ES2230714T3 - Defensina humana def-x, gen y adnc, composicion que los contiene y aplicaciones diagnosticas y terapeuticas. - Google Patents

Abstract

Polipéptido aislado elegido entre los polipéptidos siguientes: a) polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es la secuencia SEQ ID No. 6; b) polipéptido que presenta como mínimo 80 % de identidad con el polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es la secuencia SEQ ID No. 6; c) polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es la secuencia de aminoácidos de un fragmento biológicamente activo de al menos 10 aminoácidos consecutivos del polipéptido tal como está definido en a), teniendo dicho fragmento al menos una actividad elegida entre las actividades siguientes: - reconocimiento por un anticuerpo específico del polipéptido definido en a); - actividad antibiótica; - actividad citotóxica; o - actividad antitumoral; y d) polipéptido que comprende al menos un polipéptido tal como está definido en a), b), ó c).

Description

Defensina humana Def-X, gen y ADNc, composición que los contiene y aplicaciones diagnósticas y terapéuticas.

La presente invención se refiere a una nueva defensina polipeptídica humana Def-X, homóloga de HNP-4, su ADN genómico y ADNc.

La invención se refiere igualmente a vectores de clonación y de expresión, a células transformadas por dichos vectores. La invención tiene también por objetivo la utilización de dichos polipéptidos como agente antibiótico, citotóxico, de reparación y de regulación endocrina o como plaguicida así como composiciones cosméticas o farmacéuticas para el tratamiento de infecciones microbianas, especialmente bacterianas, fúngicas, y virales, o parasitarias, de cánceres, de inflamación y de déficit inmunitario. Por último, la invención comprende métodos y kits de diagnóstico para la determinación de una infección microbiana o parasitaria y una inflamación, o para la profilaxis de predisposición a deficiencias inmunitarias o enfermedades cancerosas.

Las sustancias antimicrobianas son elementos primordiales de la defensa de los organismos multicelulares. Entre estas sustancias, se encuentran tanto compuestos inorgánicos simples (peróxido de hidrógeno, ácido hipocloroso, óxido nítrico) como péptidos y proteínas complejas. Están presentes en las primeras líneas de defensa, en la superficie de las mucosas de diferentes órganos, especialmente en las células epiteliales del intestino y de los pulmones, según las especies, así como en los orgánulos microbicidas de células fagocitarias de origen hematopoyético, donde fueron en principio puestas en evidencia. Su síntesis de novo o su liberación a partir de sitios de almacenaje - orgánulos de tipo lisosomas, gránulos citoplásmicos, capaces de almacenarlas en una forma inactiva o latente - pueden ser inducidas rápidamente, lo que las hace particularmente importantes en las fases precoces de resistencia a las infecciones (Martin et al., 1995).

Las proteínas antimicrobianas de un tamaño inferior a cien aminoácidos son arbitrariamente llamadas péptidos antimicrobianos. Varias familias de péptidos antimicrobianos han sido identificadas, que difieren en cuanto a la presencia en su seno de puentes disulfuros, en cuanto a su composición en aminoácidos, a su conformación estructural y a su espectro de actividad. Los péptidos antimicrobianos que incluyen seis cisteinas conservadas forman la familia de las defensinas. Esta familia está compuesta de péptidos antimicrobianos presentes en numerosas especies, abundantes, de alrededor de 3-4 kDa (Ganz et Lehrer, 1994). Estos péptidos están formados por 30 a 40 aminoácidos, de los cuales seis cisteinas invariables que forman tres enlaces disulfuros intramoleculares. Tienen una conformación compleja, son anfipáticos, ricos en láminas beta antiparalelas, pero desprovistos de hélices alfa (Lehrer et Ganz, 1992). La acción antimicrobiana de las defensinas resultaría de su inserción en las membranas de las células dianas, permitiendo la formación de canales voltaje-dependientes. White et al. (1995) describen los posibles mecanismos de inserción membranar y de formación de poros multiméricos por las defensinas, que permiten la permeabilización de las membranas de células dianas, por ejemplo de células microbianas o tumorales. La estructura cristalográfica de la defensina humana de neutrófilo HNP-3 (ver a continuación) ha sido determinada, y además se ha sugerido un mecanismo particular de dimerización de las defensinas humanas de neutrófilo. El conocimiento extenso de esta familia de péptidos y la comparación de sus secuencias y espectros de actividad permitirán comprender mejor estos mecanismos y sus especificidades, así como los residuos aminoácidos más particularmente implicados en estos fenómenos.

Las defensinas se reparten en tres familias de péptidos, estructuralmente diferentes: defensinas "clásicas", beta-defensinas y defensinas de insectos. Estas familias presentan diferencias que se refieren a la posición y al espaciamiento de los residuos cisteinas conservados, así como los de otros aminoácidos conservados (prolina, glicina) (Ganz et Lehrer, 1995).

Las defensinas humanas de tipo clásico, provienen esencialmente de dos fuentes. Al principio fueron identificadas por purificación peptídica a partir de extractos de neutrófilos. Cuatro defensinas han sido así aisladas: "human neutrophil peptides" HNP-1, HNP-2, HNP-3, y HNP-4. Las tres primeras son productos diferentes del mismo gen (Ganz et Lehrer, 1995). Estos tres péptidos representan el 99% del contenido de los neutrófilos en defensinas, mientras que HNP-4 está también presente, pero a concentraciones 100 veces más bajas. Más recientemente, dos defensinas entéricas humanas, HD-5 y HD-6, han sido caracterizadas en el intestino delgado y más precisamente en las células de Paneth (Bevins et al., 1996). Mientras que 16 genes de defensinas entéricas han sido puestos en evidencia en el ratón, solos estos dos homólogos han sido identificados en el hombre (Mallow et al., 1996).

Las defensinas tienen una acción antimicrobiana en un amplio espectro de microorganismos in vitro (Martin et al., 1995). Este espectro de acción, particularmente amplio, comprende bacterias, Gram-positivas y Gram-negativas, varios hongos, micobacterias, parásitos de los cuales las espiroquetas y varios virus con envolvente de los cuales los virus HSV y HIV. Son igualmente citotóxicas para varias categorías de células normales y malignas, de las cuales las células resistentes al TNF-alfa y al factor citolítico NK (Kagan et al., 1994). La gran cantidad de dianas de las defensinas y su abundancia en las células sanguíneas especializadas en la defensa inmunitaria, así como el aumento dramático de su concentración en el curso de infecciones severas, sugieren que estas moléculas jugarían un papel importante en la inmunidad natural a las infecciones y a los cánceres. Especialmente, el aumento de la transcripción de los genes de las defensinas y la liberación de gránulos citoplasmáticos que contienen defensinas pre-sintetizadas en respuesta a estímulos, contribuyen a la respuesta antimicrobiana local, las defensinas pueden participar en la reacción de inflamación, en los procesos de reparación y en la regulación endocrina durante la infección. Las defensinas hematopoyéticas podrían contribuir al fenómeno de lisis de las células cancerosas, fenómeno mediado por los neutrófilos en el curso de la respuesta inmunitaria anticuerpo-dependiente. El papel fisiológico preciso de las defensinas entéricas no está claramente establecido. Podrían frenar la proliferación de la flora intraluminal o impedir la traslocación de bacterias a través de la mucosa intestinal (Mallow et al., 1996). La abundancia de ARNm de defensina en las células de Paneth refuerza la hipótesis de que estas células epiteliales jugarían un papel clave en la defensa inmunitaria del intestino. Por otra parte se ha mostrado que su esquema de expresión coincide con la aparición de células de Paneth en el curso de la embriogénesis. Mallow et al. (1996) han sugerido que bajas proporciones de expresión de defensinas entéricas en el feto sería el testigo de una inmadurez de la defensa local, lo que predispondría a los niños nacidos prematuramente a infecciones debidas a los microorganismos intestinales.

Una concentración de defensinas que corresponde al 10% de la proporción normal ha sido constatada en los pacientes afectados de "specific granule deficiency", una enfermedad rara del desarrollo de los granulocitos. Los sujetos afectados sufren infecciones frecuentes, provocadas por bacterias comunes (Ganz et Lehrer, 1995).

Las defensinas modificadas bioquímicamente son potenciales agentes profilácticos y terapéuticos contra las infecciones (Ganz et Lehrer, 1995). La investigación se refiere a estos péptidos antimicrobianos u otras moléculas que participan de la inmunidad natural, adquiere una importancia particular desde que se desarrollan fenómenos de resistencia de los microorganismos a los antibióticos tradicionales (Bevins et al., 1996).

La estructura primaria de las defensinas, especialmente de las defensinas humanas, ha sido el objetivo de estudios recientes (White et al., 1995; Mallow et al., 1996). Las defensinas clásicas comprenden 29 a 35 aminoácidos, pero derivan de precursores - preproproteínas- que comprenden 90 a 100 aminoácidos. La maduración proteolítica de las defensinas humanas de neutrófilos en péptidos maduros está acoplada con su direccionamiento hacia los granulocitos; la función del propéptido incluiría la inactivación de la forma precursora de la defensina y un soporte en la adquisición de la conformación activa del péptido maduro (Martin et al., 1995). Las homologías peptídicas son máximas a nivel de las señales péptidas, y mínimas a nivel de los péptidos maduros, que incluyen al menos seis residuos cisteinas totalmente conservados. Si la conservación de estos residuos parece necesaria para la adquisición de estructuras secundarias implicadas en la actividad de las defensinas, las diferencias de secuencias que existen en el seno de la familia muy amplia de estos péptidos antimicrobianos, especialmente en su extremo N-terminal, pero también en otras regiones no conservadas, parecen ser determinantes importantes de su espectro de actividad, y de su eficacia antimicrobiana o citotóxica. La identificación de nuevos miembros de esta familia de péptidos, y especialmente de defensinas humanas, es pues necesaria para la comprensión de su mecanismo de acción y de su especificidad, así como su utilización como agentes anti-infecciosos y/o citotóxicos, o en el diseño de péptidos variables que presentan espectros específicos y/o de eficacia disminuida o aumentada.

Sparkes et al., (1989), han localizado el gen que codifica HNP-1 en el cromosoma 8, en la región 8p23. Bevins et al., (1995), y Mallow et al. (1996), han localizado los dos genes que codifican HD-5 y HD-6 en el cromosoma 8, más precisamente en la región 8p21-pter, región que incluye la región anteriormente identificada como portadora de las defensinas hematopoyéticas. Los genes que codifican las defensinas entéricas humanas HD-5 y HD-6 contienen dos exones, mientras que los que codifican las defensinas hematopoyéticas contienen tres, los dos últimos exones que codifican el prepropéptido, tanto en el hombre, como en la cobaya y el conejo (Mallow et al., 1996). La comparación de las secuencias genómicas de los genes HD-5 y HD-6 ha revelado una similitud muy fuerte de secuencias contiguas no codificantes en 5', que sugieren que estas contienen la información necesaria en el tejido-específico de la expresión de estos genes; estas mismas regiones llevan además numerosos sitios de fijación para factores de transcripción, de los cuales dos sitios AP2 y seis sitios IL6, que sugieren vías de regulación de la expresión de estos genes en el curso de los procesos inflamatorios. De forma más general, el grado muy importante de similitud de las secuencias y de la organización genómica de las defensinas HNP-1, 2, 3, 4 y HD-5 y 6, ha conducido a Bevins et al. (1995) a un modelo de evolución que intenta relacionar la organización cromosómica de la familia, y las fracciones homólogas de cada par de genes.

Por último es interesante señalar que la región cromosómica 8p23 está implicada en numerosas patologías, especialmente cancerosas: citaremos por ejemplo el carcinoma hepatocelular (Becker et al., 1996), el cáncer de pulmón no de células pequeñas (Sundareshan et Augustus, 1996), el cáncer de próstata (Ichikawa et al., 1996), y el carcinoma colorrectal (Yaremko et al., 1994). Aunque esto no ha sido nunca documentado, es posible que una deficiencia en una u otra de las defensinas humanas tenga un papel en la predisposición a tales patologías, o en su desarrollo.

La presente invención se refiere a una nueva defensina humana, Def-X, homóloga de la defensina HNP-4.

La presente invención tiene pues por objetivo un polipéptido aislado elegido entre los péptidos siguientes:

a) polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es la secuencia SEQ ID Nº6;

b) polipéptido que presenta al menos un 80% de identidad con el polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es la secuencia SEQ ID Nº 6;

c) polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es la secuencia de aminoácidos de un fragmento biológicamente activo de al menos 10 aminoácidos consecutivos de un polipéptido tal como está definido en a) ó b);

d) polipéptido que comprende al menos un polipéptido tal como está definido en a), b) ó c).

En la presente descripción, se quiere designar igualmente por ";polipéptido" una proteína o un péptido.

Según un modo preferido, el polipéptido según la invención está caracterizado porque está constituido por polipéptidos de secuencia SEQ Nº3.

Igualmente se pueden citar los polipéptidos constituidos de uno al menos de los fragmentos siguientes:

a) péptido señal cuya secuencia de aminoácidos es la secuencia SEQ ID Nº4, que corresponde a la secuencia comprendida entre la posición 1 y la posición 19, extremos incluidos, de la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº3;

b) región pro cuya secuencia de aminoácidos es la secuencia SEQ ID Nº5, que corresponde a la secuencia comprendida entre la posición 20 y la posición 63, extremos incluidos, de la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº3;

c) péptido maduro cuya secuencia de aminoácidos es la secuencia SEQ ID Nº6, que corresponde a la secuencia comprendida entre la posición 64 y la posición 94, extremos incluidos, de la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº3; o

d) fragmento homólogo, variable o modificado de un péptido según a), b) ó c).

De forma todavía preferida, los polipéptidos según la presente invención corresponden a la estructura primaria de la defensina madura definida anteriormente, es decir la estructura que corresponde a la secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº6 siguiente:

Ile Cys His Cys Arg Val Leu Tyr Cys Ile Phe Gly Glu His Leu Gly Gly Thr Cys Phe Ile Leu Gly Glu Arg Tyr Pro Ile Cys Cys Tyr, sus homólogos que presentan al menos 80% de identidad así como sus fragmentos biológicamente activos y los polipéptidos que los contienen.

Evidentemente los polipéptidos de la invención están en forma no natural, es decir que no están tomados de su medio ambiente natural sino que han podido ser obtenidos por purificación a partir de fuentes naturales o bien obtenidos por recombinacion genética o por síntesis química como será descrito a continuación.

Por "polipéptido homólogo", se entiende un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos presenta como mínimo 80%, y preferentemente 90%, de aminoácidos en común.

Por "polipéptido variable", se quiere designar un polipéptido mutado o que corresponde a un polimorfismo que puede existir, especialmente en el ser humano y que puede presentar una eliminación, una sustitución, una deleción y/o una adición de al menos un aminoácido comparable al polipéptido según la invención.

Por "polipéptido modificado", se quiere designar un polipéptido obtenido por recombinacion genética o por síntesis química como será descrito a continuación, que presenta una modificación con relación a la secuencia normal. Estas modificaciones podrán llevar especialmente en los dominios pre-, pro-, o maduro del polipéptido según la invención, en los aminoácidos el origen de una especificidad de espectro o de eficacia de la actividad, o el origen de la conformación estructural, de la carga, o de la hidrofobicidad, y de la capacidad de multimerización y de inserción membranar del polipéptido según la invención. Se podrá así crear polipéptidos de actividad equivalente, aumentada o disminuida, y de especificidad equivalente, más estrecha o más amplia. Las modificaciones se podrán también llevar en las secuencias implicadas en la maduración, el transporte y el direccionamiento del polipéptido.

Por "fragmento biológicamente activo" de un polipéptido según la invención, se quiere designar un fragmento polipeptídico que tenga conservada al menos una actividad del polipéptido del cual procede, en particular:

\bullet

capaz de ser reconocido por un anticuerpo especifico de un polipéptido según la invención ; y/o

\bullet

capaz de actuar como antibiótico; y/o

\bullet

capaz de actuar como agente citotóxico; y/o

\bullet

capaz de actuar como agente antitumoral; y/o

\bullet

capaz de modular la reparación del tejido, la regulación endocrina o el proceso de inflamación, especialmente durante una infección.

Según la invención, los fragmentos biológicamente activos de polipéptidos según la invención tendrán al menos 10 aminoácidos, de preferencia 15 aminoácidos.

Como ya ha sido indicado anteriormente, entre los fragmentos biológicamente activos, un fragmento preferido es el péptido maduro de secuencia de aminoácidos SEQ ID Nº6.

Entre los homólogos del péptido maduro, hay que citar los polipéptidos en los cuales hasta 5 aminoácidos han sido modificados, eliminados en el extremo N- o C-terminal, o bien suprimidos, o bien añadidos, lo que representa alrededor del 80% de la secuencia.

Los fragmentos biológicamente activos de este péptido maduro comprenden de preferencia de 10 a 15 aminoácidos, cuyo interés podrá ser poder ser obtenidos fácilmente por síntesis química.

Como ya está indicado, las modificaciones del polipéptido maduro tendrán por objetivo específicamente :

- modular la actividad de la defensina,

- modificar su especificidad, tanto a nivel de los microorganismos sobre los cuales es activa como sobre su localización tisular,

- modificar su biodisponibilidad.

Los compuestos anteriores pueden obtenerse utilizando la química combinatoria, en la cual es posible hacer variar sistemáticamente partes de polipéptido antes de ensayar sobre modelos, cultivos celulares o microorganismos por ejemplo, para seleccionar los compuestos más activos o que presentan las propiedades buscadas.

La síntesis química presenta igualmente la ventaja de poder utilizar:

- aminoácidos no naturales, o

- enlaces no peptídicos.

Así, con el fin de mejorar la duración de vida de los péptidos, podrá ser interesante utilizar aminoácidos no naturales, por ejemplo en forma D, o bien análogos de aminoácidos, especialmente formas azufradas por ejemplo.

Por último, la estructura de la defensina madura o de sus homólogos, variables o modificados, igual que los fragmentos correspondientes, podrán estar integrados en estructuras químicas de tipo polipeptídico u otras. Así, podrá ser interesante prever en los extremos N- y C-terminales compuestos no reconocidos por las proteasas.

La invención comprende igualmente ácidos nucleicos aislados que codifican un polipéptido según la invención.

Según un modo preferido, los ácidos nucleicos según la invención estarán elegidos entre los ácidos nucleicos siguientes:

a) ácido nucleico de secuencia SEQ ID Nº1 (genómico);

b) ácido nucleico de secuencia SEQ ID Nº2 (DNAc);

c) ácido nucleico que presenta al menos 80% de identidad, con relación a los ácidos nucleicos según a) ó b);

d) fragmento de la secuencia SEQ ID Nº1 que comprende al menos un exón de secuencia nt 1836 a 1874, nt 3394 a 3577 ó nt 4164 a 4379 de la secuencia SEQ ID Nº1.

Se entiende que la presente invención no se refiere a las secuencias genómicas en su medio ambiente cromosómico natural; se trata de secuencias que se han aislado, es decir que han sido tomadas previamente directamente o indirectamente, su medio ambiente ha sido modificado al menos parcialmente.

Puede así tratarse de ADN genómico, de ADNc, o de ARN, que incluyen o no nucleótidos no naturales; puede tratarse de ácidos nucleicos naturales aislados, o de ácidos nucleicos de síntesis.

Por ácido nucleico equivalente, se entenderá un ácido nucleico que codifica los polipéptidos según la invención, teniendo en cuenta la degeneración del código genético, y los ADNc y ARN correspondientes.

Por ácido nucleico homólogo, se entenderá un ácido nucleico cuya secuencia presenta una homología de al menos 80%, de preferencia 90%, con las secuencias nucleicas según la invención.

Por ácido nucleico mutado, se entenderá cualquier ácido nucleico que codifica un polipéptido variable según la invención, y cualquier ácido nucleico que incluya, con relación a las secuencias SEQ ID Nº1 y SEQ ID Nº2, al menos una mutación en las secuencias promotoras y/o reguladoras, las cuales podrán tener un efecto sobre la expresión del polipéptido especialmente en su proporción de expresión y el tejido-específico de este. Las secuencias que presentan un polimorfismo presente en el ser humano están pues incluidas en la invención. Entre estos polimorfismos, algunos podrán conducir a deficiencias inmunitarias, respuesta a las infecciones, predisposiciones y/o al desarrollo de cánceres.

Por ácido nucleico modificado, se entenderá cualquier ácido nucleico que codifica un polipéptido modificado según la invención, o cualquier ácido nucleico obtenido por mutagénesis según técnicas bien conocidas por el experto, y que incluyen modificaciones con relación a las secuencias normales, especialmente mutaciones en las secuencias reguladoras y/o promotoras, especialmente que conducen a una modificación de la proporción y/o del tejdo-específico de la expresión del polipéptido.

La presente invención se refiere al conjunto de iniciadores y sondas, que podrán estar marcadas según métodos bien conocidos por el experto, que permiten poner en evidencia, especialmente por técnicas basadas en la hibridación o en la amplificación, por ejemplo por PCR, las secuencias nucleicas según la invención, incluso discriminar las secuencias normales de las secuencias mutadas.

Entre los fragmentos de ácidos nucleicos interesantes, hay que citar en particular los oligonucleótidos antisentido, es decir cuya estructura asegura, por hibridación con la secuencia diana, una inhibición de la expresión del producto correspondiente. También hay que citar los oligonucleótidos sentido que, por interacción con proteínas implicadas en la regulación de la expresión del producto correspondiente, inducirán bien sea una inhibición, bien sea una activación de esta expresión.

Se podrá tratar de secuencias que reaccionan también bien sea a nivel de las secuencias exónicas o intrónicas descritas como en las secuencias contiguas, especialmente los promotores y/o regiones 5' UTR.

La presente invención se refiere igualmente a vectores de clonación o de expresión que incluyen una secuencia nucleotídica tal como está descrita anteriormente.

Estos vectores de clonación o de expresión podrán incluir elementos que aseguran la expresión de la secuencia en una célula hospedante, especialmente secuencias promotoras y secuencias de regulación eficaces en dicha célula.

El vector causante que puede ser de replicación autónoma o bien destinado a asegurar la integración de la secuencia en el seno de los cromosomas de la célula hospedante.

En el caso de sistemas de replicacion autónoma, en función de la célula hospedante, procariota o eucariota, se utilizará de preferencia sistemas de tipo plasmídico o sistemas virales, virus vectores que pueden ser especialmente adenovirus (Perricaudet et al., 1992), retrovirus, poxvirus o virus herpéticos (Epstein et al., 1992). El experto conoce las tecnologías utilizables para cada uno de estos virus.

Así, es conocido utilizar como vector viral virus defectivos cuyo cultivo se efectúa en células de complementación, esto evita los riesgos eventuales de proliferación de un vector viral infeccioso.

Cuando se desea la integración de la secuencia en los cromosomas de la célula hospedante, será necesario prever por una parte y por otra de la secuencia nucleotídica integrar una o varias secuencias que provienen de la célula hospedante con el fin de asegurar la recombinación. Se trata aquí igualmente de procedimientos que están ampliamente descritos en la técnica anterior. Se podrá, por ejemplo, utilizar sistemas de tipo plasmídico o viral; tales virus serán, por ejemplo, retrovirus (Temin, 1986) o AAV, Adenovirus Associated Virus (Carter, 1993).

La invención se refiere igualmente a las células procariotas o eucariotas transformadas por un vector tal como está descrito anteriormente y esto con el fin de asegurar la expresión de una defensina Def-X natural, normal o variable, o modificada, o bien, por ejemplo, de uno de sus fragmentos.

Como ya se ha indicado anteriormente, la presente invención se refiere igualmente a los polipéptidos obtenidos por cultivo de células así transformadas y recuperación de la proteína expresada, dicha recuperación que puede ser efectuada de forma intracelular o bien de forma extracelular en el medio de cultivo cuando el vector ha sido concebido para asegurar la secreción de la proteína por la vía, por ejemplo, de una secuencia "señal", estando el polipéptido en forma de un pre-polipéptido o prepro-polipéptido. Las construcciones que permiten la secreción de los polipéptidos son conocidas, además de para sistemas procariotas para sistemas eucariotas. En el marco de la presente invención, algunos de los polipéptidos Def-X podrán incluir su propio sistema de secreción o de inserción membranar.

Evidentemente los polipéptidos recombinantes según la invención pueden obtenerse en forma glicosilada o no glicosilada y presentar o no la estructura terciaria natural.

Entre las células utilizables para la producción de estos polipéptidos, hay que citar evidentemente las células bacterianas (Olins et Lee, 1993), pero igualmente las células de levadura (Buckholz, 1993), igual que las células animales, en particular los cultivos de células de mamífero (Edwards et Aruffo, 1993) pero igualmente las células de insectos en las cuales se pueden utilizar procedimientos que emplean baculovirus por ejemplo (Luckow, 1993).

Las células así obtenidas pueden permitir preparar polipéptidos naturales, variables o modificados, Def-X, pero igualmente fragmentos de estos polipéptidos, especialmente polipéptidos que pueden corresponder a los fragmentos biológicamente activos.

La presente invención se refiere, además, a los mismos polipéptidos según la invención pero obtenidos por síntesis química y que pueden incluir aminoácidos no naturales o modificados.

Los polipéptidos según la presente invención, en particular la defensina madura, igual que los homólogos, derivados o polipéptidos maduros modificados, pueden ser obtenidos por síntesis química y esto utilizando una cualquiera de las numerosas síntesis peptídicas conocidas, por ejemplo las técnicas que emplean fases sólidas o técnicas que utilizan fases sólidas parciales, por condensación de fragmentos o por una síntesis en disolución clásica.

Cuando los compuestos según la presente invención son sintetizados por el método en fase sólida, el aminoácido C-terminal se fija sobre un soporte sólido inerte e incluye grupos protectores de su grupo amino en alfa (y sí es necesario, protecciones en sus grupos funcionales laterales).

Al final de esta etapa, el grupo protector del grupo amino terminal se elimina y se fija el segundo aminoácido que incluye también las protecciones necesarias.

Los grupos protectores N-terminales se eliminan después que cada aminoácido ha sido fijado, por el contrario se mantiene, evidentemente, la protección en las cadenas laterales.

Cuando la cadena polipeptídica está completa, se separa el péptido de su soporte y se eliminan los grupos de protección laterales.

La técnica de síntesis en fase sólida está descrita especialmente en Stewart et al. (1984) y Bodanszky (1984).

No serán aquí citados los detalles de la síntesis, conviene simplemente recordar que los grupos protectores preferidos para los grupos alfa-amino son grupos protectores de tipo uretano (BOC o FMOC). En cuanto a los reactivos de acoplamiento, son muy numerosos, entre ellos hay evidentemente que citar más particularmente la N,N'-diisopropil-carbodiimina (DIC) empleada en general en el DMF o el DCM.

Cuando se desea utilizar aminoácidos no naturales, podrá ser necesario prever otros tipos de reactivo y en particular otros tipos de sistema de protección.

La presente invención se refiere igualmente a los anticuerpos policlonales o monoclonales obtenidos por reacción inmunológica de un organismo humano o animal con un agente inmunógeno constituido por un polipéptido según la invención, especialmente un polipéptido obtenido por cultivo de una de las células anteriormente descritas, o por síntesis química como está indicado anteriormente.

La invención se refiere pues a los anticuerpos monoclonales y policlonales o uno de sus fragmentos, anticuerpos quiméricos, capaces de reconocer específicamente un polipéptido según la invención.

La invención comprende también los anticuerpos según la invención, caracterizados porque están marcados.

Los anticuerpos marcados podrán ser, por ejemplo, inmunoconjugados con enzimas tales como peroxidasa o fosfatasa alcalina, o marcados con la ayuda de compuestos fluorescentes, de la biotina o también radiomarcados. Las técnicas de marcaje son bien conocidas por el experto y no serán desarrolladas en la presente descripción.

La invención se extiende igualmente a un polipéptido según la invención para utilización como agente antimicrobiano, especialmente antibacteriano, antifungico, antiviral y/o antiparasitario, como agente citotóxico, es utilizado especialmente como anticanceroso, y/o como agente de modulación de los procedimientos de inflamación, reparación tisular y regulación endocrina, especialmente corticostático.

Según otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un polipéptido según la invención, que puede estar asociada a un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Tal composición podrá ser administrada por vía sistémica, local o tópica.

Su modo de administración, su posología, sus formas galénicas óptimas pueden ser determinadas según los criterios generalmente tenidos en cuenta en el establecimiento de un tratamiento adaptado a un paciente, especialmente su edad, su peso corporal, la tolerancia al tratamiento, sus efectos secundarios constatados, etc.

La invención comprende igualmente una composición farmacéutica que comprende un vector según la invención capaz de expresar in vivo un polipéptido según la invención, que puede estar asociado a un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Igualmente es posible prever la expresión de polipéptidos o sus fragmentos in vivo, especialmente por la vía de la terapia génica y utilizando los vectores que han sido descritos anteriormente.

En el marco de la terapia génica, igualmente es posible prever la utilización de secuencias de genes o de ADNc anteriormente descritos, "desnudos", esta técnica ha sido especialmente desarrollada por la sociedad Vical, que ha mostrado que era, en estas condiciones, posible expresar el polipéptido en algunos tejidos sin tener recurso al soporte de un vector viral especialmente.

Siempre en el marco de la terapia génica, es posible prever igualmente la utilización de células transformadas ex-vivo, las cuales podrán ser a continuación reimplantadas, bien sea tal cual, bien sea en el seno de sistemas de tipo organoide, tal como es igualmente conocido en el estado de la técnica (Danos et al. 1993). Igualmente se puede considerar la utilización de agentes que facilitan la identificación de un tipo celular determinado, la penetración en las células o el transporte hacia el núcleo.

Dichas composiciones farmacéuticas están, según la invención, destinadas a la prevención y/o al tratamiento de las infecciones microbianas, especialmente las infecciones microbianas de orígenes bacterianos, de bacterias Gram-positivas o Gram-negativas, micobacterias, fúngicas o virales, o parasitarias, especialmente de espiroquetas.

Según un modo preferido, la invención se refiere ventajosamente a las composiciones farmacéuticas según la invención caracterizadas porque las infecciones virales son infecciones unidas a virus con envolvente, especialmente los virus HSV y HIV.

La invención tiene igualmente por objetivo composiciones farmacéuticas según la invención, destinadas a la prevención y/o al tratamiento de cánceres, especialmente melanomas, cáncer de hígado, de la próstata, del pulmón no de pequeñas células o al carcinoma colorrectal.

La invención comprende, además, composiciones farmacéuticas según la invención, destinadas a aumentar las defensas inmunitarias, a aumentar las defensas inmunitarias en caso de inmunodeficiencia adquirida o a prevenir la inmunodeficiencia, especialmente para el tratamiento de psoriasis, o a modular los procesos inflamatorios en los casos especialmente de enfermedades con inflamación crónica.

Los polipéptidos según la presente invención son más particularmente utilizados en forma tópica externa, por ejemplo en la piel y las mucosas. Estas formas tópicas externas pueden ser tanto de uso farmacéutico, dermatológico como de uso cosmético.

En particular, estas composiciones pueden ser utilizadas como agente antiséptico farmacéutico o bien como antiséptico en algunos cosméticos, bien sea para asegurar una limpieza de la piel o de las faneras y/o como conservante de las composiciones.

Las composiciones tópicas según la presente invención pueden utilizarse especialmente en algunas afecciones cutáneas, oculares, vaginales o bucales. Pueden igualmente utilizarse como agente cosmético adicional, especialmente en algunos champús tratantes.

La invención se refiere igualmente a detectar la ausencia o una cantidad anormal de proteína o de ácido nucleico que corresponde a la defensina X como marcador de una infección o de patologías que serán descritas a continuación.

La invención se refiere igualmente a detectar una forma anormal de la proteína o la presencia de un ácido nucleico anormal que corresponde a una defensina mutada que puede eventualmente ser totalmente inactiva. En este caso, la presencia de esta forma anormal puede ser un marcador de predisposición a algunas afecciones, especialmente la inmunodeficiencia y/o los cánceres.

Es por lo que, la presente invención se refiere a un método de diagnóstico de una inmunodeficiencia y/o de una predisposición a algunos tipos de cánceres, caracterizado porque se pone en evidencia en una toma de muestra del paciente la presencia de una defensina anormal y/o de una secuencia que codifica una defensina anormal.

Los métodos de diagnóstico según la presente invención permiten, especialmente, detectar una inmunodeficiencia, y/o una predisposición a uno o varios cánceres, especialmente los citados anteriormente, en particular en familias de riesgo. Este tipo de diagnóstico será en general efectuado para detectar las formas mutadas de la proteína o de las secuencias de ácido nucleico.

Pero la invención se refiere igualmente a métodos de diagnóstico de inflamación, inmunodeficiencia, predisposición a afecciones de tipo cáncer y/o infecciones debidas a microorganismos o asociadas a un déficit inmunitario o fenómeno inflamatorio, caracterizados porque comprenden la determinación de un polipéptido o de un ácido nucleico según la invención en una muestra biológica y la comparación del resultado obtenido de dicha determinación con la cantidad de polipéptido o de ácido nucleico presente normalmente en una muestra biológica equivalente.

En este caso, la determinación peptídica permitirá, en general, una detección de una infección microbiana o parasitaria y/o una inflamación. Las determinaciones peptídicas pueden realizarse por cualquier procedimiento conocido, ELISA o RIA por ejemplo. La detección de una forma anormal de la defensina-X puede realizarse, por ejemplo, con la ayuda de un anticuerpo monoclonal específico de esta forma, en particular los anticuerpos objetivo de la invención.

Según un modo de realización preferido, la invención comprende ventajosamente los métodos caracterizados porque emplean una sonda y/o un iniciador oligonucleotídico según la invención.

Se preferirá en general los métodos en los cuales todo o parte de la secuencia que corresponde al polipéptido Def-X está amplificada previamente por determinación del ácido nucleico según la invención, estos métodos de amplificación pueden realizarse por métodos llamados PCR o PCR-like. Por PCR-like se quiere designar todos los métodos que emplean reproducciones directas o indirectas de las secuencias de ácidos nucleotidos, o bien en las que los sistemas de marcaje han sido amplificados, estas técnicas son evidentemente conocidas, en general se trata de la amplificación del ADN por una polimerasa; cuando la muestra de origen es un ARN conviene previamente efectuar una trancripción inversa. Existen actualmente numerosos procedimientos que permiten esta amplificación, por ejemplo los métodos llamados NASBA "Nucleic Acid Sequence Based Amplification" (Compton 1991), TAS "Transcription based Amplification System" (Guatelli et al. 1990), LCR "Ligase Chain Reaction" (Landegren et al. 1988), "Endo Run Amplification" (ERA), "Cycling Probe Reaction" (CPR), y SDA "Strand Displacement Amplification" (Walker et al 1992), bien conocidos por el experto.

La invención se refiere además a kits o envases con reactivos de diagnóstico para la determinación de una infección microbiana o parasitaria, una inflamación, una inmunodeficiencia y/o una predisposición a infecciones de tipo cáncer, caracterizados porque comprenden un anticuerpo según la invención.

Los kits o envases con reactivos de diagnóstico para la determinación de una infección microbiana o parasitaria, una inflamación, una inmunodeficiencia y/o predisposición a afecciones de tipo cáncer, caracterizados porque comprenden una sonda y/o un iniciador según la invención igualmente forman parte de la invención.

La invención tiene, por último, por objetivo la utilización de polipéptido según la invención como plaguicida, especialmente para el cultivo de vegetales de interés industrial como, por ejemplo, plantas de alimentación humana tales como maíz, trigo, soja, arroz o colza, plantas forrajeras, arboles frutales, vid o plantas ornamentales.

Otras características y ventajas de la presente invención aparecerán con la lectura de los ejemplos a continuación, ilustrados por las figuras cuyas leyendas están descritas a continuación.

Leyendas de las figuras Figura I

Secuencia genómica de hDef-X.

Se presenta la totalidad de la secuencia de ADN genómico de hDef-X que presenta una homología significativa con el gen que codifica hDef-4 (HNP-4).

La secuencia presenta los sitios siguientes, cuya presencia se dedujo por homología con la secuencia hDef-4:

\bullet CAAT box	1711-1714
\bullet TATA box	1758-1767
\bullet mRNA start	1836
\bullet exón 1	1836-1874
\bullet sitio de plegamiento I	GTCAGT
\bullet inserción Alu	2155-2335
\bullet inserción fragmento de LI	2710-2780
\bullet sitio de plegamiento 2	CAG
\bullet exón 2	3394-3577
\bullet principio de fase codificante	3406
\bullet sitio de plegamiento 3	GTGAGA
\bullet sitio de plegamiento 4	CAG
\bullet exón 3	4164-4379
\bullet fin de fase codificante	4276
\bullet sitio de poliadenilación	4374-4379

Figura 2

Alineación de las secuencias genómicas de las defensinas humanas Def-X y Def-4 (HNP-4).

Alineación de la totalidad de la secuencia de ADN genómico de la nueva defensina Def-X que presenta una homología con el ADN genómico de hDef-X (GenBank accession number U18745).

Las anotaciones presentan las posiciones en la secuencia de hDef-4 de las señales CAAT box, TATA box, sitios de plegamiento, principios y finales de intrones/de exones, principio de transcripción, sitio de poliadenilación.

Figura 3

Alineación de las secuencias de ADNc de hDef-4 (HNP-4) y hDef-X.

Las secuencias presentan una homología global de 61,4%. La alineación revela una inserción de alrededor de 75 bases al principio del codon STOP, presentes en la secuencia de hDef-4, pero no en la de h-Def-X; la fuerte homología vuelve a ser en toda la región comprendida entre el extremo de esta inserción y la del ADNc. Fuera de esta región de inserción, el grado de homología entre secuencias nucleicas es pues notable.

Figura 4

Secuencia peptídica de la proteína hDef-X.

La posición de sitios de separación del péptido señal y de la región pro se dedujeron de la alineación de las secuencias peptídicas de hDef-4 y hDef-X.

Figura 5

Alineación de las secuencias peptídicas de las defensinas humanas conocidas hDef-1, hDef-4, hDef-5, y hDef-6 con hDef-X.

* la estrella indica un aminoácido conservado en las cinco secuencias.

\cdot el punto indica un aminoácido cuya clase se conserva en las cinco secuencias (aminoácido bien sea idéntico, bien sea objeto de una sustitución conservadora).

^ seis flechas indican las posiciones de seis cisteinas conservadas a través de la clase de defensinas clásicas y responsables de la estructura tridimensional necesaria para la actividad de estos péptidos.

Ejemplos Ejemplo 1 Identificación del gen que codifica hDef-X Aislamiento de BAC B0725B12

Con el fin de analizar la región 8p23 del genoma humano, especialmente en la región conocida como portadora de los genes que codifican defensinas humanas, se aisló un BAC ("Bacterial Artificial Chromosome") que corresponde a dicha región. Un banco de BACs que cubren el genoma humano completo se preparó a partir del ADN de una línea linfoblástica humana derivada del individuo nº 8445 de las familias del CEPH. Esta línea se utilizó como fuente de ADN de elevado peso molecular. El ADN se digirió parcialmente con la enzima de restricción BamH1, después se clonó el sitio Bam H1 del plásmido pBeloBacII. Los clones así obtenidos se "poolés" e identificaron según un procedimiento de análisis tridimensional anteriormente descrito para la identificación de bancos de YACs ("Yeast Artificial Chromosome") (Chumakov et al., 1992 y 1995). Las muestras tridimensionales obtenidas se identificaron por PCR con la ayuda de los iniciadores que enmarcan el marcador SHGC-10793, para Neutrophil defensin 4 precursor (GeneBank: número de acceso U18745); se aisló así un clon BAC B0725B12.

Después de la digestión con el enzima de restricción NotI, el tamaño del inserto llevado por este BAC se determinó sobre un gel de agarosa 0,8% después de la migración por electroforesis en campo alterno (CHEF) (4 horas a 9 Volts/cm, con un ángulo de 100º, a 11ºC en tampón 0,5 x TAE). Se puso así en evidencia que BAC B0725B12 lleva un inserto de 220 kb, con un sitio interno para el enzima NotI.

Localización cromosómica del BAC B0725B12 por hibridación in situ fluorescente (FISH)

La localización cromosómica del BAC en la región candidata 8p23.1- 23.2 se confirmó por hibridación in situ fluorescente (FISH) en cromosomas metafásicos, según el método descrito por Cherif et al., (1990).

Secuenciación del inserto del BAC B0725B12

Con el fin de secuenciar el inserto del BAC B0725B12, se preparó un banco de sub-clones a partir del ADN sónico de este BAC.

Las células obtenidas de un litro de cultivo "overnight" se trataron por lisis alcalina según las técnicas clásicas. Después de la centrifugación del producto obtenido en un gradiente de cloruro de cesio, se purificaron 12 \mug de ADN del BAC B0725B12. Se sometieron a ultrasonidos 3 \mug de ADN con el fin de obtener fragmentos cuyos tamaños se distribuyen uniformemente de 1,2 kb a 1,5 kb. Los fragmentos obtenidos se trataron en un volumen de 50 \mul con 2 unidades de Vent polimerasa durante 20 minutos a 70ºC, en presencia de 4 deoxitrifosfatos (100 \muM). Los fragmentos con extremos contiguos que resultan de esta etapa se separaron por electroforesis en gel al 1% de agarosa a bajo punto de fusión (60 Volts durante 3 horas). Los fragmentos agrupados según sus tamaños se escindieron y las bandas obtenidas se trataron con la agarosa. Después de la extracción con cloroformo y diálisis en columnas Microcon 100, el ADN en disolución se ajustó a una concentración de 100 ng/\mul. Se efectúo una ligadura por "overnight" poniendo en presencia 100 ng de ADN fragmentado del BAC B0725B12 y 20 ng de ADN del vector BluescriptSK se linealizó por digestión enzimática, y se trató con la fosfatasa alcalina. Esta reacción se realizó en un volumen final de 10 \mul en presencia de 40 unidades/\mul de T4 ADN ligasa (New England Biolabs). A continuación los productos de ligadura sirvieron para transformar por electroporación, bien sea una cepa XL-Blue (para los plásmidos multicopias), bien sea una cepa DI0HB (para los subclones procedentes del BAC). Los clones lacZ^{-} que resisten al antibiótico se sembraron individualmente en microplacas para almacenamiento y secuenciación.

Se obtuvieron así 960 subclones que corresponden a la inserción de fragmentos de 1,2 kb a 1,5 kb en el sitio BamHI (rendimiento libre) del plásmido BluescriptSK.

Los insertos de estos subclones se amplificaron por PCR en cultivos bacterianos conducidos "overnight", utilizando los iniciadores de los vectores contiguos a las inserciones. La secuencia de los extremos de estos insertos (como media 500 bases de cada lado) se determinó por secuenciación automática fluorescente en secuenciador ABI 377, equipado del programa ABI Prism DNA Sequencing Analysis (versión 2.1.2).

Los fragmentos de secuencia que provienen del sub-BACs se reunieron por el programa Gap4 de R. Staden (Bonfield et al., 1995). Este programa permitió la reconstrucción de una secuencia completa a partir de fragmentos de secuencias. La secuencia deducida de la alineación de diferentes fragmentos es la secuencia consensuada.

Por último se utilizaron técnicas de secuenciación dirigida (marcha sistemática del iniciador) para acabar las secuencias y unir los contiguos.

Análisis de las secuencias para la identificación de genes

Los exones potenciales del inserto del BAC B0725B12 se retomaron para la investigación de homología en los bancos públicos de proteínas, de ácidos nucleicos y de EST (Expressed Sequence Tags).

Banco de datos

Se utilizaron fuentes locales de los principales bancos públicos. El banco de proteínas utilizado está constituido por la fusión no redundante de bancos Genpept (traducción automática de GenBank, NCBI; Benson et al., 1996); Swissprot (George et al.,1996) y PIR/NBRF (Bairoch et al., 1996). Se eliminaron los duplicados por el programa "nrdb" (domaine public, NCBI; Benson et al., 1996). A continuación las repeticiones internas se enmascararon por el programa "xnu" (domaine public, NCBI; Benson et al., 1996). El banco resultante, denominado NRPU (Non-Redundant Protein-Unique) sirvió de referencia para las investigaciones de homologías proteicas. Las homologías encontradas con este banco permitieron localizar regiones que codifican potencialmente un fragmento de proteína al menos aparente en una proteína conocida (exones codificantes). El banco de EST utilizado está compuesto de subsecciones "gbest" (1-9) de Genbank (NCBI; Benson et al., 1996). Contienen todos los fragmentos de transcriptos públicos.

Las homologías encontradas con este banco permitieron localizar regiones potencialmente transcritas (presentes en el ARN mensajero).

El banco de ácidos nucleicos (distintos de los EST) utilizado contiene todas las otras subsecciones de Genbank y de EMBL (Rodriguez-Tome et al., 196) cuyos duplicados se eliminaron como anteriormente.

Programas

Se utilizó el conjunto de programas BLAST (Altschul et al., 1990) de investigación de homologías entre una secuencia y bancos de datos proteicos o nucleicos. Los umbrales de significación utilizados dependen de la longitud y de la complejidad de la región ensayada así como del tamaño del banco de referencia. Se ajustaron y adaptaron a cada análisis.

Ejemplo 2 Análisis de secuencias nucleicas y peptídicas de hDef-X Estructura del gen que codifica hDef-X

La alineación del gen que codifica hDef-X con los que codifican las defensinas conocidas permitieron señalar una homología máxima entre hDef-X y hDef-4 (Figura 2). La proporción global de homología de dos secuencias nucleicas fue del 72%. Las dos solas regiones del ADN genómico de hDef-X no presentaron homología con el de hDef-4 correspondiente a dos zonas de inserción de secuencia repetida en la secuencia de hDef-X, que estaban ausentes en la secuencia de hDef-4: un elemento del tipo Alu (posiciones 2155 a 2335) y un fragmento de elemento de Línea I (posiciones 2710 a 2780).

Se nota una importante conservación de la región contigua en 5' la región promotora, de la cual emana probablemente una importante conservación de los elementos de regulación de la estabilidad del mensajero y de la expresión del gen.

La fuerte conservación de la secuencia del exón 1, no traducido, permitió incluir definitivamente la defensina hDef-X en la clase de defensinas clásicas hematopoyéticas, o sea hDef-1, 2, 3 y 4, por oposición a las defensinas entéricas hDef-5 y 6, cuya secuencia genómica no incluye más que dos exones, los dos codificantes.

La alineación del los ADNc de hDef-4 y hDef-X, que indica una homología superior al 60%, se presenta en la figura 3.

Análisis proteico

La secuencia peptídica de la defensina según la invención se representa en la figura 4. Los tres dominios de la proteína están colocados como sigue:

\bullet péptido señal:	aa 1-19
\bullet región pro:	aa 20-63
\bullet péptido maduro:	aa 64- 94

Los grados de homología específicos entre hDef-4 y hDef-X se calcularon, según la región de la proteína referida:

\bullet péptido señal:	63,2%
\bullet región pro:	52,3%
\bullet péptido maduro:	37,9%

La homología global fue del 49,5%. Estas cifras confirmaron la muy elevada homología que existe entre defensinas, homología máxima a nivel de péptidos señal y mínima a nivel de péptidos maduros.

Se encontró en la secuencia proteica primaria de Def-X los aminoácidos conservados en la clase de defensinas clásicas, especialmente las seis cisteinas implicadas en la estructura tridimensional de estas (Figura 5).

Con el fin de predecir las estructuras secundarias presentes en la defensina según la invención, se utilizaron los programas de predicción de estructura secundaria incluidos en Protein Interpretation Package, Copyright MCR 1994, Medical Research Council, Hillsroad, Cambridge, United Kingdom.

Estos programas permitieron comparar especialmente estructuras predeterminadas de Def-X y HNP-4. Perfiles de hidrofobicidad, estructuras en alfa-helices, laminas \beta, anfifilidad son superponibles en los dos péptidos, lo que sugiere procedimientos análogos de inserción membranar y de formación de canales iónicos multiméricos para estas dos defensinas.

Ejemplo 3 Investigación de mutaciones asociadas a casos de familiares de cánceres Extracción de ADN genómico

El ADN genómico de pacientes inmunodeficientes o afectados de cáncer, se extrajo de sangre venosa periférica después lisis celular, digestión proteica, partición orgánica y finalmente precipitación alcohólica, según técnicas clásicas bien conocidas por el experto.

Es especialmente interesante estudiar la presencia de mutaciones en el ADN genómico de individuos procedentes de familias con elevada proporción de cáncer, todos los tipos de cánceres mezclados. Una deficiencia en un gen de defensina de granulocito, tal como hDef-X puede tener en efecto un papel en la predisposición a los cánceres, como se ha mencionado anteriormente.

Amplificación del ADN genómico

Se utilizaron iniciadores oligonucleótidos para la amplificación genómica de secuencias exónicas derivadas del BAC B0725B12; se predeterminaron por análisis informático, y se definieron con la ayuda del programa OSP (Hillier et al., 1991).

Todos estos iniciadores contienen, al principio bases específicamente determinadas por amplificación, una cola oligonucleotídica universal común, destinada a permitir la secuenciación de los fragmentos amplificados (PU: 5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' para los iniciadores al principio, y RP: 5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3' para los iniciadores al final).

Los iniciadores oligonucleotídicos se sintetizaron según el método de fosforamidatos, en un sintetizador GENSET UFPS 24.1.

La amplificación de cada secuencia exónica predeterminada se realizó por reacción de amplificación en cadena por polimerasa (PCR), en las condiciones siguientes:

Volumen final	50 \mul
ADN genómico	100 ng
MgCl_{2}	2 mM
dNTP (para cada uno)	200 \muM
Iniciador (para cada una)	7,5 pmoles
AmpliTaq Gold DNA polymerase (Perkin)	1 unidad
Tampón de PCR (10X = 0,1 M Tris HCl pH 8,3, 0,5 M KCl)	1X

La amplificación se realizó en un termociclador Perkin Elmer 9600 ó MJ Research PTC200 con tapa caliente. Después de un calentamiento a 94ºC durante 10 minutos, se efectuaron 35 ciclos. Cada ciclo comprende: 30 segundos a 94ºC, 1 minuto a 55ºC y 30 segundos a 72ºC. Un segmento final de elongación de 7 minutos a 72ºC termina la amplificación.

La cantidad de productos de amplificación obtenida se determinó en microplaca de 96 pocillos, por fluorometría, utilizando el agente intercalante Picogreen (Molecular Probes).

Detección de polimorfismos/mutaciones

Los productos de la amplificación genómica por PCR se secuenciaron en secuenciador automático ABI 377, utilizando iniciadores fluorescentes marcados por los fluorocromos ABI (Joe, Fam, Rox y Tamra) y ADN polimerasa Thermosequanase (Amersham).

Las reacciones se realizaron en microplacas de 96 pocillos, en termociclador Perkin Elmer 9600, en las condiciones clásicas de ciclos de temperatura:

- 8 ciclos: desnaturalización : 5 seg a 94ºC; hibridación : 10 seg.; elongación : 30 seg. a 72ºC, después

- 13 ciclos: desnaturalización : 5 seg a 94ºC; elongación : 30 seg a 72ºC.

Se utilizaron 6 unidades de Thermosequanase, y 5-25 ng de producto de amplificación por reacción de secuencia.

Al final de los ciclos de amplificación, los productos de las reacciones de secuencia se precipitaron en etanol, se resuspendieron en un tampón de carga que contenía formamida, desnaturalizados, y depositados en geles de acrilamida al 4%; las electroforesis (2 horas 30 a 3000 Volts) se realizaron en secuenciadores ABI 377 equipados de programas ABI de colección y análisis (ABI Prism DNA Sequencing Analysis Softvare, versión 2.1.2).

Las secuencias obtenidas en pacientes afectados de deficiencias estudiadas, especialmente en pacientes procedentes de familias con elevada predisposición a los cánceres, se compararon con las secuencias obtenidas en sujetos controlados, aparentes y no aparentes. Un análisis estadístico (calcul de lod score) permitió concluir en cuanto a la significación de la presencia de un sitio de heterocigotia y a su asociación con una predisposición a los cánceres.

Ejemplo 4 Investigación de mutaciones puntuales

Las mutaciones puntuales identificadas como está indicado anteriormente, a continuación pueden ser puestas en evidencia en sujetos que presentan una potencial deficiencia en el gen que codifica hDef-X, según numerosos métodos conocidos por el experto. Entre ellos, se pueden citar la lista no exhaustiva siguiente:

\bullet secuenciación

\bullet"single nucleotide primer extension" (Syvanen et al., 1990)

\bullet RFLP

\bullet investigación de "single strand conformation polymorphism"

\bullet métodos basados en una separación de regiones desapareadas (separación enzimática por la SI nucleasa, separación química por diferentes compuestos tales como la piperidina o el tetróxido de osmio)

\bullet detección de heteroduplex en electroforesis

\bullet métodos basados en la utilización de "allele specific oligonucleotide" (ASO, Stoneking et al., 1991)

\bullet método OLA ("dual color oligonucleotide ligation assay, Samiotaki et al., 1994")

\bullet método ARMS ("amplification refractory mutation system"), o ASA ("allele specific amplification"), o PASA ("PCR amplification of specific allele" Wu et al., 1989).

Referencias

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(1) INFORMACIONES GENERALES:

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(i)

SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE: GENSET SA

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

CALLE: 24 RUE ROYALE

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

CIUDAD: PARÍS

\vskip0.500000\baselineskip

(E)

PAÍS: FRANCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(F)

CODIGO POSTAL: 75008

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TÍTULO DE LA INVENCIÓN: POLIPÉPTIDO DEFENSINA HUMANA Def-X, ADN GENOMICO Y ADNc, COMPOSICIÓN QUE LO CONTIENE Y APLICACIONES AL DIAGNÓSTICO Y AL TRATAMIENTO TERAPÉUTICO

\vskip0.800000\baselineskip

(iii)

NÚMERO DE SECUENCIAS: 6

\vskip0.800000\baselineskip

(iv)

FORMA DESCIFRABLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

TIPO DE SOPORTE: Floppy disk

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

SISTEMA DE EXPLOTACIÓN: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

PROGRAMA: Patentin Release # 1.0, Versión # 1.30 (OEB)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 4415 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: NUCLEOTIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: DOBLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN:LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADN

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/LLAVE: Exón 1

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

EMPLAZAMIENTO: 1836..1874

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/LLAVE: Exón 2

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

EMPLAZAMIENTO: 3394..3577

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/LLAVE: Exón 3

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

EMPLAZAMIENTO: 4161..4380

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/LLAVE: Start CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

EMPLAZAMIENTO: 3406..3408

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/LLAVE: stop CDS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

EMPLAZAMIENTO: 4276..4278

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/LLAVE: sitio de poliadenilación

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

EMPLAZAMIENTO: 4374..4379

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SECUENCIA DESCRIPCIÓN: SEQ ID NO: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

1

2

3

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 453 PARES DE BASES

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: NUCLEOTIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: DOBLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN:LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: ADNc

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SECUENCIA DESCRIPCIÓN: SEQ ID NO: 2:

4

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 94 AMINOACIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN:LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLECULA: PROTEINA

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/LLAVE: PÉPTIDO SEÑAL

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

EMPLAZAMIENTO: 1..19

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/LLAVE: REGIÓN PRO

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

EMPLAZAMIENTO: 20..63

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

CARACTERISTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

NOMBRE/LLAVE: PÉPTIDO MADURO

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

EMPLAZAMIENTO. 64..94

\vskip0.800000\baselineskip

(ix)

SECUENCIA DESCRIPCIÓN SEQ ID NO: 3:

5

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 4 :

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 19 AMINOACIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN:LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO SEÑAL

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SECUENCIA DESCRIPCIÓN SEQ ID NO: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 5 :

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 44 AMINOACIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN:LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: REGIÓN PRO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SECUENCIA DESCRIPCIÓN SEQ ID NO: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIONES PARA LA SEQ ID NO: 6 :

\vskip0.800000\baselineskip

(i)

CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

LONGITUD: 31 AMINOÁCIDOS

\vskip0.500000\baselineskip

(B)

TIPO: AMINOÁCIDO

\vskip0.500000\baselineskip

(C)

NÚMERO DE CADENAS: SIMPLE

\vskip0.500000\baselineskip

(D)

CONFIGURACIÓN:LINEAL

\vskip0.800000\baselineskip

(ii)

TIPO DE MOLÉCULA: PÉPTIDO MADURO

\vskip0.800000\baselineskip

(vi)

ORIGEN:

\vskip0.500000\baselineskip

(A)

ORGANISMO: Homo sapiens

\vskip0.800000\baselineskip

(xi)

SECUENCIA DESCRIPCIÓN:SEQ ID NO: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

8

Claims (47)

1. Polipéptido aislado elegido entre los polipéptidos siguientes:

a) polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es la secuencia SEQ ID No. 6;

b) polipéptido que presenta como mínimo 80% de identidad con el polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es la secuencia SEQ ID No. 6;

c) polipéptido cuya secuencia de aminoácidos es la secuencia de aminoácidos de un fragmento biológicamente activo de al menos 10 aminoácidos consecutivos del polipéptido tal como está definido en a), teniendo dicho fragmento al menos una actividad elegida entre las actividades siguientes:

\bullet reconocimiento por un anticuerpo específico del polipéptido definido en a);

\bullet actividad antibiótica;

\bullet actividad citotóxica; o

\bullet actividad antitumoral; y

d) polipéptido que comprende al menos un polipéptido tal como está definido en a), b), ó c).

2. Polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque dicho fragmento comprende al menos 15 aminoácidos consecutivos.

3. Polipéptido según la reivindicación 1, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido es la secuencia SEQ ID No. 3.

4. Polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se obtiene por síntesis química.

5. Acido nucleico aislado que codifica un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3.

6. Acido nucleico según la reivindicación 5, elegido entre los ácidos nucleicos siguientes:

a) ácido nucleico de secuencia SEQ ID No. 1;

b) ácido nucleico de secuencia SEQ ID No. 2;

c) ácido nucleico que presenta 80% de identidad con relación a los ácidos nucleicos según a) ó b); y

d) fragmento nucleico de la secuencia SEQ ID No.1 que comprende al menos un exón de secuencia nt 1836 a 1874, nt 3394 a 3577 ó nt 4164 a 4379 de la secuencia SEQ ID No.1.

7. Vector de clonación o de expresión en una célula hospedante apropiada de una secuencia nucleotídica, caracterizado porque incluye una secuencia según una de las reivindicaciones 5 ó 6.

8. Vector según la reivindicación 7, caracterizado porque incluye los elementos que aseguran la expresión de dicha secuencia en dicha célula hospedante.

9. Célula transformada por un vector según una de las reivindicaciones 7 y 8.

10. Célula según la reivindicación 9, caracterizada porque se trata de una célula procariota.

11. Célula según la reivindicación 9, caracterizada porque se trata de una célula eucariota.

12. Procedimiento de producción de un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se cultiva una célula según una de las reivindicaciones 8 a 10 y porque se recupera el polipéptido producido.

13. Anticuerpo monoclonal o policlonal o uno de sus fragmentos, anticuerpos quiméricos, caracterizado porque es capaz de reconocer específicamente un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 4.

14. Anticuerpo según la reivindicación 13, caracterizado porque está marcado.

15. Sonda o iniciador oligonucleotídico, caracterizado porque está constituido por un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 5 y 6.

16. Sonda según la reivindicación 15, caracterizada porque está marcada.

17. Polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 4, para utilización como agente antimicrobiano, antiparasitario, y/o antiviral.

18. Polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 4, para utilización como agente citotóxico.

19. Polipéptido según la reivindicación 18, caracterizado porque dicho agente citotóxico es utilizado como anticanceroso.

20. Polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 4, para utilización como agente de modulación de procedimientos de inflamación, de reparación tisular y de regulación endocrina.

21. Polipéptido según la reivindicación 20, caracterizado porque dicha modulación es corticostática.

22. Composición farmacéutica que comprende un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 4.

23. Composición farmacéutica según la reivindicación 22 para uso tópico externo, caracterizada porque incluye al menos un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 4.

24. Composición cosmética para uso tópico externo que comprende un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 4.

25. Composición según una de las reivindicaciones 23 ó 24, caracterizada porque se trata de una composición utilizada como agente antiséptico.

26. Composición farmacéutica que comprende un vector según una de las reivindicación 7 y 8, capaz de expresar in vivo un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3.

27. Composición farmacéutica que comprende una célula transformada según una de las reivindicaciones 9 a 11, capaz de expresar in vivo un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3.

28. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 22, 23, 26 y 27, caracterizada porque comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable.

29. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 22, 23, y 26 a 28, destinada a la prevención y/o al tratamiento de infecciones microbianas, parasitarias, o virales.

30. Composición farmacéutica según la reivindicación 29, caracterizada porque las infecciones microbianas o parasitarias son infecciones de orígenes bacterianos, de bacterias Gram-positivas o Gram-negativas, micobacterianas, fúngicas, o asociadas a espiroquetas.

31. Composición farmacéutica según la reivindicación 29, caracterizada porque las infecciones virales son infecciones asociadas a virus con envolvente.

32. Composición farmacéutica según la reivindicación 31, caracterizada porque dichos virus con envolvente son los virus HSV y HIV.

33. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 22, 23 y 26 a 28, destinada a la prevención y/o el tratamiento de cánceres.

34. Composición farmacéutica según la reivindicación 33, caracterizada porque dichos cánceres son melanomas.

35. Composición farmacéutica según la reivindicación 34, caracterizada porque el cáncer es el cáncer de hígado, de la próstata, del pulmón no de células pequeñas o el carcinoma colorrectal.

36. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 22, 23, y 26 a 28, destinada a aumentar las defensas inmunitarias, a aumentar las defensas inmunitarias en caso de inmunodeficiencia adquirida o a prevenir la inmunodeficiencia.

37. Composición farmacéutica según la reivindicación 36, caracterizada porque está destinada a tratar la psoriasis.

38. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 22, 23 y 26 a 28, destinada a modular los procesos inflamatorios.

39. Composición farmacéutica según la reivindicación 38, caracterizada porque está destinada a modular los procesos inflamatorios de enfermedades con inflamación crónica.

40. Método de detectar una expresión anormal de la proteína de secuencia SEQ ID No. 3 en una muestra biológica previamente tomada en un paciente que sufre inflamación, inmunodeficiencia, predisposiciones a afecciones de tipo cáncer y/o infecciones debidas a microorganismos o asociadas a un déficit inmunitario o fenómeno inflamatorio, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a) la determinación de un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 3 de dicha muestra biológica; y

b) la comparación del resultado de dicha determinación obtenida con la cantidad de dicho polipéptido normalmente presente en una muestra biológica equivalente.

41. Método de detectar una expresión anormal de la proteína de secuencia SEQ ID No. 3 en una muestra biológica previamente tomada en un paciente que sufre inflamación, inmunodeficiencia, predisposiciones a afecciones de tipo cáncer y/o infecciones debidas a microorganismos o asociadas a un déficit inmunitario o fenómeno inflamatorio, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a) la determinación de un ácido nucleico según una de las reivindicaciones 5 y 6 de dicha muestra biológica; y

b) la comparación del resultado de dicha determinación obtenida con la cantidad de dicho ácido nucleico normalmente presente en una muestra biológica equivalente.

42. Método según la reivindicación 40, caracterizado porque emplea un anticuerpo según una de las reivindicaciones 13 y 14.

43. Método según la reivindicación 41, caracterizado porque emplea una sonda y/o un iniciador oligonucleotídico según una de las reivindicaciones 15 y 16.

44. Kit o envase con reactivos de diagnóstico para la determinación de una infección microbiana o parasitaria, una inflamación, una inmunodeficiencia y/o predisposición a afecciones de tipo cáncer, caracterizado porque comprende un anticuerpo según una de las reivindicaciones 13 y 14.

45. Kits o envase con reactivos de diagnóstico para la determinación de una infección microbiana o parasitaria, una inflamación, una inmunodeficiencia y/o predisposición a afecciones de tipo cáncer, caracterizado porque comprende una sonda y/o un iniciador según una de las reivindicaciones 15 y 16.

46. Utilización de un polipéptido según una de las reivindicaciones 1 a 4, como plaguicida.

47. Utilización según la reivindicación 46, caracterizada porque dicho plaguicida se utiliza para el cultivo de vegetales de interés industrial.