ES2231040B1

ES2231040B1 - Procedimiento microbiologico para la preparacion de menadiona.

Info

Publication number: ES2231040B1
Application number: ES200302622A
Authority: ES
Inventors: Carles Estevez Company; Andreu Soldevila Fabrega; Josep Castells Boliart; Rafael Montilla Arevalo
Original assignee: Institut Universitari de Ciencia i Tecnologia
Current assignee: Institut Universitari de Ciencia i Tecnologia
Priority date: 2003-10-31
Filing date: 2003-10-31
Publication date: 2006-11-01
Anticipated expiration: 2023-10-31
Also published as: EP1688502B1; EP1688502A1; ATE464388T1; ES2231040A1; DE602004026622D1; WO2005042755A1; ES2345049T3

Abstract

Procedimiento microbiológico para la preparación de menadiona.

La invención proporciona un procedimiento alternativo para la preparación de menadiona, también conocida como vitamina K_{3}, que evita los residuos ácidos y el uso de compuestos químicos tóxicos, por lo que es un procedimiento económico, seguro y medioambientalmente benigno. El procedimiento comprende cultivar bacterias Bacillus cereus, particularmente Bacillus cereus biotipo I, en un medio de cultivo adecuado que comprende uno o más sustratos, preferentemente 2-metilnaftaleno, 2-metil-1-naftol o sus mezclas, y más preferentemente, 2-metilnaftaleno. El uso dé microorganismos como biocatalizadores permite un procedimiento selectivo en el que sustancialmente no se produce ningún isómero.

Description

Procedimiento microbiológico para la preparación de menadiona.

Esta invención se relaciona con el campo de la microbiología industrial, y específicamente con un nuevo procedimiento de preparación de un compuesto de bajo peso molecular utilizando microorganismos.

Estado de la técnica

La menadiona o 2-metil-1,4-naftalenodiona se conoce también como vitamina K_{3} o vitamina K_{3} sintética y tiene la fórmula química (I) que se adjunta. La menadiona juega un papel esencial en la coagulación de la sangre, actuando en la síntesis de la protrombina y los factores de coagulación sanguínea VII, IX y X. También actúa en la conversión de la glucosa hepática en glucógeno. Aparentemente, tiene un papel importante en la síntesis de los huesos humanos, razón por la que se utiliza también para la prevención de la osteoporosis. La ingesta diaria necesaria de menadiona va desde 5 \mug (niños antes de los 3 años de edad) a 80 \mug (adultos) que normalmente queda cubierta con una dieta rica en vegetales. Una deficiencia en menadiona, principalmente debida a alteraciones intestinales, puede ocasionar problemas vasculares y de coagulación. Por estas razones, la menadiona se considera un agente activo producido y utilizado en todo el mundo, tanto en terapia animal como humana.

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A nivel industrial, la menadiona se sintetiza principalmente mediante un procedimiento oxidativo extremadamente contaminante, que incluye sustancias químicas muy peligrosas y tóxicas. Este proceso supone la oxidación de 2-metilnaftaleno (II-1) con ácido crómico o derivados (CrO_{3} o Na_{2}Cr_{2}O_{7}, cfr. US 2.402.226). Se han sugerido numerosos procedimientos para la fabricación de menadiona intentando mejorar la actual síntesis industrial. Uno de ellos se basa en la oxidación con peróxido de hidrógeno (cfr. US 2.373.003), pero no ha resultado factible a nivel industrial. Otro procedimiento se basa en la oxidación de 2-metilnaftaleno con dicromato sódico, ácido sulfúrico, ácido acético y piridina (cfr. US 3.751.437), que también son compuestos químicos altamente contaminantes.

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Uno de los principales problemas de las rutas sintéticas conocidas en la técnica es la producción concomitante de un regioisómero (III) que no tiene la actividad farmacológica de la menadiona. La presencia de este subproducto hace más difíciles y caros los pasos de purificación de la menadiona. Han habido otros intentos para mejorar los procedimientos contaminantes antes indicados, pero sus escalados a nivel industrial no han sido satisfactorios. Ejemplos de estos procedimientos alternativos conllevan la oxidación en un reactor multitubular con óxido de vanadio, pirosulfato potásico y sulfato potásico, o la oxidación con hidrógenosulfato potásico y una porfirina que contiene manganeso.

Para solucionar los problemas de contaminación de los procedimientos químicos de preparación, se ha descrito un procedimiento microbiológico que implica el uso de una bacteria del género Rhodococcus (cfr. JP 6022775), aunque todavía no ha sido completamente industrializado. Por lo tanto, parece altamente deseable proporcionar procedimientos microbiológicos industriales alternativos para la preparación de menadiona, que sean tanto no contaminantes como regioselectivos.

Explicación de la invención

Los inventores han encontrado sorprendentemente un procedimiento alternativo para la preparación de menadiona. El procedimiento conlleva la eliminación de residuos ácidos y compuestos químicos tóxicos, por lo que es un procedimiento económico, seguro y medioambientalmente benigno. Una ventaja adicional es que el uso de microorganismos como biocatalizadores permite un procedimiento selectivo en el que sustancialmente no se produce ningún isómero.

Así, la invención proporciona un procedimiento de preparación de menadiona que comprende cultivar bacterias Bacillus cereus en un medio de cultivo adecuado que comprende uno o más sustratos de fórmula (II),

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donde X e Y son radicales seleccionados independientemente entre H y OH (los sustratos posibles son II-1, II-2, II-3 y II-4). En una realización preferida, el sustrato utilizado es 2-metilnaftaleno (II-1), 2-metil-1-naftol (II-2) o sus mezclas. En una realización más preferida, el sustrato es 2-metilnaftaleno (II-1).

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En una realización preferida de la invención las bacterias Bacillus cereus son de biotipo I, estando las células bacterianas rotas o enteras. En realizaciones particulares las células bacterianas han sido precultivadas en un medio de cultivo que comprende una sal alcalina de succinato. Además, en otras realizaciones de la invención, el medio de cultivo utilizado para preparar menadiona comprende un hidrocarburo saturado lineal de 10 a 18 átomos de carbono, particularmente hexadecano, en una concentración en el medio de cultivo de entre 25 mg/l y 5 g/l.

A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. El resumen de esta solicitud se incorpora aquí como referencia. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Las siguientes realizaciones particulares se proporcionan a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativas de la presente invención.

Exposición detallada de modos de realización

Ensayo 1

Preparación de menadiona con Bacillus cereus DSM 31

Crecimiento preliminar del microorganismo: Precultivos de Bacillus cereus DSM 31 (número de acceso del depósito en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) se hicieron crecer a pH 7 en medio tripticasa soja. El uno por ciento del cultivo se pasó a medio mínimo que contenía extracto de levadura (0.4 g/l), Na_{2}HPO_{4} (4.4 g/l), KH_{2}PO_{4} (2.45 g/l), (NH_{4})_{2}SO_{4} (1.98 g/l), MgSO_{4} (0.24 g/l), MnCl_{2} (0.025 g/l), FeSO_{4} (0.015 g/l) y succinato sódico (5.5 g/l). Se incubó a 35ºC con agitación vigorosa (200 rpm) hasta el comienzo de la fase estacionaria. Se recogieron las células utilizando un paso de centrifugación de 20 min a 4500 rpm, y se lavaron en tampón fosfato.

Preparación de menadiona: Se pasaron las células en medio mínimo que contenía extracto de levadura (0.4 g/l), Na_{2}HPO_{4} (4.4 g/l), KH_{2}PO_{4} (2.45 g/l), (NH_{4})_{2}SO_{4} (1.98 g/l), MgSO_{4} (0.24 g/l), MnCl_{2} (0.025 g/l) y FeSO_{4} (0.015 g/l), carente de fuentes de energía y de carbono. Se añadió el sustrato 2-metilnaftaleno a una concentración de 50 \mug/ml, utilizando DMSO como disolvente. La incubación se realizó a 35ºC y agitación a 200 rpm durante un tiempo de reacción de diez días. Después de este periodo, se recogieron las células y se extrajo la menadiona del caldo de cultivo utilizando diclorometano. El producto se concentró por evaporación y se analizó por cromatografía de gases-espectrometría de masas (GC-MS). Los resultados mostraron una producción de 1.3 mg de menadiona por litro de cultivo.

Caracterización morfológica y bioquímica del Bacillus cereus biotipo I

La caracterización del Bacillus cereus utilizado en muchos de los ejemplos se realizó mediante el "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology" (Sneath, Mair, Sharpe and Holt, 1986, Williams and Wilkins, eds., vol. 2). La capacidad de fermentar diferentes carbohidratos se determinó con el uso del sistema API 50 CHB (BioMérieux). La bacteria era un bacilo grampositivo formador de esporas, con una espora central y elíptica no deformante. La espora rompía la célula en posición ecuatorial. Crecía a 45ºC pero no a 5ºC o 55ºC.

Incrementaba el pH en agar Bacillus cereus y presentaba lecitinasa. Como fuentes de carbono, oxidaba y fermentaba los productos D-glucosa, D-fructosa, N-acetilglucosamina, esculina, maltosa, sacarosa, trealosa, almidón y xilitol. A partir de todas estas propiedades, el Bacillus cereus utilizado en muchos de los ejemplos fue caracterizado como un Bacillus cereus biotipo I.

Ensayo 2

Preparación de menadiona con células enteras de Bacillus cereus biotipo I

Crecimiento preliminar del microorganismo: Precultivos de Bacillus cereus biotipo I se hicieron crecer a pH 7 en medio tripticasa soja. El uno por ciento del cultivo se pasó a medio mínimo que contenía extracto de levadura (0.4 g/l), Na_{2}HPO_{4} (4.4 g/l), KH_{2}PO_{4} (2.45 g/l), (NH_{4})_{2}SO_{4} (1.98 g/l), MgSO_{4} (0.24 g/l), MnCl_{2} (0.025 g/l), FeSO_{4} (0.015 g/l) y succinato sódico (5.5 g/l). Se incubó a 35ºC con agitación vigorosa (200 rpm) hasta el comienzo de la fase estacionaria. Se recogieron las células utilizando un paso de centrifugación de 20 min a 4500 rpm, y se lavaron en tampón fosfato.

Preparación de menadiona: Se pasaron las células en medio mínimo que contenía extracto de levadura (0.4 g/l), Na_{2}HPO_{4} (4.4 g/l), KH_{2}PO_{4} (2.45 g/l), (NH_{4})_{2}SO_{4} (1.98 g/l), MgSO_{4} (0.24 g/l), MnCl_{2} (0.025 g/l) y FeSO_{4} (0.015 g/l), carente de fuentes de energía y de carbono. Se añadió el sustrato 2-metilnaftaleno a una concentración de 50 \mug/ml, utilizando DMSO como disolvente. La incubación se realizó a 35ºC y agitación a 200 rpm durante un tiempo de reacción de diez días. Después de este periodo, se recogieron las células y se extrajo la menadiona del caldo de cultivo utilizando diclorometano. El producto se concentró por evaporación y se analizó por GC-MS. Los resultados mostraron una producción de 1.5 mg de menadiona por litro de cultivo.

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Ensayo 3

Preparación de menadiona con células rotas de Bacillus cereus biotipo I

Crecimiento preliminar del microorganismo: Este paso se realizó como en el Ensayo 2.

Rotura de las células y preparación de menadiona: Las células se rompieron con lisozima en cinco ciclos de congelación-descongelación. Los extractos celulares se introdujeron en una solución que contenía KH_{2}PO_{4} (50 mM), NADH (0.2 mM) y 2-metil-1-naftol (25 \mug/ml) utilizando DMSO como disolvente, a 35ºC y agitación a 200 rpm durante cinco días. Después de este periodo, se recogieron las células y se extrajo la menadiona del caldo de cultivo utilizando diclorometano. El producto se concentró por evaporación y se analizó por GC-MS. Los resultados demostraron una producción de 8 mg de menadiona por litro de cultivo.

Ensayos de exploración con otros medios de cultivo

La preparación de menadiona se ensayó con otros medios de cultivo, que se muestran en la Tabla 1. Los experimentos se realizaron con células enteras y rotas, sin crecimiento preliminar.

Ensayos con células enteras: Se introdujeron células de Bacillus cereus biotipo I en el medio de cultivo elegido, añadiendo sustrato en DMSO como disolvente. Algunos ensayos se llevaron a cabo añadiendo al medio de cultivo utilizado, de 25 mg/l a 5 g/l del disolvente orgánico hexadecano para maximizar la adición del sustrato sin incrementar su toxicidad. La incubación se realizó a 35ºC y agitación a 200 rpm durante un tiempo de reacción de diez días. Después de este periodo, se recogieron las células y se extrajo la menadiona del caldo de cultivo utilizando diclorometano. El producto se concentró por evaporación y se analizó por GC-MS.

Ensayo con células rotas: Las células de Bacillus cereus biotipo I se rompieron con lisozima en cinco ciclos de congelación-descongelación. Los extractos celulares se introdujeron en la solución y sustrato seleccionados, utilizando DMSO como disolvente, a 35ºC, agitación a 200 rpm durante cinco días. Algunos ensayos se llevaron a cabo añadiendo al medio de cultivo utilizado, entre 25 mg/l y 5 g/l del disolvente orgánico hexadecano, para maximizar la adición del sustrato sin incrementar su toxicidad. Después de cinco días, se recogieron las células y se extrajo la menadiona del caldo de cultivo utilizando diclorometano. El producto se concentró por evaporación y se analizó por GC-MS.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 1 Algunos ensayos de preparación de menadiona

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Claims

1. Procedimiento de preparación de menadiona (I) que comprende cultivar bacterias Bacillus cereus en un medio de cultivo adecuado que comprende uno o más sustratos de fórmula (II),

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donde X e Y son radicales seleccionados independientemente entre H y OH.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, donde el medio de cultivo comprende 2-metilnaftaleno, 2-metil-1-naftol o sus mezclas.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, donde el medio de cultivo comprende 2-metilnaftaleno.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde las bacterias Bacillus cereus son de biotipo I.

5. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde las células bacterianas están rotas.

6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde las células bacterianas están enteras.

7. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, donde las células bacterianas han sido precultivadas en un medio de cultivo que comprende una sal alcalina de succinato.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, donde el medio de cultivo comprende un hidrocarburo saturado lineal de 10 a 18 átomos de carbono.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, donde el hidrocarburo es hexadecano.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, donde la concentración de hexadecano en el medio de cultivo está entre 25 mg/l y 5 g/l.