo 18). En los péptidos control, se sustituyen los restos de serina y/o treonina por alanina en secuencias por lo demás semejantes. La aplicación se realizó mediante un NanoPlotter de la compañía Gesim. A este respecto, la distancia punto a punto era de 1 mm, se aplicaron 0,8 nl por punto de una solución peptídica en tampón PBS 100 mM, pH 7,8 que contenía 20% de glicerina. Se representa la disposición del péptido en la Fig. 9A. A este respecto, un círculo negro representa un péptido sustrato potencial que contiene serina y/o treonina, un círculo blanco representa un péptido control. Se aplicaron tres subconjuntos idénticos sobre la superficie de vidrio. La numeración de los puntos se observa en la Fig. 9C, las secuencias de los péptidos utilizados proceden del ejemplo 18. La superficie de vidrio modificada se preincubó después de la aplicación del péptido primero con 10 ml de una solución de ATP 100 \muM en tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5, durante 10 minutos. A continuación, se recubrió la superficie de vidrio modificada con un cubreobjetos y se aplicó al espacio intermedio creado proteína quinasa A (10 U/ml) junto con una mezcla de ATP/\gamma^{32}P-ATP (100 \muM/ml, 100 \muCi/ml) mediante fuerza capilar. Después de 30 minutos de incubación a 25ºC, se detectó la fosforilación del péptido correspondiente mediante un PhosphorImager de FUJIFILM (ejemplo 39). La figura resultante se representa en la Fig. 9B. Los puntos con mayor intensidad de señal en los tres subconjuntos se asignaron a los correspondientes péptidos fosforilados con proteína quinasa A. Sus estructuras primarias se muestran en la Fig. 9D. Resulta evidente que, con una excepción, todos los péptidos que portan en la posición -2 y -3 (N-terminal) de la serina dos restos arginina sobre la superficie de vidrio modificada se reconocieron por la proteína quinasa A y se fosforilaron. Este motivo de secuencia RRxS se describe como motivo de secuencia preferido para la proteína quinasa A (A. Kreegipuu, N. Blom, S. Brunak, J. Jarv., 1998, "Statistical analysis of protein kinase specificity determinants", FEBS Lett., 430, 45-50). El péptido 83 no se fosforila probablemente a causa de la localización demasiado N-terminal del motivo sustrato. Por tanto, resulta evidente que dicha disposición es adecuada para caracterizar la especificidad de sustrato de una quinasa, como por ejemplo proteína
quinasa A.
Fig. 10. Se acoplaron exactamente 79 péptidos, modificados respectivamente en el extremo N con el dipéptido ácido aminooxiacético-\beta-alanina, a una superficie de vidrio funcionalizada con aldehído (ejemplo 20). La aplicación se realizó mediante un NanoPlotter de la compañía Gesim. A este respecto, la distancia punto a punto era de 1,5 mm, se aplicó 1 nl por punto de una solución peptídica en DMSO. Los péptidos de 13 unidades se solapan respectivamente con 11 restos aminoácidos y cubren conjuntamente por completo la estructura primaria de la MBP, es decir, representan conjuntamente un barrido de proteína básica de mielina (MBP) de bos taurus (número de acceso SWISSPROT P02687). La estructura primaria de la MBP se representa en la Fig. 10C. Para los restos destacados en negrita se ha descrito una fosforilación mediante proteína quinasa A en el estado de la técnica (A. Kishimoto, K. Nishiyama, H. Nakanishi, Y. Uratsuji, H. Nomura, Y. Takeyama, Y. Nishizuka, 1985, "Studies on the phosphorylation of myelin basic protein by protein kinase C and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase", J. Biol. Chem., 260, 12492-12499). Los péptidos de 13 unidades en el barrido presentan un desplazamiento de secuencia de 2 aminoácidos. La disposición del péptido se representa en la Fig. 10B. Por tanto, el péptido nº 1 representa la secuencia de aminoácidos 1-13 de la estructura primaria de la MBP, el péptido nº 2 la secuencia de aminoácidos 3-15 de la estructura primaria de MBP, y así. Se aplicaron tres subconjuntos idénticos sobre la superficie de vidrio. En la Fig. 10A, se representa uno de estos subconjuntos. Se preincubó la superficie de vidrio modificada después de la aplicación del péptido primero con 10 ml de solución de ATP 100 \muM en tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5 durante 10 minutos. A continuación, se recubrió la superficie de vidrio modificada con un cubreobjetos y se aplicó al espacio intermedio creado proteína quinasa A (10 U/ml) junto con una mezcla de ATP/\gamma^{32}P-ATP (100 \muM/ml, 100 \muCi/ml) mediante fuerza capilar (véase el ejemplo 40). Después de 30 minutos de incubación a 25ºC, se detectó la fosforilación del péptido correspondiente mediante un PhosphorImager de FUJIFILM. La figura resultante se representa en la Fig. 10A. Se asignaron los puntos con mayor intensidad de señal en los tres subconjuntos a los correspondientes péptidos fosforilados con proteína quinasa A. Sus estructuras primarias se muestran en la Fig. 10D. Resulta evidente que la mayoría de los péptidos, que podían encontrarse también en el experimento llevado a cabo en solución (A. Kishimoto, K. Nishiyama, H. Nakanishi, Y. Uratsuji, H. Nomura, Y. Takeyama, Y. Nishizuka, 1985, "Studies on the phosphorylation of myelin basic protein by protein kinase C and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase", J. Biol. Chem., 260, 12492-12499), sobre la superficie de vidrio modificada se reconocieron por la proteína quinasa A y se
fosforilaron,
Fig. 11. Se muestra una vista general de distintas reacciones quimioselectivas según el estado de la técnica: A) aldehídos (R^{4}= H) o cetonas (R^{4} no es H) y compuestos aminooxi reaccionan dando oximas, B) aldehídos (R^{4}= H) o cetonas (R^{4} no es H) y tiosemicarbazidas reaccionan dando tiosemicarbazonas, C) aldehídos (R^{4}= H) o cetonas (R^{4} no es H) e hidrazidas reaccionan dando hidrazonas, D) aldehídos (R^{4}= H) o cetonas (R^{4} no es H) y 1,2-aminotioles reaccionan dando tiazolinas (X= S) o reaccionan con 1,2-aminoalcoholes dando oxazolinas (X= O) o con 1,2-diaminas dando imidazolinas (X= NH), E) tiocarboxilatos y \alpha-halocarbonilos reaccionan dando tioésteres, F) tioésteres y \beta-aminotioles reaccionan dando \beta-mercaptoamidas, F) mercaptanos y maleinimida reaccionan dando succinimidas. El resto R^{1} representa a este respecto restos alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo o arilo o heterociclos o superficies, y los restos R^{4}-R^{6} representan a este respecto restos alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo o arilo o heterociclos o superficies, o H, D o T, representando alquilo restos alquilo C_{1-20} ramificado y no ramificado o cicloalquilo C_{3-20}, preferiblemente alquilo C_{1-12} ramificado y no ramificado o cicloalquilo C_{3-12}, y de forma especialmente preferida alquilo C_{1-6} ramificado y no ramificado o cicloalquilo C_{3-6}. Alquenilo representa restos alquenilo C_{2-20} ramificado y no ramificado, alquil C_{1-20}-O-alquenilo C_{2-20} ramificado y no ramificado, alquenil C_{1-20}(-O/S-C_{2-20})_{2-20}, arilalquenilo C_{2-20}, heterociclilalquenilo C_{2-20} ramificado y no ramificado o cicloalquenilo C_{3-20}, preferiblemente alquenilo C_{2-12} ramificado y no ramificado o alquenil C_{1-12}(-O/S-C_{2-12})_{2-12} ramificado y no ramificado, de forma especialmente preferida alquenilo C_{2-6} ramificado y no ramificado o alquenil C_{1-6}(-O/S-C_{2-8})_{2-8} ramificado y no ramificado. Alquinilo representa restos alquinilo C_{2-20} ramificado y no ramificado o alquinil C_{1-20}(-O/S-C_{2-20})_{2-20} ramificado y no ramificado, preferiblemente alquinilo C_{2-12} ramificado y no ramificado o alquinil C_{2-12}(-O/S-C_{2-12})_{2-12} ramificado y no ramificado, de forma especialmente preferida alquinilo C_{2-6} ramificado y no ramificado o alquinil C_{1-6}(-O/S-C_{2-8})_{2-8} ramificado y no ramificado; cicloalquilo representa restos cicloalquilo C_{3-40} con puente y sin puente, preferiblemente cicloalquilo C_{3-26} con puente y sin puente, de forma especialmente preferida cicloalquilo C_{3-15} con puente y sin puente. Arilo representa restos fenilo, pentalenilo, azulenilo, antracenilo, indacenilo, acenaftilo, fluorenilo, fenalenilo, fenantrenilo sustituidos y no sustituidos, mono- o multi-enlazados, preferiblemente restos fenilo, pentalenilo, azulenilo, antracenilo, indenilo, indacenilo, acenaftilo, fluorenilo sustituidos y no sustituidos, mono- o multi-enlazados, de forma especialmente preferida fenilo, pentalenilo, antracenilo sustituidos y no sustituidos, mono- o multi-enlazados, así como sus derivados parcialmente hidrogenados. Los heterociclos pueden ser anillos mono-, bi- y tricíclicos de 3-15 miembros insaturados y saturados con 1-7 heteroátomos, preferiblemente anillos mono-, bi- y tricíclicos de 3-10 miembros con 1-5 heteroátomos, y de forma especialmente preferida: anillos mono-, bi- y tricíclicos de 5, 6 y 10 miembros con 1-3
heteroátomos.
Además, pueden presentarse en alquilo, alquenilo, alquinilo, cicloalquilo, arilo, heteroátomos, heterociclos, biomoléculas o sustancias naturales de 0 a 30 (preferiblemente de 0 a 10, de forma especialmente preferida de 0 a 5) de los siguientes sustituyentes individualmente o en combinación entre sí: flúor, cloro, bromo, yodo, hidroxilo, amida, éster, ácido, amina, acetal, cetal, tiol, éter, fosfato, sulfato, sulfóxido, peróxido, ácido sulfónico, tioéter, nitrilo, urea, carbamato, prefiriéndose los siguientes: flúor, cloro, bromo, hidroxilo, amida, éster, ácido, amina, éter, fosfato, sulfato, sulfóxido, tioéter, nitrilo, urea, carbamato, y de forma especialmente preferida: cloro, hidroxilo, amida, éster, ácido, éter, nitrilo.
Fig. 12. Se muestran esquemáticamente distintas formas de realización de la incubación de una disposición de los compuestos (B_{1}-B_{5}) sobre la superficie de un vehículo con un agente (actividad enzimática, C) que está en disposición de reducir o aumentar el peso molecular, en las condiciones dadas, en uno o más compuestos en estado inmovilizado. A este respecto, el enlace entre la superficie y los compuestos inmovilizados (A) debería ser covalente y regioselectivo. La Fig. A muestra una forma de realización en la que el agente A se aplica sobre la superficie. La Fig. B muestra en cambio una forma de realización en la que el agente C se añade a dos superficies enfrentadas entre sí que pueden contener disposiciones iguales o distintas de los compuestos inmovilizados.
Los siguientes ejemplos se refieren a la funcionalización del vidrio, cuyas superficies son necesarias como superficies para inmovilización (ejemplos 1 a 14), a la inmovilización de distintos péptidos provistos con un grupo reactivo en una superficie (ejemplos 15 a 24) y al análisis de la modificación peptídica mediada por quinasa utilizando los péptidos inmovilizados según la invención (ejemplos 25-34). A este respecto, se utilizan las abreviaturas enumeradas a continuación:
Ala, A L-alanina
Aoa, O ácido aminooxiacético
Arg, R L-arginina
Asn, N L-asparagina
Asp, D ácido L-aspártico
ATP 5'-trifosfato de adenosina
\betaAla, B, BAL \beta-alanina, ácido 3-aminopropiónico
Boc terc-butoxicarbonilo
Cit L-citrulina
Cys, C L-cisteína
DCM diclorometano
DIC N,N'-diisopropilcarbodiimida
DIPEA N,N'-diisopropiletilamina
DMF N,N'-dimetilformamida
DMSO dimetilsulfóxido
EGTA ácido etilenglicol-bis-(2-aminoetil)-N,N,N',N'-tetraacético
Et etilo
Fmoc 9-fluorenilmetoxicarbonilo
Gln, Q glutamina
Glu, E ácido L-glutámico
Gly, G glicina
HBTU hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio
His, H L-histidina
HPLC cromatografía líquida de alta resolución
Ile, I L-isoleucina
l litro
Leu, L L-leucina
Lys, K L-lisina
M molar
MBHA metilbenzhidrilamina
MBP proteína básica de mielina
MeOH metanol
Met, M metilo
ml mililitro
mM milimolar
ARNm ARN mensajero
nl nanolitro
Phe, F L-fenilalanina
Pbf 2,2,4,6,7-pentametildihidrobenzofuran-5-sulfonilo
Pro, P L-prolina
PTFE politetrafluoroetileno
PVC poli(cloruro de vinilo)
PVDF poli(difluoruro de vinilo)
ARN ácido ribonucleico
FI fase inversa
TA temperatura ambiente
SDS laurilsulfato de sodio
Ser, S L-serina
terc-Bu terc-butilo
TFA ácido tetrafluoroacético
THF tetrahidrofurano
Thr, T L-treonina
Tris 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol
Trp, W L-triptófano
Tween 20 monolaurato de polioxietilensorbitán (obt. de la co. Atlas Chemie)
Tyr, Y L-tirosina
U unidad
Val, V L-valina
A este respecto, se utilizaron los siguientes reactivos y disolventes:
Bromo, terc-butilmetiléter, 1,3-diisopropilcarbodiimida, N,N-diisopropiletilamina, ácido acético glacial, glicerol, urea, solución de hidroxilamina al 40%, piperidina, trietilamina, diclorometano, dietiléter, N,N-dimetilformamida, etanol, metanol y tetrahidrofurano proceden de Merck Eurolab (Darmstadt, Alemania). Cloruro de oxalilo, tiocianato de sodio, ácido trifluoroacético, dimetilsulfóxido, tioacetamida, reactivo de Lawesson, ácido fórmico y tiourea se adquirieron en Fluka (Deisenhofen, Alemania). 5'-Trifosfato de adenosina, clorhidrato de 2-amino-2-hidroximetil-1,3-propanodiol, cloruro de sodio, cloruro de magnesio, 1,4-ditio-DL-treitol, laurilsulfato de sodio, monolaurato de polioxietilensorbitán y ácido etilenglicol-bis-(2-aminoetil)-N,N,N',N'-tetraacético proceden de Sigma (Taufkirchen, Alemania). La resina Rink-amida-MBHA, hexafluorofosfato de (benzotriazol-1-il)-N,N,N',N'-tetrametiluronio, así como todos los ésteres pentafluorofenílicos de Fmco-aminoácidos, se adquirieron en la compañía Novabiochem (Bad Soden, Alemania).
Para la síntesis de SPOT se utilizaron membranas de celulosa "Whatman 50" (Whatman Maidstone, RU).
Cromatografía y datos físicos
Se llevaron a cabo los análisis de F-18-HPLC-EM mediante cromatografía utilizando un sistema Hewlett-Packard serie 1100 (desgasificador G1322A, bomba cuaternaria G1311A, muestreador automático G1313A, compartimento de columna termostatizado G 1316A, detector de UV variable G1314A) y ESI-EM acoplada (espectrómetro de masas con atrapamiento de iones Finnigan LCQ). La separación se realizó en material de columna FI-18 (Vydac 218 TP5215, 2,1 x 150 mm, 5 \mum, C18, 300 A con precolumna) a 30ºC y con un flujo de 0,3 ml/min utilizando un gradiente lineal para todos los cromatogramas (5-95% de B durante 25 min, siendo A: 0,05% de TFA en agua y B: 0,05% de TFA en CH_{3}CN). La detección de UV se realizó a \lambda = 220 nm.
La HPLC preparativa se llevó a cabo con un sistema de la compañía Merck/Hitachi (bomba cuaternaria L-6250, detector de UV variable L-/400, interfaz D-7000, software: HPLC Systemmanager D-7000 para NT 4.0) utilizando una columna de la compañía Merck Eurolab (LiChrospher 100, FI18, 10x250 mm) a un caudal de disolvente de 6,0 ml/min. El sistema de disolventes empleado estaba compuesto por los componentes A (H_{2}O/0,1% en vol. de TFA) y B (CH_{3}CN/0,1% en vol. de TFA).
Aparatos para la preparación de los péptidos solubles
Los péptidos utilizados para inmovilización se sintetizaron en forma de peptidamidas C-terminales con ayuda de un dispositivo automático de síntesis paralela "Syro" (MultiSynTech, Witten, Alemania) según el protocolo Fmoc estándar en resina Rink-amida-MBHA. Todos los péptidos obtenidos se analizaron mediante HPLC después de la escisión de la resina y la escisión de todos los grupos protectores, y mostraron las señales de iones moleculares deseadas. Después de la purificación por HPLC posterior, se liofilizaron los péptidos y se dispusieron a -20ºC.
Los péptidos utilizados para inmovilización (péptidos de 13 unidades de la proteína MBP, caseína, histona H1) se llevaron a cabo automáticamente según el método de síntesis SPOT estándar con el aparato Autospot AMS 222 (Abimed, Langenfeld, Alemania) utilizando el software de gestión Autospot XL ver. 2.02. Las etapas de lavado se realizaron en cubetas de hierro fino (Merck Eurolab) que se agitaron sobre un tablero basculante.
Ejemplos Ejemplo 1 Funcionalización con maleinimido de superficies de vidrio aminopropilsililadas
Se disolvió ácido 4-maleimidobutírico 0,3 M (Fluka, 63714) en DMF. Se activó la mezcla mediante la adición de medio equivalente de diisopropilcarbodiimida (DIC) durante 15 min a temperatura ambiente (TA). Se recubrieron las superficies de vidrio aminopropilsililadas purificadas mediante aire a presión (2,5 x 7,5 cm; Sigma, Silane-Prep™, S4651) con la solución de anhídrido del ácido maleinimidobutírico así obtenida y se incubó durante 3 horas a TA. A continuación, se lavaron las superficies de vidrio así tratadas con 30 ml de DMF respectivamente durante 3 minutos a TA. Después de 3 lavados de 3 minutos respectivamente con 30 ml de diclorometano (DCM) a TA, se secaron las superficies de vidrio y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 2 Funcionalización con maleinimido de superficies de vidrio modificadas con polilisina
Se disolvió ácido 6-maleinimidocaproico 0,3 M (Fluka, 63176) en DMF. Se activó la mezcla resultante mediante la adición de medio equivalente de DIC durante 15 min a temperatura ambiente (TA). Se incubaron las superficies de vidrio modificadas con polilisina purificadas con aire a presión (Sigma, Poly-Prep™, P0425, 2,5 x 7,5 cm) con la solución de anhídrido del ácido maleinimidocaproico así obtenida durante 3 horas a TA. A este respecto, se añadieron 60 \mul de esta solución mediante fuerza capilar al intersticio que se crea entre dos superficies de vidrio modificadas enfrentadas. A continuación, se lavaron las superficies de vidrio así tratadas cinco veces respectivamente con 30 ml de DMF durante 3 minutos a TA. Después de 3 lavados de 3 minutos espectivamente con 30 ml de DCM a TA, se secaron las superficies de vidrio y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 3 Funcionalización con aldehído de superficies de vidrio aminopropilisililadas
Se disolvió 4-carboxibenzaldehído 0,3 M (Fluka, 21873) en DMF. Se activó la mezcla resultante mediante la adición de medio equivalente de DIC durante 15 min a TA. Se recubrieron las superficies de vidrio aminopropilsililadas purificadas con aire a presión (2,5 x 7,5 cm, Sigma, Silane-Prep™, S4651) con la solución de carboxibenzaldehído activado así obtenida y se incubó durante 3 horas a TA. A continuación, se lavaron las superficies de vidrio así tratadas 5 veces respectivamente con 30 ml de DMF durante 3 minutos a TA. Después de 3 lavados de 3 minutos respectivamente con 30 ml de DCM a TA, se secaron las superficies de vidrio y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 4 Funcionalización con cetona de superficies de vidrio aminopropilsililadas
Se disolvió ácido lavulánico 0,3 M (Fluka, 61380) en DMF. Se activó la mezcla resultante mediante la adición de medio equivalente de DIC durante 15 min a TA. Se recubrieron las superficies de vidrio aminopropilsililadas purificadas con aire a presión (2,5 x 7,5 cm, Sigma, Silane-Prep™, S4651) con la solución de anhídrido del ácido levulínico así obtenida y se incubó durante 3 horas a TA. A continuación, se lavaron las superficies de vidrio así tratadas cinco veces respectivamente con 30 ml de DMF durante 3 minutos a TA. Después de 3 lavados de 3 minutos respectivamente con 30 ml de DCM a TA, se secaron las superficies de vidrio y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 5 Bromoacetilación de superficies de vidrio aminopropilsililadas
Se disolvió ácido bromoacético 0,4 M en DMF. Se activó la mezcla resultante mediante la adición de medio equivalente de DIC durante 15 min a TA. Se recubrieron las superficies de vidrio aminopropilsililadas purificadas con aire a presión (2,5 x 7,5 cm, Sigma, Silane-Prep™, S4651) con la solución de anhídrido del ácido bromoacético así obtenido y se incubó durante 3 horas a TA. A continuación, se lavaron las superficies de vidrio así obtenidas cinco veces respectivamente con 30 ml de DMF durante 3 minutos a TA. Después de 3 lavados de 3 minutos respectivamente con 30 ml de DCM a TA, se secaron las superficies de vidrio y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 6 Funcionalización con ácido 4-bromometilbenzoico de superficies de vidrio aminopropilsililadas
Se disolvió ácido 4-bromometilbenzoico 0,3 M en DMF. Se activó la mezcla resultante mediante la adición de medio equivalente de DIC durante 15 min a TA. Se recubrieron las superficies de vidrio aminopropilsililadas purificadas mediante aire a presión (2,5 x 7,5 cm, Sigma, Silane-Prep™, S4651) con la solución de anhídrido del ácido 4-bromometilbenzoico así obtenida y se incubó durante 3 horas a TA. A continuación, se lavaron las superficies de vidrio así tratadas cinco veces respectivamente con 30 ml de DMF durante 3 minutos a TA. Después de tres lavados de 3 minutos respectivamente con 30 ml de DCM a TA, se secaron las superficies de vidrio y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 7 Funcionalización con feniltiourea de superficies de vidrio aminopropilsililadas
Se disolvió 4-carbonilfeniltiourea 0,2 M (Lancaster, 13407) en DMF. Se activó la mezcla resultante mediante la adición de medio equivalente de DIC durante 15 min a TA. Se recubrieron las superficies de vidrio aminopropilsililadas purificadas con aire a presión (2,5 x 7,5 cm, Sigma, Silane-Prep™, S4651) con la solución activada así obtenida y se incubó durante 3 horas a TA. A continuación, se lavaron las superficies de vidrio así tratadas cinco veces respectivamente con 30 ml de DMF durante 3 minutos a TA. Después de 3 lavados de 3 minutos respectivamente con 30 ml de DCM a TA, se secaron las superficies de vidrio y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 8 Funcionalización con tioamida de superficies de vidrio aminopropilsililadas
Se disolvió monotiamida del ácido succínico 0,2 M en DMF. Se activó la mezcla resultante mediante la adición de medio equivalente de DIC durante 15 min a TA. Se recubrieron las superficies de vidrio aminopropilsililadas purificadas con aire a presión (2,5 x 7,5 cm, Sigma, Silane-Prep™, S4651) con la solución de anhídrido del ácido succínico modificado así obtenida y se incubó durante 3 horas a TA. A continuación, se lavaron las superficies de vidrio así tratadas cinco veces respectivamente con 30 ml de DMF durante 3 minutos a TA. Después de 3 lavados de 3 minutos respectivamente con 30 ml de DCM a TA, se secaron las superficies de vidrio y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 9 Funcionalización con bromocetona de superficies de vidrio aminopropilsililadas
Se disolvió 1,4-dibromo-2,3-dicetobutano (Aldrich, D3, 916-9) 0,2 M en DMF con 0,1% de trietilamina. Se recubrieron las superficies de vidrio aminopropilsililadas purificadas con aire a presión (2,5 x 7,5 cm, Sigma, Silane-Prep™, S4651) con la solución y se incubó durante 7 horas a TA. A continuación, se lavaron las superficies de vidrio así tratadas cinco veces respectivamente con 30 ml de DMF durante 3 minutos a TA. Después de 3 lavados de 4 minutos respectivamente con 30 ml de DCM a TA, se secaron las superficies de vidrio y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 10 Funcionalización con bromocetona de superficies de vidrio modificadas con tioamida
Las estructuras representadas en este ejemplo posibilitan una modificación de superficie desarrollada fácilmente y con buenos rendimientos.
Se recubrieron superficies de vidrio aminopropilsililadas reaccionadas con monotiamida del ácido succínico (2,5 x 7,5 cm, Sigma, Silane-Prep™, S4651) (véase el ejemplo 8) con una solución de 1,4-dibromo-2,3-dicetobutano 0,1 M (Aldrich, D3, 916-9) en etanol y se incubó durante 3 horas a TA. A continuación, se lavaron las superficies de vidrio así tratadas cinco veces respectivamente con 30 ml de etanol durante 3 minutos a TA. Después de 3 lavados de 3 minutos cada uno respectivamente con 30 ml de DCM a TA, se secaron las superficies de vidrio y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 11 Funcionalización con bromocetona de superficies de vidrio modificadas con feniltiourea
Las estructuras representadas en este ejemplo posibilitan una modificación de superficie desarrollada fácilmente y con buenos rendimientos.
Se recubrieron superficies de vidrio aminopropilsililadas reaccionadas con 4-carboxifeniltiourea (2,5 x 7,5 cm, Sigma, Silane-Prep™, S4651) con una solución de 1,4-dibromo-2,3-dicetobutano 0,1 M en etanol y se incubó durante 3 horas a TA. A continuación, se lavaron las superficies de vidrio así tratadas cinco veces respectivamente con 30 ml de etanol durante 3 minutos a TA. Después de 3 lavados durante 3 minutos respectivamente con 30 ml de DCM a TA, se secaron las superficies de vidrio y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 12 Funcionalización con ácido bromopirúvico de superficies de vidrio aminopropilsililadas
Esta modificación de superficie muestra que es posible emplear también estructuras muy pequeñas para transformar una superficie de vidrio funcionalizada con amino en funcionalizada con bromocetona. A este respecto, el ácido bromopirúvico representa el compuesto más pequeño posible que contiene tanto la función carboxilo necesaria para el enlace amida como la función alfa-bromoceto necesaria para la posterior inmovilización de la biomolécula.
Se transformó piruvato de sodio con cloruro de oxalilo en el correspondiente cloruro de ácido. Se recubrieron superficies de vidrio aminopropilsililadas (2,5 x 7,5 cm, Sigma, Silane-Prep™, S4651) purificadas con aire a presión con la solución así obtenida y se incubó durante 5 horas a TA. A continuación, se lavaron las superficies de vidrio así tratadas cinco veces respectivamente con 30 ml de DMF durante 3 minutos a TA. Después de 3 lavados respectivamente de 3 minutos respectivamente con 30 ml de metanol y DCM a TA, se secaron las superficies de vidrio. Se transformaron las superficies de vidrio modificadas con ácido pirúvico así obtenidas mediante un tratamiento de una etapa con una solución de 0,1 ml de bromo y 10 ml de ácido acético glacial en superficies de vidrio modificadas con ácido bromopirúvico. Después de 3 lavados respectivamente de 3 minutos respectivamente con 30 ml de metanol y DCM a TA, se secaron las superficies de vidrio y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 13 Funcionalización con bromoacetofenona de superficies de vidrio aminopropilsililadas
Se disolvió ácido 4-acetilbenzoico 0,3 M en DMF. Se activó la mezcla resultante mediante la adición de medio equivalente de DIC durante 15 min a TA. Se recubrieron las superficies de vidrio aminopropilsililadas purificadas con aire a presión (2,5 x 7,5 cm, Sigma, Silane-Prep™, S4651) con la solución de anhídrido del ácido 4-acetilbenzoico así obtenida y se incubó durante 3 horas a TA. A continuación, se lavaron las superficies de vidrio así tratadas cinco veces respectivamente con 30 ml de DMF durante 3 minutos a TA. Después de 3 lavados respectivamente durante 3 minutos respectivamente con 30 ml de metanol y DCM a TA, se secaron las superficies de vidrio. Se transformaron las superficies de vidrio así modificadas mediante un tratamiento de una etapa con una solución de 0,1 ml de bromo en 10 ml de ácido acético glacial en superficies de vidrio modificadas con bromoacetofenona. Después de tres lavados respectivamente durante 3 minutos respectivamente con 30 ml de metanol y DCM a temperatura ambiente, se secaron las superficies de vidrio y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 14 Funcionalización con tiocianatoacetofenona de superficies de vidrio aminopropilsililadas
Se recubrieron superficies de vidrio aminopropilsililadas modificadas con bromoacetofenona (2,5 x 7,5 cm, Sigma, Silane-Prep™, S4651) (véase el ejemplo 13) con una solución de tiocianato de sodio 0,1 M en etanol y se incubó durante 5 horas a 50ºC. A continuación, se lavaron las superficies de vidrio así tratadas 5 veces respectivamente con 30 ml de etanol durante 3 minutos a TA. Después de 3 lavados durante 3 minutos respectivamente con 30 ml de DCM a TA, se secaron las superficies de vidrio y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 15 Inmovilización de péptidos que contienen cisteína en superficies de vidrio funcionalizadas con maleinimido
a)
Se sintetizaron los péptidos utilizados para la inmovilización mediante procedimientos estándar de la química basada en Fmoc en fase sólida en forma de peptidamidas C-terminales. A este respecto, se activaron los correspondientes aminoácidos protegidos con Fmoc con un equivalente de HBTU y tres equivalentes de diisopropiletilamina en DMF y se acoplaron a resina Rink-amida-MBHA en DMF. Se realizó la escisión del grupo protector Fmoc utilizando piperidina al 20% en DMF durante 30 min a TA. Se realizó la escisión de los grupos protectores permanentes (terc-Bu para serina, treonina, tirosina, ácido glutámico y ácido aspártico; Boc para lisina; tritilo para asparagina, glutamina, cisteína, histidina; y Pbf para arginina) y la disolución simultánea del polímero mediante un tratamiento de dos etapas con ácido trifluoroacético al 97% a TA. Se filtró la mezcla resultante y precipitó el filtrado mediante la adición de terc-butilmetiléter. Se separó el precipitado y se purificó mediante HPLC en material FI18 con mezclas de acetonitrilo/agua (0,1% de ácido trifluoroacético). Las fracciones que contienen el producto deseado se liofilizaron y se dispusieron a -20ºC hasta uso posterior.
b)
Se disolvieron los péptidos que contienen cisteína purificados por HPLC en tampón fosfato de sodio 200 mM, pH 7,5 (concentración final de los péptidos 10 mM). A continuación, se pipeteó a TA respectivamente 1 \mul de esta solución sobre las superficies de vidrio funcionalizadas con maleinimido (véase el ejemplo 1) mediante una pipeta Eppendorf, y se incubaron éstas durante 1 hora a TA en una atmósfera casi saturada con agua. Después de 3 lavados a TA respectivamente con 100 ml de agua destilada, se incubaron las superficies de vidrio modificadas con 30 ml de una solución 300 mM de mercaptoetanol en tampón fosfato de sodio 200 mM, pH 7,5 para desactivar las funciones maleinimido restantes. Después, se lavaron las superficies de vidrio cinco veces respectivamente con 50 ml de agua a TA y a continuación 2 veces respectivamente durante 3 minutos con 50 ml de metanol a TA. Las superficies de vidrio así obtenidas se secaron y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 16 Inmovilización de péptidos que contienen cisteína en superficies de vidrio bromoacetiladas
Se disolvieron los péptidos que contienen cisteína purificados por HPLC en tampón fosfato de sodio 200 mM a pH 6,5 (concentración final del péptido 5 mM). A continuación, se pipeteó a TA respectivamente 1 \mul de esta solución sobre las superficies de vidrio funcionalizadas (véase el ejemplo 5) mediante una pipeta Eppendorf, y se incubaron éstas durante 1 hora a TA en una atmósfera casi saturada de agua. Después de 3 lavados a TA respectivamente con 100 ml de agua destilada, se incubaron las superficies de vidrio modificadas con 30 ml de una solución de mercaptoetanol 300 mM en tampón fosfato de sodio 200 mM, pH 7,5, para desactivar las funciones maleinimido restantes. Después, se lavaron las superficies de vidrio cinco veces respectivamente durante 3 minutos con 50 ml de agua a TA. Las superficies de vidrio así tratadas se secaron y se dispusieron a 4ºC hasta uso poste-
rior.
Ejemplo 17 Inmovilización de péptidos que contienen cisteína en superficies de vidrio funcionalizadas con aldehído
Se disolvieron los péptidos que contienen cisteína purificados en tampón fosfato de sodio 200 mM, pH 5,5 (concentración final del péptido 5 mM) que contiene Tris-carboxietilfosfina 200 mM. A continuación, se pipeteó a TA respectivamente 1 \mul de esta solución sobre las superficies funcionalizadas con aldehído (véase el ejemplo 3) mediante una pipeta Eppendorf, y se incubaron éstas durante 4 horas a TA en una atmósfera casi saturada de agua. Después de 3 lavados a TA respectivamente con 100 ml de agua destilada, se incubaron las superficies de vidrio modificadas con 30 ml de una solución acuosa de hidroxilamina al 40% durante 30 minutos a TA, para desactivar las funciones aldehído restantes. Después, se lavaron las superficies de vidrio cinco veces respectivamente durante 3 minutos con 50 ml de agua a TA y a continuación dos veces respectivamente durante 3 minutos con 50 ml de metanol a TA. Se secaron las superficies de vidrio así tratadas y se dispusieron a 4ºC hasta uso poste-
rior.
Ejemplo 18 Inmovilización de péptidos que contienen cisteína en superficies de vidrio funcionalizadas con maleinimido
a)
Se sintetizaron los péptidos utilizados para inmovilización (43 péptidos que contienen serina/treonina y los correspondientes 43 péptidos control) mediante los procedimientos de síntesis estándar SPOT (R. Frank, Tetrahedron, 48, 1992, pág. 9217-9232; A. Kramer y J. Schneider-Mergener, "Methods in Molecular Biology", vol. 87: "Combinatorial Peptide Library Protocols", pág. 25-39, editado por: S. Cabilly; Humana Press Inc., Totowa, NJ) en celulosa en forma de peptidamidas C-terminales. A este respecto, se disolvieron los correspondientes pentafluorofenilésteres de aminoácidos protegidos con Fmoc en DMF y se pipeteó respectivamente 1 \mul. Se realizó la reacción de acoplamiento respectivamente durante 25 min a TA. Se realizó la escisión del grupo protector Fmoc utilizando 20% de piperidina en DMF a TA. Se realizó la escisión de los grupos protectores permanentes (terc-Bu para serina, treonina, tirosina, ácido glutámico y ácido aspártico; Boc para lisina; tritilo para asparagina, glutamina, cisteína, histidina; y Pbf para arginina) mediante tratamiento en dos etapas con ácido trifluoroacético al 97% a TA. A continuación, se lavaron los péptidos unidos a celulosa con DCM, MeOH y dietiléter y se secaron a vacío. Se realizó la escisión de los péptidos de la celulosa utilizando gas amoniaco durante 24 horas a TA. Se troquelaron los puntos con los péptidos adsorbidos físicamente y se transfirieron a placas de microvaloración de 96 pocillos. Después de la disolución de los péptidos respectivamente con 200 \mul de metanol al 20% en condiciones de ultrasonidos, se filtraron las muestras, se transfirieron a placas de microvaloración de 384 pocillos, se liofilizaron y se dispusieron a -20ºC hasta uso posterior. La siguiente lista proporciona una visión general respecto a las secuencias peptídicas sintetizadas y permite al mismo tiempo la asignación de la numeración de péptidos de las Fig. 8 y 9 (BA1 = \beta-alanina) a las secuencias correspondien-tes.
1
2
3
b)
La aplicación de los péptidos que contienen cisteína presentes en las microplacas sobre las superficies de vidrio funcionalizadas con maleinimido (véase el ejemplo 1) se realizó mediante un NanoPlotter de la compañía Gesim. A este respecto, la distancia punto a punto era de 1 mm. Se aplicaron por punto 0,8 nl de una solución peptídica en tampón PBS 100 mM, pH 7,8 que contenía 20% de glicerina, y se incubó esta disposición durante 4 horas a TA. Después de tres lavados a TA respectivamente con 100 ml de agua destilada, se incubaron las superficies de vidrio modificadas con 30 ml de una solución de mercaptoetanol 300 mM en tampón fosfato de sodio 200 mM, pH 7,5, para desactivar las funciones maleinimido restantes. Después, se lavaron las superficies de vidrio cinco veces respectivamente durante 3 minutos respectivamente con 50 ml de agua a TA, y a continuación dos veces respectivamente durante 3 minutos con 50 ml de metanol a TA. Se secaron las superficies de vidrio así tratadas y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 19 Inmovilización de péptidos de antraniloílo en superficies de vidrio funcionalizadas con aldehído
a)
Se sintetizaron los péptidos utilizados para inmovilización (respectivamente péptidos de 13 unidades que representan la estructura primaria general de la proteína MBP, caseína e histona H1) según los procedimientos de síntesis estándar SPOT (R. Frank, Tetrahedron, 48, 1992, pag. 9217-9232; A. Kramer y J. Schneider-Mergener, "Methods in Molecular Biology", vol. 87: "Combinatorial Peptide Library Protocols", pág. 25-39, editado por: S. Cabilly; Humana Press Inc., Totowa, NJ) en celulosa en forma de peptidamidas C-terminales. A este respecto, se disolvieron los correspondientes pentafluorofenilésteres de aminoácidos protegidos con Fmoc en DMF y se pipeteó respectivamente 1 \mul. Se realizó la reacción acoplamiento por duplicado respectivamente durante 25 min a TA. Se realizó la escisión del grupo protector Fmoc utilizando 20% de piperidina en DMF durante 20 min a TA. Después de la última escisión de Fmoc, se transformaron los extremos N de los péptidos unidos a celulosa mediante una incubación de cinco horas con una solución saturada de ácido isatúrico en DMF a 50ºC en los correspondientes derivados 2-aminobenzoilados. Se realizó la escisión de los grupos protectores permanentes (terc-Bu para serina, treonina, tirosina, ácido glutámico y ácido aspártico; Boc para lisina; tritilo para asparagina, glutamina, cisteína, histidina; y Pbf para arginina) mediante tratamiento en dos etapas con ácido trifluoroacético al 97% a TA. A continuación, se lavaron los péptidos unidos a celulosa con DCM, MeOH y dietiléter y se secaron a vacío. Se realizó la escisión de los péptidos de la celulosa utilizando gas amoniaco durante 24 horas a TA. Se troquelaron los puntos con los péptidos adsorbidos físicamente y se transfirieron a placas de microvaloración de 96 pocillos. Después de la disolución de los péptidos respectivamente con 200 \mul de metanol al 20% en condiciones de ultrasonidos, se filtraron las muestras, se transfirieron a placas de microvaloración de 384 pocillos, se liofilizaron y se dispusieron a -20ºC hasta uso posterior.
b)
Se disolvieron los péptidos de antraniloílo presentes en las placas de microvaloración en tampón fosfato de sodio 200 mM pH 6,0 (concentración final del péptido 0,5 mM) que contenía 15% en vol. de DMSO. A continuación, se aplicaron a TA respectivamente 0,01 \mul de esta solución sobre las superficies de vidrio modificadas con aldehído (véase el ejemplo 3) mediante un NanoPlotter de la compañía Gesim, y se incubaron éstas durante 4 horas a TA. Después de 3 lavados a TA respectivamente con 100 ml de agua destilada, se incubaron las superficies de vidrio modificadas con 30 ml de una solución acuosa al 40% de hidroxilamina durante 30 minutos a TA, para desactivar las funciones aldehído restantes. Después, se lavaron las superficies de vidrio cinco veces respectivamente durante 3 minutos respectivamente con 50 ml de agua a TA, y a continuación dos veces respectivamente durante 3 minutos respectivamente con 50 ml de metanol a TA. Las superficies de vidrio así tratadas se secaron y se dispusieron a -20ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 20 Inmovilización de péptidos que contienen ácido aminooxiacético en superficies de vidrio funcionalizadas con aldehído
a)
Se sintetizaron los péptidos utilizados para inmovilización (respectivamente péptidos de 13 unidades que representan la estructura primaria general de la proteína MBP, caseína e histona H1) según los procedimientos de síntesis estándar SPOT (R. Frank, Tetrahedron, 48, 1992, pag. 9217-9232; A. Kramer y J. Schneider-Mergener, "Methods in Molecular Biology", vol. 87: "Combinatorial Peptide Library Protocols", pág. 25-39, editado por: S. Cabilly; Humana Press Inc., Totowa, NJ) en celulosa en forma de peptidamidas C-terminales. A este respecto, se disolvieron los correspondientes pentafluorofenilésteres de aminoácidos protegidos con Fmoc en DMF y se pipeteó respectivamente 1 \mul. Se realizó la reacción acoplamiento por duplicado respectivamente durante 25 min a TA. Se realizó la escisión del grupo protector Fmoc utilizando 20% de piperidina en DMF durante 20 min a TA. Se aciló el extremo N con ácido Boc-aminooxiacético. Para ello, se activó éste en DMF con 1 equivalente de HOAT/DIC. Se pipeteó respectivamente 1 \mul de esta mezcla sobre cada péptido unido a celulosa y se dejó a TA durante 30 min. Se realizó la escisión de los grupos protectores permanentes (terc-Bu para serina, treonina, tirosina, ácido glutámico y ácido aspártico; Boc para lisina; tritilo para asparagina, glutamina, cisteína, histidina; y Pbf para arginina) mediante tratamiento en dos etapas con ácido trifluoroacético al 97% a TA. A continuación, se lavaron los péptidos unidos a celulosa con DCM, MeOH y dietiléter y se secaron a vacío. Se realizó la escisión de los péptidos de la celulosa utilizando gas amoniaco durante 24 horas a TA. Se troquelaron los puntos con los péptidos adsorbidos físicamente y se transfirieron a placas de microvaloración de 96 pocillos. Después de la disolución de los péptidos respectivamente con 200 \mul de metanol al 20% en condiciones de ultrasonidos, se filtraron las muestras, se transfirieron a placas de microvaloración de 384 pocillos, se liofilizaron y se dispusieron a -20ºC hasta uso posterior.
b)
Se disolvieron los péptidos que contienen ácido aminooxiacético presentes en las placas de microvaloración en DMSO. A continuación, se aplicó a TA respectivamente 1 nl de esta solución sobre las superficies de vidrio modificadas con aldehído (véase el ejemplo 3) mediante un NanoPlotter de la compañía Gesim, y se incubaron éstas durante 4 horas a TA. A este respecto, la distancia punto a punto era de 1,5 mm. Después de 3 lavados a TA respectivamente con 100 ml de agua destilada, se incubaron las superficies de vidrio modificadas con 30 ml de una solución acuosa al 40% de hidroxilamina durante 30 minutos a TA, para desactivar las funciones aldehído restantes. Después, se lavaron las superficies de vidrio cinco veces respectivamente durante 3 minutos respectivamente con 50 ml de agua a TA, y a continuación dos veces respectivamente durante 3 minutos respectivamente con 50 ml de metanol a TA. Las superficies de vidrio así tratadas se secaron y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 21 Inmovilización de péptidos que contienen ácido aminooxiacético en superficies de vidrio bromoacetiladas
a)
Se sintetizaron los péptidos utilizados para inmovilización (respectivamente péptidos de 13 unidades que representan la estructura primaria general de la proteína MBP, caseína e histona H1) según los procedimientos de síntesis estándar SPOT (R. Frank, Tetrahedron, 48, 1992, pag. 9217-9232; A. Kramer y J. Schneider-Mergener, "Methods in Molecular Biology", vol. 87: "Combinatorial Peptide Library Protocols", pág. 25-39, editado por: S. Cabilly; Humana Press Inc., Totowa, NJ) en celulosa en forma de peptidamidas C-terminales. A este respecto, se disolvieron los correspondientes pentafluorofenilésteres de aminoácidos protegidos con Fmoc en DMF y se pipeteó respectivamente 1 \mul. Se realizó la reacción acoplamiento por duplicado respectivamente durante 25 min a TA. Se realizó la escisión del grupo protector Fmoc utilizando 20% de piperidina en DMF durante 20 min a TA. Se aciló el extremo N con ácido Boc-aminooxiacético. Para ello, se activó éste en DMF con 1 equivalente de HOAT/DIC. Se pipeteó respectivamente 1 \mul de esta mezcla sobre cada péptido unido a celulosa y se dejó a TA durante 30 min. Se realizó la escisión de los grupos protectores permanentes (terc-Bu para serina, treonina, tirosina, ácido glutámico y ácido aspártico; Boc para lisina y ácido aminooxiacético; tritilo para asparagina, glutamina, cisteína, histidina; y Pbf para arginina) mediante tratamiento en dos etapas con ácido trifluoroacético al 97% a TA. A continuación, se lavaron los péptidos unidos a celulosa con DCM, MeOH y dietiléter y se secaron a vacío. Se realizó la escisión de los péptidos de la celulosa utilizando gas amoniaco durante 24 horas a TA. Se troquelaron los puntos con los péptidos adsorbidos físicamente y se transfirieron a placas de microvaloración de 96 pocillos. Después de la disolución de los péptidos respectivamente con 200 \mul de metanol al 20% en condiciones de ultrasonidos, se filtraron las muestras, se transfirieron a placas de microvaloración de 384 pocillos, se liofilizaron y se dispusieron a -20ºC hasta uso posterior.
b)
Se disolvieron los péptidos que contienen ácido aminooxiacético presentes en las placas de microvaloración en tampón fosfato de sodio 200 mM, pH 6,0 (concentración final del péptido 0,5 mM) que contiene 25% en vol. de glicerol. A continuación, se aplicaron a TA respectivamente 0,01 \mul de esta solución sobre las superficies de vidrio bromoacetiladas funcionalizadas con amino (véase el ejemplo 5) mediante un NanoPlotter de la compañía Gesim, y se incubaron éstas durante 4 horas a TA. Después de 3 lavados a TA respectivamente con 100 ml de agua destilada, se incubaron las superficies de vidrio modificadas con 30 ml de una solución de mercaptoetanol 300 mM en tampón fosfato de sodio 200 mM, pH 7,5, para desactivar las funciones bromoacetilo restantes. Después, se lavaron las superficies de vidrio cinco veces respectivamente durante 3 minutos respectivamente con 50 ml de agua a TA, y a continuación dos veces respectivamente durante 3 minutos respectivamente con 50 ml de metanol a TA. Las superficies de vidrio así tratadas se secaron y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 22 Inmovilización de péptidos que contienen ácido aminooxiacético en superficies de vidrio funcionalizadas con aldehído
a)
Se sintetizó el péptido utilizado para inmovilización Dpr(Aoa)-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH_{2} mediante procedimientos estándar de la química basada en Fmoc en fase sólida en forma de peptidamida C-terminal. A este respecto, se activaron los correspondientes aminoácidos protegidos con Fmoc con un equivalente de HBTU y tres equivalentes de diisopropiletilamina en DMF y se acoplaron a una resina Rink-amida-MBHA en DMF. Se realizó la escisión del grupo protector Fmoc utilizando 20% de piperidina en DMF durante 30 min a TA. Se realizó la escisión de los grupos protectores permanentes (terc-Bu para serina; Boc para la función aminooxi y Pbf para arginina) y la disolución simultánea de polímero mediante tratamiento en dos etapas con ácido trifluoroacético al 97% a TA. Se filtró la mezcla resultante y precipitó el filtrado mediante la adición de terc-butilmetiléter. Se separó el precipitado y se purificó mediante HPLC en material FI18 con mezclas de acetonitrilo/agua (0,1% de ácido trifluoroacético). Se liofilizaron las fracciones que contenían el producto deseado y se dispusieron a -20ºC hasta uso posterior.
b)
Se disolvió el péptido Dpr(Aoa)-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH_{2} en tampón acetato 200 mM, pH 4,0 (concentración final del péptido 0,5 mM) que contenía 0,25% en vol. de terc-butanol. A continuación, se aplicaron a TA respectivamente 5 nl de esta solución a una disposición de 20 filas y 48 columnas (en total 960 puntos) sobre las superficies de vidrio funcionalizadas con aldehído (vehículo de vidrio Telechem/Arrayit CSS-25) mediante un NanoPlotter de la compañía Gesim. A este respecto, la distancia punto a punto era de 1 mm. A continuación, se incubaron las superficies de vidrio así tratadas durante 4 horas a TA. Después de 3 lavados a TA respectivamente con 100 ml de agua destilada, se incubaron las superficies de vidrio modificadas con 30 ml de una solución acuosa de hidroxilamina al 40% durante 30 min a TA, para desactivar las funciones aldehído restantes. Después, se lavaron las superficies de vidrio cinco veces respectivamente durante 3 minutos con 50 ml de agua a TA y a continuación dos veces respectivamente durante 3 minutos con 50 ml de metanol a TA. Las superficies de vidrio así tratadas se secaron y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 23 Inmovilización de péptidos que contienen cisteína en superficies de vidrio 4-bromometilbenzoiladas
Se disolvió el péptido Cys-\betaAla-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH_{2} purificado por HPLC en tampón fosfato de sodio 200 mM, pH 6,5 (concentración final 2 mM) que contenía 20% en vol. de glicerol. A continuación, se aplicaron a TA respectivamente 2 nl de esta solución a una disposición de 50 filas y 120 columnas (en total 6000 puntos) sobre las superficies de vidrio funcionalizadas con ácido bromometilbenzoico (véase el ejemplo 6) mediante un NanoPlotter de la compañía Gesim. A este respecto, la distancia punto a punto era de 0,4 mm. A continuación, se incubaron las superficies de vidrio así tratadas durante 5 h a TA. Después de 3 lavados a TA respectivamente con 100 ml de agua destilada, se incubaron las superficies de vidrio modificadas con 30 ml de una solución de mercaptoetanol 300 mM en tampón fosfato de sodio 200 mM, pH 7,5, para desactivar las funciones bromometilfenilo restantes. Después, se lavaron las superficies de vidrio cinco veces respectivamente durante 3 minutos con 50 ml de agua a TA, y a continuación dos veces respectivamente durante 3 minutos con 50 ml de metanol a TA. Las superficies de vidrio así tratadas se secaron y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 24 Inmovilización de péptidos que contienen tioamida en superficies de vidrio funcionalizadas con 1-bromo-2,3-dicetobutano
a)
Se sintetizó el péptido utilizado para inmovilización Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH_{2} mediante procedimientos estándar de la química basada en Fmoc en fase sólida en forma de peptidamida C-terminal. Se calentó a reflujo una resina Rink-amida-MBHA unida a Fmoc-Gly-OH durante 3 horas con reactivo de Lawesson. A continuación, se lavó la resina con THF y DCM, se agitó durante 1 hora con DMF y después se lavó con DMF, DCM y metanol. Después de la separación del grupo protector Fmoc con 50% de morfolina en DMF (40 min), se acoplaron los correspondientes aminoácidos protegidos con Fmoc con un equivalente de HBTU y tres equivalentes de diisopropiletilamina en DMF. Se realizó la escisión del grupo protector Fmoc utilizando 20% de piperidina en DMF durante 30 min a TA. Se realizó la escisión de los grupos protectores permanentes (terc-Bu para serina y Pbf para arginina) y la disolución simultánea de polímero mediante tratamiento en dos etapas con ácido trifluoroacético al 97% a TA. Se filtró la mezcla resultante y precipitó el filtrado mediante la adición de terc-butilmetiléter. Se separó el precipitado y se purificó mediante HPLC en material FI18 con mezclas de acetonitrilo/agua (0,1% de ácido trifluoroacético). Se liofilizaron las fracciones que contenían el producto deseado y se dispusieron a -20ºC hasta uso posterior.
b)
Se disolvió el péptido Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-tioamida en tampón fosfato de sodio 200 mM, pH 5,5 (concentración final 1 mM) que contenía 0,5% en vol. de glicerol. A continuación, se aplicó a TA respectivamente 1 nl de esta solución a una disposición de 70 filas y 168 columnas (en total 11760 puntos) sobre las superficies de vidrio funcionalizadas con 1-bromo-2,3-dicetobutano (véase el ejemplo 10) mediante un NanoPlotter de la compañía Gesim. A este respecto, la distancia punto a punto era de 0,3 mm. A continuación, se trataron las superficies de vidrio así tratadas durante 2 min con microondas y después se incubaron durante 3 horas a TA. Después de 3 lavados a TA respectivamente con 100 ml de agua destilada, se incubaron las superficies de vidrio modificadas con 30 ml de una solución acuosa de tioacetamida al 3% durante 30 min a TA, para desactivar las funciones \alpha-bromoceto restantes. Después, se lavaron las superficies de vidrio cinco veces respectivamente durante 3 minutos con 50 ml de agua a TA y a continuación dos veces respectivamente durante 3 minutos con 50 ml de metanol a TA. Las superficies de vidrio así tratadas se secaron y se dispusieron a 4ºC hasta uso posterior.
Ejemplo 25 Análisis de modificaciones peptídicas mediadas por quinasa en superficies de vidrio modificadas (véase la Fig. 4)
Se incubó una superficie de vidrio modificada con el péptido Cys-\betaAla-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH_{2} (tanto en forma del péptido bruto como de péptido purificado mediante HPLC prep.) y el péptido control Cys-\betaAla-Leu-Arg-Arg-Ala-Ala-Leu-Gly-NH_{2} (superficies de vidrio funcionalizadas con maleinimido, véase el ejemplo 1) con 10 ml de ATP 100 \muM en tampón quinasa (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 30 mM, DTT 4 mM, EGTA 2 mM, pH 7,5) durante 10 minutos a TA. A continuación, se pipeteó sobre las superficies de vidrio modificadas con péptido 1 \mul de una mezcla de proteína quinasa A (Sigma, P26452, U/ml), ATP 100 \muM/ml y \gamma-^{32}P-ATP 100 \muCi/ml (Amersham, 9,25 mBq/250 \muCi/25 \mul, actividad > 5000 Ci/mmol) en tampón quinasa (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 30 mM, DTT 4 mM, EGTA 2 mM, pH 7,5) y se incubó durante 30 min a TA en una atmósfera casi saturada de agua. Para reducir el fondo causado por la unión inespecífica de moléculas de ATP o quinasa a las superficies de vidrio, se lavaron las superficies de vidrio modificadas como sigue:
-
3 veces durante 3 minutos a TA con tampón de lavado (1% de SDS y 1% de Tween 20 en tampón TRIS 50 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM),
-
2 veces durante 3 minutos a TA con una solución de NaCl 1 M,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con 80% de ácido fórmico en etanol,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
2 veces durante 5 minutos a 50ºC con una solución que contenía urea 6 M, tiourea 2 M y 1% de SDS,
-
3 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
3 veces durante 3 minutos a TA con metanol.
Después del secado de la superficie de vidrio, se determinó la cantidad de fosfato radiactivo introducido en los péptidos unidos a las superficies mediante un sistema PhosphorImager (FLA-3000, FUJIFILM) (véase la Fig. 4).
Ejemplo 26 Análisis de modificaciones peptídicas mediadas por quinasa en superficies de vidrio modificadas (véase la Fig. 5)
Se incubó una superficie de vidrio modificada con el péptido Cys-\betaAla-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH_{2} y el péptido control Cys-\betaAla-Leu-Arg-Arg-Ala-Ala-Leu-Gly-NH_{2} (superficie de vidrio funcionalizada con maleinimido, véase el ejemplo 1) con 10 ml de ATP 100 \muM en tampón quinasa (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 30 mM, DTT 4 mM, EGTA 2 mM, pH 7,5) durante 10 minutos a TA. Se secó la superficie de vidrio y a continuación se dispuso sobre la superficie de vidrio modificada con péptido un cubreobjetos. Después, se aplicaron 20 \mul de una mezcla de proteína quinasa A (Sigma, P26452, U/ml), ATP 100 \muM/ml y \gamma-^{32}P-ATP 100 \muCi/ml (Amersham, 9,25 mBq/250 \muCi/25 \mul, actividad > 5000 Ci/mmol) en tampón quinasa (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 30 mM, DTT 4 mM, EGTA 2 mM, pH 7,5) mediante fuerza capilar en el intersticio que se creó al apoyar el cubreobjetos sobre la superficie de vidrio modificada. A continuación, se incubó durante 30 min a TA en una atmósfera casi saturada de agua. Para reducir el fondo causado por la unión inespecífica de moléculas de ATP o quinasa a las superficies de vidrio, se lavaron las superficies de vidrio modificadas como sigue:
-
3 veces durante 3 minutos a TA con tampón de lavado (1% de SDS y 1% de Tween 20 en tampón TRIS 50 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM),
-
2 veces durante 3 minutos a TA con una solución de NaCl 1 M,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con 80% de ácido fórmico en etanol,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
2 veces durante 5 minutos a 50ºC con una solución que contenía urea 6 M, tiourea 2 M y 1% de SDS,
-
3 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
3 veces durante 3 minutos a TA con metanol.
Después del secado de la superficie de vidrio, se determinó la cantidad de fosfato radiactivo introducido en los péptidos unidos a las superficies mediante un sistema PhosphorImager (FLA-3000, FUJIFILM) (véase la Fig. 5).
Ejemplo 27 Análisis de modificaciones peptídicas mediadas por quinasa en superficies de vidrio modificadas (véase la Fig. 7)
Se incubó una superficie de vidrio modificada con el péptido Dpr(Aoa)-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-tioamida (véase el ejemplo 22) con 10 ml de ATP 100 \muM en tampón quinasa (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 30 mM, DTT 4 mM, EGTA 2 mM, pH 7,5) durante 10 minutos a TA. Se secó la superficie de vidrio y a continuación se dispuso sobre la superficie de vidrio modificada con péptido una segunda superficie de vidrio no modificada de iguales medidas. Después, se aplicaron 50 \mul de una mezcla de proteína quinasa A (Sigma, P26452, U/ml), ATP 100 \muM/ml y \gamma^{32}-P-ATP 100 \muCi/ml (Amersham, 9,25 mBq/250 \muCi/25 \mul, actividad > 5000 Ci/mmol) en tampón quinasa (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 30 mM, DTT 4 mM, EGTA 2 mM, pH 7,5) mediante fuerza capilar al intersticio que se creó al apoyar la segunda superficie de vidrio sobre la superficie de vidrio modificada. A continuación se incubó durante 30 min a TA en una atmósfera casi saturada de agua. Para reducir el fondo causado por la unión inespecífica de moléculas de ATP o quinasa a las superficies de vidrio, se lavaron las superficies de vidrio modificadas como sigue:
-
3 veces durante 3 minutos a TA con tampón de lavado (1% de SDS y 1% de Tween 20 en tampón TRIS 50 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM),
-
2 veces durante 3 minutos a TA con una solución de NaCl 1 M,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con 80% de ácido fórmico en etanol,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
2 veces durante 5 minutos a 50ºC con una solución que contenía urea 6 M, tiourea 2 M y 1% de SDS,
-
3 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
3 veces durante 3 minutos a TA con metanol.
Después del secado de la superficie de vidrio, se determinó la cantidad de fosfato radiactivo introducido en los péptidos unidos a las superficies mediante un sistema PhosphorImager (FLA-3000, FUJIFILM) (véase la Fig. 7).
Ejemplo 28 Análisis de modificaciones peptídicas mediadas por quinasa en superficies de vidrio modificadas (véase la Fig. 6)
Se incubó una superficie de vidrio modificada con el péptido Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-tioamida (véase el ejemplo 24) con 10 ml de ATP 100 \muM en tampón quinasa (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 30 mM, DTT 4 mM, EGTA 2 mM, pH 7,5) durante 10 minutos a TA. Se secó la superficie de vidrio y a continuación se dispuso sobre la superficie de vidrio modificada con péptido una segunda superficie de vidrio no modificada de iguales medidas. Después, se aplicaron 50 \mul de una mezcla de proteína quinasa A (Sigma, P26452, U/ml), ATP 100 \muM/ml y \gamma^{32}-P-ATP 100 \muCi/ml (Amersham, 9,25 mBq/250 \muCi/25 \mul, actividad > 5000 Ci/mmol) en tampón quinasa (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 30 mM, DTT 4 mM, EGTA 2 mM, pH 7,5) mediante fuerza capilar al intersticio que se creó al apoyar la segunda superficie de vidrio sobre la superficie de vidrio modificada. A continuación se incubó durante 30 min a TA en una atmósfera casi saturada de agua. Para reducir el fondo causado por la unión inespecífica de moléculas de ATP o quinasa a las superficies de vidrio, se lavaron las superficies de vidrio modificadas como sigue:
-
3 veces durante 3 minutos a TA con tampón de lavado (1% de SDS y 1% de Tween 20 en tampón TRIS 50 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM),
-
2 veces durante 3 minutos a TA con una solución de NaCl 1 M,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con 80% de ácido fórmico en etanol,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
2 veces durante 5 minutos a 50ºC con una solución que contenía urea 6 M, tiourea 2 M y 1% de SDS,
-
3 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
3 veces durante 3 minutos a TA con metanol.
Después del secado de la superficie de vidrio, se determinó la cantidad de fosfato radiactivo introducido en los péptidos unidos a las superficies mediante un sistema PhosphorImager (FLA-3000, FUJIFILM) (véase la Fig. 6).
Ejemplo 29 Análisis de modificaciones peptídicas mediadas por quinasa en superficies de vidrio modificadas (véase la Fig. 1)
Se incubó una superficie de vidrio modificada con los péptidos Cys-\betaAla-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH_{2}, Cys-\betaAla-Gln-Lys-Arg-Pro-Ser-Gln-Arg-Ser-Lys-NH_{2} y Cys-\betaAla-Arg-Arg-Lys-Asp-Leu-His-Ap-Asp-Glu-Glu-
Asp-Glu-Ala-Met-Ser-Ile-Thr-Ala-NH_{2} o los correspondientes péptidos control Cys-\betaAla-Leu-Arg-Arg-Ala-Ala-Leu-Gly-NH_{2}, Cys-\betaAla-Gln-Lys-Arg-Pro-Ala-Gln-Arg-Ala-Lys-NH_{2} y Cys-\betaAla-Arg-Arg-Lys-Asp-Leu-His-Asp-Asp-Glu-Glu-Asp-Glu-Ala-Met-Ala-Ile-Ala-Ala-NH_{2} (superficie de vidrio funcionalizada con maleinimido, véase el ejemplo 2) con 10 ml de ATP 100 \muM en tampón quinasa (Tris-HCl 50mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 30 mM, DTT 4 mM, EGTA 2 mM, pH 7,5) durante 10 minutos a TA. A continuación se pipeteó sobre las superficies de vidrio modificadas con péptido 1 \mul de una mezcla de proteína quinasa (proteína quinasa A, Sigma, P2645, 1,67 \mug/ml para Cys-\betaAla-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH_{2} y Cys-\betaAla-Leu-Arg-Arg-Ala-Ala-Leu-Gly-NH_{2}; proteína quinasa C, Sigma, P7956, 1,3 \mug/ml para Cys-\betaAla-Gln-Lys-Arg-Pro-Ser-Gln-Arg-Ser-Lys-NH_{2} y Cys-\betaAla-Gln-Lys-Arg-Pro-Ala-Gln-Arg-Ala-Lys-NH_{2}; caseína quinasa 1, New England Biolabs, P6030S, 2,5 \mug/ml para Cys-\betaAla-Arg-Arg-Lys-Asp-Leu-His-Ap-Asp-Glu-Glu-Asp-Glu-Ala-Met-Ser-Ile-Thr-Ala-NH_{2} y Cys-\betaAla-Arg-Arg-Lys-Asp-Leu-His-Asp-Asp-Glu-Glu-Asp-Glu-Ala-Met-Ala-Ile-Ala-Ala-NH_{2}), ATP 100 \muM/ml y \gamma-^{32}P-ATP 100 \muCi/ml (Amersham 9,25 Bq/250 \muCi/25 \mul, actividad > 5000 Ci/mmol) en tampón quinasa (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 30 mM, DTT 4 mM, EGTA 2 mM, pH 7,5) y se incubó durante 30 min a TA en una atmósfera casi saturada de agua. Para reducir el fondo causado por la unión inespecífica de moléculas de ATP o quinasa a las superficies de vidrio, se lavaron las superficies de vidrio modificadas como sigue:
-
3 veces durante 3 minutos a TA con tampón de lavado (1% de SDS y 1% de Tween 20 en tampón TRIS 50 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM),
-
2 veces durante 3 minutos a TA con una solución de NaCl 1 M,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con 80% de ácido fórmico en etanol,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
2 veces durante 5 minutos a 50ºC con una solución que contenía urea 6 M, tiourea 2 M y 1% de SDS,
-
3 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
3 veces durante 3 minutos a TA con metanol.
Después del secado de la superficie de vidrio, se determinó la cantidad de fosfato radiactivo introducido en los péptidos unidos a las superficies mediante un sistema PhosphorImager (FLA-3000, FUJIFILM) (véase la Fig. 1).
Ejemplo 30 Análisis de modificaciones peptídicas mediadas por quinasa en distintas superficies modificadas (véase la Fig. 2)
Se incubaron superficies modificadas con los péptidos Cys-\betaAla-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH_{2} y Cys-\betaAla-Leu-Arg-Arg-Ala-Ala-Leu-Gly-NH_{2} (superficie de vidrio funcionalizada con maleinimido, véase el ejemplo 1; celulosa funcionalizada con maleinimidobutiril-\beta-alaninina así como membranas de polipropileno funcionalizadas con maleinimidobutiril-\beta-alaninina) con 10 ml de ATP 100 \muM en tampón quinasa (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 30 mM, DTT 4 mM, EGTA 2 mM, pH 7,5) durante 10 minutos a TA. A continuación, se recubrieron las superficies con una mezcla de proteína quinasa A (Sigma, P26452, U/ml), ATP 100 \muM/ml y \gamma-^{32}P-ATP 100 \muCi/ml (Amersham, 9,25 mBq/250 \muCi/25 \mul, actividad > 5000 Ci/mmol) en tampón quinasa (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 30 mM, DTT 4 mM, EGTA 2 mM, pH 7,5) y se incubó durante 30 min a TA en una atmósfera casi saturada de agua. Para reducir el fondo causado por la unión inespecífica de moléculas de ATP o quinasa a las superficies de vidrio, se lavaron las superficies de vidrio modificadas como sigue:
-
3 veces durante 3 minutos a TA con tampón de lavado (1% de SDS y 1% de Tween 20 en tampón TRIS 50 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM),
-
2 veces durante 3 minutos a TA con una solución de NaCl 1 M,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con 80% de ácido fórmico en etanol,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
2 veces durante 5 minutos a 50ºC con una solución que contenía urea 6 M, tiourea 2 M y 1% de SDS,
-
3 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
3 veces durante 3 minutos a TA con metanol.
Después del secado de las superficies, se determinó la cantidad de fosfato radiactivo introducido en los péptidos unidos a las superficies mediante un sistema PhosphorImager (FLA-3000, FUJIFILM) (véase la Fig. 2).
Ejemplo 31 Análisis de modificaciones peptídicas mediadas por quinasa dependientes del tiempo en distintas superficies modificadas (véase la Fig. 3)
Se incubaron superficies modificadas con el péptido Cys-\betaAla-Leu-Arg-Arg-Ala-Ser-Leu-Gly-NH_{2} (superficie de vidrio funcionalizada con maleinimido, véase el ejemplo 1 y celulosa funcionalizada con maleinimidobutiril-\beta-alaninina) con 10 ml de ATP 100 \muM en tampón quinasa (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 30 mM, DTT 4 mM, EGTA 2 mM, pH 7,5) durante 10 minutos a TA. A continuación, se mezclaron las superficies respectivamente con 1 \mul de una mezcla de proteína quinasa A (Sigma, P26452, U/ml), ATP 100 \muM/ml y \gamma-^{32}P-ATP 100 \muCi/ml (Amersham, 9,25 mBq/250 \muCi/25 \mul, actividad > 5000 Ci/mmol) en tampón quinasa (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, MgCl_{2} 30 mM, DTT 4 mM, EGTA 2 mM, pH 7,5) y se incubó durante los tiempos dados a TA en una atmósfera casi saturada de agua. Para reducir el fondo causado por la unión inespecífica de moléculas de ATP o quinasa a las superficies de vidrio, se lavaron las superficies de vidrio modificadas como sigue:
-
3 veces durante 3 minutos a TA con tampón de lavado (1% de SDS y 1% de Tween 20 en tampón TRIS 50 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM),
-
2 veces durante 3 minutos a TA con una solución de NaCl 1 M,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con 80% de ácido fórmico en etanol,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
2 veces durante 5 minutos a 50ºC con una solución que contenía urea 6 M, tiourea 2 M y 1% de SDS,
-
3 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
3 veces durante 3 minutos a TA con metanol.
Después del secado de las superficies, se determinó la cantidad de fosfato radiactivo introducido en los péptidos unidos a las superficies mediante un sistema PhosphorImager (FLA-3000, FUJIFILM) (véase la Fig. 3).
Ejemplo 32 Análisis de modificaciones peptídicas mediadas por quinasa en distintas superficies de vidrio modificadas (véase la Fig. 8)
Se acoplaron exactamente 43 péptidos que contienen serina y/o treonina (péptidos sustrato potenciales para quinasas) y los correspondientes péptidos control, modificados respectivamente en el extremo N con el dipéptido cisteinil-\beta-alanina mediante una adición de Michael, en una superficie de vidrio funcionalizada con maleinimido (véase el ejemplo 18). Se representa la disposición del péptido en la Fig. 8A. Se observa la numeración de los puntos en la Fig. 8C, las secuencias de los péptidos utilizados proceden del ejemplo 18. Se preincubó la superficie de vidrio modificada después de la aplicación del péptido primero con 10 ml de solución de ATP 100 \muM en tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5 durante 10 minutos. A continuación, se recubrió la superficie de vidrio modificada con un cubreobjetos y se introdujo proteína quinasa C (10 U/ml) junto con una mezcla de ATP/\gamma^{32}-P-ATP (100 \muM/ml, 100 \muCi/ml) mediante fuerza capilar en el espacio intermedio creado. Después, se incubó durante 30 minutos a 25ºC. Para reducir el fondo causado por la unión inespecífica de moléculas de ATP o quinasa a las superficies de vidrio, se lavaron las superficies de vidrio modificadas como sigue:
-
3 veces durante 3 minutos a TA con tampón de lavado (1% de SDS y 1% de Tween 20 en tampón TRIS 50 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM),
-
2 veces durante 3 minutos a TA con una solución de NaCl 1 M,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con 80% de ácido fórmico en etanol,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
2 veces durante 5 minutos a 50ºC con una solución que contenía urea 6 M, tiourea 2 M y 1% de SDS,
-
3 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
3 veces durante 3 minutos a TA con metanol.
Después del secado de las superficies, se determinó la cantidad de fosfato radiactivo introducido en los péptidos unidos a las superficies mediante un sistema PhosphorImager (FLA-3000, FUJIFILM). Se representa la figura resultante en la Fig. 8B. Los puntos con mayor intensidad de señal en los tres subconjuntos se asignaron a los correspondientes péptidos fosforilados con proteína quinasa C. Se muestran sus estructuras primarias en la Fig. 8D. Resulta evidente que los péptidos conocidos como sustratos de proteína quinasa C (nº de péptido sustrato 3, 23, 27, 41, 43) y otros no descritos como sustratos de proteína quinasa C de esta quinasa se reconocieron sobre la superficie de vidrio modificada y se fosforilaron. Así, resulta evidente que dicha disposición es adecuada para caracterizar la especificidad de sustrato de una quinasa, como por ejemplo proteína quinasa C.
Ejemplo 33 Análisis de modificaciones peptídicas mediadas por quinasa en distintas superficies modificadas (véase la Fig. 9)
Se acoplaron exactamente 43 péptidos que contienen serina y/o treonina(péptidos sustrato potenciales para quinasas) y los correspondientes péptidos control, modificados respectivamente en el extremo N con el dipéptido cisteinil-\beta-alanina mediante una adición de Michael, en una superficie de vidrio funcionalizada con maleinimido (véase el ejemplo 18). Se representa la disposición del péptido en la Fig. 8A. Se observa la numeración de los puntos en la Fig. 8C, las secuencias de los péptidos utilizados proceden del ejemplo 18. Se preincubó la superficie de vidrio modificada después de la aplicación del péptido primero con 10 ml de solución de ATP 100 \muM en tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5 durante 10 minutos. A continuación, se recubrió la superficie de vidrio modificada con un cubreobjetos y se introdujo proteína quinasa A (10 U/ml) junto con una mezcla de ATP/\gamma^{32}-P-ATP (100 \muM/ml, 100 \muCi/ml) mediante fuerza capilar en el espacio intermedio creado. Después, se incubó durante 30 minutos a 25ºC. Para reducir el fondo causado por la unión inespecífica de moléculas de ATP o quinasa a las superficies de vidrio, se lavaron las superficies modificadas como sigue:
-
3 veces durante 3 minutos a TA con tampón de lavado (1% de SDS y 1% de Tween 20 en tampón TRIS 50 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM),
-
2 veces durante 3 minutos a TA con una solución de NaCl 1 M,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con 80% de ácido fórmico en etanol,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
2 veces durante 5 minutos a 50ºC con una solución que contenía urea 6 M, tiourea 2 M y 1% de SDS,
-
3 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
3 veces durante 3 minutos a TA con metanol.
Después del secado de las superficies, se determinó la cantidad de fosfato radiactivo introducido en los péptidos unidos a las superficies mediante un sistema PhosphorImager (FLA-3000, FUJIFILM). Se representa la figura resultante en la Fig. 9B. Los puntos con mayor intensidad de señal en los tres subconjuntos se asignaron a los correspondientes péptidos fosforilados con proteína quinasa A. Se muestran sus estructuras primarias en la Fig. 9D. Resulta evidente que, con una excepción, se reconocieron y fosforilaron por la proteína quinasa A todos los péptidos que portan dos restos arginina en la posición 2 y 3 (N-terminal) de serina sobre la superficie de vidrio modificada. Este motivo de secuencia RRxS se describe como motivo de sustrato preferido para la proteína quinasa A (A. Kreegipuu, N., Blom. S., Brunak, J., Jarv, 1998, "Statistical analysis of protein kinase specificity determinants", FEBS Lett., 430, 45-50). El péptido 83 no se fosforila probablemente a causa de la localización demasiado N-terminal del motivo de sustrato. Por tanto, resulta evidente que dicha disposición es adecuada para caracterizar la especificidad de sustrato de una quinasa como por ejemplo proteína quinasa A.
Ejemplo 34 Análisis de modificaciones peptídicas mediadas por quinasa en distintas superficies modificadas (véase la Fig. 10)
Se acoplaron exactamente 79 péptidos, respectivamente modificados en el extremo N con el dipéptido ácido aminooxiacético-\beta-alanina, en una superficie de vidrio funcionalizada con aldehído (véase el ejemplo 20). Se representa la estructura primaria de la MBP en la Fig. 10C. Para los restos destacados en negrita se ha descrito una fosforilación mediante proteína quinasa A en el estado de la técnica (A. Kishimoto, K. Nishiyama, H. Nakanishi, Y. Uratsuji, H. Nomura, Y. Takeyama, Y. Nishizuka, 1985, ``Studies on the phosphorylation of myelin basic protein by protein kinase C and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase, J. Biol. Chem., 260, 12492-12499). Los péptidos de 13 unidades en el barrido presentan un desplazamiento de secuencia de 2 aminoácidos. La disposición del péptido se representa en la Fig. 10B. Por tanto, el péptido nº 1 representa la secuencia de aminoácidos 1-13 de la estructura primaria de la MBP, el péptido nº 2 la secuencia de aminoácidos 3-15 de la estructura primara de MBP, y así. Se aplicaron tres subconjuntos idénticos sobre la superficie de vidrio. En la Fig. 10A, se representa uno de estos subconjuntos. Se preincubó la superficie de vidrio modificada después de la aplicación del péptido primero con 10 ml de solución de ATP 100 \muM en tampón fosfato de sodio 50 mM, pH 7,5 durante 10 minutos. A continuación, se recubrió la superficie de vidrio modificada con un cubreobjetos y se aplicó al espacio intermedio creado proteína quinasa A (10 U/ml) junto con una mezcla de ATP/\gamma^{32}P-ATP (100 \muM/ml, 100 \muCi/ml) mediante fuerza capilar. Después, se incubó durante 30 minutos a 25ºC. Para reducir el fondo causado por la unión inespecífica de moléculas de ATP o quinasa a las superficies de vidrio, se lavaron las superficies modificadas como sigue:
-
3 veces durante 3 minutos a TA con tampón de lavado (1% de SDS y 1% de Tween 20 en tampón TRIS 50 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM),
-
2 veces durante 3 minutos a TA con una solución de NaCl 1 M,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con 80% de ácido fórmico en etanol,
-
2 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
2 veces durante 5 minutos a 50ºC con una solución que contenía urea 6 M, tiourea 2 M y 1% de SDS,
-
3 veces durante 3 minutos a TA con agua destilada,
-
3 veces durante 3 minutos a TA con metanol.
Después del secado de las superficies, se determinó la cantidad de fosfato radiactivo introducido en los péptidos unidos a las superficies mediante un sistema PhosphorImager (FLA-3000, FUJIFILM). Se representa la figura resultante en la Fig. 10A. Los puntos con mayor intensidad de señal en los tres subconjuntos se asignaron a los correspondientes péptidos fosforilados con proteína quinasa A. Se muestran sus estructuras primarias en la Fig. 10D. Resulta evidente que la mayoría de los péptidos, que podían encontrarse también en el experimento llevado a cabo en solución (A. Kishimoto, K. Nishiyama, H. Nakanishi, Y. Uratsuji, H. Nomura, Y. Takeyama, Y. Nishizuka, 1985, "Studies on the phosphorylation of myelin basic protein by protein kinase C and adenosine 3':5'-monophosphate-dependent protein kinase", J. Biol. Chem., 260, 12492-12499), se reconocieron por la proteína quinasa A y se fosforilaron sobre la superficie de vidrio modificada.
Las características de la invención dadas a conocer en la descripción, los ejemplos, las reivindicaciones, las figuras y el protocolo de secuencias anteriores pueden ser esenciales tanto individualmente como en cualquier combinación para la ejecución de la invención en sus distintas formas de realización.

Claims (25)

1. Procedimiento para la determinación de la especificidad de sustrato de una actividad enzimática que comprende las siguientes etapas:
-
preparación de una disposición que comprende una pluralidad de secuencias de aminoácidos sobre una superficie plana de un material vehiculante, estando inmovilizadas ordenadamente las secuencias de aminoácidos,
-
puesta en contacto y/o incubación de una actividad enzimática con la disposición, y
-
análisis de una reacción entre una o varias de las secuencias de aminoácidos inmovilizadas en la disposición y la actividad enzimática.
caracterizado porque en la reacción de la actividad enzimática con la disposición se realiza un cambio del peso molecular de al menos unas de las secuencias de aminoácidos y la superficie es una superficie no porosa.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque el análisis de la reacción se realiza en o utilizando la secuencia de aminoácidos inmovilizada sobre la superficie del material vehiculante.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque el cambio del peso molecular se realiza mediante la formación o escisión de un enlace covalente en una de las secuencias de aminoácidos, preferiblemente en aquella secuencia de aminoácidos que reacciona con la actividad enzimática.
4. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el análisis de la reacción se realiza mediante la detección del cambio del peso molecular.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el análisis se realiza mediante un procedimiento de análisis que se selecciona del grupo que comprende autorradiografía, espectroscopia de resonancia de plasmón y espectroscopia de fluorescencia.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque al menos una de las secuencias de aminoácidos es un sustrato para una actividad enzimática.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la disposición de las secuencias de aminoácidos presenta al menos un sustrato para al menos dos actividades enzimáticas distintas.
8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la actividad enzimática se selecciona del grupo que comprende oxidorreductasas, transferasas, hidrolasas, liasas y ligasas, y se selecciona especialmente del grupo que comprende quinasas, sulfotransferasas, glicosiltransferasas, acetiltransferasas, farnesiltransferasas, palmitiltransferasas, fosfatasas, sulfatasas, esterasas, lipasas, acetilasas y proteasas.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque el análisis de la reacción entre las secuencias de aminoácidos inmovilizadas sobre la disposición y la actividad enzimática se repite varias veces, preferiblemente en momentos separados.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque se determina la actividad enzimática en una muestra y la muestra se selecciona del grupo que comprende orina, líquido cefalorraquídeo, esputo, heces, líquido linfático, lisados celulares, lisados de tejido, lisados de órgano, extractos, extractos brutos, preparados purificados y preparados no purificados.
11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el material vehiculante es vidrio.
12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos está inmovilizada mediante un grupo que comprende azufre en la superficie de vidrio.
13. Disposición de una pluralidad de secuencias de aminoácidos sobre una superficie, en la que las secuencias de aminoácidos están inmovilizadas orientadamente sobre la superficie plana de un material vehiculante, caracterizada porque al menos una de las secuencias de aminoácidos representa un sustrato para una actividad enzimática, en la que se realiza un cambio del peso molecular en el sustrato por la actividad enzimática, y en la que la superficie es una superficie no porosa.
14. Disposición según la reivindicación 13, caracterizada porque el cambio del peso molecular se realiza mediante la formación o escisión de un enlace covalente en el sustrato.
15. Disposición según la reivindicación 13 ó 14, caracterizada porque la disposición de las secuencias de aminoácidos presenta al menos un sustrato para al menos dos actividades enzimáticas distintas.
16. Disposición según las reivindicaciones 13 a 15, caracterizada porque el material vehiculante se selecciona del grupo que comprende silicatos, cerámica, vidrio, metales y materiales vehiculantes orgánicos.
17. Disposición según una de las reivindicaciones 13 a 16, caracterizada porque las secuencias de aminoácidos se seleccionan del grupo que comprende péptidos, oligopéptidos, polipéptidos y proteínas, así como sus respectivos derivados.
18. Disposición según una de las reivindicaciones 13 a 17, caracterizada porque se dispone definidamente cada una de dichas secuencias de aminoácidos o grupo de secuencias de aminoácidos respecto a otra secuencia de aminoácidos o grupos de secuencias de aminoácidos.
19. Vehículo que comprende una disposición según una de las reivindicaciones precedentes.
20. Vehículo según la reivindicación 19, caracterizado porque el vehículo comprende un material vehiculante básico.
21. Vehículo según la reivindicación 19 ó 20, caracterizado porque la disposición dispone una pluralidad de secuencias de aminoácidos sobre una o varias superficies del vehículo.
22. Disposición vehiculante que comprende al menos dos vehículos según una de las reivindicaciones 19 a 21, estando separados respectivamente los dos vehículos por un intersticio.
23. Disposición vehiculante según la reivindicación 22, caracterizada porque al menos una disposición sobre un primer vehículo está enfrentada con una disposición sobre un segundo vehículo.
24. Disposición vehiculante según la reivindicación 22 ó 23, caracterizada porque el intersticio presenta una anchura de aproximadamente 0,01 mm a 10 mm, preferiblemente de aproximadamente 0,1 mm a 2 mm, y preferiblemente de aproximadamente 0,5 mm a 1 mm.
25. Uso de una disposición según una de las reivindicaciones 13 a 18 y/o un vehículo según una de las reivindicaciones 19 a 21 y/o una disposición vehiculante según una de las reivindicaciones 22 a 24 en un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 12.
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