ES2230569T3 - Funciones accesorias para uso en la produccion de viriones aav recombinantes. - Google Patents

Funciones accesorias para uso en la produccion de viriones aav recombinantes.

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ES2230569T3 ES96940378T ES96940378T ES2230569T3 ES 2230569 T3 ES2230569 T3 ES 2230569T3 ES 96940378 T ES96940378 T ES 96940378T ES 96940378 T ES96940378 T ES 96940378T ES 2230569 T3 ES2230569 T3 ES 2230569T3
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Abstract

SE APORTAN FUNCIONES ACCESORIAS CAPACES DE SOPORTAR LA PRODUCCION EFICIENTE DE VIRIONES RECOMBINANTES DE AAV (RAAV) EN UNA CELULA HUESPED ADECUADA. LAS FUNCIONES ACCESORIAS ESTAN EN FORMA DE UNO O MAS VECTORES QUE COMPRENDEN UNA SECUENCIA DE NUCLEOTIDOS SELECCIONADA DEL GRUPO COMPUESTO POR )I) UNA SECUENCIA QUE APORTA ARNS DE ADENOVIRUS VA, (II) UNA REGION DE CODIFICACION DE ADENOVIRUS E4 ORF6, (III) UNA REGION DE CODIFICACION DE ADENOVIRUS E2A DE 72KD Y CUALQUIER COMBINACION DE LAS SECUENCIAS DE NUCLEOTIDOS (I), (II) Y (III), Y QUE SEAN CAPACES DE SER TRANSFERIDOS ENTRE CELULAS. TAMBIEN SE APORTAN METODOS DE PRODUCCION DE LOS VIRIONES DE RAAAV. LOS METODOS PUEDEN USARSE PARA PRODUCIR NIVELES COMERCIALMENTE SIGNIFICATIVOS DE PARTICULAS DE RAAV SIN QUE SE GENEREN TAMBIEN NIVELES SIGNIFICATIVOS DE VIRUS HERPES INFECCIOSO U OTROS PRODUCTOS COLATERALES CONTAMINANTES.

Description

Funciones accesorias para uso en la producción de viriones AAV recombinantes.
Campo técnico
La presente invención hace una referencia general a las funciones accesorias para uso en la producción de viriones de virus adenoasociados (AAV). Más particularmente, la invención hace referencia a los vectores que proporcionan funciones accesorias capaces de sostener una producción eficaz de viriones AAV recombinantes eficientes en una célula huésped adecuada, y métodos para su uso.
Antecedentes de la invención
La transmisión de genes es un método prometedor para el tratamiento de enfermedades adquiridas y heredadas. Un número de sistemas basados en virus con finalidades para la transferencia de genes se han descrito, como los sistemas de retrovirus que son actualmente los más ampliamente usados como sistemas de vectores víricos con esta finalidad. Para descripciones de varios sistemas de retrovirus, véase por ejemplo, la patente de Estados Unidos número 5.219.740; Miller y Rosman (1989) BíoTechniques 7: 980-990; Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1: 5-14; Scarpa et al. (1991) Virology 180: 849-852; Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 8033-8037; y Boris-Lawrie y Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109.
Los sistemas de virus adenoasociados (AAV) también se han utilizado para la transmisión de genes. El AAV es un parvovirus DNA dependiente colaborador [helper] que pertenece al género Dependovirus. El AAV necesita infección con virus colaborador no relacionado, cualquier adenovirus, un herpesvirus o vaccinia, con el fin de que se produzca la infección productiva. El virus colaborador suple las funciones accesorias que son necesarias para la mayoría de pasos en la replicación del AAV. En ausencia de dicha infección, el AAV establece un estado latente mediante la inserción de su genoma en el cromosoma de la célula huésped. La infección subsiguiente por un virus colaborador libera la copia integrada que puede replicar entonces para producir una progenie viral infecciosa. El AAV tiene un rango de huéspedes amplio y es capaz de replicarse en células de muchas especies con tal de que haya también una infección exitosa de dichas células con un virus colaborador apropiado. Así, por ejemplo, el AAV humano replicará en células caninas coinfectadas con un adenovirus canino. El AAV no se ha asociado con ninguna enfermedad humana o animal y no parece alterar las propiedades biológicas de la célula huésped sobre integración. Para un estudio de AAV, véase, por ejemplo, Berns y Bohenzky (1987) Advances in Virus Research (Academic Press, Inc.) 32: 243-307.
El genoma AAV está compuesto por una molécula DNA lineal de cadena simple que contiene 4.681 bases (Berns y Bohenzky, véase arriba). El genoma incluye repeticiones terminales invertidas (ITRs) en cada extremo cuya función en cis actúa como origen de la replicación de DNA y como señales de empaquetamiento para el virus. Las ITRs miden aproximadamente 145 pares de bases de longitud. La porción no repetida interna del genoma incluye dos porciones de cuadros de lectura [reading frames] abiertos, conocidos como regiones AAV rep y cap, respectivamente. Estas regiones codifican para las proteínas virales involucradas en la replicación y el empaquetameinto del virión. En particular, una familia de al menos cuatro proteínas virales se sintetizan de la región AAV rep, Rep 78, Rep 68, Rep 52 y Rep 40, denominadas de acuerdo con su peso molecular aparente. La región AAV cap codifica al menos para tres proteínas, VP1, VP2 y VP3. Para una descripción detallada del genoma del AAV, véase, por ejemplo, Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158: 97-129.
Se ha descrito la construcción de viriones AAV recombinantes. Véase, por ejemplo, las patentes de los Estados Unidos números 5.173.414 y 5.139.941; las Publicaciones Internacionales con números WO 92/01070 (publicada el 23 de enero de 1992) y WO 93/03769 (publicada el 4 de marzo de 1993); Lebkowski et al. (1998) Molec. Cell.Biol. 8: 3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3: 533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158: 97-129; y Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801.
La producción del virión contemporáneo AAV recombinante (rAAV) implica la cotransfección de una célula huésped con un vector plasmídico AAV y una contrucción que proporciona las funciones AAV colaborador para funciones complementarias que no se encuentran en el vector plasmídico AAV. En este sentido, la célula huésped es capaz de expresar las proteínas AAV necesarias para la replicación y el empaquetamiento de AAV. La célula huésped es así infectada con un virus colaborador para proporcionar funciones accesorias. El virus colaborador es generalmente un adenovirus infeccioso (tipo 2 ó 5), o un herpesvirus.
Las funciones AAV colaborador se pueden proporcionar vía un plásmido colaborador AAV que incluye el AAV rep y/o cap codificando regiones pero que carecen ITRs de AAV. Por consiguiente, el plásmido colaborador tampoco no puede replicar ni tampoco realizar el empaquetamiento por sí mismo. Se conoce un cierto número de vectores que contiene la región codificadora rep, incluyendo esos vectores descritos en la patente de Estados Unidos número 5.139.941, teniendo el número ATCC de acceso 53.222, 53.223, 53.224, 53.225 y 53.226. De modo parecido, los métodos que obtiene vectores que contienen HHV-6 homólogo de AAV rep se describen en Thomson et al. (1994) Virology 204: 304-311. Un número de vectores que contienen la región codificadora cap también se han descrito, incluyendo los vectores descritos en la patente de Estados Unidos número 5.139.941.
El vector plasmídico AAV se puede componer para contener una secuencia nucleotídica relevante de interés (por ejemplo, un gen seleccionado, una molécula de ácido nucleico antisentido, una ribozima, o similares) que está flanqueada por ITRs AAV que proporcionan las funciones de replicación y empaquetamiento AAV. Después de que un plásmido AAV colaborador y un plásmido vector AAV relacionando la secuencia nucleotídica se introduzcan en la célula huésped mediante transfección transitoria, las células transfectadas se pueden infectar con un virus colaborador, más típicamente un adenovirus, que, entre otras funciones, transactiva los promotores AAV presentes en el plásmido colaborador que dirige la transcripción y la traducción de las regiones AAV rep y cap. Sobre el subsiguiente cultivo de células huésped se producen los viriones rAAV (acogiendo la secuencia nucleotídica de interés) y las partículas de virus colaborador.
Cuando las células huésped se cultivan y se produce un extracto bruto, la preparación resultante contendrá, entre otros componentes, aproximadamente igual número de partículas de virión rAAV y de viriones colaboradores infecciosos. Las partículas de virión rAAV se pueden purificar lejos de la mayoría de virus colaboradores contaminados, proteínas virales no ensambladas (del virus colaborador y de la cápside AAV) y las proteínas de la célula huésped utilizando técnicas conocidas. Las preparaciones purificadas de virus rAAV que se han producido utilizando infección con adenovirus tipo 2 contienen altos niveles de contaminantes. Particularmente, el 50% o más del total de proteínas obtenidas en dichas preparaciones de viriones rAAV es libre de proteína fibrosa de adenovirus. También hay variaciones de las cantidades de varias proteínas de adenovirus no identificados y de células huésped. Adicionalmente, niveles significativos de viriones de adenovirus infecciosos se obtienen mediante la inactivación por calor. Los adenovirus infecciosos contaminantes se pueden inactivar mediante tratamiento con calor (56ºC durante una hora) y se presentan indetectables por ensayos sensibles de crecimiento de andenovirus (por ejemplo, por el efecto citopatológico (CPE) en la línea celular permisiva). Sin embargo, el tratamiento por calor también resulta en una caída (drop) aproximadamente del 50% en la concentración (titer) de viriones rAAV funcionales.
La producción de viriones rAAV utilizando un virus colaborador (tal como un adenovirus tipo 2, o un herpesvirus) para suplir funciones accesorias no es deseable por varias razones. Los métodos de producción del vector AAV que emplean un virus colaborador requieren el uso y la manipulación de grandes cantidades de alta concentración de virus colaborador infeccioso que presenta un número de medidas de seguridad y salud, particularmente considerando el uso de un herpesvirus. También, la producción conjunta de partículas de virus colaborador en células productoras de virión rAAV aporta grandes cantidades de recursos celulares lejos de la producción de virión rAAV, posiblemente resultando en rendimientos menores de virión rAAV.
Más particularmente, en métodos donde la infección de células con adenovirus tipo 2 se usan para proporcionar las funciones accesorias, más del 95% de los contaminantes encontrados en las preparaciones de virión rAAV se derivan de adenovirus. El contaminante principal, la proteína fibrosa libre de adenovirus, tiende a copurificarse con viriones rAAV en gradientes de densidad de CsCl a causa de una asociación no covalente entre la proteína y los viriones rAAV. Esta asociación hace especialmente difícil la separación de los dos, reduciendo la eficiencia de la purificación del virión rAAV. Dichos contaminantes pueden ser particularmente problemáticos de varias proteínas adenovíricas, incluyendo la proteína fibrosa, que se ha mostrado que es citotóxica (normalmente a altas concentraciones), y por esto puede afectar de forma adversa o matar las células objetivo. De esta forma, un método de producción de viriones rAAV sin la utilización de virus colaboradores infecciosos para proporcionar las funciones accesorias sería ventajoso.
Un número de investigadores han estudiado la base genética de las funciones accesorias, particularmente de las funciones derivadas del adenovirus. Generalmente, dos aproximaciones se han utilizado para intentar identificar estos genes de adenovirus que están implicados en la replicación AAV: el examen de la habilidad de varios adenovirus mutantes para proporcionar funciones accesorias; y el estudio del efecto de genes de adenovirus transfectados o regiones en la replicación AAV en ausencia de la infección del adenovirus.
Estudios con varios adenovirus mutantes que son capaces de sostener la replicación AAV (por ejemplo, sustituyendo la funciones accesorias necesarias) en o sobre los niveles obtenidos mediante infección con adenovirus tipo salvaje han demostrado que los genes de adenovirus particulares o regiones de genes no están implicadas en la replicación AAV. Sin embargo, los datos de la pérdida de función de dichos estudios han fallado al proporcionar información concluyente que una región génica particular está implicada con la replicación AAV desde que varios de los genes de adenovirus y las regiones de control se superponen y/o mapan incompletamente.
Particularmente, los adenovirus mutantes con mutaciones bien caracterizadas justamente en los siguientes genes o las regiones génicas se han probado para su capacidad de proporcionar funciones accesorias necesarias para la replicación AAV viral: E1a (Laughlin et al. (1982) J. Virol. 41: 868, Janik et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci USA 78: 1925); E1b (Laughlin et al. (1982), véase arriba, Janik et al. (1981), véase arriba, Ostrove et al. (1980) Virology 104: 502); E2a (Handa et al. (1975) J. Gen. Virol. 29: 239, Straus et al. (1976) J. Virol. 17: 140, Myers et al. (1980) J. Virol. 35: 665, Jay et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2927, Myers et al. (1981) J. Biol. Chem. 256: 567); E2b (Carter, B. J. (1990) "Funciones de los virus colaboradores adenoasociados", en CRC Handbook of Parvoviruses, vol. I (P. Tijssen, ed.); E3 (Carter et al. (1983) Virology 126: 505); y E4 (Carter et al. (1983), véase arriba, Carter, B. J. (1995), véase arriba). Se ha probado los mutantes de adenovirus mal caracterizados que son incapaces de llevar a cabo la replicación de DNA y también la síntesis de genes tardíos (Ito et al. (1970) J. Gen. Virol. 9: 243, Ishibashi et al. (1971) Virology 45: 317).
Los mutantes de adenovirus con defectos en las regiones E2b y E3 se ha demostrado que sostienen la replicación AAV, indicando que las regiones E2b y E3 probablemente no están implicadas en proporcionar funciones accesorias (Carter et al. (1983), véase arriba). Los adenovirus mutantes defectuosos en la región E1a, o que tienen una región E4 delecionada, no son capaces de sostener la replicación AAV, indicando que las regiones E1a y E4 es probable que se requieran para la replicación AAV, ya sea directa o indirectamente (Laughlin et al. (1982), véase arriba, Janik et al. (1981), véase arriba, Carter et al. (1983), véase arriba). Estudios con mutantes E1b y E2a han dado resultados conflictivos. Además, los mutantes de adenovirus incapaces de llevar a cabo la replicación de DNA y de la síntesis de genes tardíos se ha demostrado que es permitida para la replicación AAV (Ito et al. (1970), véase arriba, Ishibashi et al. (1971), véase arriba). Estos resultados indican que ni la replicación de DNA de adenovirus ni de los genes tardíos de adenovirus se necesita para la replicación AAV.
Estudios de la transfección con genes seleccionados de adenovirus se han utilizado para intentar establecer si una colección de genes de adenovirus es capaz de proporcionar el mismo nivel de funciones accesorias para la replicación AAV como el que proporciona una infección de adenovirus. Particularmente, la replicación AAV in vitro se ha calculado utilizando 293 células humanas transfectadas transitoriamente con varias combinaciones de fragmentos restrictivos de adenovirus codificando genes simples de adenovirus o grupos de genes (Janik et al. (1981), véase arriba). Desde que los estudios de la transfección descritos anteriormente se hicieron en células que expresan de forma estable las regiones de adenovirus E1a y E1b, el requisito para estas regiones no se pudo probar. Sin embargo, se ha deducido que la combinación de tres regiones de genes de adenovirus, VA I RNA, E2a y E2b, podían proporcionar funciones accesorias (por ejemplo, sostener la replicación AAV) a un nivel que era sustancialmente el antecedente anterior, pero que todavía era aproximadamente 8.000 pliegues por debajo del nivel proporcionado por la infección con adenovirus. Cuando todas las combinaciones de dos de los tres genes se probaron, los niveles de la función accesoria oscilaban entre 10.000 y 100.000 pliegues por debajo de los niveles proporcionados por la infección con adenovirus.
Estudios de la transfección con genes del virus del herpes simple Herpesvirus simplex tipo 1 (HSV-1) también se han dirigido en un intento de establecer si una colección de genes HSV-1 transfectada es capaz de proporcionar el mismo nivel de funciones accesorias para la replicación AAV como el que se proporciona por una infección HSV-1. Weindler et al. (1991) J. Virol. 65: 2476-2483. Sin embargo, dichos estudios se limitaron a identificar sólo esos genes HSV-1 necesarios para sostener la replicación AAV tipo salvaje, no la producción rAAV. Además, las funciones accesorias HSV-1 identificadas eran significativamente menos eficaces para sostener la replicación AAV que las funciones derivadas de adenovirus.
Janik et al. publicó en Proc. Natl. Acad. Sci. USA, vol. 78, número 3, 1981, páginas 1925-1929 que tres fragmentos de endonucleasa de restricción de DNA de adenovirus son necesarios para la producción de AAV infecciosos en células 293-31. Estos fragmentos corresponden a las ubicaciones de VAI RNA, a la región 2 proximal (72 kDa) y la región 4 proximal. La línea celular 293-31, que se ha encontrado que expresa proteínas E1a y E1b, sola es incapaz de sostener la replicación AAV, sin embargo experimentos con mutantes de rango huésped de adenovirus del tipo 5 indican que al menos E1a proporciona funciones adicionales. Estos fragmentos se clonaron en pBR y se usaron para transfecciones.
Carter et al. en Virology, vol. 126, número 2, 1983, páginas 505-516, hace referencia a un mutante adenovirus tipo 2, Ad2d1807, que carece de una parte del DNA genómico que se extiende desde la región 3 proximal a la región 4 proximal y a su habilidad para sostener la replicación de AAV. Publica que se requiere una función de la región Ad 4 proximal a un estadio muy temprano de la replicación DNA AAV para permitir la amplificación del DNA replicante (RF) dúplex. Se ha expuesto además que también E1A, E1B, E2A pero no E2B en células KB y E2A, E4 y el gen VA RNA aparecen como necesarios para la producción de viriones AAV.
Samulski et al. en el Journal of Virology, vol. 63, número 9, 1989, páginas 3822-3827, y Rolling y Samulski en Molecular Biotechnology, vol. 3, 1995, páginas 9-15, publica un método para la producción de virus adenoasociados recombinantes (AAV) surtidos que contienen AAV colaborador tipo salvaje activo no detectable, por inactivación por calor del adenovirus a 56ºC durante 30 minutos.
De acuerdo con esto, se mantiene una necesidad en la materia para identificar una subcolección del genoma de adenovirus u honólogos funcionales del genoma de denovirus, que incluye sólo esas funciones accesorias requeridas para la producción de viriones rAAV. La subcolección se puede incluir en un vector funcional accesorio o un sistema que, cuando se introduce en la célula huésped adecuada, sostiene la producción de viriones rAAV en una cantidad que es sustancialmente equivalente a, o mayor que, la cantidad producida utilizando una infección de adenovirus. Además, se mantiene una necesidad de proporcionar un sistema de funciones accesorias que sea capaz de producir niveles comerciales significativos de partículas de virión rAAV sin que se generen niveles significativos de viriones de adenovirus infeccioso, u otros productos secundarios contaminantes.
Resumen de la invención
La presente invención se basa en la identificación de las funciones accesorias necesarias para sostener la replicación AAV eficiente en una célula huésped adecuada. La invención proporciona un sistema que incluye dichas funciones y permite la producción de viriones rAAV sin la utilización de un virus colaborador.
En ciertas formas de realización, la invención hace referencia a moléculas de ácido nucleico que codifican funciones accesorias y que carecen de al menos una región génica tardía. Las moléculas se pueden proporcionar en uno o más vectores que incluyen secuencias de nucleótidos derivadas de un adenovirus de genoma tipo 2 o tipo 5, o sus homólogos funcionales. Así, en un aspecto, la invención hace referencia a un vector que contiene una secuencia de nucleótidos seleccionada de un grupo que consiste en (i) una secuencia que proporciona VA RNAs de adenovirus, (ii) una región codificadora E4 ORF6 de adenovirus, (iii) una región codificadora de adenovirus E2a de 72 kD (codificadora para E2a, proteína de unión DNA de 72 kD), y alguna combinación de secuencias de nucleótidos (i), (ii) y (iii).
Según otra forma de realización, la invención hace referencia a moléculas de ácido nucleico que proporcionan funciones accesorias capaces de sostener la producción de virión AAV recombinante (rAAV) eficiente en una célula huésped adecuada y que carecen de al menos una región génica adenoviral tardía y vectores que contienen las moléculas de ácido nucleico.
En otro aspecto, la invención hace referencia a un vector que contiene una pluralidad de secuencias de nucleótido, incluyendo una secuencia que proporciona un adenovirus VA RNA, una secuencia que comprende una región codificadora E4 adenovirus, y una secuencia que comprende una región codificadora adenovirus E2a.
En todavía otro aspecto de la invención, se proporciona un vector que contiene una secuencia que proporciona un RNA VA de adenovirus, una secuencia que comprende una región codificadora E4 de adenovirus, una secuencia que comprende una región codificadora E2a de adenovirus, y una secuencia que comprende una región codificadora E1a y E1b de adenovirus.
En otra forma de realización de la invención, se proporcionan los sistemas de funciones accesorias para la producción de virión rAAV, donde los sistemas contienen una pluralidad de vectores de funciones accesorias que proporcionan componentes de funciones accesorias adecuados para sostener la producción eficaz de virión AAV en una célula huésped adecuada.
En todavía otra forma de realización de la invención, se proporcionan métodos para producir viriones rAAV. Los métodos generalmente suponen (1) introduciendo un vector AAV en una célula huésped adecuada; (2) introduciendo una construcción colaboradora AAV en la célula, donde la construcción es capaz de ser expresada en la célula huésped para complementar las funciones colaboradoras AAV que faltan en el vector AAV; (3) introduciendo uno o más vectores de funciones accesorias en la célula huésped, donde uno o más vectores de funciones accesorias proporcionan funciones accesorias capaces de sostener la producción de viriones rAAV en la célula huésped; y (4) cultivando la célula para producir viriones rAAV.
En la forma de realización adicional, también se proporcionan viriones AAV recombinantes producidos por los métodos de la presente invención.
Éstas y otras formas de realización de la invención se llevarán a cabo fácilmente con técnicas ordinarias de esta materia según se revela aquí.
Breve descripción de las figuras
La figura 1 representa la construcción plasmídica pladeno 1 que incluye VA RNA, E4 (conteniendo la ORF 6) y las regiones génicas adenovirales E2a derivadas de adenivirus tipo 5 que fueron insertados en un vector plasmídico pBSII s/k-.
La figura 2 representa la construcción plasmídica pladeno 1 El que se formó insertando un fragmento BsrGI-Eco47III de 4.102 bp (pares de bases) (que contiene las regiones codificadoras E1a y E1b del adenovirus tipo 5) en la construcción pladeno 1.
La figura 3 representa la construcción plasmídica pladeno 5 que incluye las regiones génicas adenovirales VA RNA, E4 ORF6 y E2a derivadas del genoma de adenovirus tipo 2.
Descripción detallada de la invención
La práctica de la presente invención utilizará, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de virología, microbiología, biología molecular y técnicas de DNA recombinante sin la técnica de la materia. Dichas técnicas están explicadas de forma completa en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Sambrook, et al. Molecular cloning: A Laboratory Manual (Current edition); DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucloatide Synthesis (N. Gait, ed., Current Edition); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Current Edition); CRC Handbook of Parvoviruses, vol. I & II (P. Tijessen, ed.); Fundamental Vírology, 2nd Edition, vol. I & II (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.).
Como se utiliza en esta descripción y en las reivindicaciones anexas, las formas del singular "un", "una" y "el", "la" incluyen sus referencias plurales respectivas a menos que el contenido dicte claramente lo contrario.
A. Definiciones
Describiendo la presente invención, los términos siguientes se utilizan y se pretende que se definan como se indica a continuación.
"Transferencia de genes" o "traspaso de genes" hace referencia a métodos o sistemas para insertar DNA foráneo de forma fiable en células huésped. Dichos métodos pueden resultar en expresión transitoria de DNA transferido no integrado, replicación extracromosómica y expresión de replicones transferidos (por ejemplo, episomas), o integración de material genético transferido en el DNA genómico de las células huésped. La transferencia de genes proporciona un enfoque único para el tratamiento de enfermedades adquiridas e inherentes. Numerosos sistemas se han desarrollado para la transferencia de genes en células de mamíferos. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos número 5.399.346.
Por "vector" entendemos cualquier elemento genético, como un plásmido, un fago, un transposón, un cósmido, un cromosoma, un virus, un virión, etc., que es capaz de replicarse cuando se asocia con los elementos correctos de control y puede transferir secuencias de genes entre células. De esta manera, el término incluye vehículos de clonaje y expresión, así como también vectores virales.
Por "repeticiones terminales invertidas de virus adenoasociados" o "ITRs AAV" entendemos las regiones reconocidas en la materia encontradas en cada región final del genoma AAV que funciona en cis como origen de la replicación de DNA y como señales de empaquetamiento para los virus. Las ITRs AAV, junto con la región codificadora AAV rep, proporcionan para la forma eficiente de excisión y rescate, una secuencia de integración de un nucleótido entre dos ITRs flanqueantes en el genoma de las células de mamíferos.
Se conocen las secuencias de nucleótidos de las regiones ITR AAV. Véase, por ejemplo, Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801; Berns, K. I. "Parvoviridae and their Replication" en Fundamental Virology, 2nd Edition (B. N. Fields and D. M. Knipe, eds.) para la secuencia AAV-2. Como se utiliza aquí, una "ITR AAV" no necesita tener representada la secuencia de nucleótidos de tipo salvaje, pero puede estar alterada, por ejemplo, por inserción, deleción o sustitución de nucleótidos. Adicionalmente, la ITR AAV puede estar derivada de cualquiera de los varios serotipos AAV, incluyendo sin limitación, AAV-1, AAV- 2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAVX7, etc. Además, las ITRs 5' y 3' que flanquean una secuencia de nucleótidos seleccionada en un vector AAV no necesitan sólo ser idénticas o derivadas del mismo serotipo AAV o aisladas, de la manera como se aplica su función, por ejemplo, para permitir por excisión y rescate de la secuencia de interés de un genoma de la célula huésped o vector, y para permitir integración de las secuencias heterólogas en el genoma celular receptor cuando los productos del gen Rep AAV están presentes en la célula.
Por "región codificante AAV rep" se entiende la región reconocida en la materia del genoma AAV que codifica para las proteínas de replicación del virus que se requieren colectivamente para replicar el genoma vírico y para insertar el genoma vírico en un genoma huésped durante la infección latente, o sus homólogos funcionales como el gen rep herpesvirus humano 6 (HHV-6) que también es conocido mediante la replicación de DNA AAV-2 (Thomson et al. (1994) Virologyc 204: 304-311). De esta manera, la región codificante rep incluye al menos los genes codificantes para AAV Rep 78 y Rep 68 (las "formas largas de Rep"), y Rep 52 y Rep 40 (las "formas cortas de Rep"), o sus homólogos funcionales. Para una descripción más amplia, de la región codificante AAV rep, véase, por ejemplo, Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158: 97-129; y Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801. La región codificante rep, como se utiliza aquí, puede ser derivada de cualquier serotipo viral, tal como los serotipos AAV descritos anteriormente. La región no necesita incluir todos los genes tipo salvaje pero puede estar alterada, por ejemplo, por la inserción, la deleción o la sustitución de nucleótidos, de manera que los genes rep presentes proporcionan funciones de integración suficientes cuando se expresan en la célula receptora adecuada.
Por "región codificadora AAV cap" se entiende la región del genoma AAV, reconocida en la materia, que codifica para proteínas de cubierta del virus que se requieren colectivamente para empaquetar el genoma viral. De esta manera, la región codificadora cap incluye al menos los genes codificantes para las proteínas de cubierta VP1, VP2 y VP3. Para una descripción más amplia de la región codificadora cap, véase, por ejemplo, Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158: 97-129; y Kotin, R. M. (1994) Miman Gene Therapy 5: 793-801. La región codificadora cap, como se utiliza aquí, se puede derivar de cualquier serotipo AAV, como se ha descrito anteriormente. La región no necesita incluir todo de los genes cap tipo salvaje pero puede estar alterada, por ejemplo, por la inserción, la supresión o la sustitución de nucleótidos, de manera que los genes proporcionan para funciones de empaquetamiento suficientes cuando se presentan en una célula huésped con el vector AAV.
Por un "vector AAV" se entiende un vector derivado de un serotipo de virus adenoasociado, incluyendo sin limitación, AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV-4, AAV-5, AAVX7, etc. Los vectores AAV pueden tener uno o más de los genes de tipo salvaje AAV suprimidos totalmente o en una parte, preferiblemente los genes rep y/o cap, pero conservan secuencias ITRs funcionales flanqueantes. Las secuencias ITRs funcionales son necesarias para el rescate, la replicación y el empaquetamiento del virión AAV. De esta manera, un vector AAV se define aquí para incluir al menos esas secuencias requeridas en cis para la replicación y el empaquetamiento (por ejemplo, ITRs funcionales) del virus. Las ITRs no necesitan ser las secuencias de nucleótidos de tipo salvaje, y pueden estar alteradas, por ejemplo, por la inserción, la supresión o la sustitución de nucleótidos, de manera que las secuencias se proporcionan para el rescate funcional, la replicación y el empaquetamiento.
"Funciones colaboradoras AAV" hace referencia a las secuencias codificadoras derivadas de AAV que pueden estar expresadas para proporcionar productos génicos AAV que, por turno, funcionan en trans para la replicación productiva AAV. De esta manera, las funciones colaboradoras AAV incluyen ambos de los cuadros de lectura AAV abiertos (ORFs), rep y cap. Los productos de expresión Rep se ha demostrado que poseen varias funciones, incluyendo, entre otras: el reconocimiento, la unión y el mellado del origen AAV de replicación de DNA; la actividad helicasa DNA y la modulación de transcripción desde promotores AAV (u otros heterólogos). Los productos de expresión Cap soportan las funciones de empaquetamiento necesarias. Las funciones colaboradoras AAV se usan aquí como complemento de las funciones AAV en trans que no se presentan en los vectores AAV.
El término "construcción colaboradora AMI" hace referencia generalmente a una molécula de ácido nucleico que incluye secuencias de nucleótidos proporcionando funciones AAV suprimidas de un vector AAV que se usarán para producir un vector transductor para el traspaso de una secuencia de nucleótidos de interés. Las construcciones colaboradoras AAV son comúnmente utilizadas para proporcionar expresión transitoria de genes AAV rep y/o cap para complementar la funciones que no están en AAV que son necesarias para la replicación lítica AAV; sin embargo, las construcciones colaboradoras carecen de ITRs AAV y tampoco pueden replicarse ni empaquetarse. Las construcciones colaboradoras AAV pueden estar en forma de plásmido, de fago, de trasposón, de cósmido, de virus o de virión. Un número de construcciones colaboradoras AAV se han descrito, tal como los plásmidos comúnmente utilizados pAAV/Ad y pIM29+45 que codifican ambos productos de expresión Rep y Cap. Véase por ejemplo, Samulski et al. (1989) J. Virol. 63: 3822-3828; y McCarty et al. (1991) J.Virol. 65 2936-2945. Numerosos otros vectores se han descrito que codifican los productos de expresión Rep y/o Cap. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos número 5.139.941.
El término "funciones accesorias" hace referencia a funciones virales no derivadas de AAV y celulares sobre las cuales AAV es dependiente para su replicación. De este modo, el término proteínas de captura y RNAs que se requieren en la replicación AAV, incluyendo esas porciones implicadas en la activación de la transcripción de genes AAV, estadio específico de corte y empalme [splicing] mRNA AAV, la replicación DNA AAV, la síntesis de los productos de expresión Cap y el ensamblaje de la cápside AAV. Las funciones accesorias basadas en virus pueden derivar de cualquiera de los virus colaboradores conocidos como un adenovirus, un herpesvirus (otro que no sea el virus de herpes simplex tipo-1) y virus vaccinia.
Por ejemplo, las funciones accesorias derivadas de adenovirus se han estudiado ampliamente, y un número de genes de adenovirus involucrados en funciones accesorias se han identificado y caracterizado parcialmente. Véase, por ejemplo, Carter, B. J. (1990) "Adeno-Associated Virus Helper Functions", en CRC Handbook of Parvoviruses, vol. I (P. Tijssen, ed.), y Muzyczka, N. (1992) Curr. Topics Microbiol. and Immun. 158: 97-129. Especialmente, las regiones génicas proximales de adenovirus E1a, E2a, E4, VAI RNA y, posiblemente, E1b se pensaba que participaban en el proceso accesorio. Janik et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 1925-1929. Las funciones accesorias derivadas de herpesvirus se han descrito. Véase, por ejemplo, Young et al. (1979) Prog. Med. Virol. 25:113. Las funciones accesorias derivadas de virus vaccinia también han sido descritas. Véase, por ejemplo, Carter, B. J. (1990), véase arriba, Schlehofer et al. (1986) Virology 152: 110-117.
El término "vector de funciones accesorias" hace referencia generalmente a una molécula de ácido nucleico que incluye secuencias de nucleótidos que proporcionan funciones accesorias. Un vector de funciones accesorias se puede transfectarse en una célula huésped adecuada, en el que el vector es entonces capaz de sostener la producción de virión AAV en la célula huésped. Expresamente se ha excluido del término las partículas infecciosas virales como existen en la naturaleza, como en las partículas víricas de adenovirus, herpesvirus o vaccinia. De esta manera, los vectores de funciones accesorias pueden estar en la forma de plásmido, de fago, de transposón o de cósmido.
Por "capaz de sostener la producción de virión rAAV eficiente" se hace referencia a la habilidad de un vector de función accesoria o de un sistema para proporcionar funciones accesorias que son suficientes para complementar la producción de virión rAAV en una célula huésped particular a un nivel sustancialmente equivalente a, o mayor que, el cual se podía obtener sobre infección de la célula huésped con un virus colaborador adenovirus. De esta manera, la habilidad de un vector de función accesoria o sistema para soportar la producción de virión rAAV eficiente se puede determinar comparando los concentraciones de virión rAAV obtenidos utilizando el vector accesorio o el sistema con concentraciones obtenidas utilizando infección con un adenovirus infeccioso. Más particularmente, un vector de función accesoria o un sistema que soporta una producción de virión rAAV eficiente sustancialmente equivalente a, o mayor que, que el obtenido utilizando un adenovirus infeccioso cuando la cantidad de viriones obtenidos de un número equivalente de células huésped no es mayor que aprox. 200 veces menos que la cantidad obtenida utilizando la infección de adenovirus, más preferiblemente no más de aproximadamente 100, y más preferiblemente igual a, o mayor que, la cantidad obtenida utilizando la infección de adenovirus.
Por "virus recombinante" se menciona un virus que ha sido alterado genéticamente, por ejemplo, mediante la adición o la inserción de una construcción de ácido nucleico heterólogo dentro de la partícula.
Por "virión AAV" se menciona una partícula vírica completa, como una partícula de virus AAV de tipo salvaje (wt: wild type) (comprendiendo un genoma de ácido nucleico AAV de cadena lineal simple asociado con una cápside AAV de cubierta proteica). En este aspecto, las moléculas de ácido nucleico AAV de cadena simple de cualquier sentido complementario, por ejemplo, cadenas "sentido" o "antisentido", se pueden empaquetar en cualquier de los viriones AAV y ambas cadenas son igualmente infecciosas.
Un "virión AAV recombinante", o "virión rAAV" se define aquí como virus infeccioso, de replicación defectuosa compuesto por una estructura proteica AAV, encapsidando una secuencia de nucleótidos heterólogos de interés que es flanqueada en ambos lados por ITRs AAV. Un virión rAAV se produce en una célula huésped adecuada que ha tenido un vector AAV, funciones colaboradoras AAV y funciones accesorias introducidas aquí. En este sentido, la célula huésped se vuelve capaz de codificar polipéptidos AAV que se requieren para el empaquetamiento del vector AAV (que contienen una secuencia recombinante de nucleótidos de interés) en partículas de virión recombinante infeccioso para su traspaso de genes subsiguiente.
El término "transfección" se utiliza para referirse a una toma de DNA foráneo por una célula, y una célula ha sido "transfectada" cuando el DNA exógeno se ha introducido dentro de la membrana celular. Un número de técnicas de transfección se conocen de forma general en la técnica. Véase, por ejemplo, Graham et al. (1973) Virology 52: 456, Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratorios, Nueva York, Davies et al. (1986) Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier, and Chu et al. (1981) Gene 13: 197. Dichas técnicas se pueden utilizar para introducir una o más porciones de DNA exógeno, como un vector de integración de nucleótidos y otra molécula de ácido nucleico, en las células huésped adecuadas.
El término "célula huésped" denota, por ejemplo, microorganismos, células de levadura, células de insecto, y células de mamífero, que pueden ser, o han sido, utilizadas como receptoras de una construcción colaboradora AAV, un plásmido vector AAV, un vector de función accesoria, u otro DNA de transferencia. El término incluye la progenie de la célula original que ha sido transfectada. De esta manera, un "célula huésped" como se usa aquí generalmente hace referencia a una célula que se ha transfectado con una secuencia de DNA exógeno. Se entiende que la progenie de una célula parental simple puede no ser necesariamente completamente idéntica en morfología o en genómica o complemento total de DNA como el parental original, a causa de una mutación natural, accidental o deliberada.
Como se utiliza aquí, el término "línea celular" hace referencia a una población de células capaz de un crecimiento prolongado o continuo y una división in vitro. A menudo, las líneas celulares son poblaciones clonales derivadas de una célula progenitora simple. Además se conoce en la técnica que los cambios espontáneos o inducidos pueden ocurrir en cariotipo durante almacenamiento o transferencia de dichas poblaciones clonales. Por tanto, las células derivadas de una línea celular referida a no poder ser precisamente idéntica a las células o cultivos ancestrales, y la línea celular referida incluye dichas variantes.
El término "heterólogo" hace referencia a secuencias de ácido nucleico como secuencias codificadoras que normalmente no se juntan, y/o normalmente no se asocian con una célula particular. De esta manera, una región "heteróloga" de una construcción de ácido nucleico o un vector es un segmento de ácido nnnucleico dentro o adjunta a otra molécula de ácido nucleico que no se encuentran en asociación con otra molécula en la naturaleza. Por ejemplo, una región heteróloga de una construcción de ácido nucleico podía incluir una secuencia codificadora flanqueada por secuencias no encontradas en asociación con la secuencia codificadora en la naturaleza. Otro ejemplo de una secuencia codificadora heteróloga es una construcción donde la secuencia codificadora misma no se encuentra en la naturaleza (por ejemplo, secuencias sintéticas que tienen codones diferentes del gen nativo). De una forma similar, una célula transformada con una construcción que normalmente no está presente en la célula, se consideraría heteróloga para finalidades de esta invención. La variación alélica o los acontecimientos de mutación que ocurren de forma natural no dan lugar a DNA heterólogos, como se utiliza aquí.
Una "secuencia codificadora" o una secuencia que "codifica" una proteína particular, es una secuencia de ácido nucleico que se transcribe (en el caso del DNA) y se traduce (en el caso del mRNA) en un polipéptido in vitro o in vivo cuando está bajo control de las secuencias reguladoras adecuadas. Los límites de la secuencia codificadora se determinan por un codón iniciador en el extremo 5' (amino) y un codón de terminación de translación en el extremo 3' (carboxi). Una secuencia codificadora puede incluir, pero no limitar, un cDNA de un mRNA procariótico o eucariótico secuencias DNA genómicas de un DNA procariótico o eucariótico, e incluso secuencias de DNA sintético. Una secuencia de terminación de la transcripción normalmente se localizará en 3' de la secuencia codificadora.
Una secuencia de "ácido nucleico" hace referencia a una secuencia de DNA o RNA. El término secuencias de capturas que incluye cualesquiera bases conocidas análogas de DNA y RNA, tal como, pero sin limitar a 4-acetilcitosina, 8-hidroxi-N6-metiladenosina, aziridinilcitosina, pseudoisocitosina, 5-(carboxihidroxilmetil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, inosina, N6-isopentiladenina, 1-metiladenina, 1-metilpseudouracilo, 1-metilguanina, 1-metilinosina,2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-metiladenina, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-1,2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarbonilmetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metil- tio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético metiéster, ácido uracil-5-oxiacético, oxibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, ácido N-uracilo-5-oxiacético metiléster, ácido uracil-5-oxiacético, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, y 2,6-diaminopurina.
El término "secuencias de control" de DNA hace referencia colectivamente a secuencias promotoras, señales de poliadenilación, secuencias de terminación de la transcripción, dominios reguladores en dirección hacia el origen [upstream], orígenes de replicación, sitios internos de entrada al ribosoma ("IRES"), estimuladores, y sus similares, que colectivamente proporcionan para la replicación, la transcripción y la traducción de una secuencia codificadora en una célula receptora. No todas estas secuencias de control necesitan siempre estar presentes de manera que la secuencia codificadora seleccionada es capaz de replicarse, transcribirse y traducirse en la célula huésped apropiada.
El término "región promotora" se utiliza aquí en su sentido ordinario para hacer referencia a una región de nucleótidos que comprenden una secuencia de DNA reguladora, donde la secuencia reguladora se deriva de un gen que es capaz de unir una polimerasa RNA e iniciar la transcripción de una secuencia codificadora en dirección 3' hacia el final [downstream].
"Vinculados operativamente" hace referencia a una adaptación de elementos donde los componentes descritos se configuran de manera que ejerzan su función habitual. De esta manera, las secuencias de control operativamente vinculadas a una secuencia codificadora son capaces de afectar a la expresión de la secuencia codificadora. Las secuencias de control no necesitan estar contiguas con una secuencia codificadora, ya que su función es dirigir la expresión de la misma. De esta manera, por ejemplo, el intermedio no traducido todavía de las secuencias transcritas puede estar presente entre una secuencia promotora y la secuencia codificadora y su secuencia promotora puede todavía ser considerada "vinculada operativamente" a su secuencia codificadora.
Mediante el término "aislado" se hace referencia a una secuencia de nucleótidos, y significa que una molécula indicada está presente en la ausencia sustancial de otras macromoléculas biológicas del mismo tipo. De esta manera, una "molécula de ácido nucleico aislada que codifica un polipéptido particular" hace referencia a una molécula de ácido nucleico que es sustancialmente libre de otras moléculas de ácido nucleico que no codifican al polipéptido objeto; sin embargo, la molécula puede incluir algunas bases adicionales o porciones que no afectan deletéreamente las características básicas del compuesto.
Con la finalidad de describir la posición relativa de secuencias de nucleótidos en una molécula de ácido nucleico particular a través de la aplicación instantánea, como cuando una secuencia de nucleótidos particular se describe como estando situada "upstream", "downstream", "3'" o "5'", relativa a otra secuencia, se entenderá que es la posición de las secuencias en el "sentido" o cadena "codificadora" de una molécula de DNA que está siendo referida de la forma convencional en la materia.
"Homología" hace referencia al porcentaje de identidad entre porciones de dos polinucleótidos o dos polipéptidos. La correspondencia entre la secuencia de una porción a otra se puede determinar mediante técnicas conocidas en la materia. Por ejemplo, la homología se puede determinar mediante comparación directa de una información de la secuencia entre dos moléculas de polipéptidos mediante alineamiento de la información de la secuencia y utilizando fácilmente programas informáticos disponibles. Alternativamente, la homología se puede determinar por hibridación de polinucleótidos bajo condiciones que permiten para la formación de dúplex estables entre regiones homólogas, seguidas por digestión con nucleasa (o nucleasas) específica de cadena simple, y la determinación del tamaño de los fragmentos digeridos. Dos DNA, o dos secuencias de polipéptidos son sustancialmente homólogas'' entre ellas cuando al menos sobre el 80%, preferiblemente al menos sobre el 90%, y más preferiblemente al menos sobre 95% de los nucleótidos o aminoácidos se aparean por encima de una longitud definida de las moléculas, como se determina utilizando los métodos mencionados anteriormente.
Un "homólogo funcional", o un "equivalente funcional" de un polipéptido dado incluye moléculas derivadas de la secuencia de polipéptidos nativa, así como polipéptidos producidos por recombinación o por síntesis química cuya función en un sentido similar al de la molécula de referencia para alcanzar el resultado deseado. De esta manera, un homólogo funcional de AAV Rep68 o Rep78 rodea los derivados y análogos de estos polipéptidos -incluyendo cualquier adición sustitución y/O supresión simple o múltiple de aminoácidos, que ocurren internamente o su extremo amino o a su extremo carboxi- de manera que se mantiene la actividad de integración.
Un "homólogo funcional", o un "equivalente funcional" de una región de nucleótidos de adenovirus dada incluye regiones similares derivadas de un serotipo de adenovirus heterólogo, regiones de nucleótidos derivadas de otros virus o de una fuente de células, así como polinucleótidos producidos por recombinación o sintetizados químicamente que funciona en un sentido similar al de la región de nucleótidos de referencia para alcanzar un resultado deseado. De esta manera, un homólogo funcional de una región de gen VA RNA de adenovirus o una región de gen E2a adenovírica rodea los derivados y análogos de dichas regiones de genes -incluyendo cualquier adición sustitución y/o supresión de bases nucleotídicas simple o múltiple, que ocurre en las regiones, de manera que el homólogo mantiene la habilidad de proporcionar su función accesoria inherente para sostener la producción de virión AAV a niveles detectables en los antecendentes anteriores.
B. Métodos generales
El tema principal de la presente invención es el desarrollo de sistemas de función accesoria que permiten la producción eficiente de viriones rAAV en ausencia de infección con el virus colaborador. A diferencia de métodos de producción anterior, las funciones accesorias se proporcionan introduciendo uno o más vectores, tales como plásmidos, que contienen genes requeridos para complementar la producción de virión rAAV, en la célula huésped. En este sentido, los sistemas de función accesoria presentes pueden sostener la producción de niveles significativos comercialmente de viriones rAAV sin niveles significativos de partículas de virus colaborador contaminantes, u otros productos de virus contaminantes (por ejemplo, la proteína fibrosa adenoviral). La producción eficiente de viriones rAAV se alcanza cuando los rendimientos del virión rAAV se obtienen a niveles que no son menores que unas 200 veces menos que los niveles obtenidos cuando se usan infecciones de adenovirus tipo 2 para proporcionar las funciones accesorias.
Las funciones accesorias se proporcionan en uno o más vectores. El vector (o vectores) incluirá secuencias de nucleótidos derivadas de adenovirus necesarias para la producción de virión rAAV. Como se explica más adelante, la secuencia presente de la construcción (o construcciones) de la función accesoria será determinada por la célula huésped utilizada y puede incluir las regiones E1a, E1b, E2a, E4 y regiones VA RNA.
Mientras no estén limitadas por cualquier teoría particular, las funciones accesorias proporcionadas por los genes proximales de adenovirus E1b, E2a, y E4 se piensa que se requieren en la replicación DNA AAV. Las funciones accesorias proporcionadas por las regiones génicas de adenovirus E1b, E4 y VA RNA parece que participan en acontecimientos de postranscripción y traducción en el ciclo de vida de AAV. Con respecto a las funciones accesorias proporcionadas por E4, sólo la proteína E4 de 34 kD codificada por el cuadro de lectura abierto 6 (ORF 6) de la región codificante E4 se requiere para la replicación AAV. Las funciones accesorias proporcionadas por la región génica del adenovirus E1a se piensa que se necesita para moduladores para activar la transcripción o la expresión de las otras regiones génicas de adenovirus, incluyendo E1b, E2a, E4 y VA RNA.
Los vectores de funciones accesorias de la invención pueden incluir alternativamente uno o más polinucleótidos homólogos que reemplazan las secuencia de genes de adenovirus, de manera que cada homólogo mantiene la capacidad de proporcionar las funciones accesorias del gen de adenovirus remplazado. De esta manera, las secuencias de nucleótidos homólogas, se pueden derivar de otro serotipo de adenovirus (por ejemplo, adenovirus tipo 2), de otra porción del virus colaborador (por ejemplo un herpesvirus o un virus vaccinia), o puede estar derivado de otra fuente adecuada.
Además, los vectores de funciones accesorias construidos de acuerdo con la invención pueden estar en la forma de plásmido, de fago, de transposón o de cósmido. Alternativamente, el vector puede estar en la forma de uno o más fragmentos de DNA o RNA linealizados que, cuando se asocian con los elementos y enzimas de control necesarios, se pueden transcribir o expresar en la célula huésped para proporcionar funciones accesorias. Todos los vectores descritos anteriormente pueden introducirse fácilmente en una célula huésped adecuada utilizando técnicas de transfección que se conocen en la materia. Dichos métodos de transfección se han descrito, incluyendo la coprecipitación de fosfato de calcio (Graham et al. (1973) Virol. 52: 456-467), microinyección directa en células cultivadas (Capecchi, M. R. (1980) Cell 22: 479-488), electroporación (Shigekawa et al. (1988) BioTechniques 6: 742-751), transferencia de genes mediada por liposomas (Mannino et al. (1988) BioTechniques 6: 682-690), transfección mediada por lípidos (Felgner et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 7413-7417), y su traspaso de ácidos nucleicos utilizando microproyectiles de alta velocidad (Klein et al. (1987) Nature 327: 70-73).
Vectores de funciones accesorias se pueden gestionar utilizando técnicas recombinantes convencionales. Particularmente, las moléculas de ácidos nucleicos se pueden ensamblar fácilmente en cualquier orden deseado insertando una o más secuencias de nucleótidos de funciones accesorias en una construcción, tales como por fragmentos de restricción ligadores en el vector de clonación utilizando oligonucleótidos poliligadores o sus similares. La molécula de ácido nucleico recién formada se puede cortar del vector y situarla en una construcción de expresión apropiada utilizando enzimas de restricción u otras técnicas que se conocen bien en la técnica.
Más particularmente, los genes de adenovirus seleccionados o regiones de genes (por ejemplo, E1a, E1b, E2a, E4 y VA RNA) o sus homólogos funcionales, se pueden cortar del genoma viral, o de un vector que contenga el mismo, y se puede insertar en un vector cualquiera adecuado individualmente, o enlazados juntos, para proporcionar una construcción de función accesoria utilizando técnicas de ligación estándar como las que se describen en Sambrook et al., véase arriba. Haciendo referencia a la figura 2, una de dichas construcciones se puede dirigir para incluir cuatro moléculas de ácido nucleico derivadas del genoma del adenovirus tipo 5: una región que contenga VA RNA; una región que contenga E2a; una región que contenga E4 y una región que contenga E1a, E1b. Específicamente, la figura 2 muestra: un fragmento de 1.724 bp {pares de bases) SalI-HinDIII que contiene VA RNA (correspondiente a los nucleótidos que se extienden de las posiciones 9.831 hasta 11.555 del genoma del adenovirus tipo 2); un fragmento de 5.962 bp (pares de bases) SrfI-BamHI que contiene E2a (correspondiente a los nucleótidos que se extienden de las posiciones 21.606 hasta 27.568 del genoma del adenovirus tipo 2); una fragmento de 3.669 bp (pares de bases) HphI-HinDIII que contiene E4 (correspondiente a los nucleótidos que se extienden de las posiciones de nucleótidos 32.172 a 36.841 del genoma del virus tipo 2); y un fragmento de 4.102 bp (pares de bases) BsrGI-Eco47III que contiene E1a, E1b (correspondiente a los nucleótidos que se extienden de las posiciones 192 hasta 4.294 del genoma del adenovirus tipo 2), donde las moléculas de ácido nucleico están ligadas juntas para proporcionar un complemento completo de funciones accesorias en una construcción de funciones accesorias simple. Las ligaciones se pueden cumplir en 20 mM Tris-Cl pH 7,5, 10mM MgCl_{2}, 10 mM DTT, 33 \mug/ml BSA, 10 mM-50 mM NaCl, y cualquiera de 40 \muM ATP, 0,01-0,02 (Weiss) de ligasa de DNA de unidades T4 a 0ºC (para ligación "final pegado") o 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss) ligasa de DNA de unidades T4 a 14ºC (para ligación de "final tajante"). Las ligaciones de "final pegado" intermolecular se ejercen normalmente a 30-100 \mug/ml de las concentraciones totales de DNA (5-100 nM de concentración final total). La molécula ensamblada puede insertarse fácilmente en un vector de expresión que es capaz de transferir la construcción de función accesoria entre células.
Como alternativa, las moléculas de ácido nucleico que comprenden una o más funciones accesorias pueden derivar sintéticamente, utilizando una combinación de métodos de ligación química y enzimática de síntesis de oligonucleótidos directos de fase sólida que son convencionales en la materia. Las secuencias sintéticas se pueden construir teniendo rasgos como sitios de enzimas de restricción, y se pueden preparar en recursos de síntesis de oligonucleótidos comercialmente disponibles tales como los recursos disponibles de Applied Biosystems, Inc. (Foster City, CA, EE. W.) utilizando el método fosforamidito. Véase, por ejemplo, Beuacage et al. (1981) Tetrahedron Lett. 22:1859-1862. La secuencia de nucleótidos del genoma de adenovirus tipo 2 generalmente se conoce, y está disponible en publicaciones (por ejemplo, como GeneBank con nombre de referencia ADRCG, número de acceso: J01917; y como número de identificación NCBI: 209811). La secuencia de nucleótidos del genoma de adenovirus tipo 5 se cree que es homólogo en el 991 al genoma del adenovirus tipo 2. Los codones preferibles para la expresión de la molécula sintética en células de mamífero también se pueden sintetizar fácilmente. Las moléculas de ácido nucleico se ensamblan entonces a los oligonucleótidos superpuestos preparados mediante los métodos mencionados anteriormente. Véase, por ejemplo, Edge (1981), Nature 292: 756; Nambair et al. (1984), Science 223: 1299; Jay et al. (1984), J. Biol. Chem. 259: 6311.
Cuando las regiones de genes de adenovirus se utilizan en los vectores de la invención para proporcionar funciones accesorias, estas regiones serán ligadas operativamente a secuencias de control que dirigen la transcripción o su expresión. Dichas secuencias de control pueden comprender estas secuencias de control adenovirales en el genoma de adenovirus de tipo salvaje. Alternativamente, las secuencias de control heterólogas se pueden utilizar como se desee. Las secuencias promotoras heterólogas útiles incluyen esas secuencias derivadas que codifican para genes mamíferos o genes virales. Los ejemplos incluyen, pero no limitan, los promotores adenovirales homólogos, el promotor proximal SV40, el promotor LTR del virus tumoral mamario de rata; el promotor (Ad MLP) tardío principal de adenovirus; un promotor de virus de herpes simples (HSV), un promotor de citomegalovirus (CMV) (por ejemplo, la región del promotor proximal inmediata CMV), un promotor de virus del sarcoma de Rous (RSV), promotores sintéticos, promotores híbridos, y sus similares. Además, las secuencias derivadas de los genes no virales, tales como el gen metalotioneína murina, también encontrarán uso aquí. Dichas secuencias de promotor están disponibles comercialmente de, por ejemplo, Stratagene (San Diego, CA, EE. UU.).
Además, los vectores de la presente invención se pueden construir para incluir también marcadores seleccionables. Los marcadores adecuados incluyen genes que confieren resistencia o sensibilidad a antibióticos, o transmiten color, o cambian las características antigénicas cuando las células que se han transfectado con la construcción de ácido nucleico crecen en un medio selectivo adecuado. Los genes marcadores seleccionables particulares útiles en la práctica de la invención incluyen el gen de resistencia a la higromicina B (que codifica para la aminoglicosidofosfotransferasa (APH)) que permite la selección en células de mamíferos confiriendo resistencia a G418 (disponible por Sigma, St Louis, MO, EE. W.). Otros marcadores adecuados se conocen por los expertos en la materia.
Los vectores de función accesoria que contienen una complemento completo de los genes de función accesoria adenoviral o regiones de genes (por ejemplo, E1a, E1b, E2a, E4, VA RNA, y/o sus homólogos funcionales) se pueden utilizar para suplir las funciones accesorias a una célula huésped, incluyendo esas células no permisivas para virus colaboradores (por ejemplo, no infectables por virus colaboradores tales como un adenovirus o no capaces de sostener la replicación del virus colaborador). En este sentido, la producción de virión rAAV puede ser transportada en un rango amplio de células huésped, incluyendo ésas que previamente eran refractivas a sostener dicha producción.
Como alternativa, los vectores de función accesoria se pueden construir para contener menos que un complemento completo de funciones accesorias. Dichos vectores se pueden utilizar en una célula que todavía es capaz de soportar una o más funciones accesorias, por ejemplo, en una célula que suple una o más funciones accesorias cualquiera de las dos formas inherentemente (por ejemplo, donde la célula expresa una función accesoria homóloga) o para un acontecimiento de transformación. Los vectores de función accesoria que contienen menos que una complemento completo de funciones accesorias también se pueden utilizar en combinación con otras construcciones de función accesoria auxiliar.
Particularmente, las células huésped adecuadas se pueden dirigir utilizando técnicas recombinantes ordinarias para producir células que proporcionan una o más funciones accesorias. Por ejemplo, la línea celular humana 293 es una célula de riñón embrionario humano que se ha transformado con fragmentos de DNA de adenovirus tipo 5 (Graham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36: 59), y expresa los genes de adenovirus E1a y E1b (Aiello et al. (1979) Virology 94: 460). La línea celular 293 se transfecta fácilmente, y proporciona una plataforma particularmente adecuada para producir viriones rAAV. De esta manera, en una forma de realización particularmente preferida de la invención, un vector de función accesoria se proporciona sólo en las regiones de genes adenovirales E2a, E4 y VA RNA, o sus homólogos funcionales.
Haciendo referencia a la figura 1, una tal construcción se puede dirigir para incluir tres moléculas de ácido nucleico derivadas del genoma de adenovirus tipo 5: un fragmento de 1.724 bp (pares de bases) SalI-HinDIII que contiene VA RNA (correspondiente a nucleótidos que se extienden sobre las posiciones 9.831 hasta 11.555 del genoma de adenovirus tipo 2); un fragmento de 5.962 pares de bases SrfI-BamHI que contiene E2a (correspondiente a los nucleótidos que se extienden sobre las posiciones 21.606 hasta 27.568 del genoma de adenovirus tipo 2); y un fragmento de 3.669 pares de bases HphI-HinDIII que contiene E4 (correspondiente a los nucleótidos que se extienden sobre las posiciones 32.172 hasta 36.841 del genoma de adenovirus tipo 2), donde las moléculas de ácido nucleico están ligadas juntas para proporcionar un complemento truncado de funciones accesorias en una construcción de función accesoria simple.
Referente a la figura 3, una construcción alternativa se puede dirigir para incluir tres moléculas de ácido nucleicos derivadas del genoma de adenovirus tipo 2: un fragmento de 732 bp (pares de bases) EcoRV-SacII que contiene VA RNA (correspondiente a los nucleótidos que se extienden sobre las posiciones 10.423 hasta 11.155 de un genoma de adenovirus tipo 2); un fragmento de 5.962 pares de bases SrfI-KpnI que contiene un fragmento E2a (correspondiente a los nucleótidos que se extienden sobre las posiciones 21.606 hasta 27.568 del genoma de un adenovirus tipo 2) y un fragmento de 3.192 pares de bases SrfI-SpeI modificado que contiene ORF 6 E4 (correspondiente a los nucleótidos que se extienden sobre las posiciones 32.644 hasta 34.210 del genoma de adenovirus tipo 2). Las moléculas de ácido nucleico están ligadas juntas para proporcionar incluso un complemento adicional truncado de las funciones accesorias en una construcción de funciones accesorias simple.
Estos vectores se pueden construir como se ha descrito anteriormente utilizando técnicas recombinantes y/o sintéticas, y pueden incluir una variedad de componentes auxiliares tales como regiones de promotor heterólogo, marcadores seleccionables y sus similares. Encima de la transfección en la célula huésped 293, los vectores proporcionan funciones accesorias que son capaces de sostener la producción eficiente del virión rAAV.
Una vez dirigidos, los vectores de función accesoria de la presente invención se pueden utilizar en una variedad de sistemas para la producción de viriones rAAV. Por ejemplo, las células huésped adecuadas que se han transfectado con uno o más vectores de función accesoria son de ese modo capaces de volver a producir viriones rAAC cuando se cotransfectan con un vector AAV y una construcción colaboradora AAV capaz de ser expresada en una célula para proporcionar funciones colaboradoras AAV.
El vector AAV, la construcción colaboradora AAV y el vector (o los vectores) de función accesoria se pueden introducir en la célula huésped, cualquiera de las formas simultáneamente o en serie, utilizando las técnicas de transfección descritas anteriormente.
Los vectores AAV utilizados para producir viriones rAAV para traspaso de una secuencia de nucleótidos de interés se puede construir para incluir una o más secuencias de nucleótidos heterólogas flanqueadas en ambos lados (5' y 3') con ITRs AAV funcionales. En la práctica de la invención, un vector AAV generalmente incluye al menos una ITR AAV y una secuencia de promotor apropiada adecuadamente posicionada relativa a una secuencia de nucléotidos heteróloga, y al menos una ITR AAV posicionada en dirección 3' de la secuencia heteróloga. Las ITRs 5' y 3' no necesitan ser idénticas necesariamente para o derivada de el mismo AAV aíslado, mientras que su función sea la pretendida.
Las secuencias de nucleótidos heterólogos adecuadas para el uso en vectores AAV incluyen cualquier secuencia de nucleótidos relevante funcionalmente. De esta manera, los vectores AAV para uso en la práctica de la invención pueden incluir cualquier gen deseado que codifique para una proteína que es defectiva de o que carece de un genoma celular receptor o que codifica para una proteína no nativa que tiene un efecto biológico o terapéutico deseado (por ejemplo, una función antiviral), o la secuencia puede corresponder a una molécula que tiene una función antisentido o ribozima. Los genes adecuados incluyen, pero no limitan, los que se usan para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, autoinmunológicas, crónicas e infecciosas, incluyendo dichos desórdenes como el sida, el cáncer, enfermedades neurológicas, enfermedades cardiovasculares, hipercolestemia; varios desórdenes sanguíneos, incluyendo varias anemias, talasemias y hemofilia; defectos genéticos tales como la fibrosis quística, la enfermedad de Gaucher, la deficiencia de adenosina desaminasa (ADA), enfisema, o sus similares. Un número de oligonucleótidos antisentido (por ejemplo oligonucleótidos cortos complementarios a secuencias alrededor de sitio de iniciación traduccional (codón AUG) de un mRNA) que son útiles en terapias antisentido para el cáncer, enfermedades cardiovasculares y virales se han descrito en la materia. Véase, por ejemplo, Han et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 4313-4317; Uhlmann et al. (1990) Chem. Rev. 90: 543-584; Helene et al. (1990) Biochim. Biophys. Acta. 1049: 99-125; Agarwal et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 7079-7083; y Heikkila et al. (1987) Nature 328: 445-449. Para una discusión de ribozymas adecuados, véase, por ejemplo, Cech et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 17479-17482 y la patente de los Estados Unidos número 5.225.347 por Goldberg et al.
Los vectores AAV también pueden incluir secuencias control, tales como promotores y sitios de poliadenilación, así como marcadores seleccionables o genes reporter, secuencias estimuladoras, y otros elementos de control que permiten la inducción de la transcripción. Dichos vectores AAV se pueden construir utilizando técnicas bien conocidas en la materia. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos número 5.173.414; número de publicación internacionales WO 92/01070 (publicado el 23 de enero de 1992) y WO 93/03769 (publicado el 4 de marzo de 1993); Lebkowski et al. (1988) Molec. Cell. Biol. 8: 3988-3996; Vincent et al. (1990) Vaccines 90 (Cold Spring Harbor Laboratory Press); Carter, B. J. (1992) Current Opinion in Biotechnology 3: 533-539; Muzyczka, N. (1992) Current Topics in Microbiol. and Immunol. 158: 97-129; Kotin, R. M. (1994) Human Gene Therapy 5: 793-801; Shelling y Smith (1994) Gene Therapy 1: 165-169; y Zhou et al. (1994) J. Exp. Med. 179: 1867-1875.
En los métodos de la invención, las construcciones colaboradoras AAV se usan para complementar las funciones AAV suprimidas del vector AAV. Un número de construcciones colaboradoras adecuadas se han descrito, incluyendo, por ejemplo, los plásmidos pAAV/Ad y pIM29+45 que codifican para ambos productos de expresión rep y cap (véase, por ejemplo, Samulski et al. (1989) J. Virol. 63: 3822-3828 y McCarty et al. (1991) J. Virol. 65: 2936- 2945). Complementando las funciones colaboradoras AAV en este sentido para sostener la producción de virión rAAV es una técnica aceptada en la materia. Sin embargo, a causa de los acontecimientos de recombinación de homólogos entre las secuencias ITR AAV presentes en el vector AAV y las secuencias de función colaboradora AAV en la construcción colaboradora, dichas técnicas también general viriones AAV de tipo salvaje contaminantes en las cepas de virión rAAV. La presencia de partículas AAV de tipo salvaje en los sistemas vectores basados en AAV potencialmente pueden conducir a la extensión no intencionada de viriones recombinantes AAV, y puede interferir con la expresión eficiente de los genes foráneos.
C. Experimental
Más adelante hay ejemplos de formas de realización específicas para llevar a cabo la presente invención. Los ejemplos se ofrecen sólo con finalidades ilustrativas, y no se pretende que limiten el alcance de la invención en ningún caso.
Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud respecto a los números utilizados (por ejemplo, las cantidades, las temperaturas, etc.), pero algún error experimental y alguna desviación, deberían, por supuesto, permitirse.
Construcción de plásmidos
El plásmido JM17 (McGrory et al. (1988) Virology 163: 614-617), que comprende el adenovirus tipo 5 circularizado aislado con el vector de plásmido pBR322X insertado en el único sitio XbaI al final del gen E1a de adenovirus, se utilizaba como fuente de genes de adenovirus. Ni los adenovirus de tipo 5 ni el pJM17 se han secuenciado completamente. De acuerdo con esto, se han aproximado las medidas de los fragmentos del adenovirus tipo 5 descritos más adelante. Puesto que el adenovirus tipo 2 se ha secuenciado completamente, y que los adenovirus tipo 2 y tipo 5 se pensaba que eran homólogos en un 99%, las medidas del fragmento de adenovirus tipo 5 se han aproximado basándose en los correspondientes fragmentos de adenovirus tipo 2.
El plásmido pBSII-VA RNAs (número de acceso de ATCC 98233) se construyó como se expone a continuación. El fragmento HinDIII-HinDIII de aproximadamente 5.324 pares de bases (bp) (que contiene las regiones codificadoras I y II del VA RNA del adenovirus tipo 5) se obtuvo del plásmido pJM17. El fragmento de 5.324 pares de bases de insertó en el vector plasmídico pBSII s/k- (obtenido de Strategene) en el sitio HinDIII. El fragmento de 5.324 pares de bases corresponde a nucleótidos que se extienden desde la posición 6.231 hasta 11.555 (sitios HinDIII) de un genoma de adenovirus tipo 2 (disponible públicamente, por ejemplo, con el nombre de referencia de GeneBank: ADRCG, y número de acceso: J01917; y el número de identificación del NCBI: 209811).
El plásmido pBSII-E2a+E4 se construyó como se explica a continuación. El fragmento BamHI-XbaI de aproximadamente 15.667 pares de bases (que contiene las regiones codificadoras del adenovirus de tipo 5 E2a, E3 y E4, las repeticiones terminales adenovirales ligadas cabeza con cabeza, y una porción de la región codificadora E1a del adenovirus de tipo 5). El vector plasmídico pBSII s/k- se cortó con BamHI y XbaI, y el fragmento de 15.667 pares de bases se clonó en dicho vector. El fragmento de 15.667 pares de bases corresponde a los nucleótidos que se extienden desde la posición 21.606 (un sitio de BamHI) hasta 35.937 (el extremo distal de la región terminal 3'), y los nucleótidos que se extienden desde la posición 1 (el inicio de la región terminal 5'), hasta 1.336 (un sitio de XbaI) del genoma del adenovirus de tipo 2.
El plásmido pBSII-E2a se construyó como se presenta a continuación. El fragmento BamHI-EcoRI de 5.935 pares de bases (que contiene la región codificadora E2a del adenovirus de tipo 5) se obtuvo del plásmido pJM17. El vector plasmídico pBSII s/k- se cortó con BamHI y EcoRI, y el fragmento de 5.935 pares de bases se clonó en dicho vector. El fragmento de 5.935 pares de bases corresponde a los nucleótidos que se extienden de la posición 15.403 (un sitio de BamHI) hasta 21.338 (un sitio de EcoRI) del genoma del adenovirus tipo 2.
El plásmido pBSII-E4 se construyó de la forma siguiente. El fragmento de aproximadamente 5.111 pares de bases (que contiene la región codificadora del adenovirus tipo 5, las repeticiones terminales del adenovirus ligadas cabeza con cabeza, y una porción de la región codificadora El del adenovirus de tipo 5) se obtuvo de pJM17. El vector plasmídico pBSII s/k- se cortó con XhoI y XbaI, y el fragmento de 5.111 pares de bases se clonó en dicho vector. El fragmento de 5.111 pares de bases corresponde a los nucleótidos que se extienden desde la posición 29.788 (un sitio de XhoI) hasta 35.937 (el final de la región terminal 3'), y los nucleótidos que se extienden de la posición 1 (el inicio de la región terminal 5') hasta 1.336 (un sitio de XbaI) del genoma del adenovirus tipo 2.
El plásmido pWadhlacZ se construyó como se detalla a continuación. El plásmido pUC119 (número de referencia de GeneBank: U07649) se digirió parcialmente con AflIII y BspHI, el extremo romo modificado con la enzima Klenow, y luego se ligó a la forma circular de plásmido de 1.732 pares de bases que contiene el origen bacteriano y el único gen amp (el poliligador y el origen F1 se eliminó). La unión AflIII y BspHI roma y ligada forma un único sitio NspI). El plásmido de 1.732 pares de bases se cortó con NspI, de extremo final romo modificado con la polimerasa T4, y un fragmento HinDIII-HinCII de 20 pares de bases (extremo final romo modificado con la enzima Klenow) se obtuvo del poliligador pUC119 se ligó en el sitio romo NspI del plásmido. El sitio HinDIII del poliligador romo se regeneró, y luego se posicionó adyacente al origen de replicación bacteriano. El plásmido resultante se cortó al sitio único PstI/Sse8387I, y se le ligó un oligonucleótido Sse8387I-PvuII-Sse8387I (5'-GGCAGCTGCCTGCA-3' (secuencia de identificación número: 
\hskip0.5cm
)). El sitio único restante BspHI se cortó, se modificó el extremo final romo con la enzima Klenow, y se ligó aquí un oligonucleótido que contiene un ligador AscI (5'-GAAGGCGCGCCTTC-3' (secuencia de identificación número: 
\hskip0.5cm
)), eliminando el sitio BspHI. El plásmido resultante se llamó pWee.
Con la finalidad de crear la construcción pWadhlacZ, una cassette de expresión CMVlacZ (que comprende una secuencia de nucleótidos flanqueada en 3' y en 5' por ITRs AAV, donde la secuencia de nucleótidos contiene los elementos siguientes: un promotor CMV, el primer intrón hGH, un fragmento adhlacZ y un sitio SV40 proximal) se insertó en un sitio único PvuII de pWee utilizando múltiples pasos como que el promotor CMV se colocó próximo al gen bacteriano amp de pWee.
Con el fin de crear la construcción PwadhlacZ, una cassette de expresión CMvlacZ (que comprende una secuencia de nucleótido flanqueada 5' y 3' por AAV ITRs, en la que la secuencia de nucleótido contiene los elementos siguientes: un promotor CMV, el primer intron de hGH, un fragmento adhlacZ y un sitio SV40 de poliademilación proximal) fué insertada en un sitio Pvull único de pWee empleando etapas múltiples tales como el promotor CMV fué dispuesto proximal al gen bacterial amp de pWee.
Más concretamente, una cassette de expresión CMV1acZ se derivó del plásmido psub201CMV, que se construyó como se muestra a continuación. Un oligonucleótido codificando los sitios de enzimas de restricción: NotI-MluI-SnaBI-AgeI-BstBI-BssHII-NcoI- HpaI-BspEI-PmlI-RsrII-NotI y teniendo la secuencia nucleotídica siguiente: 5'-GCGGCCGCACGCGTACGTACCGGTTCGAAGCGCGCACGGCCGACCATGGTTAACTCCGGACACGTGCGT
GCGGACCGCGGCCGC-3' (número de identificación de secuencia: 
\hskip0.5cm
) se sintetizó y se clonó en el sitio de extremo final romo modificado KasI-EarI (parcial) de pUC119 para proporcionar un fragmento de vector de 2.757 pares de bases. Un fragmento de 653 pares de bases SpeI-SacII que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para el promotor proximal inmediato CMV se clonó en el sitio SnaBI del fragmento del vector de 2.757 pares de bases. Además, un fragmento BstBI-BstBI producido por PCR de 269 pares de bases que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para el primer intrón hGH que se derivó utilizando los cebadores siguientes: 5'-AAAATTCGAACC TGGGGAGAAACCAGAG-3' (número de identificación de secuencia: 
\hskip0.5cm
) y 3'-aaattcgaacaggtaagcgcccctTTG-5' (número de identificación de secuencia: 
\hskip0.5cm
), se clonó en 1 sitio BstBI del fragmento de vector de 2.757 pares de bases, y un fragmento HpaI-BamHI de 135 pares de bases (extremo final romo modificado) que contiene el sitio de poliadenilación proximal SV40 del plásmido pCMV-\beta (obtenido de Clonetech) se clonó en el sitio HpaI del fragmento de vector sujeto para dar como resultado en un plásmido llamado pl.lc. El plásmido pl.lc se cortó con NotI para proporcionar una primera cassette de expresión CMV.
El plásmido psub201 (Salmuski et al. (1987) J. Virol. 61: 3096-3101) se cortó con Xbal, extremo final romo modificado, y ligadores Notl (5'-TTGCGGCCGCAA-3' (número de identificación de secuencia: 
\hskip0.5cm
)) se ligaron a los extremos finales para proporcionar un fragmento de vector que contiene el origen bacteriano de la replicación y un gen amp, donde el fragmento de vector está flanqueado en ambos lados por sitios NotI. Después de cortarse con NotI, el primer cassette de expresión CMV se clonó en el fragmento de vector psub201 para crear psub201CMV. El cassette de expresión de este plásmido se aisló cortando con PvuII para crear pWCMV. El pWCMV entonces se cortó con BssHII (parcial), y un fragmento de 3.246 pares de bases que contiene el gen adhlacZ (en el fragmento de nucleótidos SmaI-DraI obtenido del plásmido pCMV-\beta, que tienen ligadores AscI (5'-GAAGGCGCGCCTTC-3' (número de identificación de secuencia: 
\hskip0.5cm
)) ligado a los extremos finales para proporcionar un fragmento de 3.246 pares de bases) se ligó en el sitio BssHII de pWCMV para obtener la construcción pWadhlacZ.
El plásmido pW1909adhlacZ se construyó como se indica a continuación. Un fragmento SpeI-EcoRV de 4.723 pares de bases que contiene la región codificante AAV rep y cap se obtuvo del plásmido pGN1909 (número de acceso ATCC 69.871) en una eficiencia alta del plásmido de colaborador AAV teniendo los genes AAV rep y cap con una región promotora p5 AAV que se colocó en la construcción para estar en dirección 3' respecto a su posición normal (en el tipo salvaje del genoma AAV) relativo a una región codificadora rep. El fragmento de 4.723 pares de bases se modificó su extremo final romo, y los ligadores AscI (5'-GAAGGCGCGCCTTC-3' (número de identificación de secuencia: 
\hskip0.5cm
)) se ligaron a los extremos finales romos. El fragmento resultante se ligó entonces a un sitio único AscI de pWadhlacZ y se orientó de tal manera que las secuencias codificantes AAV se colocaron proximales al origen bacteriano de replicación en la construcción.
El plásmido pW620adhlacZ se construyó como se indica a continuación. Un fragmento MscI de 4.439 pares de bases se obtuvo del plásmido pSM620 (Salmuski et al. (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2.77-2.081. El fragmento de 4.439 pares de bases de extremo final romo modificado, y los ligadores ASCI (5'-GAAGGCGCGCCTTC-3' (número de identificación de secuencia: 
\hskip0.5cm
)) se ligaron entonces a los extremos ramas. El fragmento resultante se ligó entonces al sitio Ascl único de pWadhlacZ y se orientó de tal forma que las secuencias codificadoras AAV se colocaron proximales al origen bacteriano de replicación en la construcción.
El plásmido pW1909 se construyó como se explica a continuación. El plásmido pW1909adhLacZ se cortó con Sse8387, y el fragmento Sse8387I-Sse8387I de 6.506 pares de bases (que contiene el gen de resistencia a ampicilina, el origen de replicación coli 1, y la secuencia colaboradora AAV) se recircularizó mediante ligación intramolecular para proporcionar la construcción pW1909.
El plásmido vector pVlacZ es una versión modificada del fragmento Sse8387I-Sse8387I obtenido del
pW1909adhlacZ que se ha clonado en el plásmido pUC119. El Sse8387I-Sse8387I de pVlacZ difiere del fragmento Sse8387I-Sse8387I de pW1909 en que todas las secuencias no derivadas de las repeticiones terminales invertidas (ITRs) se han eliminado. El plásmido pVlacZ se ha construido como se indica a continuación. Piezas de DNA sintéticas, formadas por combinación de un serotipo 2 AAV de 122 a 145 pares de bases con un final compatible NotI en dirección 3', se construyeron para proporcionar fragmentos MscI-NotI que contengan secuencias ITR AAV incluyendo toda el bucle D. Los DNAs sintéticos se ligaron en ambos extremos finales del fragmento NotI de 4.384 pares de bases del plásmido pW1909adhlacZ. El fragmento de 4.384 pares de bases contiene las secuencias CMV1acZ. El fragmento resultante se ligó entonces al fragmento MscI de 6.732 pares de bases de pW1909adhlacZ para proporcionar una construcción de ensamblaje. La construcción de ensamblaje se cortó con Sse8387I para obtener un fragmento Sse8387I- Sse8387I de 4.666 pares de bases (que contiene las secuencias CMV1acZ) y el fragmento de 4.666 pares de bases se ligó al pUC119 en el sitio Sse8387I para obtener el plásmido vector pVlacZ.
Ejemplo 1 Producción del virión rAAV utilizando genes de adenvirus transfectado para suplir las funciones accesorias
Con la finalidad de determinar qué genes adenovirales, introducidos en una célula huésped adecuada por transfección, son capaces de proporcionar funciones accesorias similares a las que proporciona una infección de adenovirus en el contexto de la replicación AAV, se llevó a cabo el experimento siguiente.
Células de la línea celular humana estable 293 (fácilmente disponible a través de, por ejemplo, el ATCC bajo el número de acceso CRL1573), fueron plaqueadas en ocho cápsulas de cultivo celular de 10 cm a 1 \cdot 10^{6} células/cápsula para proporcionar 4 grupos experimentales duplicados. Las células se hicieron crecer a 37ºC para alcanzar el 90% de confluencia sobre un período de 24 a 48 horas previo a la transfección. En cada grupo, el plásmido pW1909adhlacZ se utilizó como una fuente de vector AAVlacZ rescatable y las regiones codificadoras rep y cap AAV.
Las transfecciones se realizaron utilizando un método de fosfato de calcio modificado con un total de 20 \mug de DNA durante un período de 5 horas. Más concretamente, de 1 a 4 horas anteriores a la transfección, el medio en los placas de cultivo tisular se reemplazaron con medio de cultivo DME/F12 que contiene un 10% de FCS, un 1% de penicilina/estreptomicina y un 1% de glutamina. Un total de 20 \mug de DNA que comprende uno o más vectores, se añadió a 1 ml de CaCl_{2} estéril 300 mM, que se añadió en 1 ml de solución estéril HBS 2X (formada mezclando NaCl 280 mM, solución tamponadora HEPES 50 mM, 1,5 Na_{2}HPO_{4} 1,5 mM y ajustando el pH con NaOH 10 M) e inmediatamente mezclado con inversión suave. La mezcla resultante se pipeteó inmediatamente en las placas de 10 cm de células confluentes 90% (en 10 ml del medio de cultivo descrito anteriormente) y agitó para producir una solución homogénea. Las placas se llevaron a una incubadora de CO_{2} 5% y se cultivaron a 37ºC durante aproximadamente 5 horas sin alterarlas. Después de la transfección, el medio de cultivo se eliminó de las placas, y se aplicó un lavado a las células una vez con solución salina tamponada fosfato (PBS).
La reserva de trabajo de adenovirus se preparó diluyendo una reserva madre de adenovirus tipo 2 a una concentración de 10^{6} pfu/ml (unidades formadoras de placas de lisis por ml) en DME/F12 más un 10% de FCS, 1% penicilina/estreptomicina, 1% glutamina y solución tamponadora HEPES estéril 25 mM (pH 7,4).
Los cultivos celulares del primer grupo se transfectaron con 10 \mug cada plásmido pW1909adhlacZ y pBSII s/k-. Después del período de la transfección, el medio se reemplazó, 10 ml de medio que contenía adenovirus tipo 2 se añadió a una multiplicidad de infecciones (MOI) de 1, y los cultivos se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 72 horas. Los cultivos celulares del segundo grupo se transfectaron con 10 pg cada uno de los plásmidos pW1909adhlacZ y pJM17. Después del período de transfección, el medio se reemplazó, y los cultivos se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 72 horas.
Los cultivos celulares del tercer grupo se transfectaron con 10 \mug cada pBSII s/k- y pJM17. Después del período de transfección, el medio se reemplazó, y los cultivos se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 72 horas.
Los cultivos celulares del cuarto grupo se transfectaron con 10 \mug cada uno de pW1909adhlacZ y pBSII s/k-. Después del período de transfección, el medio se reemplazó, y los cultivos se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 72 horas.
Las células de cada grupo experimental se recogieron, los medios se eliminaron por centrifugación (1.000 x g durante 10 minutos), y un lisado de 1 ml se produjo utilizando 3 ciclos congelado/descongelado (alternando entre hielo seco de etanol y baños de 37ºC). Se eliminaron los desechos de los lisados se con centrifugación (10.000 x g durante 10 minutos). La producción de virión lacZ rAAV se valoró por concentración de los extractos congelado/descongelado en células 293, y ensayados por lacZ.
Específicamente, las células 293 se plaquearon en doce placas de pozos (a 1 \cdot 10^{5} células por pozo) y se inocularon con un rango de volúmenes (10-0,01 \mul) del anteriormente descrito proceso de congelado/descongelado de lisados y incubado durante 24 horas a 37ºC. Las células fueron fijadas y se tiñeron por eliminación del medio, la incubación de células durante 5 minutos en PBS que contenía formaldehído 2% y glutaraldehído 0,2%, realizando un lavado con PBS que contiene ferrocianida de potasio 5 mM, ferricianida de potasio 5 mM, cloruro de magnesio 2 mM, y 1 mg/ml de X-Gal (Sanes et al. (1986) Embo 5: 3133-3142). La concentración del virión rAAV se calculó entonces cuantificando el número de células azules utilizando microscopia óptica.
La producción de adenovirus infecciosos contaminantes se ensayaron como se indica a continuación. Las muestras de lisados celulares se añadieron a 50% de las células 293 confluyentes (cultivadas en 12 placas de pozos a 1 \cdot 10^{5} células/pozo), y los cultivos se pasaron durante 30 días (por ejemplo, los cultivos disociados 1 a 5, cada tres días) o hasta que el cultivo exhibiera el 100% de CPE a causa de la infección de adenovirus. Los cultivos se examinaron a diario por CPE, y se anotó el día en el cual cada cultivo experimental mostró 100% CPE. Los cultivos infectados de las células 293 referenciados con un rango de cantidades conocidas de adenovirus tipo 2 (de 0 a 1 \cdot 10^{7} pfu/cultivo) se preparó también y se trató en el mismo sentido. Una curva estándar se preparó entonces de los datos obtenidos de los cultivos de referencia, donde el número de pfu de adenovirus se representó frente al día de 100% CPE. La concentración del adenovirus infeccioso tipo 2 en cada cultivo experimental se obtuvo fácilmente como determinado de la curva estándar. El límite de la detección en el ensayo era de 100 pfu/ml.
Los resultados del experimento se describen en la tabla 1 de abajo.
TABLA 1
1
Como se puede ver por los resultados de la tabla 1, los genes de adenovirus introducidos en la célula huésped por transfección y expresados en ausencia de infección de adenovirus pueden proporcionar funciones accesorias a un nivel que es aproximadamente el 20% (por ejemplo, 5 duplicaciones menos) tan efectivo como el nivel de funciones accesorias proporcionadas por una infección de adenovirus.
Ejemplo 2 Identificación de las regiones de genes de adenovirus responsables de las funciones accesorias
Con la finalidad de determinar que genes adenovirales o regiones de genes son necesarias y suficientes para proporcionar funciones accesorias, se llevó a cabo el experimento siguiente.
Las células 293 se plaquearon en doce cápsulas de cultivo celular de 10 cm a 1 \cdot 10^{6} células/cápsula para proporcionar 6 grupos experimentales duplicados. Las células entonces se hicieron crecer a 37ºC para alcanzar aproximadamente el 90% de confluencia sobre un período de 24 a 48 horas previo a la transfección. En cada grupo, el plásmido pW1909adhlacZ se utilizó como una fuente de vector AAVlacZ rescatable y regiones codificadoras rep y cap AAV. Las transfecciones se realizaron como se describió anteriormente en el ejemplo 1. La reserva de trabajo del adenovirus se preparó también como se ha descrito anteriormente.
Cada uno de los cultivos celulares 293 se transfectó con el plásmido pW1909adhlacZ y cualquier plásmido pBSII s/k- (como control), de varias combinaciones de genes de adenovirus aislados.
Más concretamente, las células en el primer grupo experimental se cotransfectaron con 5 \mug plásmido
pW1909adhlacZ (para proporcionar funciones colaboradoras AAV) y 15 \mug de plásmido pBSII s/k-. Después de período de la transfección, el medio se reemplazó, y las células se infectaron utilizando 10 ml de medio que contenía adenovirus tipo 2 (MOI = 1). Los cultivos se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 72 horas.
Las células del segundo grupo experimental se cotransfectaron con 5 \mug de plásmido pW1909adhlacZ (para proporcionar funciones colaboradoras AAV), y 15 \mug de plásmido pJMl7. Después del período de transfección, el medio se reemplazó, y los cultivos se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 72 horas.
Las células del tercer grupo experimental se cotransfectaron con 5 \mug de plásmido pW1909adhlacZ (para proporcionar funciones colaboradoras AAV), 10 \mug de plásmido pBSII-E2a+E4, y 5 \mug de plásmido pBSII s/k-. Después del período de transfección, el medio se reemplazó, y los cultivos se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 72 horas.
Las células del cuarto grupo experimental se cotransfectaron con 5 \mug de plásmido pW1909adhlacZ (para proporcionar funciones colaboradoras AAV), 10 \mug de plásmido pBSII-E2a+E4, y 5 \mug de plásmido pBSII-VA RNAs. Después del período de transfección, el medio se reemplazó, y los cultivos se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 72 horas. Las células del quinto grupo experimental se cotransfectaron con 5 \mug de plásmido pW1909adhlacZ (para proporcionar funciones colaboradoras AAV), 5 \mug de plásmido pBSII-E2a, 5 \mug de plásmido pBSII-E4, y 5 \mug de plásmido pBSII s/k-. Después del período de transfección, el medio se reemplazó, y los cultivos se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 72 horas.
Las células del sexto grupo experimental se cotransfectaron con 5 \mug de plásmido pW1909adhlacZ (para proporcionar funciones colaboradoras AAV), 5 \mug de plásmido pBSII-E2a, 5 \mug de plásmido pBSII-E4, y 5 \mug de plásmido pBSII-VA RNAs. Después del período de transfección, el medio se reemplazó, y los cultivos se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 72 horas.
Las células de cada grupo experimental se recogieron, los medios se eliminaron por centrifugación (1.000 x g durante 10 minutos), y 1 ml de lisado se produjeron utilizando 3 ciclos congelado/descongelado (alternando entre hielo seco de etanol seco y baños de 37ºC). Se eliminaron los desechos de los lisados por centrifugación (10.000 x g durante 10 minutos). La producción de virión lacZ rAAV se valoró utilizando las técnicas descritas en el ejemplo 1, y la cantidad de genomas rAAV se cuantificó por el método de ensayo siguiente.
50 \lambda del lisado de cada grupo experimental se añadió a una alícuota 100 \lambda de medio DMEM (disponible por Sigma, Saint Louis, MO, EE.UU) que contiene 50 U/ml de DNAsa I para formar muestras de ensayo. Las muestras se incubaron a 37ºC durante 1 hora aproximadamente, después de la cual 100 \lambda de proteinasa K (1 mg/ml) en un cebador de proteinasa K 2X (20mM Tris Cl, 20 mM EDTA, 1% SDS, pH ajustado a 8,0) se añadió a cada muestra que estuvo entonces en incubación a 37ºC durante otra hora. El DNA de las muestras fue extraído con fenol/cloroformo, se precipitó con EtOH y luego se recogieron por centrifugación a 5ºC durante 5 minutos. Los pellets de DNA se redisolvieron en 200 \lambda TE para proporcionar muestras de DNA. Los ensayos de transferencia de puntos [dot blot] se llevaron a cabo como se muestra a continuación. La membrana Zeta Probe® (Bio Rad, Richmond, CA, EE. UU.) se cortó para cortar a la medida y se ensambló en un aparato de transferencia de puntos. Las muestras de DNA se desnaturalizaron utilizando 200 \lambda de una solución alcalina 2X (0,8 M NaOH, 20 mM EDTA), y, después de 5 minutos, las membranas se enjuagó en una solución SSC 2X durante 1 minuto, se secó en un papel de filtro, y entonces se puso en calor al vacío a 80ºC durante aproximadamente 30 minutos. Las hibridaciones se llevaron a cabo a 65ºC durante 30 minutos en un cebador de hibridación (1 mM EDTA, 40 mM Na_{2}HPO_{4} (pH 7,2), 7% SDS). Los filtros de lavaron y se autoradiografiaron durante aproximadamente 20 horas, la radioactividad se determinó utilizando contador por centelleo.
Los resultados del experimento se representan en la tabla 2 que se presenta a continuación.
TABLA 2
2
Como se puede ver por los resultados representados en la tabla 2, las regiones de genes de adenovirus aisladas se pueden transfectar con éxito en células huésped para proporcionar funciones accesorias que son necesarias y suficientes para la replicación del virión rAAV. Además, los resultados obtenidos con los grupos 3 y 5 indican que la región VA RNA de adenovirus no es esencial para la replicación de viriones rAAV; sin embargo, la región se necesita para obtener concentraciones de rAAV comparables con los que se obtienen utilizando la infección adenoviral.
Ejemplo 3 Correlación de la dosis VA RNA para la producción del virión rAAV
Con la finalidad de investigar qué correlación existe entre la cantidad de región de genes VA RNA de adenovirus transfectada suplía a una célula huésped, y el nivel de funciones accesorias proporcionado para completar la replicación rAAV en la célula huésped, se llevó a cabo el experimento siguiente.
Las células 293 se plaquearon en cápsulas de cultivo tisular de 10 cm a 1 \cdot 10^{6} células/cápsula, y se cultivaron a 37ºC para alcanzar aproximadamente el 90% de confluencia sobre un período de 24 a 48 horas previo a la transfección. Las transfecciones se realizaron como se describió anteriormente en el ejemplo 1.
Específicamente, las células 293 se transfectaron con 5 \mug de plásmido pW1909adhlacZ, 10 \mug de plásmido pBSII-E2a+E4 y de 0 a 25 \mug de plásmido pBSII-Va RNA para variar la relación molar del plásmido en relación con el VA RNA (relativo a los otros plásmidos) por encima del rango de 0 a 5. Después de período de la transfección, el medio se reemplazó, y las células se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 72 horas.
Las células de cada grupo experimental se recogieron, los medios se eliminaron por centrifugación (1.000 x g durante 10 minutos), y 1 ml de lisado se produjo utilizando 3 ciclos congelado/descongelado (alternando entre hielo seco de etanol y baños de 37ºC). Se eliminaron los desechos de los lisados por centrifugación (10.000 x g durante 10 minutos). La producción del vector lacZ rAAV se valoró utilizando las técnicas descritas en el ejemplo 1. Los resultados del experimento se representan en la tabla 3 presentada a continuación.
TABLA 3
3
Como se puede ver en la tabla 3, aunque los VA RNAs adenovirales se necesitan para obtener la producción del virión rAAV en los niveles sustancialmente equivalentes a los que se obtuvieron con infección de adenovirus, las variaciones en la relación VA RNA/otras regiones de genes de adenovirus por encima de la relación investigada no afecta significativamente la producción del virión rAAV.
Ejemplo 4 Demostración de la necesidad de las regiones génicas de adenovirus E2a, E4 y VA RNA en las funciones accesorias
Con la finalidad de establecer unas contribuciones relativas de las regiones de genes E2a, E4 y VA RNA en el suministro de funciones accesorias para la producción del virión rAAV, se llevó a cabo el experimento siguiente.
Las células 293 se plaquearon en cápsulas de cultivo tisular de 10 cm a 1 \cdot 10^{6} células/cápsula, y se cultivaron a 37ºC para alcanzar aproximadamente el 90% de confluencia sobre un período de unas 24 a 48 horas previas a las cotransfecciones. Todas las transfecciones se realizaron como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 1.
Los cultivos de células 293 se cotransfectaron con 5 \mug de plásmido pW1909adhlacZ, y 15 \mug (totales) de cualquiera de todos ellos, o con combinaciones de parejas de los plásmidos siguientes: plásmido pBSII- E2a, pBSII-E4, pBSII-VA RNA para proporcionar cultivos en que cada una de las regiones de genes de adenovirus codificadoras E2a, E4 y VA RNA se eliminaron de la cotransfección. Después de período de la transfección, los medios se reemplazaron, y las células se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 72 horas.
Las células de cada grupo de cotransfección se recogieron, los medios se eliminaron por centrifugación (1.000 x g durante 10 minutos), y 1 ml de lisado se produjo utilizando 3 ciclos congelado/descongelado (alternando entre hielo seco de etanol y baños de 37ºC). Se eliminaron los desechos de los lisados por centrifugación (10.000 x g durante 10 minutos). La producción del virión lacZ rAAV se valoró utilizando las técnicas descritas en el ejemplo 1. Los resultados del experimento se representan en la tabla 4 que se presenta a continuación.
TABLA 4
4
Como se puede ver en los resultados representados en la tabla 4, cada una de las regiones de genes de adenovirus E2a, E4 y VA RNA no son absolutamente esenciales para proporcionar las funciones accesorias necesarias para sostener la producción del virión rAAV; sin embargo, todas las regiones de genes se necesitan para producir niveles de viriones rAAV comparables a los que se han obtenido con la infección de adenovirus. Más concretamente, la omisión de VA RNA que contiene el plásmido de la cotransfección resultante en un descenso de 7 veces en la producción de virión rAAV (7 \cdot 10^{8} unidades funcionales por cápsulas de 10 cm). La producción de virión rAAV se vio aún más severamente afectada por omisión de los plásmidos que contienen E4 y E2a de la cotransfección. La omisión de la construcción E4 resultante en un descenso de 83 veces en producción (6 \cdot 10^{7} unidades funcionales por cápsulas de 10 cm), y omisión de la construcción resultado en un descenso de 10.000 veces en la producción de virión rAAV (5 \cdot 10^{5} unidades funcionales por cápsulas de 10 cm).
Ejemplo 5 Comparación de la producción de virión rAAV utilizando pW1909adhlacZ o pW620adhlacZ basado en la colaboración AAV
Con la finalidad de comparar la eficiencia de la producción de virión rAAV en una célula huésped utilizando sistemas de funciones accesorias no virales con construcciones colaboradoras AAV que contienen cualquiera de las funciones colaboradoras de tipo salvaje o modificadas (regiones codificadoras rep y cap AAV), se llevó acabo el experimento siguiente.
Las células 293 se plaquearon en doce cápsulas de cultivo tisular a 1 \cdot 10^{6} células/cápsula, y se cultivaron a 37ºC para alcanzar aproximadamente el 90% de confluencia sobre un período de unas 24 a 48 horas previas a la transfección. Las transfecciones se realizaron como se describió anteriormente en el ejemplo 1.
Una primera colección de los cultivos celulares 293 se cotransfectó con 5 \mug plásmido pW620adhlacZ (que contiene las funciones colaboradoras AAV de tipo salvaje), 10 \mug de plásmido pBSII-E2a+E4 y 5 \mug de plásmido pBSII-VA RNAs. Una segunda colección de los cultivos celulares 293 se cotransfectó con 5 \mug plásmido pW1909adhlacZ (que contiene las funciones colaboradoras AAV modificadas), 10 \mug de plásmido pBSII-E2a+E4 y 5 \mug de plásmido pBSII-VA RNAs. Después de período de las transfecciones, los medios se reemplazaron, y los cultivos se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 72 horas.
Las células de cada grupo de cotransfección se recogieron, los medios se eliminaron por centrifugación (1.000 x g durante 10 minutos), y 1 ml de lisado se produjo utilizando 3 ciclos congelado/descongelado (alternando entre hielo seco de etanol y baños de 37ºC). Se eliminaron los desechos de los lisados por centrifugación (10.000 x g durante 10 minutos). La producción de virión lacZ rAAV se valoró utilizando las técnicas descritas en el ejemplo 1. Los resultados del experimento se representan a continuación en la tabla 5.
TABLA 5
Construcción vector/colaborador Concentración rAAV\dagger
pW1909adhlacZ 5 \cdot 10^{9}
pW620adhlacZ 4 \cdot 10^{9}
\dagger Como se determina en el ensayo de lacZ. 
\newpage
Como se puede ver por los resultados representados en la tabla 5, ambas formas, de tipo salvaje y modificada, del AAV colaborador soportaron la producción del virión rAAV aproximadamente al mismo nivel.
Ejemplo 6 Comparación de la eficiencia de la producción del virión rAAV de las funciones accesorias basadas en plásmidos
Con la finalidad de comparar la eficiencia de la producción de virión rAAV en una célula huésped utilizando funciones accesorias aisladas basadas en plásmidos, sus combinaciones, y una construcción que contiene las regiones de genes del adenovirus VA RNA, E4 y E2a (el plásmido pladeno 1, descrito más adelante) con la producción de virión rAAV obtenida utilizando la infección de adenovirus tipo 2 (ad-2), el experimento siguiente se llevó a cabo.
1. Construcción del pladeno 1 y el pladeno 1 E1
El plásmido pladeno 1, que contienen las regiones de genes del adenovirus VA RNA, E4 y E2a, se ensambló clonando los genes del adenovirus tipo 5 en un poliligador a medida que se insertó entre los sitios PvuII del pBSII s/k-. En la figura 1 se representa un mapa de la construcción del pladeno 1. Más concretamente, un poliligador oligonucleótido de doble cadena codificante de los sitios de enzimas de restricción SalI-XbaI-EcoRV-SrfI-BamHI (5'-GTCGACAAATCTAGATATCGCCGGGCGATCC- 3' (número de identificación de secuencia: 
\hskip0.5cm
)) se ligó a un fragmento vector PvuII de 2.513 pares de bases de pBSII s/k- para proporcionar un plásmido de ensamblaje. Los fragmentos siguientes que contienen los genes del adenovirus tipo 5 o las regiones de genes se obtuvieron del plásmido pJM17: el fragmento que contiene VA RNA SalI-HinDIII de 1.724 pares de bases (correspondiente a las posiciones abiertas de los nucleótidos de 9.831 a 11.555 del genoma del adenovirus tipo 2); el fragmento que contiene E2a SrfI-BamHI de 5.962 pares de bases (correspondiente a las posiciones abiertas de nucleótidos 21.606 hasta 27.568 del genoma del adenovirus tipo 2); y el fragmento que contiene E4 HphI-HinDIII pares de bases de 3.669 pares de bases (correspondientes a las posiciones abiertas de nucleótidos sobre 32.172 hasta 36.841 del genoma del adenovirus tipo 2). Un sitio XbaI se añadió al final HphI del fragmento que contiene E4, clonando el fragmento HphI-HinDIII de 3.669 pares de bases dentro del sitio HpaI del vector de clonación, y luego produciendo una excisión en el fragmento con XbaI y HinDIII (digestión parcial). El fragmento que contiene E2a de 5.962 pares de bases se clonó entre los sitios SrfI y BamHI del plásmido de ensamblaje, y el fragmento que contiene VA RNA de 1.724 pares de bases y los fragmentos modificados que contienen E4 de 3.669 pares de bases se juntaron por sus extremos finales comunes HinDIII y se ligaron entre los sitios SalI y XbaI del plásmido de ensamblaje para obtener la construcción del pladeno
1.
Haciendo ahora referencia a la figura 2, el plásmido El pladeno 1 se ensambló como se indica a continuación. El fragmento BsrGI-Eco47III de 4.102 pares de bases (que contiene las regiones codificadoras E1a y E1b del adenovirus tipo 5) se obtuvo del plásmido pJM17. Dicho fragmento corresponde a las posiciones abiertas de nucleótidos de 192 hasta 4.294 del genoma del adenovirus tipo 2. Se modificó el extremo final romo del fragmento de 4.102 pares de bases, y luego se insertó en un sitio Hpal en el fragmento VA RNA del plásmido pladenol para obtener el plásmido El pladenol.
2. Ensayo de la producción del virión rAAV
Se plaquearon las células 293 en cápsulas de cultivo tisular de 10 cm a 1 \cdot 10^{6} células/cápsula, y se cultivaron a 37ºC para alcanzar aproximadamente el 90% de confluencia sobre un período de unas 24 a 48 horas previas a la cotransfección. Todas las transfecciones se realizaron como se describió anteriormente en el ejemplo 1.
Todos los cultivos celulares 293 se transfectaron con 5 \mug plásmido pW1090adhlacZ. Los grupos experimentales de los cultivos también se cotransfectaron con varias combinaciones de 5 \mug cada una de las funciones accesorias que contienen los plásmidos o el plásmido control (pBSII s/k-). Después de las transfecciones, los medios se reemplazaron, y los cultivos se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 72 horas. Como comparación, 10 ml de medio que contiene adenovirus tipo 2 (MOI = 1) se añadió a las células 293 que se han transfectado con 5 \mug de plásmido pW1909adhlacZ, y se incubó a 37ºC durante aproximadamente 72 horas.
Las células de cada grupo experimental entonces se recogieron, los medios se eliminaron por centrifugación (1.000 x g durante 10 minutos), y 1 ml de lisado se produjo utilizando 3 ciclos congelado/descongelado (alternando entre hielo seco de etanol y baños de 37ºC). Se eliminaron los desechos de los lisados por centrifugación (10.000 x g durante 10 minutos). La producción de virión lacZ rAAV se valoró utilizando las técnicas que se han descrito en el ejemplo 1. Los resultados del experimento se representan a continuación en la tabla 6.
TABLA 6
6
Como se puede ver por los resultados representados en la tabla 6, la construcción pladeno 1 es capaz de sostener la producción eficiente de virión rAAV (a sustancialmente el mismo nivel que el que se obtiene utilizando la infección con el adenovirus tipo 2). La combinación de construcciones de funciones accesorias pBSII-E2a, pBS-E4 y pBS-VA RNAs también era capaz de sostener la producción de virión rAAV eficiente a niveles sustancialmente equivalentes a la infección con ad-2. La combinación de construcciones de funciones accesorias pBSII- E2a+E4 y pBS-VA RNAs era capaz de sostener la producción de rAAV (10 veces menos que los niveles de la infección con ad-2); y la construcción que contiene E2a (pBSII-E2a) soportó la producción de rAAV a un nivel aproximadamente 200 veces menos que el obtenido utilizando la infección ad-2.
Ejemplo 7 Comparación a gran escala de la producción de virión rAAV obtenida utilizando funciones accesorias basadas en adenovirus o plásmidos
Con la finalidad de comparar las preparaciones a gran escala de viriones rAAV producidos utilizando cualquiera de los adenovirus tipo 2 (ad-2) o pladeno 1 basada en las funciones accesorias, se llevó acabo el experimento siguiente.
Aproximadamente 10^{9} células 293 se transfectaron con el vector rAAV que contenía el gen de la eritroproteína humana utilizando el método de transfección descrito en el ejemplo 1. Una preparación fue co-transfectada con el pladeno 1 obtenido, la otra preparación fue infectada con adenovirus tipo 2 como fuente de funciones accesorias.
Después del período de incubación adecuado, las células de cada grupo experimental se recogieron, el medio de crecimiento se eliminó por centrifugación (1.000 x g durante 10 minutos), y un lisado se produjo utilizando 3 ciclos congelado/descongelado (alternando entre hielo seco de etanol y baños de 37ºC). Se eliminaron los desechos de los lisados por centrifugación (10.000 x g durante 10 minutos) para obtener lisado grosero. Con la finalidad de obtener una muestra purificada, los lisados groseros se sujetaron a una centrifugación de gradiente de densidad.
La cantidad de genomas rAAV producidos por cada preparación se cuantificó por ensayo de transferencia de puntos descrito en el ejemplo 2. Los resultados del experimento se representan a continuación en la tabla 7.
TABLA 7
7
Como se puede ver por los resultados de la tabla 7, la preparación utilizando las funciones accesorias basadas en el pladeno 1 el rendimiento de virión rAAV que era 2,4 veces mayor que el obtenido de la preparación utilizando las funciones accesorias basadas en el adenovirus tipo 2.
Ejemplo 8 Determinación de las contribuciones relativas de las funciones accesorias adenovirales individuales en la producción del virión rAAV
Con la finalidad de determinar las contribuciones relativas de las funciones accesorias individuales de los adenovirus en la producción del virión rAAV, se llevó a cabo el experimento siguiente. Las funciones accesorias adenovirales individuales, ya sea solas o en combinaciones, se utilizaron para sostener la producción de adenovirus rAAV en células huésped. Además, el efecto de sustituir las construcciones conducidas por CMV E2a o E4 ORF6 (las construcciones p3.3cE2A yp3.3cE4ORF6, descritas más adelante), para construcciones que contienen las regiones completas E2a y E4 ORF 6 y se valoraron conducidas por promotores homólogos (las construcciones pBSII-E2a y pBSII-E4).
1. Construcción del p3.3cE2A y p3.3cE4ORF6
Los genes estructurales que codifican la proteína aglutinadoras de DNA, y la proteína de adenovirus tipo 5 E4 de cuadro de lectura abierta 6 (ORF 6), ambas se clonaron en una construcción de expresión conducida por CMV, p3.3c para proporcionar las construcciones plasmídicas p3.3cE2A y p3.3E4ORF6, respectivamente.
El plásmido p3.3c se construyó como se detalla a continuación. El fragmento NotI de 2.732 pares de bases de pl.lc, que contiene las secuencias de vector pUC119, se ligó a un fragmento de DNA sintético que contiene los sitios de restricción siguiente: NotI; MluI; Ecl136II; SacII; BstBI; BssHII; SrfI; BssHII; SnaBI; BstEII; PmlI; RsrII; y NotI. Las secuencias del fragmento de DNA sintético es: 5'-GCGCCGCACGCGTGAGCTCCGCGGTTCGAAGCGCGCAAAGCCCGGGCAAAGCG CGCAGATCTACGTAGGTAACCACGTGCGGACCGGCGGCCGC-3' (número de identificación de secuencia: 
\hskip0.5cm
). Un fragmento SpeI-SacII de 653 pares de bases que incluye el promotor del citomegalovirus inmediato proximal (CMV IE); un fragmento BstBI-BstBI producido por PCR de 269 pares de bases codificador del primer intrón hGH que se ha obtenido utilizando los cebadores siguientes: 5'-AAAATTCGAACAG GTAAGCGCCCCTTTG-3' (número de identificación de secuencia: 
\hskip0.5cm
) y 3'-AAAATTCGAATCCTGGGGAGAAACCAGAC-5'(número de identificación de secuencia: 
\hskip0.5cm
); y el fragmento BamHI-BamHI (blunted) de 213 pares de bases que contiene el sitio de poliadenilación tardío SV40 del pCMV-\beta (obtenido de Clonetech), se clonaron en los sitios del ligador sintético Ec1136II, BstBI y SnaBI, respectivamente, para resultar en una construcción de expresión p3.3c.
El plásmido p3.3cE4ORF6 (número de acceso ATCC 98234) se preparó como se indica a continuación. El fragmento BglII-SmaI de 1.024 pares de bases del pBSII-E4, que contiene secuencias codificadoras E4 ORF6 de adenovirus tipo 5, se obtuvo y se modificó el extremo final romo. Este fragmento corresponde a la posición 33.309 (sitio SmaI) a través de la posición 34.115 (sitio BglII) del genoma del adenovirus tipo 2. El fragmento modificado se clonó en el sitio SrfI de p3.3c para proporcionar el plásmido p3.3cE4ORF6.
El plásmido p3.3cE2a (número de acceso ATCC 98235) se preparó como se indica a continuación. Se obtuvo el fragmento MscI(parcial)-BamHI de 2.467 pares de bases del pBSII-E2a. Este fragmento contiene secuencias codificadoras E2a de adenovirus tipo 5, y corresponde a la posición 33.309 (sitio SmaI) a través de las posiciones de 24.073 (sitio MscI) hasta 21.606 (sitio BamHI) del genoma del adenovirus tipo 2. El fragmento de 2.467 pares de bases se subclonó entre los sitios MscI y BamHI de pCITE2A (obtenido de Novagene) para proporcionar la construcción pCITE2AE2A. El fragmento NcoI(parcial)-BsrGI de 1.636 pares de bases se cortó de pCITE2AE2A. Este fragmento contiene secuencias codificadoras de la proteína E2a de 72 kD, y las posiciones correspondientes 24.076 (sitio MscI/NcoI) hasta 22.440 (sitio BsrGI) del genoma del adenovirus tipo 2. El fragmento de 1.636 pares de bases se modificó el extremo final romo, y se clonó en p3.3c para proporcionar el plásmido p3.3cE2A.
2. Ensayo de la producción del virión rAAV
Se plaquearon las células 293 en cápsulas de cultivo tisular de 10 cm a 2 \cdot 10^{6} células/cápsula, y se cultivaron a 37ºC para alcanzar aproximadamente el 90% de confluencia sobre un período de unas 48 horas previas a las cotransfecciones. Todas las cotransfecciones se realizaron utilizando el método CaPO_{4} con las combinaciones siguientes de DNAs. Todos los cultivos celulares 293 se transfectaron con 5 \mug plásmido pW620adhlacZ. 5 \mug de varias construcciones de funciones accesorias (como se muestra en la tabla 8 presentada a continuación) se usaron para proporcionar un total de 20 \mug de DNA por cápsula. Para las muestras que recibían menos de 4 construcciones, se usó pBSII BNA para dar las cantidad total de DNA transfectado a 20 \mug. Después de las transfecciones, los medios se reemplazaron, y los cultivos que usaban los adenovirus para las funciones accesorias recibieron adenovirus tipo 2 a un MOI de 5. Todos los cultivos se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 72 horas previas a la recogida.
Las células de cada cápsula se recogieron, los medios se eliminaron por centrifugación (1.000 x g durante 10 minutos), y 1 ml de lisado se produjo utilizando 3 ciclos congelado/descongelado (alternando entre hielo seco de etanol y baños de 37ºC). Se eliminaron los desechos de los lisados por centrifugación (10.000 x g durante 10 minutos). La producción de virión lacZ rAAV se valoró utilizando las técnicas que se han descrito en el ejemplo 1. Las concentraciones de lacZ se hicieron en presencia de adenovirus. Todas las muestras se ensayaron por duplicado. Los resultados del experimento se representan a continuación en la tabla 8.
\vskip1.000000\baselineskip
TABLA 8
8
Como se puede ver por los resultados representados en la tabla 8, las regiones de adenovirus E2a, E4 y VA RNA son todas necesarias para proporcionar una producción eficiente de virión rAAV (a niveles sustancialmente equivalentes a los que se han obtenido utilizando la infección de adenovirus para proporcionar funciones accesorias). Sin embargo, ninguna de esas regiones simples se necesita de forma absoluta para la producción de virión rAAV.
Las regiones E2a y E4 que se han subclonado en las construcciones pBSII-E2a y pBSII-E4 contienen varios cuadros de lectura abierta (construcción pladeno 1 es capaz de sostener la producción eficiente de virión rAAV (ORFs) además de los ORFs para la proteína de aglutinación de DNA E2a de 72 kD y la proteína ORF6 E4. Sustituyendo las construcciones conducidas por CMV p3.3cE2A y el p3.3cE4ORF6 para las construcciones pBSII-E2ay el pBSII-E4 en el estudio descrito anteriormente, se ha establecido ahora que la proteina de aglutinación E2a de 72 kD y la proteína ORF6 son capaces de proporcionar funciones accesorias completas en ausencia de todos los otros cuadros de lectura abierta de sus regiones codificadoras respectivas.
Ejemplo 9 Reconstrucción del plásmido pladeno 1 y comparación de la eficiencia de producción del virión rAAV
El plásmido pladeno 1 se reconstruyó utilizando adenovirus purificado DNA tipo 2 como una fuente de los genes de adenovirus en lugar de los genes de adonvirus derivados de pJM17 que se utilizaron en la construcción de pladeno 1. El plásmido reconstruido, llamado pladeno 5, se describe detalladamente más adelante. Esta reconstrucción se llevó a cabo para reducir la medida total del plásmido. Además, el plásmido reconstruido (pladeno 5) no codifica para la proteasa de adenovirus, mientras que el pladeno 1 sí que lo hace.
1. Construcción del pladeno 5
El plásmido pladeno 5 se construyó como se detalla a continuación. Los fragmentos de DNA que codifican para las regiones E2a, E4 y VA RNA aisladas de DNA de adenovirus tipo 2 purificado (obtenido de Gibco/BRL) se ligaron en un plásmido llamado pAmpscript. El plásmido pAmpscript se ensambló de la forma siguiente: la mutagénesis dirigida a oligonucleotide se utilizó para eliminar la región de 623 pares de bases incluyendo el poliligador y la cassette de expresión alfa complementación de pBSII s/k+ (obtenida de Stratagene), y para reemplazarla con un sitio EcoRV. La secuencia de oligo mutagénico utilizado en la mutagénesis dirigida a oligonucleotide era: 5'- CCGCTACAGGGCGCGATATCAGCTC ACTCAA-3' (número de identificación de secuencia: 
\hskip0.5cm
). Un poliligador (que contiene los sitios de restricción siguientes: BamHI; KnpI; SrfI; XbaI; ClaI; Bst1107I; SalI; PmeI; y NdeI) se sintetizó y se insertó en el sitio EcoRV creado anteriormente tal que el sitio BamHI del ligador proximal al origen Fl en el plásmido modificado para proporcionar el plásmido pAmpscript. La secuencia del poliligador era: 5'- GGATCCGGTACCGCCCGGGCTCTAGAATCGATGTATAC GTCGAC GTTTAAACCATATG-3'(número de identificación de secuencia: 
\hskip0.5cm
).
Los fragmentos de DNA que comprenden las secuencias de adenovirus tipo 2 E2a y VA RNA se clonaron directamente en el pAmpscript. Concretamente, un fragmento SrfI-KpnI(parcial) de 5.962 pares de bases que contiene la región E2a se clonó entre los sitios SrfI y KnpI del pAmpscript. El fragmento de 5.962 pares de bases comprende los pares de bases de 21.606 a 27.568 del genoma del adenovirus tipo 2. Un fragmento EcoRV-SacII(romo) que contiene VA RNAs se clonó en el sitio Bst1107I del pAmpscript. El fragmento de 732 pares de bases se corresponde a los pares de bases 10.423 a 11.155 del genoma del adenovirus tipo 2.
El DNA que comprende las secuencias E4 del adenovirus tipo 2 tuvo que modificarse antes que se pudiera insertar en el poliligador pAmpscript. Concretamente, la mutagénesis PCR se utilizó para reemplazar el E4 proximal, la repetición terminal de adenovirus con un sitio Srfl. La localización de este Srfl se corresponde a los pares de bases 35.836 a 37.844 del genoma del adenovirus tipo 2. Las secuencias de los oligonucleótidos utilizados en la mutagénesis eran: 5'-AGAGGCCCGGGCGTTTTAGGGCGGAGTAACT TGC-3' (número de identificación de secuencia: 
\hskip0.5cm
); y 5'-ACATACCCGCAGGCGTAGAGAC-3'(número de identificación de secuencia: 
\hskip0.5cm
). Un fragmento E4 de 3.192 pares de bases, producido por partir el gen E4 modificado descrito anteriormente con SrfI y SpeI, se ligó entre los sitios SrfI y XbaI del pAmpscript que ya contenía las secuencias E2a y VA RNA que dio como resultado el plásmido pladeno 5. El fragmento de 3.192 pares de bases corresponde a los pares de bases 32.644 a 35.836 del genoma del adenovirus tipo 2. 2. Ensayo de la producción del virión rAAV
Se plaquearon las células 293 en cápsulas de cultivo tisular de 10 cm a 1 \cdot 10^{6} células/cápsula, y se cultivaron a 37ºC para alcanzar aproximadamente el 90% de confluencia sobre un período de unas 24 a 48 horas previas a las cotransfecciones. Todas las transfecciones se realizaron como se ha descrito anteriormente en el ejemplo 1.
Los cultivos celulares 293 se transfectaron con 5 \mug plásmido vector pVlacZ, 5 \mug de plásmido pW1909, y 5 \mug de cualquiera de los plásmidos pladeno 1 o pladeno 5. Después de las transfecciones, los medios se reemplazaron, y los cultivos se incubaron a 37ºC durante aproximadamente 72 horas previas a la recogida.
Las células de cada grupo experimental se recogieron, los medios se eliminaron por centrifugación (1.000 x g durante 10 minutos), y 1 ml de lisado se produjo utilizando 3 ciclos congelado/descongelado (alternando entre hielo seco de etanol y baños de 37ºC). Se eliminaron los desechos de los lisados por centrifugación (10.000 x g durante 10 minutos). La producción de virión lacZ rAAV se valoraron utilizando las técnicas que se han descrito en el ejemplo 1. Los resultados del experimento se representan a continuación en la tabla 9.
TABLA 9
Vector de funciones accesorias Concentración rAAV\dagger
pladeno 1 2,2 \cdot 10^{9}
pladeno 5 5,5 \cdot 10^{9}
\dagger Como se determina en el ensayo de lacZ.
Como se puede ver por los resultados representados en la tabla 9, se aprecia mayor eficiencia de producción de virión rAAV cuando se utiliza el pladeno 5 (la producción del pladeno 5 presenta un rendimiento 2,5 veces más que los viriones de la producción de pladeno 1).
De acuerdo con esto, las funciones accesorias nuevas capaces de soportar una producción eficiente de virión 1Y recombinante se han descrito.
Depósitos de cepas útiles en la práctica de la invención
Un depósito de cultivos puros biológicos de las cepas siguientes se hizo con la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, EE. UU., bajo las provisiones de Budapest Treaty. El número de acceso indicado se asignó después de pruebas de viabilidad exitosas, y los honorarios requeridos se pagaron. El acceso a dichos cultivos será disponible durante la vigencia de la solicitud de patente determinada por un Comisario para que se titule bajo 37CFR 1.14 y 35 USC 122. Sobre la concesión de la patente en esta solicitud, todas las restricciones impuestas por el depositador en la disponibilidad del público al material biológico depositado será irrevocablemente eliminado con la excepción siguiente como se especifica en 37 CFR §1.808(b), dicha excepción es el depositador quien se reserva el derecho de contratar con el depositario para requerir que las muestras del material depositado se suministren sólo si hay un requerimiento de una muestra, durante el término de la patente, con cualquiera, o todas, las siguientes 3 condiciones: (1) el requerimiento se presentará por escrito u otra forma tangible y con fecha; y/o (2) el requerimiento contendrá el nombre y la dirección de la parte que hace el requerimiento y el número de acceso del depósito; y/o (3) el requerimiento se comunicará por escrito por al depositante al depositador con la fecha en cada muestra y se suministrará el nombre y la dirección de la parte a quien la muestra se suministre. Además, los depósitos designados se mantendrán durante el período de treinta (30) años desde la fecha del depósito, o durante cinco (5) años después del último requerimiento para depósito; o durante el tiempo en el cual se haga cumplir la patente de los Estados Unidos, que sea más largo. Un cultivo podría convertirse en no viable o ser destruido de forma no anunciada, o, en el caso de cepas que contengan plásmidos, que pierdan dichos plásmidos, y se reemplazarán con cultivo viable (o cultivos viables) de la misma descripción taxonómica.
Estos depósitos se proporcionan meramente como conveniencia a esos técnicos en la materia, y no se admiten requerimientos de depósitos. Las secuencias de ácido nucleico de estos plásmidos, así como las secuencias amino de los polipéptidos codificados de esta manera, estén controlando en el acontecimiento de cualquier conflicto con la descripción presente. Una licencia se puede requerir para hacer, utilizar, o vender los materiales depositados, y dicha licencia no es concedida por la presente.
9

Claims (22)

1. Molécula de ácido nucleico que proporciona dos o más funciones accesorias para soportar la producción de virión recombinante AAV (rAAV) en una célula huésped adecuada, dicha molécula de ácido nucleico no tiene al menos una región tardía de genes de adenovirus y comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de un grupo que consiste en (i) una secuencia que proporciona VA RNAs de adenovirus,(ii) una región codificadora E4 ORF6 de adenovirus, (iii) una región codificadora E2a de 72 kD de adenovirus, y cualquier combinación de secuencias de nucleótidos (i), (ii) y (iii).
2. Utilización de la molécula de ácido nucleico que proporciona una o más funciones accesorias para soportar la producción de virión recombinante AAV (rAAV) en una célula huésped adecuada, dicha molécula de ácido nucleico no tiene al menos una región tardía de genes de adenovirus y que comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada de un grupo que consiste en (i) una secuencia que proporciona VA RNAs de adenovirus, (ii) una región codificadora E4 ORF6 de adenovirus, (iii) una región codificadora E2a de 72 kD, y cualquier combinación de secuencias de nucleótidos (i), (ii) y (iii) para la producción de viriones AAV.
3. Utilización según la reivindicación 2, caracterizada porque dicha molécula no tiene regiones proximales de genes de adenovirus 2b y 3.
4. Utilización según la reivindicación 2 ó 3 que proporciona funciones accesorias para soportar la producción de virión rAAV en una célula huésped humana 293.
5. Utilización según la reivindicación 4, que comprende:
una primera secuencia de nucleótidos que proporciona un VA RNA de adenovirus;
una segunda secuencia de nucleótidos que comprende una región codificadora E4 de adenovirus que contiene el ORF 6; y
una tercera secuencia de nucleótidos que comprende una región codificadora E2a de adenovirus.
6. Utilización según la reivindicación 2, caracterizada porque dicha molécula proporciona funciones accesorias para soportar la producción de virión AAV recombinante (rAAV) en una célula huésped adecuada que no es infectable por adenovirus o no es capaz de sostener la replicación de adenovirus.
7. Utilización según la reivindicación 6, que comprende:
una primera secuencia de nucleótidos que proporciona un VA RNA de adenovirus;
una segunda secuencia de nucleótidos que comprende una región codificadora E4 de adenovirus que contiene ORF 6;
una tercera secuencia de nucleótidos que comprende una región codificadora E2a de adenovirus; y
una cuarta secuencia de nucleótidos que comprende las regiones codificadoras de adenovirus E1a y E1b.
8. Utilización según la reivindicación 4 ó 6, que comprende una o más secuencias de nucleótidos derivadas del genoma de un adenovirus tipo 2 o de un genoma de adenovirus tipo 5.
9. Utilización de un vector de función accesoria que comprende una molécula de ácido nucleico que proporciona una o más funciones accesorias para soportar la producción de virión AAV recombinante (rAAV) en una célula huésped adecuada que no es capaz de sostener la replicación de adenovirus, dicha molécula de ácido nucleico que no tiene al menos una región tardía de genes de adenovirus y comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en (i) una secuencia que proporciona VA RNAs de adenovirus, (ii) una región codificadora E4 ORF6 de adenovirus, (iii) una región codificadora E2a de 72 kD de adenovirus, y cualquier combinación de secuencias de nucleótidos (i), (ii) y (iii) para la producción de viriones AAV.
10. Utilización según la reivindicación 9, caracterizada porque dicho vector es un plásmido.
11. Utilización según la reivindicación 10 además comprende una marcador genético seleccionable.
12. Utilización según la reivindicación 11, caracterizada porque el marcador genético seleccionable comprende un gen de resistencia a antibiótico.
13. Utilización según la reivindicación 10 además comprende al menos una región promotora heteróloga para la producción de viriones AAV.
14. Vector de función accesoria según la reivindicación 13, caracterizado porque al menos una región promotora heteróloga comprende una secuencia de nucleótidos sustancialmente homólogos para la región promotora proximal inmediata de citomegalovirus (CMV) para la producción de viriones AAV.
15. Sistema de funciones accesorias para la producción de viriones AAV recombinantes (rAAV), que comprende los vectores de funciones accesorias primero, segundo y tercero, donde:
(a) dicho primer vector de función accesoria comprende una secuencia de nucleótidos que proporciona VA RNAs de adenovirus;
(b) dicho segundo vector de función accesoria comprende una región codificadora de adenovirus E4ORF6; y
(c) dicho tercer vector de función accesoria comprende una región codificadora de adenovirus E2a de 72 kD.
16. Sistema de funciones accesorias según la reivindicación 15 caracterizado porque el primer vector de función accesoria es el plásmido pBSII-VA RNAs (número de acceso ATCC: 98233), el segundo vector de función accesoria es p3.3cE4ORF6 (número de acceso ATCC: 98234) y el tercer vector de función accesoria es el p3.3cE2A (número de acceso ATCC: 98235).
17. Utilización de la célula huésped que se ha transfectado con un vector de función accesoria que comprende una molécula de ácido nucleico que proporciona una o más funciones accesorias para soportar la producción de virión AAV recombinante (rAAV) en una célula huésped adecuada que no es capaz de soportar la replicación de adenovirus, dicha molécula de ácido nucleico no tiene al menos una región tardía de genes de adenovirus y comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en (i) una secuencia que proporciona VA RNAs de adenovirus, (ii) una región codificadora E4 ORF6 de adenovirus, (iii) una región codificadora E2a de 72 kD de adenovirus, y cualquier combinación de secuencias de nucleótidos (i), (ii) y (iii) para la producción de viriones AAV.
18. Célula capaz de producir viriones AAV recombinantes (rAAV) cuando se transfectan con un vector AAV, dicha célula comprende la célula huésped que se ha transfectado con el vector de función accesoria que comprende una molécula de ácido nucleico que proporciona una o más funciones accesorias para soportar la producción de viriones AAV recombinantes (rAAV) en una célula huésped adecuada que no es capaz de sostener la replicación de adenovirus, dicha molécula de ácido nucleico no tiene al menos una región tardía de genes de adenovirus y comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en (i) una secuencia que proporciona VA RNAs de adenovirus, (ii) una región codificadora E4 ORF6 de adenovirus, (iii) una región codificadora E2a de 72 kD de adenovirus, y cualquier combinación de secuencias de nucleótidos (i), (ii) y (iii) cotranfectadas con una construcción colaboradora AAV que es capaz de expresarse en dicha célula para proporcionar las funciones colaboradoras AAV.
19. Método de producir viriones AAV recombinantes (rAAV), que comprende:
(a) introduciendo un vector en una célula huésped adecuada que no es capaz de sostener la replicación de adenovirus, donde el vector AAV es un vector derivado de un serotipo de virus adenoasociado, incluyendo AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV4, AAV-5 y AAVX7, e incluye al menos esas secuencias que se requieren en cis para la replicación y el empaquetamiento del virus;
(b) introduciendo una construcción colaboradora AAV en la célula huésped, donde la construcción colaboradora AAV es una molécula de ácido nucleico que incluye secuencias de nucleótidos que proporcionan las AAV suprimidas del vector AAV que no se utilizará para proporcionar un vector de transducción para la entrega de las secuencias de nucleótidos de interés y que no tiene ITRs AAV y que tampoco no puede ni replicarse ni empaquetarse, dicha construcción colaboradora que comprende las regiones codificadoras AAV que se expresan en la célula huésped para complementar las funciones colaboradoras AAV que no están en dicho vector AAV;
(c) introduciendo el sistema de función accesoria de la reivindicación 16 en la célula huésped, dicho sistema de función accesoria que proporciona funciones accesorias para soportar la producción de virión rAAV en la célula huésped; y
(d) haciendo cultivos de células huésped para producir viriones rAAV.
20. Método de producción de viriones AAV recombinantes (rAAV), que comprende:
(a) introduciendo un vector AAV en una célula huésped adecuada que no es capaz de soportar la replicación de adenovirus, donde el vector AAV es un vector derivado de un serotipo de virus adenoasociado, incluyendo AAV-1, AAV-2, AAV-3, AAV4, AAV-5 y AAVX7, y que incluye al menos esas secuencias que se requieren en cis para la replicación y el empaquetamiento del virus;
(b) introduciendo una construcción colaboradora AAV en la célula huésped, donde la construcción colaboradora AAV es una molécula de ácido nucleico que incluye secuencias de nucleótidos que proporcionan las AAV suprimidas del vector AAV que no se utilizará para producir un vector de transducción para la entrega de las secuencias de nucleótidos de interés y que no tiene ITRs AAV y que tampoco no puede ni replicarse ni empaquetarse, dicha construcción colaboradora comprende las regiones codificadoras AAV que se expresan en la célula huésped para complementar las funciones colaboradoras AAV que no están en dicho vector AAV;
(c) introduciendo el vector de función accesoria que comprende una molécula de ácido nucleico que proporciona una o más funciones accesorias para soportar la producción de virión AAV recombinante (rAAV) en una célula huésped adecuada, preferiblemente una célula huésped que no es infectable por adenovirus o que no es capaz de soportar la replicación de adenovirus, y que no tiene al menos una región de genes tardía de adenovirus, dicha molécula comprende una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en (i) una secuencia que proporciona VA RNAs de adenovirus, (ii) una región codificadora E4 ORF6 de adenovirus, (iii) una región codificadora E2a de 72 kD de adenovirus, y cualquier combinación de secuencias de nucleótidos (i), (ii) y (iii) en la célula huésped, dicho vector de función accesoria proporciona las funciones accesorias para soportar la producción de virión rAAV en la célula huésped; y
(d) haciendo cultivos de células huésped para producir viriones rAAV.
21. Preparación de viriones AAV recombinantes que se puede producir por el método de acuerdo con la reivindicación 19 ó 20.
22. Preparación de viriones AAV recombinantes libres de adenovirus.
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Families Citing this family (100)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6040183A (en) * 1995-06-07 2000-03-21 University Of North Carloina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
US6093570A (en) * 1995-06-07 2000-07-25 The University Of North Carolina At Chapel Hill Helper virus-free AAV production
US6001650A (en) * 1995-08-03 1999-12-14 Avigen, Inc. High-efficiency wild-type-free AAV helper functions
US6027931A (en) * 1995-08-03 2000-02-22 Avigen, Inc. High-efficiency AA V helper functions
US6632670B1 (en) 1995-09-08 2003-10-14 Genzyme Corporation AAV vectors for gene therapy
JP2006075171A (ja) * 1995-11-09 2006-03-23 Avigen Inc 組換えａａｖビリオン産生における使用のための補助機能
US6004797A (en) * 1995-11-09 1999-12-21 Avigen, Inc. Adenovirus helper-free recombinant AAV Virion production
US20020037867A1 (en) * 1999-02-26 2002-03-28 James M. Wilson Method for recombinant adeno-associated virus-directed gene therapy
DE19644500C2 (de) * 1996-10-25 1998-11-05 Deutsches Krebsforsch AAV-DNA mit Helfervirus-Sequenzen
US6221646B1 (en) 1997-07-31 2001-04-24 Chiron Corporation Materials and methods for simplified AAV production
US6989264B2 (en) 1997-09-05 2006-01-24 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
DK1009808T3 (da) 1997-09-05 2013-01-21 Genzyme Corp Fremgangsmåder til generering af hjælper-frie præparater af rekombinante aav-vektorer med høj titer
US6566118B1 (en) 1997-09-05 2003-05-20 Targeted Genetics Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
EP1064393B1 (en) * 1998-03-20 2004-12-29 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
US6953690B1 (en) 1998-03-20 2005-10-11 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
US6291214B1 (en) * 1998-05-11 2001-09-18 Glaxo Wellcome Inc. System for generating recombinant viruses
WO1999061066A2 (en) 1998-05-27 1999-12-02 Avigen, Inc. Convection-enhanced delivery of aav vectors
WO1999067400A1 (en) 1998-06-24 1999-12-29 Musc Foundation For Research Development Tissue-specific and target rna-specific ribozymes
EP1930418B1 (en) 1998-09-04 2015-04-08 Genzyme Corporation Methods for generating high titer helper-free preparations of released recombinant AAV vectors
WO2000022152A1 (en) * 1998-10-13 2000-04-20 Avigen, Inc. Compositions and methods for producing recombinant adeno-associated virus
EP1124976A1 (en) * 1998-10-27 2001-08-22 Crucell Holland B.V. Improved aav vector production
US6509150B1 (en) * 1999-03-05 2003-01-21 Universite De Nantes Compositions and methods for recombinant Adeno-Associated Virus production
JP4693244B2 (ja) 1999-03-18 2011-06-01 ザ・トラステイーズ・オブ・ザ・ユニバーシテイ・オブ・ペンシルベニア 組換えアデノ随伴ウイルスのヘルパー無しの生産のための組成物および方法
US6258595B1 (en) 1999-03-18 2001-07-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions and methods for helper-free production of recombinant adeno-associated viruses
US6271359B1 (en) 1999-04-14 2001-08-07 Musc Foundation For Research Development Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes
CA2365901A1 (en) 1999-04-14 2000-10-19 Musc Foundation For Research Development Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents and ribozymes
DK1180159T3 (da) 1999-05-28 2008-11-17 Targeted Genetics Corp Fremgangsmåder og sammensætninger til at sænke niveauet af Tumor-Nekrose-Faktor (TNF) i TNF-associerede lidelser
EP1939300A1 (en) 1999-05-28 2008-07-02 Targeted Genetics Corporation Methods and compositions for lowering the level of tumor necrosis factor (TNF) in TNF-associated disorders
EP1916258B1 (en) 1999-08-09 2014-04-23 Targeted Genetics Corporation Enhancement of expression of a single-stranded, heterologous nucleotide sequence from recombinant viral vectors by designing the sequence such that it forms intrastrand base pairs
CA2379166C (en) 1999-08-09 2013-03-26 Targeted Genetics Corporation Enhancement of expression of a single-stranded, heterologous nucleotide sequence from recombinant viral vectors by designing the sequence such that it forms instrastrand base pairs
US6582692B1 (en) 1999-11-17 2003-06-24 Avigen, Inc. Recombinant adeno-associated virus virions for the treatment of lysosomal disorders
US7208315B2 (en) * 2000-01-05 2007-04-24 Fred Hutchinson Cancer Research Center Compositions and methods for efficient AAV vector production
EP1702983A3 (en) 2000-04-13 2007-01-10 Medical University of South Carolina Tissue-specific and pathogen-specific toxic agents, ribozymes, DNAzymes and antisense oligonucleotides and methods of use thereof
DE60129229T2 (de) * 2000-08-17 2008-05-08 Ozawa, Keiya Adeno-assoziierte virus-vermittelte übertragung von angiogenesefaktoren
DE10056210A1 (de) * 2000-11-13 2002-05-29 Arimedes Biotechnology Gmbh Virales Expressionssystem
AU2003223497A1 (en) * 2002-04-05 2003-10-27 Centocor, Inc. Asthma-related anti-il-13 immunoglobulin derived proteins, compositions, methods and uses
US7261544B2 (en) 2003-05-21 2007-08-28 Genzyme Corporation Methods for producing preparations of recombinant AAV virions substantially free of empty capsids
SI1633772T1 (sl) 2003-06-19 2016-06-30 Genzyme Corporation AAV virioni z zmanjšano imunoreaktivnostjo in uporaba za ta namen
US7261882B2 (en) 2003-06-23 2007-08-28 Reagents Of The University Of Colorado Methods for treating neuropathic pain by administering IL-10 polypeptides
DE602004027048D1 (de) * 2003-07-16 2010-06-17 Resverlogix Inc Verbindungen und methoden für das downregulating der effekte von tgf-beta
US7427396B2 (en) * 2004-06-03 2008-09-23 Genzyme Corporation AAV vectors for gene delivery to the lung
EP1755400A2 (en) * 2004-06-18 2007-02-28 The University Of Montana Aav mediated gene delivery to cochlear cells
MX2007003850A (es) 2004-10-05 2007-11-21 Genzyme Corp Canula escalonada.
US7943374B2 (en) * 2005-08-21 2011-05-17 Markus Hildinger Super-size adeno-associated viral vector harboring a recombinant genome larger than 5.7 kb
EP2425000B1 (en) 2009-04-30 2019-02-20 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Compositions for targeting conducting airway cells comprising adeno-associated virus constructs
HRP20250897T1 (hr) 2009-05-02 2025-09-26 Genzyme Corporation Genska terapija za neurodegenerativne poremećaje
WO2011094198A1 (en) 2010-01-28 2011-08-04 The Children's Hospital Of Philadelphia Research Institute, Abramson Research Center A scalable manufacturing platform for viral vector purification and viral vectors so purified for use in gene therapy
DK2368903T3 (da) * 2010-03-26 2014-05-05 Deutsches Krebsforsch Adenovirusafledt hjælpevirus til fremme af produktion af rekombinant parvovirus
US9428565B2 (en) 2011-01-31 2016-08-30 The General Hospital Corporation Treatment and bioluminescent visualization using multimodal TRAIL molecules
US20150004144A1 (en) 2011-12-02 2015-01-01 The General Hospital Corporation Differentiation into brown adipocytes
KR101738438B1 (ko) 2012-07-06 2017-05-22 다카라 바이오 가부시키가이샤 아데노-관련 바이러스 벡터의 생산세포
WO2014035474A1 (en) 2012-08-30 2014-03-06 The General Hospital Corporation Compositions and methods for treating cancer
CA2909706C (en) 2013-04-17 2023-02-14 Genzyme Corporation Use of an il17 inhibitor for treating and preventing macular degeneration
JP6649250B2 (ja) 2013-05-21 2020-02-19 プレジデント・アンド・フェロウズ・オブ・ハーバード・カレッジ 操作されたヘム結合性構成物およびその使用
CN105339495A (zh) 2013-07-11 2016-02-17 宝生物工程株式会社 制备无包膜病毒的方法
WO2015031686A1 (en) 2013-08-30 2015-03-05 Amgen Inc. High titer recombinant aav vector production in adherent and suspension cells
BR112016017817A2 (pt) 2014-02-06 2017-10-10 Genzyme Corp composições e métodos para o tratamento e a prevenção de degeneração macular
US10023846B2 (en) 2014-07-10 2018-07-17 Takara Bio Inc. Production method for non-enveloped virus particles
EP3194446B1 (en) 2014-09-18 2022-10-26 Cedars-Sinai Medical Center Compositions and methods for treating fibrosis
KR102493350B1 (ko) 2015-01-09 2023-01-27 다카라 바이오 가부시키가이샤 비엔벨로프 바이러스 입자의 제조방법
EP3283529B1 (en) 2015-04-17 2023-06-07 The General Hospital Corporation Agents, systems and methods for treating cancer
US12551526B2 (en) 2015-04-22 2026-02-17 Cedars-Sinai Medical Center Enterically delivered bitter oligopeptides for the treatment for type 2 diabetes
FI3436593T3 (fi) 2016-03-28 2023-03-16 Ultragenyx Pharmaceutical Inc Adenoviruksen lämpöinaktivointimenetelmiä
LT3436051T (lt) 2016-03-31 2021-11-25 Spark Therapeutics, Inc. Kolonėlėmis pagrįstas visiškai keičiamo masto raav gavimo būdas
PL3526321T3 (pl) 2016-10-14 2025-04-28 Ultragenyx Pharmaceutical Inc. Zastosowanie środków regulujących ciśnienie osmotyczne w celu zwiększenia wydajności rekombinacyjnego wirusa związanego z adenowirusami
WO2018175775A1 (en) 2017-03-22 2018-09-27 Dimension Therapeutics Cell culture methods involving hdac inhibitors or rep proteins
WO2018208960A1 (en) 2017-05-09 2018-11-15 Dimension Therapeutics, Inc. Scalable method for producing transfection reagents
WO2018226887A1 (en) 2017-06-07 2018-12-13 Spark Therapeutics, Inc. ENHANCING AGENTS FOR IMPROVED CELL TRANSFECTION AND/OR rAAV VECTOR PRODUCTION
MX2020011386A (es) 2018-04-27 2021-01-29 Spacecraft Seven Llc Terapia genica para la degeneracion del snc.
KR102918544B1 (ko) 2018-07-12 2026-01-27 로켓 파마슈티컬스, 리미티드 다논병을 치료하기 위한 유전자 요법 벡터
CA3112883A1 (en) 2018-10-25 2020-04-30 Baxalta Incorporated Aav triple-plasmid system
WO2021028837A1 (en) 2019-08-13 2021-02-18 Waters Technologies Corporation Affinity resins and sample preparation devices based on cartilaginous fish ignar derived binding domains
US20230013253A1 (en) 2019-12-19 2023-01-19 Pfizer Inc. Compostions and methods for nucleic acid transfection using cationic polymers and stabilizers
AU2021213735A1 (en) 2020-01-30 2022-09-22 Umoja Biopharma, Inc. Bispecific transduction enhancer
WO2021236908A2 (en) 2020-05-20 2021-11-25 Biomarin Pharmaceutical Inc. Use of regulatory proteins for the production of adeno-associated virus
KR20230043869A (ko) 2020-08-07 2023-03-31 스페이스크래프트 세븐, 엘엘씨 Aav 벡터를 사용한 플라코필린-2(pkp2) 유전자 요법
EP4229204A1 (en) 2020-10-15 2023-08-23 F. Hoffmann-La Roche AG Nucleic acid constructs for simultaneous gene activation
CA3197730A1 (en) 2020-10-15 2022-04-21 F. Hoffman-La Roche Ag Nucleic acid constructs for va rna transcription
US20230407328A1 (en) 2020-11-02 2023-12-21 Biomarin Pharmaceutical Inc. Process for enriching adeno-associated virus
WO2023060113A1 (en) * 2021-10-05 2023-04-13 Regenxbio Inc. Compositions and methods for recombinant aav production
CN118202060A (zh) * 2021-10-05 2024-06-14 再生生物股份有限公司 用于重组aav生产的组合物和方法
EP4508241A1 (en) 2022-04-13 2025-02-19 F. Hoffmann-La Roche AG Method for determining aav genomes
CN119256220A (zh) 2022-05-23 2025-01-03 豪夫迈·罗氏有限公司 用于区分aav颗粒血清型和aav颗粒荷载状态的基于拉曼的方法
CN119301260A (zh) 2022-06-03 2025-01-10 豪夫迈·罗氏有限公司 用于生产重组aav颗粒的方法
KR20250036743A (ko) 2022-07-14 2025-03-14 에프. 호프만-라 로슈 아게 재조합 aav 입자를 생산하는 방법
CA3264505A1 (en) 2022-09-12 2024-03-21 F. Hoffmann-La Roche Ag METHOD FOR SEPARING SOLID AND EMPTY VAA PARTICLES
TW202421788A (zh) 2022-09-22 2024-06-01 美商拜奧馬林製藥公司 用ａａｖ基因療法載體治療致心律不整性心肌病
CN120380156A (zh) 2022-09-22 2025-07-25 迪纳柯公司 用aav基因治疗载体治疗心肌病
AU2024216670A1 (en) 2023-02-07 2025-07-31 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the detection of anti-aav particle antibodies
AU2024239386A1 (en) 2023-03-21 2025-08-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for the production of recombinant aav particle preparations
WO2024233791A1 (en) 2023-05-11 2024-11-14 Seelos Therapeutics, Inc. Methods of treating neurodegenerative disorders
TW202545971A (zh) 2024-02-08 2025-12-01 美商戴諾治療公司 殼體多肽及其使用方法
WO2025168663A1 (en) 2024-02-09 2025-08-14 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for producing recombinant adeno-associated viral particles
WO2025214477A1 (en) 2024-04-12 2025-10-16 Skyline Therapeutics (Shanghai) Co., Ltd. Treatment of genetic cardiomyopathies with aav gene therapy vectors
WO2025252480A1 (en) 2024-06-07 2025-12-11 F. Hoffmann-La Roche Ag Method for purifying plasmid dna
WO2026022064A1 (en) 2024-07-22 2026-01-29 F. Hoffmann-La Roche Ag Novel aav rep orfs and rep polypeptides
WO2026037757A1 (en) 2024-08-13 2026-02-19 F. Hoffmann-La Roche Ag Modified aav particles
WO2026064428A2 (en) 2024-09-18 2026-03-26 Dyno Therapeutics, Inc. Capsid polypeptides and methods of use thereof
WO2026064444A1 (en) 2024-09-18 2026-03-26 Dyno Therapeutics, Inc. Capsid polypeptides and methods of use thereof
WO2026064442A2 (en) 2024-09-18 2026-03-26 Dyno Therapeutics, Inc. Capsid polypeptides and methods of use thereof

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5436146A (en) * 1989-09-07 1995-07-25 The Trustees Of Princeton University Helper-free stocks of recombinant adeno-associated virus vectors
US5173414A (en) * 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US6268213B1 (en) * 1992-06-03 2001-07-31 Richard Jude Samulski Adeno-associated virus vector and cis-acting regulatory and promoter elements capable of expressing at least one gene and method of using same for gene therapy
FR2705686B1 (fr) * 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
SK282843B6 (sk) * 1993-07-13 2002-12-03 Rhone-Poulenc Rorer S. A. Defektný rekombinantný adenovírus a farmaceutický prostriedok s jeho obsahom
FR2707664B1 (fr) * 1993-07-13 1995-09-29 Centre Nat Rech Scient Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique.
PT728214E (pt) * 1993-11-09 2004-11-30 Ohio Med College Linhas celulares estaveis capazes de expressar o gene de replicacao do virus adeno-associado
US5872005A (en) * 1994-11-03 1999-02-16 Cell Genesys Inc. Packaging cell lines for adeno-associated viral vectors
IL116816A (en) * 1995-01-20 2003-05-29 Rhone Poulenc Rorer Sa Cell for the production of a defective recombinant adenovirus or an adeno-associated virus and the various uses thereof
US6281010B1 (en) * 1995-06-05 2001-08-28 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Adenovirus gene therapy vehicle and cell line
CA2221293C (en) * 1995-06-07 2012-09-18 University Of North Carolina At Chapel Hill Helper virus-free aav production
US6632670B1 (en) * 1995-09-08 2003-10-14 Genzyme Corporation AAV vectors for gene therapy
US6004797A (en) * 1995-11-09 1999-12-21 Avigen, Inc. Adenovirus helper-free recombinant AAV Virion production
US5945335A (en) * 1995-11-09 1999-08-31 Avigen, Inc. Adenovirus helper-free system for producing recombinant AAV virions lacking oncogenic sequences

Also Published As

Publication number Publication date
EP1522588A2 (en) 2005-04-13
US20050164392A1 (en) 2005-07-28
CA2236968A1 (en) 1997-05-15
JP4473346B2 (ja) 2010-06-02
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DE69633572D1 (de) 2004-11-11
US6004797A (en) 1999-12-21
US6897063B2 (en) 2005-05-24
WO1997017458A1 (en) 1997-05-15
DE69633572T2 (de) 2005-10-06
US7485458B2 (en) 2009-02-03
JP2012050453A (ja) 2012-03-15
ATE278789T1 (de) 2004-10-15
EP0862643A1 (en) 1998-09-09
US20030170896A1 (en) 2003-09-11
EP1522588A3 (en) 2006-06-07
JP2001517071A (ja) 2001-10-02
US6482633B1 (en) 2002-11-19
PT862643E (pt) 2005-01-31
CA2236968C (en) 2007-05-08

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