ES2230512T3

ES2230512T3 - Procedimiento de preparacion de un extracto de hojas de ginkgo biloba altamente enriquecido en principios activos.

Info

Publication number: ES2230512T3
Application number: ES02761922T
Authority: ES
Inventors: Beng-Poon Teng
Original assignee: Societe de Conseils de Recherches et dApplications Scientifiques SCRAS SAS
Current assignee: Ipsen Pharma SAS
Priority date: 2001-04-10
Filing date: 2002-04-09
Publication date: 2005-05-01
Anticipated expiration: 2022-04-09
Also published as: CN1245167C; FR2823116B1; HUP0303797A3; FR2823116A1; CA2443302A1; CN1501806A; RU2003132470A; DK1379262T3; JP2004538263A; EP1379262B1; KR20030087068A; HUP0303797A2; DE60201525T8; ATE278411T1; DE60201525D1; PL366938A1; CA2443302C; US20040109907A1; JP4416404B2; RU2297235C2

Abstract

Procedimiento de preparación de un extracto de hojas de Ginkgo biloba, que comprende las siguientes etapas sucesivas: vi. extracción de fragmentos secos de hojas de Ginkgo biloba en etanol que contiene como máximo 20% en peso de agua; vii. concentración del extracto a presión reducida en presencia de una disolución acuosa de cloruro de sodio y eliminación del aceite oscuro del resto de la disolución clara; viii. lavado de la disolución acuosa residual por extracción líquido-líquido con n-hexano, n-heptano o ciclohexano; ix. extracción líquido-líquido de la fase acuosa lavada con acetato de etilo; x. lavado de la fase acetato de etilo obtenida en la etapa iv con una disolución de cloruro de sodio y luego evaporación a sequedad de la fase acetato de etilo lavada.

Description

Procedimiento de preparación de un extracto de hojas de Ginkgo biloba altamente enriquecido en principios activos.

La invención se refiere a un procedimiento de preparación de un extracto de hojas de Ginkgo biloba altamente enriquecido en principios activos.

Algunas preparaciones fitofarmacéuticas normalizadas a base de extractos de hojas de Ginkgo biloba se utilizan actualmente para tratar trastornos vasculares cerebrales y periféricos, principalmente en Europa, en Estados Unidos y en Extremo Oriente.

El extracto de Ginkgo biloba utilizado con más frecuencia en la actualidad (EGb 761®) contiene 24% de flavonaglicósidos, 3% de ginkgólidos A, B, C y J en total y 3% de bilobálido (cf. K. Drieu, La Presse Médicale (1986), 15, 1455-1457). La dosis diaria recomendada para un paciente es de 120 miligramos.

La patente US 5.399.348 describe por ejemplo un método para preparar un extracto de Ginkgo biloba, con una composición media de 24% de glicósidos de flavona, 3% de ginkgólidos A, B, C y J y 3% de bilobálido. Este método comprende las siguiente etapas:

i.: extracción del polvo seco de hojas en acetona que contiene 40% en peso de agua;

ii.: eliminación de los lípidos por concentración del extracto a presión reducida hasta obtener un concentrado que contiene aproximadamente 30% de sólidos para eliminar así la acetona y luego dilución con agua para obtener una concentración de 15% en sólidos, enfriamiento de la suspensión obtenida a aproximadamente 10ºC durante una hora antes de eliminar por filtración los precipitados lipídicos;

iii.: enriquecimiento de la fase orgánica por adición de una disolución de sulfato de amonio al 30% al filtrado acuoso seguido por una extracción líquido-líquido con una mezcla de metiletilcetona y de acetona (entre 9:1 y 4:6) y concentración de la fase orgánica para obtener una concentración de 50 a 70% en sóli- dos;

iv.: eliminación de los taninos por dilución del concentrado en una mezcla de agua y de etanol 50/50 en peso para obtener una concentración de 10% en sólidos, adición de una disolución acuosa de una sal de plomo hasta que el color pase de pardo a ámbar y filtración del precipitado de plomo-taninos para obtener un filtrado claro;

v.: eliminación del plomo en forma de su sulfato insoluble por concentración del filtrado para guardar una proporción máxima de 5% en etanol, adición de sulfato de amonio hasta una concentración de aproximadamente 20% seguido de una extracción líquido-líquido con una mezcla de metiletilcetona y etanol (entre 8:2 y 1:1); y

vi.: secado del producto final por concentración de la fase orgánica para obtener una concentración de 50 a 70% en sólidos y secado a vacío en un horno a 60-80ºC para aislar el producto final que contiene menos de 5% de agua.

Durante estos diez últimos años, se han realizado grandes esfuerzos para enriquecer la parte de los compuestos activos de los extractos de ginkgo biloba reduciendo al mismo tiempo la parte de los compuestos alergénicos alquilfenólicos de cadena larga, tales como los ácidos ginkgólicos.

Existe un cierto número de solicitudes de patentes y de patentes que describen procedimientos que permiten obtener extractos de hojas de ginkgo biloba enriquecidos en glicósidos de flavona y lactonas de terpeno.

Por ejemplo, la patente US 5.389.370 se refiere a métodos de preparación de extractos concentrados en compuestos activos. La estrategia empleada en este caso es mezclar la fracción rica en glicósidos de flavona obtenida por extracción líquido-líquido con bilobálido y ginkgólidos aislados gracias a una separación cromatográfica en columna para obtener las composiciones deseadas que contienen típicamente 50% de glicósidos de flavona, 6% de bilobálido, 50% de glicósidos de flavona y 7% de ginkgólidos o 50% de glicósidos de flavona, 6% de bilobálido y 7% de ginkgólidos. El procedimiento descrito recoge las dos primeras etapas de la patente US 5.399.348 citada anteriormente (que se designarán aquí como las etapas 1 y 2) a las que se añaden las siguientes etapas sucesivas:

3. enriquecimiento de las fases orgánicas: extracción líquido-líquido con una mezcla de acetato de etilo y de hexano (9:1), volviendo a extraer la fase acuosa con n-butanol y concentrándose la fase n-butanol obtenida a sequedad para obtener la fracción rica en glicósidos de flavona;

4. tratamiento con carbono activo: lavado de la fase acetato de etilo-hexano con agua, siendo, a continuación, la fase acetato de etilo-hexano lavada tratada con carbono activo, filtrada y concentrada en seco;

5. recristalización: disolución del residuo sólido en una mezcla 50/50 en peso de etanol y agua, enfriamiento para cristalizar y filtración para recuperar los ginkgólidos;

6. cromatografía en columna: concentración a sequedad del sobrenadante de la etapa 5 y separación cromatográfica sobre columna de gel de sílice para obtener fracciones ricas en bilobálido y en ginkgólidos; y

7. mezcla de fracciones: mezcla de la fracción rica en glicósidos de flavona de la etapa 3 con los ginkgólidos obtenidos en la etapa 5 ó 6 y/o con el bilobálido obtenido en la etapa 6.

Según una variante del procedimiento anterior, las etapas 4 y 5 se pueden reemplazar por una cromatografía en columna.

Por otra parte, la patente US 6.030.621 describe un método de obtención de extractos de Ginkgo biloba enriquecido en glicósidos de flavona y en lactonas de terpeno. La estrategia empleada es análoga a la de la patente US 5.89.370: la fracción rica en glicósidos de flavona se mezcla con las fracciones ricas en lactonas de terpeno, obteniéndose estas últimas por cromatografía en columna. Típicamente, los extractos preparados comprenden 47,2% de glicósidos de flavona y 6,3% de lactonas de terpeno o 70% de glicósidos de flavona y 10% de lactonas de terpeno. Este método comprende las siguientes etapas:

a): extracción del polvo seco de hojas en etanol que contiene 50% en peso de agua;

b): eliminación de los lípidos por concentración del extracto a presión reducida hasta eliminación del etanol, dilución del concentrado con agua, reposo de la mezcla durante 48 horas y filtración de los precipitados lipídicos;

c): captura de los compuestos activos por paso del filtrado acuoso a través de una resina que consiste en una mezcla de resina XAD-4 (mezcla de polímeros porosos) y de poliamida;

d): elución de los compuestos activos utilizando mezclas de etanol-agua sucesivas que contienen 30, 60 y 90% en peso de etanol; y

e): combinación de todas las fracciones obtenidas en d), evaporación del etanol, lavado del concentrado acuoso con hexano y evaporación a sequedad de la fase acuosa lavada para obtener un extracto que contiene 47,2% de glicósidos de flavona y 6,3% de lactonas de terpeno.

En una variante del procedimiento anterior, la fracción obtenida a partir de la mezcla etanol-agua que contiene 30% de etanol se somete a una cromatografía por desorción súbita para obtener una fracción que contiene al menos 80% de lactonas de terpeno. De la misma forma, las fracciones obtenidas a partir de las mezclas etanol-agua que contienen 60-90% de etanol se combinan y someten a una cromatografía por desorción súbita para obtener una fracción que contiene al menos 80% de glicósidos de flavona. La fracción que contiene al menos 80% de glicósidos de flavona y la fracción que contiene al menos 80% de terpeno-laconas se mezclan en diferentes proporciones y permiten obtener extractos que contienen hasta 70% de glicósidos de flavona y 10% de lactonas de terpeno.

Debido a las crecientes exigencias en materia de seguridad sanitaria, resulta preferible utilizar principios activos cada vez más puros. La tendencia para los extractos de Ginkgo biloba sería por lo tanto la de abandonar un día los extractos como el EGb 761® en beneficio de extractos todavía más ricos en principios activos. Típicamente, se podrían considerar extractos que contengan al menos 50% en peso de glicósidos de flavona y 12% en peso de lactonas de terpeno, o bien extractos que contengan al menos 30% en peso de lactonas de terpeno y al menos 15% en peso de glicósidos de flavona. Los procedimientos de las patentes US 5.389.370 ó 6.030.621 permitirían obtener dicho extracto pero se comprueba sin embargo que son costosos cuando se trata de utilizarlos a una escala industrial debido principalmente a la presencia de etapas de separación por cromatografía.

La solicitante acaba de poner a punto un método que permite obtener extractos de hojas de Ginkgo biloba que responden a las especificaciones indicadas sin utilizar ninguna etapa de separación por cromatografía.

La invención tiene por lo tanto como objetivo un procedimiento de preparación de un extracto de hojas de Ginkgo biloba, que comprende las siguientes etapas sucesivas:

i.: extracción de fragmentos secos de hojas de Ginkgo biloba en etanol que contiene como máximo 20% en peso de agua;

ii.: concentración del extracto a presión reducida en presencia de una disolución acuosa de cloruro de sodio y eliminación del aceite oscuro del resto de la disolución clara;

iii.: lavado de la disolución acuosa residual por extracción líquido-líquido con n-hexano, n-heptano o ciclohexano;

iv.: extracción líquido-líquido de la fase acuosa lavada con acetato de etilo;

v.: lavado de la fase acetato de etilo obtenida en la etapa iv con una disolución de cloruro de sodio y luego evaporación a sequedad de la fase acetato de etilo lavada.

Por fragmentos secos de hojas de Ginkgo biloba, se entiende en la presente solicitud fragmentos secos cuyo tamaño de partícula no excede de 5 mm.

Preferentemente según la invención, los fragmentos secos de hojas de Ginkgo biloba estarán en forma de polvo seco. Por polvo, se entiende en la presente solicitud un polvo cuyo tamaño de partícula no excede de 1 mm (y preferentemente de 0,5 mm).

El procedimiento según la invención se puede aplicar:

-: bien a fragmentos (y preferentemente a un polvo) de hojas de Ginkgo biloba liofilizadas, en cuyo caso se obtendrán extractos que contienen al menos 50% en peso de glicósidos de flavona y 12% en peso de lactonas de terpeno;

-: bien a fragmentos (y preferentemente a un polvo) de hojas de Ginkgo biloba secadas, en cuyo caso se obtendrán extractos -denominados en adelante "extractos principales"- que contienen al menos 30% en peso de lactonas de terpeno y al menos 15% en peso de glicósidos de flavona (permitiendo dicho procedimiento en este caso obtener además como producto anexo de los extractos -en adelante denominados "extractos anexos"- análogos a los descritos en la solicitud de patente PCT WO 96/33.728, es decir extractos que contienen aproximadamente 30 a 35% en peso de glicósidos de flavona y aproximadamente 1% en peso de lactonas de terpeno).

Según una de las variantes de la invención, el procedimiento descrito anteriormente se aplicará a fragmentos (o a un polvo) de hojas de Ginkgo biloba liofilizados y el extracto obtenido será preferentemente tal que contenga aproximadamente 52% en peso de glicósidos de flavona y aproximadamente 13% en peso de lactonas de terpeno.

Según la variante preferida de la invención, el procedimiento descrito anteriormente se aplicará a fragmentos (o a un polvo) de hojas de Ginkgo biloba secadas y el extracto principal obtenido será preferentemente tal que contenga 34 a 46% en peso de lactonas de terpeno y de 18 a 30% en peso de glicósidos de flavona. Más preferentemente, el procedimiento descrito anteriormente se aplicará a fragmentos (o a un polvo) de hojas de Ginkgo biloba secadas y el extracto principal obtenido será tal que contenga de 36 a 44% en peso de lactonas de terpeno y de 20 a 28% en peso de glicósidos de flavona. En particular, el procedimiento descrito anteriormente se aplicará a fragmentos (o a un polvo) de hojas de Gingko biloba secadas y el extracto principal obtenido contendrá aproximadamente 40% en peso de lactonas de terpeno (de las que serán aproximadamente 24,5% en peso de ginkgólidos A, B y C y aproximadamente 15,5% en peso de bilobálido) y aproximadamente 24% en peso de glicósidos de flavona.

Preferentemente, la extracción de la etapa i se hará por medio de etanol que contenga entre 10 y 20% en peso de agua, y más preferentemente entre 15 y 20% en peso de agua.

Preferentemente también, la mezcla obtenida después de concentración del extracto a presión reducida en presencia de una disolución acuosa de cloruro de sodio durante la etapa ii se enfriará, por ejemplo a una temperatura de aproximadamente 10ºC, preferentemente durante un tiempo de 10 ó 15 minutos a 1 ó 2 horas, antes de efectuar la eliminación del aceite oscuro del resto de la disolución clara. Siempre preferentemente, se añadirá celita a la mezcla obtenida después de la concentración del extracto a presión reducida en presencia de una disolución acuosa de cloruro de sodio durante la etapa ii y la totalidad del etanol presente en dicha mezcla se evaporará antes de proceder al enfriamiento de dicha mezcla.

De preferencia igualmente, el lavado de la etapa iii se efectuará con n-heptano.

Según una variante particularmente preferida del procedimiento de la invención cuando éste se aplica a fragmentos (o a un polvo) de hojas de Ginkgo biloba secadas, el volumen de la disolución acuosa residual de la etapa iii y la cantidad de cloruro de sodio en la disolución se ajustarán previamente para que, por una parte, el contenido en peso de sólidos hidrosolubles sea de aproximadamente 8% en relación al peso total de la disolución, y por otra parte, el contenido en peso de cloruro de sodio sea de 16% en relación al peso total de la disolución. El contenido en sólidos hidrosolubles se evalúa tomando una muestra de disolución etanólica que se evapora para eliminar etanol y luego se extrae con diclorometano, siendo la fase residual acuosa a continuación evaporada a sequedad y pesada; el contenido en sólidos hidrosolubles se puede entonces deducir de la masa de residuo sólido obtenida.

En lo relativo a la etapa iv, la metiletilcetona que contiene de 2 a 10% de acetona o de etanol en términos de volumen podría eventualmente reemplazar al acetato de etilo.

En lo relativo a las disoluciones acuosas de cloruro de sodio empleadas en las etapas ii y v, tendrán preferentemente una concentración de al menos 10% en peso de cloruro de sodio para la etapa ii mientras que estarán preferentemente saturadas con cloruro de sodio para la etapa v.

Según una variante preferida del procedimiento anterior aplicado a fragmentos (o a un polvo) de hojas de Ginkgo biloba secadas, la fase acuosa salina recuperada después de la extracción líquido-líquido de la etapa iv podría retirarse mediante un procedimiento que comprende las siguientes etapas:

a): extracción líquido-líquido por medio de una mezcla de aproximadamente 1:1 de acetato de etilo y de etanol; y

b): evaporación en seco de la fase orgánica recuperada después de la etapa a);

c): disolución del residuo obtenido en la etapa b) en etanol absoluto para obtener una concentración de aproximadamente 5% a 10% en peso de sólidos en relación con la masa de la disolución etanólica;

d): enfriamiento de la mezcla a una temperatura preferentemente inferior o igual a 10ºC (por ejemplo a una temperatura de 2 a 8ºC), preferentemente durante un tiempo de 30 minutos a 12 horas; y

e): filtración y evaporación del etanol del filtrado recuperado para dar un extracto seco.

Este procedimiento adicional permite recuperar un extracto suplementario, que contiene generalmente aproximadamente 30 a 35% en peso de glicósidos de flavona y aproximadamente 1% en peso de lactonas de terpeno.

Opcionalmente, el procedimiento descrito anteriormente podrá comprender, después de las etapas i a v, la etapa vi siguiente:

iv. disolución del extracto seco en etanol y enfriamiento de la disolución a una temperatura preferentemente inferior o igual a 10ºC (por ejemplo a una temperatura de 2 a 8ºC), filtración de la sal eventualmente precipitada y evaporación a sequedad de la disolución resultante.

En este caso, cuando el procedimiento de la invención se utilice a escala industrial, se preferirá para la etapa v simplemente concentrar la fase orgánica hasta obtener una concentración de aproximadamente 50 a 70% en peso de sólidos (y no evaporarlo a sequedad) y añadir etanol para obtener una composición que contenga 5 a 20% en peso de agua, 5 a 20% en peso de sólidos y el resto de etanol antes de efectuar la etapa vi. Procediendo así, se economizará una etapa de secado.

Los extractos principales obtenidos según la invención son utilizadas en farmacia o en el campo de la alimentación (por ejemplo como ingredientes de suplementos nutricionales) ya que, por una parte, contienen menos de 5 ppm de alquilfenoles (medida efectuada por dosificación HPLC) y, por otra parte, contienen menos de 0,3% de prodelfinidinas (preferentemente menos de 0,25% y generalmente entre 0,05 y 0,25% de prodelfinidinas). Por otra parte, también tienen pocas impurezas lipófilas y pocos polisacáridos, proantocianidinas diferentes a las prodelfinidinas y proteínas de peso molecular elevado.

En particular, debido a su bajo contenido en prodelfinidinas, los extractos principales según la invención se adaptarán mejor a una administración a los pacientes por vía intravenosa. Como comparación, un extracto comercial tal como el EGb 761® puede contener hasta 1,5% de prodelfinidinas.

Además, los extractos principales de la invención serán preferentemente tales que los picos correspondientes al O-ramnopiranosil-4-O-D-(trans-p-cumaroil-6''')glucopiranosiloxi-3-tetrahidroxi- 3',4',5,7-flavonol (ó 3-(6'''-trans-p-cumaroil)-glucoramnósido de quercetina)O-ramnopiranosil-4-O- D-(trans-p-cumaroil-6''')glucopiranosiloxi-3-trihidroxi-4',5,7-flavonol (ó 3-(6''''-trans-p-cumaroil)-glucoramnósido de kampferol) representarán juntos aproximadamente 39% de la superficie total de los picos del cromatograma. En particular, los extractos principales de la invención serán preferentemente tales como el pico correspondiente al O-ramnopiranosil-4-O-D-(trans-p-cumaroil-6''')glucopiranosiloxi-3-tetrahidroxi- 3',4',5,7-flavonol (ó 3-(6'''-trans-p-cumaroil)-glucoramnósido de quercetina) representará aproximadamente 20% de la superficie total de los picos del cromatograma. Incluso, los extractos principales de la invención serán preferentemente tales que el pico correspondiente al O-ramnopiranosil-4-O-D-(trans-p-cumaroil-6''')glucopiranosiloxi-3-trihidroxi- 4',5,7-flavonol (ó 3-(6'''-trans-p-cumaroil)glucoramnósido de kampferol) representará aproximadamente 19% de la superficie total de los picos del cromatograma.

Por otra parte, los extractos anexos obtenidos por medio del procedimiento según la invención contendrán menos de 0,5% de prodelfinidinas (preferentemente menos de 0,40% y generalmente entre 0,15 y 0,40% de prodelfinidinas).

La invención tiene además como objetivo los extractos principales susceptibles de obtenerse por un procedimiento según la invención. Tiene también por objetivo dichos extractos principales como de medicamentos, comprendiendo las composiciones farmacéuticas, como principio activo, dichos extractos principales y la utilización de dichos extractos principales para preparar medicamentos destinados a tratar enfermedades/trastornos elegidos entre las enfermedades/trastornos siguientes: trastornos vasculares cerebrales y periféricos (como los acúfenos de origen vascular, aterosclerosis, isquemias, trombosis, síntomas en relación con insuficiencia venosa, manifestaciones venosas inflamatorias agudas y síntomas en relación con una crisis hemorroide), enfermedades neurodegenerativas (como por ejemplo la enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington o la esclerosis lateral amiotrófica) y el déficit patológico cognitivo y neurosensorial crónico del anciano (especialmente la pérdida de memoria observada en los ancianos no afectados por la enfermedad de Alzheimer u otra demencia). Tiene finalmente como objetivo la utilización de dichos extractos principales para preparar medicamentos destinados a ofrecer una terapia coadyuvante para tratar las enfermedades proliferativas (especialmente el cáncer).

Las composiciones farmacéuticas que contienen un extracto según la invención pueden estar en forma sólida como, por ejemplo, polvos, píldoras, gránulos, comprimidos, liposomas, cápsulas o supositorios. Las píldoras, comprimidos o cápsulas pueden estar revestidos por una sustancia capaz de proteger la composición de la acción del ácido gástrico o de las enzimas en el estómago del sujeto durante un periodo de tiempo suficiente para permitir que esta composición pase no digerida al intestino delgado de este último. El extracto también se puede administrar localmente, por ejemplo en la misma ubicación de un tumor. El extracto también se puede administrar según un proceso de liberación prolongado (por ejemplo utilizando una composición de liberación prolongada o una bomba de infusión). Los soportes sólidos apropiados pueden ser, por ejemplo, el fosfato de calcio, estearato de magnesio, carbonato de magnesio, talco, azúcares, lactosa, dextrina, almidón, gelatina, celulosa, celulosa de metilo, celulosa de carboximetilo de sodio, polivinilpirrolidina y cera.

Las composiciones farmacéuticas que contienen un extracto de la invención pueden igualmente presentarse en forma líquida como, por ejemplo, disoluciones, emulsiones, suspensiones o una formulación de liberación prolongada. Los soportes líquidos apropiados pueden ser, por ejemplo, agua, disolventes orgánicos tales como glicerol o glicoles tal como el polietilen glicol, incluso sus mezclas, en proporciones variadas en el agua.

La administración de un medicamento según la invención podrá hacerse por vía tópica, oral, parenteral, por inyección intramuscular, etc.

La dosis de un extracto según la presente invención, a prever para el tratamiento de las enfermedades o trastornos mencionados anteriormente, varía según el modo de administración, la edad y el peso corporal del sujeto que se va a tratar así como del estado de este último, y lo decidirá en definitiva el médico o el veterinario de cabecera. Dicha cantidad determinada por el médico o el veterinario de cabecera se denomina aquí "cantidad terapéuticamente eficaz".

Sin prejuzgar la opinión del médico de cabecera, y teniendo en cuenta el contenido en principios activos de los extractos principales según la invención podrá por ejemplo ser considerada, la administración a un ser humano de una dosis diaria de 5 a 150 mg, y preferentemente de una dosis de 10 a 100 mg (en particular una dosis de 40 a 80 mg, por ejemplo de 50 a 70 mg) de dichos extractos principales.

En la presente solicitud, el término "aproximadamente" hace referencia a un intervalo alrededor del valor considerado. Tal como se utiliza en la presente solicitud, "aproximadamente X" significa un intervalo de X menos 10% de X a X más 10% de X, y preferentemente un intervalo de X menos 5% de X a X más 5% de X.

A menos de que no estén definidos de otra manera, todos los términos técnicos y científicos utilizados aquí tienen el mismo significado que el habitualmente comprendido por un especialista normal del campo al que pertenece esta invención.

Los ejemplos que siguen se presentan para ilustrar los procedimientos anteriores.

Ejemplos Ejemplo 1

100 g de hojas liofilizadas de Ginkgo biloba trituradas (tamaño de partícula inferior a 4 mm) se extraen dos veces, una vez con 800 ml y una segunda vez con 600 ml de una mezcla de etanol-agua que contiene 88% de peso de etanol, cada vez a 60ºC y durante 1 hora. Los extractos de las dos etapas de extracción se filtran y los restos de hojas recuperadas se lavan con 200 ml de la misma mezcla de disolventes. Los extractos combinados se reducen por evaporación a un volumen de 100 ml con un contenido en productos sólidos de aproximadamente 35 g. Se añaden 350 ml de una disolución acuosa de cloruro de sodio al 10% en peso al concentrado etanólico y la evaporación se continúa a presión reducida a 50ºC para eliminar el resto de etanol. La disolución salina límpida naranja clara se separa del aceite oscuro por decantación a través de un tampón de algodón sobre un embudo filtrante y luego por filtración sobre celita con succión. El extracto en disolución acuosa salina se lava con dos porciones de 150 ml de n-heptano antes de ser extraído dos veces con 150 ml de acetato de etilo en cada vez. Las fases acetato de etilo combinadas se lavan con 50 ml de una disolución saturada de cloruro de sodio y luego se evaporan a sequedad a presión reducida. El extracto seco se vuelve a disolver en 60 ml de etanol absoluto, se deja durante la noche en un refrigerador a 5ºC, se filtra para eliminar la sal eventualmente precipitada y el filtrado se evapora a sequedad para dar 1,42 g de extracto que contiene 51,7% de glicósidos de flavona y 13% de lactonas de terpeno (6,55% de bilobalido).

Ejemplo 2

100 g de hojas de Ginkgo biloba obtenidas después de secado en una estufa rotativa industrial y trituradas (tamaño de partícula inferior a 4 mm; contenido de 1,8% en peso de glicósidos de flavona y de 0,12% en peso de ginkgólidos) se extraen dos veces, una vez con 800 ml y una segunda vez con 600 ml de una mezcla de etanol-agua que contiene 80% en peso de etanol, cada vez a 60ºC y durante 1 hora. Los extractos de las dos etapas de extracción se filtran y los restos de hojas recuperadas se lavan con 200 ml de la misma mezcla de disolventes. Los extractos combinados se reducen por evaporación a un volumen de 800 ml con un contenido en productos sólidos de aproximadamente 33 g. Se añaden 60 g de cloruro de sodio, 100 ml de agua y 22 g de celita al concentrado etanólico y la evaporación se continúa a presión reducida a 50ºC para eliminar el resto de etanol. El concentrado acuoso se enfría a 10ºC durante una hora y la disolución salida límpida naranja clara se separa del aceite oscuro por decantación a través de un tampón de algodón sobre un embudo filtrante y luego por filtración con succión sobre material sinterizado recubierto de un lecho de celita. El extracto en disolución acuosa salina (-300 ml) se lava con dos porciones de 125 ml de n-heptano antes de ser extraído dos veces con 125 ml de acetato de etilo cada vez. Las fases acetato de etilo combinadas se lavan con 50 ml de una disolución saturada en cloruro de sodio y luego se evaporan a sequedad a presión reducida. El extracto seco se vuelve a disolver en 23 ml de etanol absoluto, se deja durante la noche en un refrigerador a 4ºC, se filtra para eliminar la sal eventualmente precipitada y el filtrado se evapora a sequedad para dar 1,06 g de extracto que contiene 23,6% de glicósidos de flavona, 39,2% de lactonas de terpeno (de ellos 24,6% ginkgólidos de A, B y C y 14,5% de bilobálido) y aproximadamente 0,14% de prodelfinidinas.

Ejemplo 3

La fase acuosa salina que se recupera después de las etapas sucesivas de lavado con n-heptano y de la extracción con acetato de etilo del procedimiento de preparación del extracto del ejemplo 2 se somete a una extracción líquido-líquido por medio de dos porciones de 125 ml de una mezcla de acetato de etilo-etanol 1:1. La fase orgánica recuperada se evapora a sequedad. El extracto seco se recoge en etanol absoluto de forma que se tenga una concentración de 5% en peso de extracto seco en relación al peso total de la disolución. La mezcla se deja durante la noche en un refrigerador a 4ºC antes de ser filtrada sobre papel (se lavan los sólidos con etanol absoluto a 4ºC). Después de evaporación a sequedad, se obtiene un extracto que contiene 31,88% de glicósidos de flavona y 0,67% de terpenos (de ellos 0,50% de ginkgólidos A, B y C y 0,17% de bilobálido) y aproximadamente 0,21% de prodelfinidinas.

Caracterización de los extractos según la invención A) HPLC

Los extractos según la invención se pueden caracterizar por medio del método de Cromatografía Líquida de Alta Eficacia (HPLC) con elución por gradientes descrito a continuación.

Materiales

-: Cromatógrafo en fase líquida y equipo adaptado a las condiciones especificadas a continuación.

-: Artículos de vidrio para laboratorio.

-: Balanza de precisión a décimas de mg.

Reactivos

-: Agua pura (calidad HPLC).

-: Acetonitrilo (calidad HPLC).

-: Isopropanol (calidad HPLC).

-: Ácido cítrico (calidad HPLC).

-: Metanol R.

-: Extracto de Ginkgo biloba patrón de referencia.

Procedimiento

Se prepara una disolución del extracto que se va ensayar por disolución de 200 mg de extracto que se quiere analizar en 10 ml de metanol. Paralelamente, se disuelven 200 mg de extracto de Ginkgo biloba patrón de referencia (EGb 761®) en 10 ml de metanol y constituyen la disolución de referencia.

Se emplean las siguientes condiciones de cromatografía:

-: Tipo de gradiente: lineal de 0% a 100% de fase móvil secundaria en 15 minutos y luego 5 minutos con la fase móvil secundaria. Reequilibrar la columna durante 10 minutos con la fase móvil primaria antes de la inyección siguiente.

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-: Fase móvil primaria:

	Agua purificada	1.000 ml
	Acetonitrilo	200 ml
	Isopropanol	30 ml
	Ácido cítrico	4,92 g

-: Fase móvil secundaria:

	Agua purificada	1.000 ml
	Acetonitrilo	470 ml
	Isopropanol	50 ml
	Ácido cítrico	6,08 g

-: Caudal: 1,5 ml/min

-: Detección: UV 360 nm

-: Columna: Acero inoxidable, 15 cm, diámetro 4,6 mm; rellena de gel de sílice para cromatografía R Nucleosil 5C18 Macherey-Nagel o equivalente (5 \mum)

-: Volumen inyectado: 5\mul

-: Temperatura de columna: 20 \pm 2ºC

Resultados

El cromatograma obtenido para el extracto obtenido en el ejemplo 2 se reproduce en Figura 1 y aquel para el extracto obtenido en el ejemplo 3 en Figura 2.

Las integraciones determinadas para los diferentes picos se reproducen en las tablas I (extracto del ejemplo 2) y II (extracto del ejemplo 3) a continuación. Los picos mayores que tienen tiempos de retención de aproximadamente 13 y 15 minutos en las condiciones descritas anteriormente corresponden respectivamente al O-ramnopiranosil-4-O-D-(trans-p-cumaroil-6''')glucopiranosiloxi-3-tetrahidroxi- 3',4',5,7-flavonol (ó 3-(6'''-trans-p-cumaroil)-glucoramnósido de quercetina) y al O-ramnopiranosil-4-O-D-(trans-p-cumaroil-6''')glucopiranosiloxi-3-trihidroxi- 4',5,7-flavonol (ó 3-(6'''-trans-p-cumaroil)-glucoramnósido de kampferol).

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA I

1

2

TABLA II

3

4

B) Determinación del contenido en prodelfinidinas

El contenido en prodelfinidinas de los extractos de la invención se evalúa como se expone a continuación.

Se disuelven aproximadamente 50 mg de extracto se disuelven en 25 ml de una mezcla de isopropanol y de disolución de ácido clorhídrico 3N (5/1 v/v). Se transfieren 5 ml de la mezcla obtenida a un matraz de 10 ml cerrado con un tapón estanco y el matraz se sumerge a continuación en agua hirviendo durante 45 minutos. Después de enfriamiento a 20ºC, se lleva el volumen a 10 ml añadiendo mezcla de isopropanol y de disolución de ácido clorhídrico 3N. La absorbancia se mide a 556 nm y el porcentaje de prodelfinidinas se obtiene efectuando el siguiente cálculo:

% prodelfinidinas = A x 86,206897 / B

A: Absorbancia a 556 nm

B: mg de muestra

Para disminuir la incertidumbre en cuanto al resultado, la experiencia se repite 3 veces y se hace una media con los resultados obtenidos.

Propiedades farmacológicas de los extractos según la invención

Para demostrar las propiedades farmacológicas de los extractos según la invención, se pueden llevar a cabo los siguientes ensayos.

1) Proliferación celular Línea de células

El linaje de células de cáncer de seno MDA-231 se han adquirido a Lombardi Cancer Center (Georgetown University Medical Center). Estas líneas de células se cultivan en recipientes de cultivo en poliestireno (Corning) y se multiplican en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) complementado con 10% de suero fetal bovino (FBS).

Ensayos de unión

Las células MDA-231 se dispersan por trituración en 5 ml de disolución salina de tampón fosfato (SSTP) y luego se centrifugan a 500 g durante 15 minutos. Las células centrifugadas se vuelven a poner en suspensión en una SSTP y se ensayan para medir su contenido en proteínas. Los ensayos [^{3}H]PK 11195 se pueden efectuar como se describe en Papadopoulos et coll., J. Biol.. Chem. (1990), 265, 3772-3779 y Hardwick et coll., Cancer Res. (1999), 59, 831-842. El [N-metil-^{3}H]PK 11195 ó (1-(2-clorofenil)-N-metil-N-(1-metil-propil)-3-isoquinolinocarboxamida se obtiene en Du Pont-New England Nuclear (Wilmington, DE, Estados Unidos) y el PK 11195 dirigiéndose a Research Biochemicals Incorporated (Natick, MA, Estados Unidos). Los resultados obtenidos se analizan por medio del programa LIGAND (Munson et Robard, Anal. Biochem. (1976), 72, 248-254.

Análisis del ARN por transferencia de Northern

La expresión del ARNm de los receptores de benzodiacepina de tipo periférico (PBR) en células MDA 231 tratadas con el extracto del ejemplo 1 o del ejemplo 2 o del EGb 761® (referencia) se puede evaluar por medio de un análisis de Northern como se describe en Hardwick et coll., Cancer Res. (1999), 59, 831-842. El ARN celular total se ha aislado por medio de un reactivo RNAzol B (TEL-TEST, Inc., Friendswood, TX, Estados Unidos) y cloroformo. Se pasan 20 \mug de ARN total sobre gel de 1% de agarosa y se transfiere durante la noche sobre membranas de nilón (S&S Nytran, Scheicher & Schuell, Keene, NH, Estados Unidos). Un fragmento de ADNc humano de PBR de una longitud de 0,2 kb (derivado del vector plásmido pCMV5-PBR que contiene la secuencia completa del PBR humano) se marca por medio de [\alpha^{-32p}] dCTP por medio de un sistema aleatorio de identificación de iniciadores ADN (Life Technologies, Gaithersburg, MD, Estados Unidos). Las condiciones de hibridación utilizadas se describen en la referencia citada anteriormente. La auto-radiografía se efectúa exponiendo los borrones a una película X-OMAT AR (Kodak, Rochester, NY, Estados Unidos) a -70ºC durante 4-48 horas. La cuantificación del ARNm de PBR se hace por medio del programa SigmaGel (Jandel Scientific, San Rafel, CA, Estados Unidos).

Proliferación celular

Se colocan células MDA-231 sobre placas de 96 pozos (Corning, NJ, Estados Unidos) a una concentración de aproximadamente 10.000 células por pozo (24 h de incubación) ó 5.000 células por pozo (48 h de incubación) en DMEM complementado con 0,1% de FBS. Las células se incuban a continuación en FBS a 10% con concentraciones variadas en compuesto del ejemplo o del compuesto de referencia (EGb 761®) durante los periodos indicados anteriormente. Las diferencias en término de proliferación celular se analizan por medida de la cantidad de 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) incorporado, que se determina utilizando el material BrdU ELISA (Boehringer Mannheim, Indianápolis, IN, Estados Unidos). La incorporación del BrdU se mide a la longitud de onda de 450 nm (referencia: 690 nm).

2) Neurotoxicidad inducida por el glutamato

Un extracto según la invención se puede ensayar como sigue: neuronas de cerebro de rata, se tratan o no con concentraciones crecientes de extracto del ejemplo 1 o del ejemplo 2 anteriores y luego, 30 minutos después, se exponen a glutamato a una concentración de 250 \mum. La dosis inhibidora del 50% de la toxicidad del glutamato (designada como IC_{50}) se puede entonces evaluar y luego se compara con la obtenida por un extracto como el EGb 761®, menos rico en glicósidos de flavona y lactonas de terpeno (es decir 100 \mug de EGb 761® por ml).

3) Toxicidad celular

Los efectos de un extracto según la invención sobre la viabilidad de las células se pueden estudiar sobre una línea de células HT 22 (células hipocampales de ratón). La viabilidad de las células se calcula por determinación de la cantidad de LDH liberada por células tratadas por dosis crecientes del extracto del ejemplo 1 ó del ejemplo 2 anterior y por el ensayo de exclusión en el azul de tripano.

Líneas de células

La línea de células HT-22 proviene del Salk Institute for Biological Research (La Jolla, CA, Estados Unidos). Esta línea de células se mantiene a 37ºC en el medio Eagle modificado de Dulbecco (DNEM) complementado con 10% de suero fetal bovino (FBS), en adelante llamado medio completo.

Protocolo del ensayo

Se colocan células HT-22 sobre una placa de 96 pozos a una concentración de 5.10^{3} células por pozo en el medio completo. 24 horas después, el extracto del ejemplo se solubiliza en DMEM y se añade a la concentración de 10, 25, 50, 100, 500 y 1.000 \mug/ml; el extracto se deja entonces en contacto durante 24 ó 48 horas. La medida de LDH se hace por medio de un equipo de dosificación Promega según las instrucciones dadas por el fabricante. Las absorbancias se leen a 470 nm. La liberación máxima de LDH se obtiene después de lisis completa de las células por medio de Triton X-100.

Para las medidas de viabilidad calculada por el ensayo de exclusión con azul de tripano, las células se colocan en placas de 6 pozos y el extracto del ejemplo 1 o del ejemplo 2 se añade a la concentración de 100 \mug/ml durante 24 horas.

Las células se lavan a continuación con una disolución tampón de fosfato exenta de calcio y de magnesio y expuestas a tripsina durante 5 minutos a 37ºC. La reacción se para con el medio completo y se añade 0,04% de azul de tripano a la suspensión celular. El número de células que excluyen el colorante (es decir, las células vivas) se determina por medio de un hematocitómetro. El porcentaje de viabilidad de células se calcula como sigue: número de células viables (no coloreadas)/número total de células (coloreadas y no coloreadas) x 100.

Claims

1. Procedimiento de preparación de un extracto de hojas de Ginkgo biloba, que comprende las siguientes etapas sucesivas:

vi.: extracción de fragmentos secos de hojas de Ginkgo biloba en etanol que contiene como máximo 20% en peso de agua;

vii.: concentración del extracto a presión reducida en presencia de una disolución acuosa de cloruro de sodio y eliminación del aceite oscuro del resto de la disolución clara;

viii.: lavado de la disolución acuosa residual por extracción líquido-líquido con n-hexano, n-heptano o ciclohexano;

ix.: extracción líquido-líquido de la fase acuosa lavada con acetato de etilo;

x.: lavado de la fase acetato de etilo obtenida en la etapa iv con una disolución de cloruro de sodio y luego evaporación a sequedad de la fase acetato de etilo lavada.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque no comprende ninguna etapa cromatográfica.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que los fragmentos secos de hojas de Ginkgo biloba de la etapa i se reemplazan por un polvo seco de hojas de Ginkgo biloba.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la extracción de la etapa i se efectúa por medio de etanol que contiene de 10 a 20% en peso de agua.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el lavado de la etapa iii se efectúa con n-heptano.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque las disoluciones acuosas de cloruro de sodio empleadas en las etapas ii y v tienen una concentración de al menos 10% en peso de cloruro de sodio.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6 que comprende además, después de las etapas i a v, la siguiente etapa vi:

iv. disolución del extracto seco en etanol y enfriamiento de la disolución, filtración de la sal eventualmente precipitada y evaporación a sequedad de la disolución resultante.

8. Extracto de hojas de Gingko biloba susceptible de obtenerse por un procedimiento de preparación según una de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Extracto de hojas de Gingko biloba según la reivindicación 8, caracterizado porque el procedimiento se efectúa a partir de fragmentos secos de hojas secadas de Ginkgo biloba.

10. Extracto de hojas de Ginkgo biloba según la reivindicación 9, caracterizado porque contiene de 34 a 46% en peso de lactonas de terpeno y de 18 a 30% en peso de glicósidos de flavona.

11. Extracto de hojas de Gingko biloba según la reivindicación 8, caracterizado porque el procedimiento se efectúa a partir de fragmentos secos de hojas liofilizadas de Ginkgo biloba.

12. Extracto de hojas de Ginkgo biloba según la reivindicación 11, caracterizado porque contiene aproximadamente 52% en peso de glicósidos de flavona y aproximadamente 13% en peso de lactonas de terpeno.

13. Como medicamento, un extracto según una de las reivindicaciones 8 a 12.

14. Composición farmacéutica que comprende, como principio activo, un extracto según una de las reivindicaciones 8 a 12.

15. Utilización de un extracto según una de las reivindicaciones 8 a 12 para preparar un medicamento destinado a tratar enfermedades/ trastornos elegidos entre las siguientes enfermedades/ trastornos: trastornos vasculares cerebrales y periféricos y enfermedades neurodegenerativas.

16. Utilización de un extracto según una de las reivindicaciones 8 a 12, para preparar medicamentos destinados a ofrecer una terapia coadyuvante para tratar enfermedades proliferativas.