ES2230539T3 - Metodo mejorado de amplificacion de acidos nucleicos por nasba. - Google Patents
Metodo mejorado de amplificacion de acidos nucleicos por nasba.Info
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Abstract
Un método para la amplificación de una secuencia diana de ácido nucleico consistente en las siguientes etapas: a) disponer de una plantilla de ADN correspondiente a la secuencia diana que incluye un promotor de doble hebra reconocido por una ARN polimerasa dependiente de ADN; b) transcribir múltiples copias de ARN de dicha plantilla de ADN usando la ARN polimerasa dependiente de ADN y una mezcla que contiene inosina de ribonucleótidos en donde los nucleótidos de trifosfato de inosina (ITP) substituyen a no más del 50% de los nucleótidos de trifosfato de guanina (GTP); c) utilizar el ARN generado en donde se han incorporado los nucleótidos de inosina como plantilla para la posterior generación de una nueva cantidad de la plantilla de doble hebra y repetir las etapas b y c para amplificar la cantidad de ARN.
Description
Método mejorado de amplificación de ácidos
nucleicos por NASBA.
La presente invención se relaciona con un método
para la amplificación de ácido nucleico por NASBA.
La amplificación de segmentos específicos de
ácidos nucleicos es particularmente útil para la generación de
cantidades detectables de ciertos tipos de ácido nucleico. Por
ejemplo, cuando se ha de indicar la presencia de ácido nucleico
característico de un estado de enfermedad específico, este ácido
nucleico está generalmente presente en muestras biológicas en
pequeñas cantidades. Para poder detectar estas pequeñas cantidades
de ácido nucleico, se tendrían que emplear métodos de detección muy
sensibles o se tendrían que concentrar cantidades muy grandes de
material de muestra. Con las actuales técnicas de amplificación, se
pueden amplificar las pequeñas cantidades de un segmento específico
de ácido nucleico presentes en una muestra biológica. Este ácido
nucleico amplificado puede ser fácilmente detectado, por ejemplo,
hibridándolo a un oligonucleótido complementario marcado. Por
supuesto, la amplificación de ácidos nucleicos es también útil para
la generación de mayores cantidades de ácido nucleico usadas en las
técnicas de ADN recombinante con fines de clonación y
secuenciación.
Las técnicas conocidas para la amplificación de
segmentos de ácidos nucleicos específicos son, por ejemplo, la
reacción en cadena de polimerasa ("PCR"), según se describe en
la Patente EE.UU. Nº 4.683.195 y en la Patente EE.UU. Nº 4.683.202,
y la amplificación basada en la secuencia de ácidos nucleicos
("NASBA"), según se describe en la solicitud de Patente Europea
EP 0.329.822 o en J. Virol. Meth. 35, 273, 1991, Kievils y col. Con
la PCR, se generan grandes cantidades de ácido desoxirribonucleico
(ADN) tratando una secuencia objeto de ADN con cebadores
oligonucleotídicos, de tal forma que se sintetice un producto de
prolongación con cebadores, que se separa de la plantilla usando
desnaturalización por calor y, a su vez, sirve como plantilla, dando
como resultado al amplificación de la secuencia objeto de ADN.
Cuando se ha de amplificar ARN con PCR, se transcribe primeramente
la hebra de ARN a una hebra de ADN con ayuda de transcriptasa
inversa. Los intermediarios en la reacción en cadena de polimerasa
consisten sólo en ADN.
Con ayuda de la NASBA, se generan grandes
cantidades de ARN de una sola hebra a partir de ARN o ADN de una
sola hebra o de ADN de doble hebra. Cuando se ha de amplificar ARN
con NASBA, el ARN de una sola hebra sirve como plantilla para la
síntesis de una primera hebra de ADN por alargamiento de un primer
cebador que contiene un sitio de reconocimiento de la ARN
polimerasa. Esta hebra de ADN sirve, a su vez, como plantilla para
la síntesis de una segunda hebra de ADN complementaria por
alargamiento de un segundo cebador, dando lugar a un sitio promotor
de ARN polimerasa activo de doble hebra y la segunda hebra de ADN
sirve como plantilla para la síntesis de grandes cantidades de la
primera plantilla, el ARN de una sola hebra, con ayuda de una ARN
polimerasa.
Todos los procesos de amplificación consisten en
la unión de cebadores a plantillas y el posterior alargamiento de
estos cebadores por determinadas polimerasas de ácidos nucleicos,
que pueden diferir dependiendo de la técnica de amplificación
empleada.
Un problema que surge en la amplificación de
ácidos nucleicos es que el ácido nucleico es capaz de formar
diversas estructuras secundarias. Las hebras de ácidos nucleicos
pueden contener secuencias que pueden dar lugar a la formación, por
ejemplo, de bucles en horquilla. Estas estructuras secundarias
pueden obstaculizar la unión de un cebador a una plantilla y la
posterior elongación del cebador a lo largo de la plantilla.
Interfiriendo con la hibridación o la prolongación de los cebadores
de amplificación, estas estructuras secundarias reducen la
eficiencia de la amplificación.
Por incorporación durante la amplificación de
nucleótidos que debilitan el emparejamiento normal de bases, se
evita la formación de estructuras secundarias, como la formación de
bucles internos, en el amplificado. Con la incorporación de estos
nucleótidos desestabilizadores de la estructura, se desestabilizan
las estructuras secundarias y la amplificación será más
eficiente.
También se sabe que la formación de estructuras
secundarias en el ácido nucleico es un problema con la secuenciación
de ácidos nucleicos, ya que dichas estructuras, es decir, las
regiones comprimidas, pueden dar lugar a patrones anómalos de
migración durante la electroforesis en gel. Se ha descrito la
substitución con inosina de la guanosina en los fragmentos de ácidos
nucleicos sintetizados para la secuenciación de ARN por D.R. Mills y
col., P.N.A.S., Vol 75, pp. 2232-2235. Con la
introducción de inosina en los fragmentos de ácidos nucleicos, se
evitan las estructuras secundarias y se mejora así la resolución
obtenida en las separaciones por gel tras la secuenciación del ácido
nucleico.
La incorporación de un análogo de base
desestabilizador de la estructura en ADN amplificado con la reacción
en cadena de polimerasa ha sido descrita por Cetus Corporation en la
solicitud PCT Nº WO90/03443. El nucleótido desestabilizador de la
estructura incorporado durante la amplificación por PCR en el método
reivindicado por Cetus es el
7-desaza-2'-desoxiguanosina-5'-trifosfato
(c^{7}dGTP).
La utilización de c^{7}dGTP en la PCR da como
resultado la incorporación de 7-desazaguanina en el
producto de ADN amplificado. El análogo difiere de la guanina normal
en que el N-7 del anillo de la guanina es
substituido con un resto de metino, que impide la formación de
enlace de Hoogsteen. Para procedimientos de amplificación con
intermediarios de ADN, la incorporación de c^{7}dGTP aumenta la
eficacia de la amplificación.
El método de la presente invención para la
amplificación de nucleótidos de ácidos nucleicos se caracteriza por
introducir nucleótidos durante la amplificación por NASBA que
debilitan el emparejamiento normal de bases.
Se sabe que determinadas secuencias de ARN forman
estructuras secundarias muy resistentes que apenas pueden ser
destruidas. Los ribonucleótidos que debilitan el emparejamiento
normal de bases usados en un método según la presente invención son
incorporados en intermediarios del ácido nucleico durante la
amplificación para hacer que el ácido ribonucleico sea menos capaz
de formar estructuras secundarias, como bucles en horquilla, que
pueden impedir la amplificación.
Como ribonucleótido que debilita el
emparejamiento normal de bases, se usa el trifosfato de inosina
(ITP). El ITP es un análogo del trifosfato de guanina (GTP). La
inosina difiere de la guanina, cuando se incorpora en un ácido
nucleico, en que sólo forma dos enlaces de hidrógeno con la
citosina, mientras que la guanina forma tres enlaces de hidrógeno
con la citosina. Los pares de bases I-G son, por lo
tanto, relativamente débiles en comparación con los pares de bases
G-C normales. Las estructuras secundarias, que
normalmente se mantienen juntas por los relativamente resistentes
pares de bases G-C, se debilitan, por lo tanto, por
la incorporación de ITP o no se forman en absoluto. El ITP se
incorpora al ácido ribonucleico durante la prolongación con
cebadores por una polimerasa de ácido nucleico adecuada. Como las
hebras de ácido nucleico así obtenidas son menos capaces de formar
estructuras secundarias, servirán como plantillas más eficientes en
posteriores ciclos de amplificación.
El método según la invención es útil en métodos
de amplificación como la NASBA, que, a diferencia de la PCR, generan
grandes cantidades de intermediarios de ARN, partiendo de ADN así
como de ARN.
La incorporación de inosina a los intermediarios
de ADN durante la amplificación por PCR da lugar a frecuentes
emparejamientos erróneos de bases durante la prolongación con
cebadores, como se dice en la solicitud PCT antes mencionada de
Cetus Corp. (WO 90/03443).
Sorprendentemente, con técnicas de amplificación
en las que se generan intermediarios de ARN, se obtienen buenos
resultados y la frecuencia de errores en la amplificación es
ciertamente no superior a la de la amplificación convencional, es
decir, sin la incorporación de ITP.
Cuando se usa NASBA como técnica de
amplificación, la incorporación de ITP durante la amplificación
podría incluso dar lugar a un factor de amplificación
10-100 veces superior. Esto significa que, con la
incorporación de ITP, se producirá 10-100 veces más
ARN a partir de la cantidad original de ácido nucleico presente en
una muestra biológica que sin la incorporación de ITP.
Con el método según la invención, se añade ITP a
la mezcla de amplificación que contiene ribonucleótidos normales,
como GTP, UTP, CTP y ATP.
El ITP añadido substituye parcialmente al GTP
normalmente presente. Se obtienen buenos resultados cuando se
substituye no más del 50% del GTP presente en una mezcla de reacción
de amplificación con ITP.
Cuando la proporción ITP:GTP es demasiado alta,
se impide la amplificación. El ITP ha mostrado no ser tan bueno como
un substrato para las enzimas usadas en la amplificación, las
polimerasas de ácidos nucleicos como la polimerasa T7 usada en
NASBA, como el GTP. La razón óptima de ITP:GTP ha resultado ser de
aproximadamente 1:3. De esta forma, se incorporará suficiente ITP al
ácido nucleico amplificado como para interferir con la formación de
estructuras secundarias rígidas, mientras que la amplificación aún
no está obstaculizada por la cantidad de ITP presente en la mezcla
de reacción de la amplificación.
También forma parte de la presente invención un
kit para la amplificación de ácidos nucleicos según la
reivindicación 5. Dicho kit de amplificación puede además incluir
cebadores de amplificación adecuados para el ácido nucleico
específico que se haya de amplificar y otros reactivos de
amplificación, como las enzimas necesarias.
Una mezcla según la reivindicación 4 forma parte
de la invención. También se describe un método para la detección de
ácidos nucleicos amplificados, donde el ácido nucleico se hibrida
con una sonda de detección complementaria y el ácido nucleico que se
ha de detectar es amplificado con el método para la amplificación de
ácidos nucleicos según la invención. La incorporación de inosina da
lugar tanto a una amplificación más eficiente como a una detección
más sensible. La hibridación de una sonda de detección
complementaria al ácido nucleico que se ha de detectar puede ser
también efectuada por la presencia de estructuras secundarias en el
ácido nucleico amplificado. Las estructuras secundarias pueden
obstaculizar al oligonucleótido en su unión al ácido nucleico
amplificado. La interferencia de las estructuras secundarias con la
unión de un oligonucleótido marcado al ácido nucleico puede reducir
la sensibilidad del método de detección. Con el método para la
detección de ácidos nucleicos amplificados, aumenta la sensibilidad,
ya que se evita la formación de estructuras secundarias que
interfieren con la hibridación del ácido nucleico amplificado y un
oligonucleótido complementario. La ventaja de la incorporación de
los nucleótidos interferentes al ácido nucleico amplificado, por lo
tanto, es doble: no sólo aumenta la eficiencia de la amplificación,
sino que también aumenta marcadamente la sensibilidad de los métodos
de detección, donde se detecta el ácido nucleico hibridándolo a una
sonda de detección.
Una forma común en la que frecuentemente se lleva
a cabo la detección de ácidos nucleicos amplificados es sometiendo
la muestra con ácido nucleico amplificado a electroforesis en gel,
escurriendo el gel sobre un filtro e hibridando el ácido nucleico
con una sonda de detección, donde la sonda de detección es un
oligonucleótido complementario marcado.
El ácido nucleico que se ha de detectar y que es
amplificado con el método según la invención se unirá al filtro en
una forma más bien desenrollada, ya que se evita la formación de
estructuras secundarias mediante la incorporación de nucleótidos que
debilitan el emparejamiento normal de bases. Debido a la ausencia de
estructuras secundarias, mejora la hibridación de una secuencia
complementaria al ácido nucleico amplificado presente en un filtro,
o sobre cualquier otra fase sólida.
Por supuesto, el método de detección no se limita
a la realización antes descrita. Cualquier método de detección que
implique la hibridación del ácido nucleico amplificado con una
secuencia complementaria se beneficiará de los efectos de la
incorporación de inosina, mediante la cual se evita la formación de
estructuras secundarias. El método según la invención puede ser
igualmente aplicado a cualquier otro método de detección donde se
hibride el ácido nucleico amplificado con una secuencia
complementaria.
Por ejemplo, la sonda de detección puede ser
también un oligonucleótido complementario inmovilizado sobre una
fase sólida, como en un ensayo de hibridación en sándwich. En este
caso, el ácido nucleico amplificado se une a la fase sólida por
hibridación al oligonucleótido complementario inmovilizado sobre la
fase sólida y puede ser detectado por hibridación del ácido nucleico
amplificado inmovilizado con un segundo oligonucleótido
complementario marcado.
Más aún, la presente solicitud describe un kit de
ensayo para la detección de ácido nucleico amplificado. Dicho kit de
ensayo puede contener reactivos adecuados para la amplificación del
ácido nucleico, incluyendo una mezcla de nucleótidos que contenga
una cierta cantidad de inosina, cebadores de amplificación adecuados
y enzimas (polimerasas de ácidos nucleicos) y medios de detección
como, por ejemplo, una fase sólida con oligonucleótidos
complementarios inmovilizados sobre la misma a los que se puede unir
el ácido nucleico amplificado y un segundo oligonucleótido
complementario marcado.
O, cuando se somete el ácido nucleico amplificado
a electroforesis, se pueden incluir en el kit de ensayo reactivos
adecuados para la detección del ácido nucleico tras completarse la
electroforesis. Los reactivos para la detección del ácido nucleico
amplificado tras la electroforesis pueden incluir un oligonucleótido
complementario marcado, que puede hibridarse al ácido nucleico
amplificado antes o después de la electroforesis. Cuando el
oligonucleótido está marcado con enzimas, el kit de ensayo puede
incluir también un substrato adecuado para el marcaje
enzimático.
En el Ejemplo 1 se da una posible realización de
la presente invención. Se puede ver por este ejemplo y por la figura
1, en donde se representan los resultados, que la incorporación de
ITP en el procedimiento de amplificación mejora marcadamente la
eficacia del procedimiento de amplificación y da como resultado una
mayor selectividad durante la detección. La intensidad de la señal
obtenida durante la detección aumenta por la mayor unión del
oligonucleótido marcado al amplificado.
El vector pGem7z^{f}(+) (Promega) contiene una
inserción en el sitio sma I (sitio de clonación múltiple) de 277 nt
(región UTR) del genoma de HCV. El vector fue denominado #14.
Se realizó la transcripción con polimerasa T7
según el protocolo de Promega, generando así la hebra de ARN
(+).
Se amplificó el ARN (+) generado in vitro
según el NASBA-sop (estándar).
Se añadió ITP al tampón NASBA 2,5 nM, siendo la
razón ITP:GTP de 1:3.
Se sometió el ácido nucleico amplificado a
electroforesis en un sistema de gel nativo (nusiva/1% agarosa) y se
escurrió sobre una membrana Zetaprobe y se hibridó con
oligonucleótidos marcados con ^{32}P complementarios a un
fragmento interno del amplificado.
Se sometieron a amplificación muestras con
diferentes cantidades de partida de moléculas de ácidos nucleicos
(variando las entradas entre 10^{2} y 10^{8} moléculas).
Se compararon los resultados obtenidos con los
resultados obtenidos cuando se amplificó el mismo segmento de ácido
nucleico sin la adición de ITP.
En la figura 1 se dan los resultados. Se puede
ver por esta figura que una entrada de 10^{2} moléculas de ácido
nucleico amplificado en presencia de ITP daban ya lugar a una banda
detectable en el gel, mientras que el ácido nucleico amplificado en
ausencia de ITP sólo daba una señal detectable cuando se inició la
amplificación con una entrada de 10^{4} moléculas.
Claims (5)
1. Un método para la amplificación de una
secuencia diana de ácido nucleico consistente en las siguientes
etapas:
a) disponer de una plantilla de ADN
correspondiente a la secuencia diana que incluye un promotor de
doble hebra reconocido por una ARN polimerasa dependiente de
ADN;
b) transcribir múltiples copias de ARN de dicha
plantilla de ADN usando la ARN polimerasa dependiente de ADN y una
mezcla que contiene inosina de ribonucleótidos en donde los
nucleótidos de trifosfato de inosina (ITP) substituyen a no más del
50% de los nucleótidos de trifosfato de guanina (GTP);
c) utilizar el ARN generado en donde se han
incorporado los nucleótidos de inosina como plantilla para la
posterior generación de una nueva cantidad de la plantilla de doble
hebra y repetir las etapas b y c para amplificar la cantidad de
ARN.
2. Método según la reivindicación 1, donde la
razón de ITP:GTP es de aproximadamente 1:3.
3. Método según la reivindicación 1 ó 2, donde la
ARN polimerasa dependiente de ADN es polimerasa T7.
4. Mezcla de reacción para llevar a cabo un
método de amplificación basado en la transcripción consistente
en:
- -
- una ARN polimerasa dependiente de ADN y
- -
- una mezcla que contiene inosina de ribonucleótidos en donde los nucleótidos de trifosfato de inosina (ITP) substituyen a no más del 50% de los nucleótidos de trifosfato de guanina (GTP).
5. Kit para llevar a cabo el método de la
reivindicación 1, consistente en:
- -
- una mezcla enzimática para una reacción de amplificación basada en la transcripción que contiene una ARN polimerasa dependiente de ADN;
- -
- una mezcla que contiene inosina de ribonucleótidos en donde los nucleótidos de trifosfato de inosina (ITP) substituyen a no más del 50% de los nucleótidos de trifosfato de guanina (GTP), y
- -
- eventualmente otros reactivos de amplificación.
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