ES2328585T3 - Vector de adenovirus recombinante y metodo de utilizacion. - Google Patents

Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un vector de expresión de adenovirus recombinante, comprendiendo el vector un gen que codifica una proteína foránea y una deleción total de la secuencia codificante de la proteína IX, donde la proteína foránea es una proteína supresora de tumores seleccionada del grupo que consiste en p53, p21, p16, Rb, proteína WT1 del tumor de Wilms, h-NUC y mitosina.

Description

Vector de adenovirus recombinante y método de utilización.

Esta solicitud es una continuación de parte del documento U.S. Núm. de Serie 08/233.777, presentado el 19 de Mayo de 1994, que es una continuación de parte del documento U.S. Núm. de Serie 08/142.669 presentado el 25 de Octubre de 1993.

La producción de adenovirus recombinantes útil para la terapia génica requiere el uso de una línea celular capaz de suministrar en trans los productos génicos de la región E1 viral que están suprimidos en estos virus recombinantes. En la actualidad la única línea celular útil disponible es la línea celular 293 descrita originalmente por Graham et al. en 1977. Las células 293 contienen aproximadamente el 12% de la izquierda (4,3 kb) del genoma del adenovirus de tipo 5 (Aiello (1979) y Spector (1983)).

Los vectores adenovirales que están siendo sometidos a ensayo en la actualidad para las aplicaciones de terapia génica tienen típicamente suprimido el ADN de Ad2 o Ad5 que se extiende desde aproximadamente 400 pares de bases del extremo 5' del genoma viral a aproximadamente 3,3 kb del extremo 5', para una deleción de E1 total de 2,9 kb. Por lo tanto, existe una región limitada de homología de aproximadamente 1 kb entre la secuencia de ADN del virus recombinante y el ADN de Ad5 en la línea celular. Esta homología define una región de recombinación potencial entre las secuencias de adenovirus virales y celulares. Semejante recombinación da como resultado un virus de tipo salvaje fenotípicamente que porta la región E1 de Ad5 de las células 293. Este evento de recombinación explica presumiblemente la frecuente detección de adenovirus de tipo salvaje en las preparaciones de virus recombinante y se ha demostrado directamente que es la causa de la contaminación de tipo salvaje del virus recombinante basado en Ad2 Ad2/CFTR-1 (Rich et al. (1993)).

Debido al alto grado de homología de secuencia en el subgrupo de adenovirus de tipo C es probable que se produzca semejante recombinación si el vector se basa en cualquier adenovirus del grupo C (tipos 1, 2, 5, 6).

En una producción a pequeña escala de adenovirus recombinantes, la generación de virus de tipo salvaje contaminante se puede gestionar mediante un procedimiento de escrutinio que descarte aquellas preparaciones de virus que se ha encontrado que están contaminadas. Como la escala de producción del virus crece hasta satisfacer la demanda esperada de agentes terapéuticos genéticos, la probabilidad de que cualquier lote individual sea contaminado con un virus de tipo salvaje también aumentará así como la dificultad de proporcionar preparaciones recombinantes no contaminadas.

Habrá más de un millón de nuevos casos de diagnósticos de cáncer este año, y la mitad de esa cifra de muertes relacionadas con cánceres (American Cancer Society, 1993). Las mutaciones de p53 son la alteración genética más común asociada con los cánceres humanos, existiendo en 50-60% de los cánceres humanos (Hollstein et al. (1991); Bartek et al. (1991); Levine (1993)). El objetivo de la terapia génica en el tratamiento de los tumores carentes de p53, por ejemplo, es restituir una copia funcional, normal del gen p53 de tipo salvaje de manera que se restaure el control de la proliferación celular. p53 juega un papel fundamental en el progreso del ciclo celular, deteniendo el crecimiento de manera que se pueda producir la reparación apoptosis en respuesta al deterioro del ADN. El p53 de tipo salvaje ha sido identificado recientemente como un componente necesario para la apoptosis inducida por radiación o tratamiento con algunos agentes quimioterapéuticos (Lowe et al. (1993) A y B). Debido a la elevada prevalencia de las mutaciones de p53 en los tumores humanos, es posible que los tumores se hayan vuelto refractarios a los tratamientos con quimioterapia y radiación debido en parte a la carencia de p53 de tipo salvaje. Volviendo a suministrar p53 funcional a estos tumores, es razonable que sean susceptibles ahora de la apoptosis normalmente asociada con el deterioro del ADN inducido por la radiación y la quimioterapia.

Uno de los puntos críticos en la terapia génica satisfactoria de supresión de tumores es la capacidad para afectar a una fracción significativa de las células cancerosas. El uso de vectores retrovirales ha sido en gran parte explorado para este fin en una variedad de modelos de tumor. Por ejemplo, para el tratamiento de las malignidades hepáticas, se han empleado vectores retrovirales con escaso éxito debido a que estos vectores no son capaces de lograr el alto nivel de transferencia génica requerido para la terapia génica in vivo (Huber, B.E. et al., 1991; Caruso M. et al., 1993).

Para lograr una fuente más continua de producción de virus, los investigadores han intentado superar el problema asociado con el bajo nivel de transferencia génica mediante inyección indirecta de líneas celulares de empaquetamiento retrovirales a los tumores sólidos (Caruso, M. et al., 1993; Ezzidine, Z.D. et al., 1991; Culver, K.W. et al., 1992). Sin embargo, estos métodos no son satisfactorios para su uso en pacientes humanos debido a que el método es dificultoso e induce una respuesta inflamatoria contra la línea celular de empaquetamiento en el paciente. Otra desventaja de los vectores retrovirales es que requieren células en división para integrarse eficazmente y expresar el gen recombinante de interés (Huber, B.E. 1991). La integración estable en un gen anfitrión esencial puede conducir al desarrollo o la herencia de estados de enfermedad patogénicos.

Los adenovirus recombinantes tienen claras ventajas sobre los métodos retrovirales y de liberación de otros genes (para una revisión, véase Siegfried (1993)). Nunca se ha demostrado que los adenovirus induzcan tumores en los seres humanos y se han utilizado con seguridad como vacunas vivas (Straus (1984)). Se pueden producir adenovirus recombinantes carentes de replicación remplazando la región E1 necesaria para la replicación por el gen diana. El adenovirus no se integra en el genoma humano como consecuencia normal de la infección, reduciendo de ese modo enormemente el riesgo de mutagénesis insercional posible con los retrovirus o los vectores virales adenoasociados (AAV). Esta carencia de integración estable también conduce a una característica de seguridad adicional ya que el efecto del gen transferido será transitorio, puesto que el ADN extracromosómico se perderá gradualmente con la continua división de las células normales. Se pueden producir adenovirus recombinantes de elevado título, estables a niveles no alcanzables con retrovirus o AAV, permitiendo que se produzca suficiente material para tratar una gran población de pacientes. Por otra parte, los vectores de adenovirus son susceptibles de transferencia génica in vivo altamente eficaz en una amplia gama de tipos de tejidos y células tumorales. Por ejemplo, otros han demostrado que el reparto de genes mediado por adenovirus tiene un fuerte potencial para la terapia génica para enfermedades tales como la fibrosis quística (Rosenfeld et al. (1992); Rich et al. (1993)) y la deficiencia de \alpha_{1}-antitripsina (Lemarchand et al. (1992)). Aunque también se están explorando en la actualidad otras alternativas para el reparto génico, tales como los complejos de liposomas catiónicos/ADN, ninguno hasta ahora parece tan eficaz como el reparto de genes mediado por adenovirus.

Como con el tratamiento de los tumores carentes de p53, el objetivo de la terapia génica para otros tumores consiste en restituir el control de la proliferación celular. En el caso de p53, la introducción de un gen funcional restituye el control del ciclo celular permitiendo la muerte celular apoptótica inducida por agentes terapéuticos. De un modo similar, la terapia génica es igualmente aplicable a otros genes supresores de tumores que se pueden utilizar solos o combinados con agentes terapéuticos para controlar el progreso del ciclo celular de las células tumorales y/o inducir la muerte celular. Por otra parte, los genes que no codifican proteínas reguladoras del ciclo celular, pero inducen directamente la muerte celular tales como los genes suicidas o, los genes que son directamente tóxicos para la célula se pueden utilizar en los protocolos de terapia génica para eliminar directamente el progreso del ciclo celular de las células tumorales.

Independientemente de qué gen se utilice para restituir el control del progreso del ciclo celular, la razón fundamental y la aplicabilidad práctica de este enfoque son idénticas. Esto es, lograr eficacias elevadas de transferencia génica para expresar cantidades terapéuticas del producto recombinante. La elección de qué vector utilizar para permitir una transferencia génica de elevada eficacia con un mínimo riesgo para el paciente es por lo tanto importante para el nivel de éxito del tratamiento de terapia génica.

De este modo, existe la necesidad de vectores y métodos que proporcionen una eficacia de transferencia génica y una expresión de proteínas de alto nivel que proporcionen tratamientos de terapia génica seguros y eficaces. La presente invención satisface esta necesidad y proporciona también las ventajas relacionadas.

Compendio de la invención

Esta invención proporciona un vector de expresión de adenovirus recombinante caracterizado por una deleción total del ADN de la proteína IX adenoviral y por tener un gen que codifica una proteína foránea, donde la proteína foránea es una proteína supresora de tumores seleccionada del grupo que consiste en p53, p21, p16, Rb, proteína WT1 del tumor de Wilms, h-NUC y mitosina.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un vector adenoviral recombinante de esta invención. Este constructo fue ensamblado como se muestra en la Figura 1. El virus resultante porta una deleción 5' de secuencias adenovirales que se extienden desde el nucleótido 356 al 4020 y elimina los genes E1a y E1b así como la secuencia codificante de la proteína IX completa, dejando el sitio de poliadenilación compartido por los genes E1b y pIX intacto para su uso en la terminación de la transcripción de cualquier gen deseado.

La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos de p110^{RB}.

La Figura 3 muestra una secuencia de ADN que codifica una proteína supresora del tumor retinoblastoma.

La Figura 4 muestra un esquema de constructos de p53 recombinante/adenovirus dentro del alcance de esta invención. Los recombinantes de p53 se basan en Ad 5 y tienen la región E1 de los nucleótidos 360-3325 sustituida por un ADNc de p53 completo de 1,4 kb conducido por los promotores MLP de Ad 2 (A/M/53) o CMV humano (A/C/53) seguidos de un ADNc líder tripartito de Ad 2. El A/M del virus de control tiene las mismas deleciones de Ad 5 que el virus A/M/53 pero carece del inserto de ADNc de p53 de 1,4 kb. La secuencia de E1b restante (705 nucleótidos) ha sido suprimida para crear la proteína IX con los constructos A/M/N/53 y A/C/N/53 suprimidos. Estos constructos también tienen una deleción XbaI de 1,9 kb en la región E3 del adenovirus de tipo 5.

Las Figuras 5A y 5B muestran la expresión de la proteína p53 en células tumorales infectadas con A/M/53 y A/C/53. Figura 5A) se infectaron células Saos-2 (osteosarcoma) a las multiplicidades de infección (MOI) indicadas con el virus A/M/53 o A/C/53 purificado y se cosecharon 24 horas más tarde. Se utilizó el anticuerpo de p53 pAb 1801 para teñir las inmunotransferencias de las muestras cargadas con concentraciones totales de proteína iguales. Se utilizaron concentraciones de proteína iguales de extractos celulares de SW40, que expresaban al alza la proteína p53 mutante, como marcador para el tamaño de p53. "O" bajo el encabezamiento A/C/53 indica una infección simulada, que contiene producto lisado de Saos-2 no tratado. Figura 5B) se infectaron células Hep 3B (carcinoma hepatocelular) con el virus A/M/53 o A/C/53 a la MOI indicada y se analizaron como en el apartado A). La flecha indica la posición de la proteína p53.

Las Figuras 6A a 6C muestran el cambio de morfología de Saos-2 dependiente de p53. Las células Saos-2 subconfluentes (1 x 10^{5} células/placa de 10 cm) o no fueron infectadas (A), fueron infectadas a una MOI = 50 con (B) el virus A/M de control o con (C) el virus A/C/53. Las células fueron fotografiadas 72 horas después de la infección.

La Figura 7 muestra la inhibición de la síntesis de ADN dependiente de p53 en líneas celulares tumorales humanas mediante A/M/N/53 y A/C/N/53. Se infectaron nueve líneas celulares tumorales diferentes con adenovirus de control A/M (-x-x-), o el virus A/M/N/53 (-\Delta-\Delta-) que expresaba p53, o A/C/N/53 (-O-O-) a una MOI creciente indicada. El tipo de tumor y el estatus de p53 se indican para cada línea celular (wt = tipo salvaje, nulo = proteína no expresada, mut = proteína mutante expresada). Se midió la síntesis de ADN 72 horas después de la infección como se describe más abajo en el Experimento Núm. II. Los resultados son de las medidas por triplicado a cada dosis (media +/- DT), y se trazan como el % de control del medio versus MOI. * Las células H69 solamente fueron sometidas a ensayo con virus A/M y A/M/N/53.

La Figura 8 muestra la tumorigenicidad de células Saos-2 infectadas con p53 en ratones carentes de sistema inmunitario. Las células Saos-2 fueron infectadas con el virus A/M de control o A/M/N/53 con p53 recombinante a una MOI = 30. Las células tratadas fueron inyectadas subcutáneamente en los flancos de los ratones carentes de sistema inmunitario, y las dimensiones del tumor fueron medidas (como se describe en el Experimento Núm. II) dos veces por semana durante 8 semanas. Se trazaron los resultados como el tamaño del tumor versus los días después de la implantación de las células tumorales tanto para las células tratadas con A/M (-x-x-) de control como con A/M/N/53 (-\Delta-\Delta-). Las barras de error representan el tamaño medio del tumor =/- ETM para cada grupo de 4 animales en cada momento puntual.

La Figura 9 es la expresión de ARN rAd/p53 en tumores establecidos. Se inyectaron células H69 (SCLC) subcutáneamente en ratones carentes de sistema inmunitario y se dejó que desarrollaran tumores durante 32 días hasta alcanzar un tamaño de aproximadamente 25-50 mm^{3}. Se escogieron los ratones al azar y se les inyectaron peritumoralmente 2 x 10^{9} pfu de virus A/C/-gal de control o A/C/53. Los tumores fueron extirpados a los 2 y 7 días de la inyección, y se preparó ARN poliA a partir de cada muestra de tumor. Se llevó a cabo la RT-PCR utilizando concentraciones de ARN iguales y cebadores específicos para el mensaje de p53 recombinante. Se realizó la amplificación por PCR durante 30 ciclos a 94ºC 1 min., 55ºC 1,5 min., 72ºC 2 min., y un período de prolongación final de 10 min., a 72ºC en un ciclador térmico Omnigen (Hybaid). Los cebadores de la PCR utilizados fueron un ADNc Líder Tripartito 5' (5'-CGCCACC
GAGGGACCTGAGCGAGTC-3') y un cebador p53 3' (5'-TTCTGGGAAGGGACAGAAGA-3'). Las calles 1, 2, 4, y 5 son muestras tratadas con p53 extirpadas el día 2 o 7 según se indique. Las calles 3 y 6 son de tumores tratados con \beta-gal. Las calles 7,8, y 9 son réplicas de las calles 4,5, y 6 respectivamente, amplificadas con cebadores de actina para verificar una carga igual. La calle 10 es un control positivo que utiliza un plásmido que contiene el tripartito/p53.

Las Figuras 10A y 10B muestran la supresión del tumor in vivo y el aumento del tiempo de supervivencia con A/M/N/53. Se inyectaron células tumorales H69 (SCLC) subcutáneamente en ratones carentes de sistema inmunitario y se dejó que se desarrollaran durante 2 semanas. Se administraron inyecciones peritumorales de tampón solo (- - -), adenovirus A/M de control (-x-x-), o A/M/N/53 (-\Delta-\Delta), ambos virus (2 x 10^{9} pfu/inyección) dos veces por semana durante un total de 8 dosis. Se midieron las dimensiones del tumor dos veces por semana y se estimó el volumen del tumor como se describe en el Experimento Núm. II. A) Se trazó el tamaño del tumor para cada virus versus tiempo (días) después de la inoculación de células H69. Las barras de error indican el tamaño medio del tumor +/- ETM para cada grupo de 5 animales. Las flechas indican los días de las inyecciones con virus. B) Se controló la supervivencia de los ratones y se trazó la fracción de ratones supervivientes por grupo versus el tiempo post inoculación de las células H69 tratadas con tampón solo (- - - -), virus de control A/M (\cdot\cdot\cdot \cdot\cdot\cdot \cdot\cdot\cdot) o A/M/N/53 (--).

Las Figuras 11A a 11C muestran mapas de construcciones de plásmidos recombinantes. Los plásmidos se construyeron como se detalla más abajo. Las líneas en negrita de los constructos indican los genes de interés mientras las indicaciones en negrita indican los sitios de restricción utilizados para generar los fragmentos que se van a ligar entre sí para formar el plásmido subsiguiente como se indica mediante las flechas. En la Figura 11A, se construyó el plásmido pACNTK subclonando el gen HSV-TK a partir de pMLBKTK (ATCC Núm. 39369) en el poliligador de un vector de clonación, seguido de aislamiento del gen TK con los extremos deseados para la clonación en el vector pACN. El vector contiene las secuencias adenovirales necesarias para que se produzca la recombinación in vivo para formar adenovirus recombinante (véase la Figura 12). En la Figura 11B, se muestra la construcción del plásmido pAANTK comenzando por los fragmentos amplificados por PCR que codifican las regiones intensificadora de \alpha-fetoproteína (AFP-E) y promotora (AFP-P) subclonadas a través de diversas etapas en un plásmido final en el que el intensificador y el promotor de AFP se encuentran aguas arriba del gen HSV-TK seguido de las secuencias del adenovirus de Tipo 2 necesarias para que se produzca la recombinación in vivo para formar el adenovirus recombinante. En la Figura 11C, se muestra la construcción del plásmido pAANCAT comenzando por el aislamiento del gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) de un plásmido disponible en el mercado y la subclonación del mismo en el plásmido pAAN (véase más arriba), generando el plásmido final pAANCAT donde el intensificador/promotor de AFP dirige la transcripción del gen CAT en un fondo de secuencia de adenovirus.

La Figura 12 es un mapa esquemático de adenovirus recombinantes ACNTK, AANTK y AANCAT. Para construir adenovirus recombinantes a partir de los plásmidos descritos en la Figura 11, se linealizaron 4 partes (20 \mug) de plásmido pACNTK, pAANTK, o pAANCAT con Eco R1 y se cotransfectaron con 1 parte (5 \mug) del fragmento grande de adenovirus recombinante digerido con Cla 1 (rAC\beta-gal) que contenía una deleción de la región E3 (Wills et al., 1994). En los virus resultantes, los nucleótidos 360-4021 de Ad 5 son remplazados por el promotor de CMV y el ADNc líder tripartito (TPL) o por el intensificador y el promotor de la \alpha-fetoproteína (AFP) que conducen la expresión del gen TK o CAT de HSV-1 como se indica. Los adenovirus recombinantes resultantes se denominan ACNTK, AANTK, y AANCAT respectivamente.

La Figura 13 muestra la especificidad del promotor de la expresión de CAT en los vectores adenovirales recombinantes. Se infectaron dos (2) X 10^{6} de las líneas celulares diseñadas a las MOI = 30 o 100 del adenovirus recombinante AANCAT como se indica o se dejaron sin infectar (UN). Las células Hep G2 y Hep 3B expresan la \alpha-fetoproteína mientras las otras líneas celulares no lo hacen. Al cabo de tres días, se recogieron las células, se ajustaron los volúmenes extraídos a concentraciones totales de proteína iguales, y se midió la actividad CAT como se describe en la sección Métodos, más abajo. Un número igual de células no infectadas sirvió como controles individuales para la actividad CAT de fondo, mientras el cloranfenicol marcado con C^{14} (C^{14}- solo) y el extracto de una línea celular estable (B21) que expresaba actividad CAT sirvieron como controles negativo y positivo respectivamente. Se indica el porcentaje de conversión de acetil CoA, demostrando que la expresión de CAT está limitada a aquellas células que expresan la \alpha-fetoproteína.

La Figura 14 muestra los efectos del tratamiento con TK/GCV sobre líneas celulares de carcinoma hepatocelular y los efectos de la especificidad del promotor. Se infectaron las líneas celulares Hep-G2 (AFP positiva) y HLF (AFP negativa) durante la noche con virus ACNTK [-\Delta-] AANTK [-\ding{115}-], o control ACN [-\Box-] a una multiplicidad de infección de 30 y con posterioridad se trataron con un única dosis de ganciclovir a las concentraciones indicadas. Se evaluó la proliferación celular añadiendo timidina-H^{3} a las células aproximadamente 18 horas antes de la cosecha. Se midió la incorporación de timidina-H^{3} al ácido nucleico celular 72 horas después de la infección (Top Count, Packard y se expresó como un porcentaje (media +/- D.T.) del control no tratado. Los resultados muestran una inhibición de la proliferación dependiente de la dosis no selectiva con el constructo conducido por CMV, mientras TK conducido por AFP inhibe selectivamente Hep-G2.

La Figura 15 muestra la citotoxicidad de ACNTK más ganciclovir en HCC. Se infectaron células HLF a una MOI de 30 con ACNTK [-\bullet-] o el virus de control ACN [-\Box-] y se trataron con ganciclovir a las dosis indicadas. Setenta y dos (72) horas después del tratamiento con ganciclovir, se midió la cantidad de lactato deshidrogenasa (LDH) liberada en el sobrenadante celular colorimétricamente y se trazó media +/- ETM) versus concentración de ganciclovir para los dos grupos tratados con virus.

Las Figuras 16A y 16B muestran el efecto de ACNTK más ganciclovir sobre tumores de carcinoma hepatocelular (HCC) establecido en ratones carentes de sistema inmunitario. Se inyectaron una (1) X 10^{7} células Hep 3B subcutáneamente en el flanco de ratones hembra carentes de sistema inmunitario y se dejó que crecieran durante 27 días. Después los ratones recibieron inyecciones intratumorales y peritumorales de virus ACNTK [-\bullet-] o control ACN [-\Box-] (1 X 10^{9} ui en un volumen de 100 \mul) un día si y otro no durante un total de tres dosis (indicado mediante flechas). Las inyecciones de ganciclovir (100 mg/kg ip) comenzaron 24 horas después de la dosis de virus inicial y continuaron durante un total de 10 días. En la Figura 6A, los tamaños de los tumores se trazan para cada virus versus días post infección (media +/- ETM). En la Figura 6B, el peso corporal para cada grupo de animales tratado con virus se traza como la media +/- ETM versus días post infección.

\vskip1.000000\baselineskip

Descripción detallada de la invención

Para reducir la frecuencia de contaminación con el adenovirus de tipo salvaje, es deseable mejorar el virus o la línea celular para reducir la probabilidad de recombinación. Por ejemplo, se podría utilizar un adenovirus de un grupo con una baja homología con los virus del grupo C para diseñar virus recombinantes con poca propensión a la recombinación con las secuencias de Ad5 en las células 293. Sin embargo, un método alternativo, más fácil para reducir la recombinación entre las secuencias virales y celulares consiste en incrementar el tamaño de la deleción en el virus recombinante y reducir de ese modo el grado de secuencia compartida entre éste y los genes de Ad5 en las células 293.

Las deleciones con una extensión de más de 3,5 kb desde el extremo 5' del genoma adenoviral afectan al gen para la proteína IX adenoviral y no se consideraban deseables en los vectores adenovirales (véase más abajo).

El gen de la proteína IX de los adenovirus codifica un componente minoritario de la cápside adenoviral externa que estabiliza el grupo de nueve hexonas que componen la mayoría de las cápsides virales (Stewart (1993)). Basándose en el estudio de los mutantes por deleción de adenovirus, se pensó inicialmente que la proteína IX era un componente no esencial de los adenovirus, aunque su ausencia estuviera asociada con una mayor labilidad térmica que la observada con el virus de tipo salvaje (Colby y Shenk (1981)). Más recientemente se descubrió que la proteína IX es esencial para empaquetar el ADN viral completo en cápsides y que en ausencia de proteína IX, solamente los genomas al menos 1 kb más pequeños que el de tipo salvaje podían ser propagados como virus recombinantes (Ghosh-Choudhury et al. (1987)). Dada esta limitación de empaquetamiento, las deleciones de la proteína IX no han sido consideradas deliberadamente en el diseño de vectores adenovirales.

Por ejemplo, el vector adenoviral descrito por Venkatesh L.K. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) Vol. 87, págs. 8746-8750) contiene una deleción en la región E1a/E1b que se extiende desde un sitio de restricción PvuII a un sitio de restricción 8g111, de manera que el gen que codifica la proteína IX permanece intacto.

En esta solicitud, se hace referencia a libros de texto convencionales de biología molecular que contienen definiciones, métodos y medios para llevar a cabo técnicas básicas, abarcadas por la presente invención. Véase por ejemplo, Sambrook et al. (1989) y las diversas referencias allí citadas.

Al contrario de lo que se sabía en la técnica, esta invención reivindica el uso de adenovirus recombinantes que portan deleciones del gen de la proteína IX como medio para reducir el riesgo de contaminación por adenovirus de tipo salvaje en preparaciones de virus para su uso en aplicaciones de diagnóstico y terapéuticas tales como la terapia génica. Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término "recombinante" represente una progenie formada como resultado de la ingeniería genética. Estas deleciones pueden separar de 500 a 700 pares de bases adicionales de la secuencia de ADN que está presente en los virus con E1 suprimida convencionales, y es asequible para la recombinación con las secuencias de Ad5 integradas en las células 293. Los adenovirus recombinantes basados en cualquier virus del grupo C, serotipo 1, 2, 5 y 6, están incluidos en esta invención. También está incluido en esta invención un híbrido Ad2/Ad5 basado en un virus recombinante que expresa el ADNc de p53 humano a partir del promotor tardío principal del adenovirus de tipo 2. Este constructo fue ensamblado como se muestra en la Figura 1. El virus resultante porta una deleción 5' de secuencias adenovirales que se extienden desde aproximadamente el nucleótido 357 al 4020 y elimina los genes E1a y E1b así como la secuencia codificante de la proteína IX completa, dejando el sitio de poliadenilación compartido por los genes de E1b y la proteína IX intactos para su uso en la terminación de la transcripción de cualquier gen deseado. En la Figura 4 se muestra una realización separada. Alternativamente, la deleción se puede extender de 30 a 40 pares de bases más sin afectar al gen adyacente para la proteína IVa2, aunque en ese caso se proporciona una señal de poliadenilación exógena para terminar la transcripción de los genes insertados en el virus recombinante. El virus inicial construido con esta deleción es fácilmente propagado en las células 293 sin evidencia de contaminación viral de tipo salvaje y dirige una expresión de p53 robusta desde la unidad transcripcional insertada en el sitio de la deleción.

La capacidad del inserto de los virus recombinantes que portan la deleción de la proteína IX descritos antes es de aproximadamente 2,6 kb. Esta es suficiente para muchos genes incluyendo el ADNc de p53. La capacidad del inserto se puede incrementar introduciendo otras deleciones en la cadena principal adenoviral, por ejemplo, deleciones dentro de las regiones tempranas 3 o 4 (para una revisión véase: Graham y Prevec (1991)). Por ejemplo, el uso de una cadena principal adenoviral que contiene una deleción de 1,9 kb de una secuencia no esencial dentro de la región temprana 3. Con esta deleción adicional, la capacidad del inserto del vector aumenta a aproximadamente 4,5 kb, suficientemente grande como para ADNc mucho mayores, incluyendo el del gen supresor del tumor de retinoblastoma.

Un vector de expresión de adenovirus recombinante caracterizado por una deleción total del ADN de la proteína IX adenoviral y que tiene un gen que codifica una proteína foránea, donde la proteína foránea es una proteína supresora de tumores seleccionada del grupo que consiste en p53, p21, p16, Rb, proteína WT1 del tumor de Wilm, h-NUC y mitosina. Estos vectores son útiles para la producción recombinante segura de polipéptidos y proteínas de diagnóstico y terapéuticos, y más importantemente, para la introducción de genes en la terapia génica. Se puede utilizar cualquier casete de expresión en los vectores de esta invención. Una "casete de expresión" representa una molécula de ADN que tiene un promotor/intensificador de la transcripción tal como el promotor intensificador de CMV, etc., un gen foráneo, y en algunas realizaciones definidas más abajo, una señal de poliadenilación. Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término "gen foráneo" represente una molécula de ADN no presente en la orientación y posición exactas como molécula de ADN contraparte encontrada en el adenovirus de tipo salvaje. El gen foráneo es una molécula de ADN de hasta 4,5 kilobases. "Vector de expresión" representa un vector que produce la expresión de las secuencias de ADN insertadas cuando se propaga en una célula anfitriona adecuada, esto es, la proteína o polipéptido codificado por el ADN es sintetizado por el sistema del anfitrión.

Los promotores inducibles también se pueden utilizar en el vector adenoviral de esta invención. Estos promotores iniciarán la transcripción solamente en presencia de una molécula adicional. Los ejemplos de los promotores inducibles incluyen aquellos obtenibles de un gen de interferón \beta, un gen de choque térmico, un gen de metalotioneína o aquellos obtenibles a partir de genes sensibles a hormonas esteroideas. La expresión específica de los tejidos ha sido bien caracterizada en el campo de la expresión génica y los promotores inducibles y específicos de los tejidos tales como estos son muy bien conocidos en la técnica. Estos genes se utilizan para regular la expresión del gen foráneo después de haber sido introducido en la célula diana.

La presente invención también abarca un vector de expresión de adenovirus recombinante, como se ha descrito antes, que tiene deleciones menos extensas de la secuencia del gen de la proteína IX que se extienden de 3500 pb a partir del extremo viral 5' a aproximadamente 4000 pb, en una realización. En una realización separada, el vector de expresión de adenovirus recombinante puede tener una deleción adicional de una secuencia de ADN no esencial en la región temprana de adenovirus 3 y/o 4 y/o una deleción de las secuencias de ADN denominadas E1a y E1b de adenovirus. En esta realización, el gen foráneo es una molécula de ADN de un tamaño de hasta 4,5 kilobases.

Una realización adicional tiene una deleción de hasta cuarenta nucleótidos situados 3' con respecto a la deleción de E1a y E1b y pIX y una molécula de ADN foráneo que codifica una señal de poliadenilación insertada en el vector recombinante en una posición relativa al gen foráneo para regular la expresión del gen foráneo.

Para los fines de esta invención, el vector de expresión de adenovirus recombinante puede derivar de un adenovirus del grupo de tipo salvaje, serotipo 1, 2, 5 o 6.

En una realización, el vector de expresión de adenovirus recombinante tiene un gen foráneo que codifica una proteína supresora de tumores funcional, o un fragmento biológicamente activo de la misma. Según se utiliza en la presente memoria, el término "funcional" cuando se refiere a un gen supresor de tumores, hace referencia a genes supresores de tumores que codifican proteínas supresoras de tumores que inhiben eficazmente el comportamiento de una célula como célula tumoral. Los genes funcionales pueden incluir, por ejemplo, el tipo salvaje de genes normales y las modificaciones de los genes normales que conservan su capacidad para codificar proteínas supresoras de tumores eficaces y otros genes anti-tumorales tales como una proteína suicida condicional o una toxina.

De un modo similar, "no funcional" según se utiliza en la presente memoria es sinónimo de "inactivado". Los genes no funcionales o defectuosos pueden estar causados por una variedad de eventos, incluyendo por ejemplo mutaciones puntuales, deleciones, metilación y otros conocidos por los expertos en la técnica.

Según se utiliza en la presente memoria, un "fragmento activo" de un gen incluye porciones más pequeñas del gen que conservan la capacidad de codificar proteínas que tienen actividad supresora de tumores. p56^{RB}, descrito más completamente más abajo, es un ejemplo de un fragmento activo de un gen supresor de tumores funcional. Las modificaciones de los genes supresores de tumores también están contempladas dentro del significado de fragmento activo, tales como las adiciones, deleciones o sustituciones, con tal que se conserve la actividad funcional del gen no modificado.

Otro ejemplo de gen supresor de tumores es el retinoblastoma (RB). Las secuencias de nucleótidos del ADNc de RB completo y las secuencias de aminoácidos pronosticadas de la proteína RB resultante (denominadas p110^{RB}) son mostradas por Lee et al. (1987) y en la Figura 3. También es útil para expresar la proteína supresora de tumores retinoblastoma la molécula de ADN que codifica la secuencia de aminoácidos mostrada en la Figura 2 o que tiene la secuencia de ADN mostrada en la Figura 3. Asimismo es útil una versión truncada de p110^{RB}, denominada p56^{RB}. Para la secuencia de p56^{RB}, véase Huang et al. (1991). Se pueden utilizar genes supresores de tumores adicionales en los vectores de esta invención. Estos pueden ser la proteína p16 (Kamb et al. (1994)), la proteína p21, la proteína WT1 del tumor de Wilm, la mitosina, h-NUC, o la proteína DCC del carcinoma de colon. La mitosina es descrita por X. Zhu y W-H Lee, Solicitud de los Estados Unidos Núm. de Serie 08/141.239, presentada el 22 de Octubre de 1993, y una continuación en parte posterior de los mismos inventores, número de declaración para la solicitud P-CJ 1191, presentada el 24 de Octubre de 1994. De un modo similar, h-NUC es descrita por W-H Lee y P-L Chen, Solicitud de los Estados Unidos Núm. de Serie 08/170.586, presentada el 20 de Diciembre de 1993.

Como es sabido por los expertos en la técnica, el término "proteína" representa un polímero lineal de aminoácidos reunidos en una secuencia específica por medio de enlaces peptídicos. Según se utiliza en la presente memoria, el término "aminoácido" hace referencia a la forma estereoisomérica D o L del aminoácido, a menos que se designe específicamente de otro modo. También están incluidas las proteínas equivalentes o los péptidos equivalentes que tienen, p. ej., la actividad biológica de la proteína supresora de tumores de tipo salvaje purificada. "Proteínas equivalentes" y "polipéptidos equivalentes" hacen referencia a compuestos que se originan a partir de la secuencia lineal de las proteínas o polipéptidos de origen natural, pero que tienen sustituciones de aminoácidos que no cambian su actividad biológica. Estos equivalentes pueden diferir de las secuencias nativas mediante remplazo de uno o más aminoácidos por aminoácidos relacionados, por ejemplo, aminoácidos similarmente cargados, o sustitución o modificación de las cadenas laterales o los grupos funcionales.

También están incluidos en la definición de proteína supresora de tumores funcional cualquier proteína cuya presencia reduce la tumorigenicidad, la malignidad o el fenotipo hiperproliferativo de la célula anfitriona. Los ejemplos de las proteínas supresoras de tumores de esta definición incluyen, pero no están limitados a p110^{RB}, p56^{RB}, mitosina, h-NUC y p53. Se pretende que "tumorigenicidad" represente la capacidad para formar tumores o la capacidad de ocasionar la formación de tumores y es sinónimo de crecimiento neoplásico. Se pretende que "malignidad" describa una célula tumorigénica que tiene la capacidad de formar metástasis y poner en riesgo la vida del organismo anfitrión. Se pretende que "fenotipo hiperproliferativo" describa una célula en crecimiento y división a una velocidad más allá de las limitaciones de crecimiento normales para ese tipo celular. También se pretende que "neoplásico" incluya células que carecen de una proteína supresora de tumores funcional endógena o la incapacidad de la célula para expresar un ácido nucleico endógeno que codifique una proteína supresora de tumores funcional.

Un ejemplo de un vector de esta invención es un vector de expresión de adenovirus recombinante que tiene un gen foráneo que codifica la proteína p53 o uno de sus fragmentos activos es proporcionado por esta invención. La secuencia codificante del gen p53 se muestra más abajo en la Tabla I.

TABLA I

1

Cualquiera de los vectores de expresión descritos en la presente memoria es útil como composición para la diagnosis o la terapia. Los vectores se pueden utilizar para escrutar cuál de los muchos genes supresores de tumores podría ser útil en la terapia génica. Por ejemplo, se puede recoger una muestra de las células que se sospecha que son neoplásicas de un sujeto y mamífero. Las células se pueden poner en contacto, con condiciones adecuadas y con una cantidad eficaz de un vector recombinante de esta invención que tenga insertado en él un gen foráneo que codifique uno de los diversos genes supresores de tumores funcionales. Se puede medir si la introducción de este gen revertirá el fenotipo maligno mediante formación de colonias en agar blando o formación de tumores en ratones carentes de sistema inmunitario. Si se revierte el fenotipo maligno, se determina que el gen foráneo es un candidato positivo para la terapia génica acertada del sujeto o mamífero. Cuando se utilizan farmacéuticamente, se pueden combinar con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables. Los portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos en la técnica e incluyen soluciones acuosas tales como solución salina tamponada fisiológicamente u otros disolventes o vehículos tales como glicoles, glicerol, aceites vegetales (p. ej., aceite de oliva) o ésteres orgánicos inyectables. Se puede utilizar un portador farmacéuticamente aceptable para administrar las presentes composiciones a una célula in vitro o a un sujeto in vivo.

Un portador farmacéuticamente aceptable puede contener un compuesto fisiológicamente aceptable que actúa, por ejemplo, para estabilizar la composición o para incrementar o disminuir la absorción del agente. Un compuesto fisiológicamente aceptable puede incluir, por ejemplo, carbohidratos, tales como glucosa, sacarosa o dextranos, antioxidantes, tales como ácido ascórbico o glutatión, agentes quelantes, proteínas de bajo peso molecular u otros estabilizantes o excipientes. Otros compuestos fisiológicamente aceptables incluyen agentes humectantes, agentes emulsionantes, agentes dispersantes o conservantes, que son particularmente útiles para evitar el crecimiento o la acción de los microorganismos. Los diversos conservantes son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, fenol y ácido ascórbico. Un experto en la técnica sabrá que la elección de un portador farmacéuticamente aceptable, incluyendo un compuesto fisiológicamente aceptable, depende, por ejemplo, de la ruta de administración del polipéptido y de las características fisico-químicas concretas del polipéptido específico. Por ejemplo, un compuesto fisiológicamente aceptable tal como monoestearato de aluminio o gelatina es particularmente útil como agente retardador, que prolonga la velocidad de absorción de una composición farmacéutica administrada a un sujeto. Se pueden encontrar ejemplos adicionales de portadores, estabilizantes o coadyuvantes en Martin, Remington's Pharm. Sci., 15ª Ed. (Mack Publ. Co., Easton, 1975). La composición farmacéutica también se puede incorporar, si se desea, a liposomas, microesferas u otras matrices poliméricas (Gregoriadis, Liposome Technology, Vol. 1 (CRC Press, Boca Raton, Florida 1984)). Los liposomas, por ejemplo, que consisten en fosfolípidos u otros lípidos, son portadores no tóxicos, fisiológicamente aceptables y metabolizables que son relativamente simples de elaborar y administrar.

Según se utiliza en la presente memoria, "composición farmacéutica" hace referencia a cualquiera de las composiciones de materia descritas en la presente memoria combinada con uno o más de los portadores farmacéuticamente aceptables anteriores. Las composiciones se pueden administrar después terapéuticamente o profilácticamente. Se pueden poner en contacto con la célula anfitriona in vivo, ex vivo, o in vitro, en una cantidad eficaz. Los medios in vitro y ex vivo para poner en contacto las células anfitrionas se proporcionan más abajo. Cuando se ponen en práctica in vivo, los métodos de administración de un fármaco que contiene un vector de esta invención, son bien conocidos en la técnica e incluyen pero no están limitados a, la administración oral, intra-tumoral, intravenosa, intramuscular o intraperitoneal. La administración se puede efectuar continuamente o intermitentemente y variará con el sujeto y la condición que se vaya a tratar, p. ej., en el caso de otras composiciones terapéuticas (Landmann et al. (1992); Aulitzky et al. (1991); Lantz et al. (1990); Supersaxo et al. (1988); Demetri et al. (1989); y LeMaistre et al. (1991)).

Adicionalmente esta invención proporciona una célula anfitriona procariótica o eucariótica transformada, por ejemplo una célula animal o una célula de mamífero, que tiene insertado un vector de expresión de adenovirus recombinante descrito antes. Las células procarióticas adecuadas incluyen pero no están limitadas a células bacterianas tales como células de E. coli. Los métodos de transformación de células anfitrionas con vectores retrovirales son conocidos en la técnica, véase Sambrook et al. (1989) e incluyen, pero no están limitados a transfección, electroporación, y microinyección.

Según se utiliza en toda esta solicitud, se pretende que el término animal sea sinónimo de mamífero e incluya, pero no esté limitado a bovino, porcino, felino, simio, canino, equino, murino, ratas o seres humano. Las células anfitrionas adicionales incluyen pero no están limitadas a cualquier célula neoplásica o tumoral, tal como osteosarcoma, carcinoma ovárico, carcinoma de mama, melanoma, hepatocarcinoma, cáncer de pulmón, cáncer de cerebro, cáncer colorrectal, de células hematopoyéticas, cáncer de próstata, carcinoma cervical, retinoblastoma, carcinoma esofágico, cáncer de vejiga, neuroblastoma, o cáncer renal.

Adicionalmente, cualquier línea celular eucariótica capaz de expresar E1a y E1b o E1a, E1b y pIX es un anfitrión adecuado para este vector. En una realización, una célula anfitriona eucariótica adecuada es la línea celular 293 asequible de la Colección de Cultivos Tipo Americana, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, EEUU. 20231.

Cualquiera de las células anfitrionas transformadas descritas en la presente memoria es útil como composición para la diagnosis o la terapia. Cuando se utilizan farmacéuticamente, se pueden combinar con diversos portadores farmacéuticamente aceptables. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados son bien conocidos por los expertos en la técnica y son, por ejemplo, los descritos antes. Las composiciones se pueden administrar después terapéuticamente o profilácticamente, en cantidades eficaces, descritas con más detalle más abajo.

También se proporciona un método de transformación de una célula anfitriona. Este método estipula poner en contacto una célula anfitriona, esto es, una célula anfitriona procariótica o eucariótica, con cualquiera de los vectores de expresión descritos en la presente memoria y en condiciones adecuadas. El contacto se puede efectuar in vitro, in vivo, o ex vivo, utilizando métodos bien conocidos en la técnica (Sambrook et al. (1989)) y utilizando cantidades eficaces de los vectores de expresión. También se proporciona en esta invención un método de producción de una proteína o polipéptido recombinante haciendo crecer la célula anfitriona transformada en condiciones adecuadas que favorezcan la transcripción y la traducción del gen foráneo insertado. Los métodos de expresión recombinante en una variedad de células anfitrionas, tales como células de mamífero, levadura, insecto o bacterianas, son ampliamente conocidos, incluyendo los descritos por Sambrook et al., supra. El gen foráneo traducido se puede aislar después mediante métodos convencionales, tales como la purificación en columna o la purificación utilizando un anticuerpo anti-proteína. También se pretende que la proteína o polipéptido aislado estén dentro del alcance de esta invención. Según se utiliza en la presente memoria, purificado o aislado significa sustancialmente libre de proteínas o ácidos nucleicos nativos normalmente asociados con la proteína o polipéptido en el entorno nativo o de la célula anfitriona.

También son proporcionados por esta invención los animales no humanos que tienen insertados los vectores de expresión o las células anfitrionas transformadas de esta invención. Estos animales "transgénicos" se elaboran utilizando métodos bien conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5.175.384 o mediante técnicas de terapia ex vivo convencionales, como describen Culver et al. (1991).

Como se muestra con detalle más abajo, los adenovirus recombinantes que expresan una p53 de tipo salvaje supresora de tumores, como se ha descrito antes, pueden inhibir eficazmente la síntesis de ADN y suprimir el crecimiento de una amplia gama de tipos celulares tumorales humanos, incluyendo dianas clínicas. Además, los adenovirus recombinantes pueden expresar genes de supresión de tumores tales como p53 en un tumor establecido in vivo sin contar con la inyección directa en el tumor o el tratamiento ex vivo previo de las células cancerosas. La p53 expresada es funcional y suprime eficazmente el crecimiento tumoral in vivo y aumenta significativamente el tiempo de supervivencia en un modelo de ratón carente de sistema inmunitario de cáncer de pulmón humano.

De este modo, los vectores de esta invención son particularmente adecuados para la terapia génica. Por consiguiente, los métodos de terapia génica que utilizan estos vectores están dentro del alcance de esta invención. El vector se purifica y después se administra una cantidad eficaz in vivo o ex vivo al sujeto. Los métodos de la terapia génica son bien conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Larrick, J.W. y Burck, K.L. (1991) y Kreigler, M. (1990). "Sujeto" representa cualquier animal, mamífero, rata, murino, bovino, porcino, equino, canino, felino o paciente humano. Cuando el gen foráneo codifica un gen supresor de tumores u otra proteína anti-tumoral, el vector es útil para tratar o reducir las células hiperproliferativas en un sujeto, para inhibir la proliferación tumoral en un sujeto o para aliviar una patología afín concreta. Las células hiperproliferativas patológicas son características de los siguientes estados de enfermedad, hiperplasia tiroidea - Enfermedad de Grave, psoriasis, hipertrofia prostática benigna, síndrome Li-Fraumeni incluyendo cáncer de mama, sarcomas y otros neoplasmas, cáncer de vejiga, cáncer de colon, cáncer de pulmón, diversas leucemias y linfomas. Los ejemplos de las células hiperproliferativas no patológicas se encuentran, por ejemplo, en las células epiteliales de los conductos mamarios durante el desarrollo de la lactancia y también en células asociadas con la reparación de heridas. Las células hiperproliferativas patológicas muestran característicamente pérdida de inhibición de contacto y un descenso de su capacidad para adherirse selectivamente que implica un cambio en las propiedades de la superficie de la célula y una interrupción adicional en la comunicación intercelular. Estos cambios incluyen la estimulación de la división y la capacidad para secretar enzimas proteolíticas.

Se pretende que el término "tumorigenicidad reducida" represente células tumorales que han sido convertidas en células menos tumorigénicas o no tumorigénicas. Las células con una tumorigenicidad reducida no forman tumores in vivo o presentan un lapso de tiempo prolongado de semanas a meses antes de la aparición de crecimiento tumoral in vivo y/o una masa tumoral tridimensional de crecimiento más lento en comparación con los tumores que tienen genes supresores de tumores totalmente inactivados o no funcionales.

Según se utiliza en la presente memoria, se pretende que el término "cantidad eficaz" represente la cantidad de vector o proteína anti-cancerosa que logra un resultado positivo sobre el control de la proliferación celular. Por ejemplo, una dosis contiene de aproximadamente 10^{8} a aproximadamente 10^{13} unidades infecciosas. El curso de tratamiento típico sería una de tales dosis al día a lo largo de un período de cinco días. La cantidad eficaz variará con la patología o la condición a tratar, el paciente y su estatus, y otros factores bien conocidos por los expertos en la técnica. Las cantidades eficaces son fácilmente determinadas por los expertos en la técnica.

También está dentro del alcance de esta invención el uso de los vectores de la invención en un método de tratamiento del cáncer de vejiga en un sujeto.

Esta invención también proporciona el uso de los vectores de la invención en un método para reducir la proliferación de las células tumorales de vejiga en un sujeto.

Como en el uso de los genes supresores de tumores descritos previamente, el uso de otros genes anti-tumorales, ya sea solos o combinados con el agente terapéutico apropiado, proporciona un tratamiento del crecimiento o proliferación celular incontrolados característicos de tumores y malignidades. De este modo, esta invención hace referencia a una terapia para detener el crecimiento celular incontrolado en el paciente con cáncer de vejiga, aliviando de ese modo los síntomas de la enfermedad o la caquexia presentes en el paciente. El efecto de este tratamiento incluye, pero no está limitado a, prolongación del tiempo de supervivencia del paciente, reducción de la masa o carga tumoral, apoptosis de las células tumorales o reducción del número de células tumorales circulantes. Los medios para cuantificar los efectos beneficiosos de esta terapia son bien conocidos por los expertos en la técnica.

El método de liberación específica del tumor de un gen supresor de tumores se completa poniendo en contacto el tejido diana de un animal con una cantidad eficaz del vector de expresión adenoviral recombinante de esta invención. El gen está destinado a codificar un agente anti-tumoral, tal como un gen supresor de tumores funcional. Se pretende que "poner en contacto" abarque cualquier método de liberación para la transferencia eficaz del vector, tal como la inyección intratumoral.

El uso del vector adenoviral de esta invención para preparar medicamentos para el tratamiento del cáncer de vejiga o para la terapia del mismo es proporcionado adicionalmente por esta invención.

\vskip1.000000\baselineskip

Experimento núm. I

Se utilizó el plásmido pAd/MLP/p53/E1b- como material de partida para estas manipulaciones. Este plásmido se basa en el derivado de pBR322 pML2 (pBR322 con los pares de bases 1140 a 2490 suprimidos) y contiene secuencias de adenovirus de tipo 5 que se extienden desde el par de bases 1 al par de bases 5788 excepto que se han suprimido los pares de bases 357 a 3327 del adenovirus de tipo 5. En el sitio de la deleción 357/3327 de Ad5 se inserta una unidad transcripcional que está comprendida por el promotor tardío principal de adenovirus de tipo 2, el ADNc líder tripartito del adenovirus de tipo 2 y el ADNc de p53 humano. Este es un vector de sustitución de E1 típico con los genes E1a y E1b de Ad5 suprimidos pero que contiene el gen de la proteína IX de Ad5 (para una revisión de los vectores de Adenovirus véase: Graham y Prevec (1992)). El ADN de Ad2 se obtuvo de Gibco BRL. Las endonucleasas de restricción y la ADN ligasa de T4 se obtuvieron de New England Biolabs. Las células E. coli DH5\alpha competentes se adquirieron de Gibco BRL y las células 293 se obtuvieron de la Colección de Cultivos Tipo Americana (ATCC). La resina de purificación de ADN Prep-A-Gene se obtuvo de BioRad. El medio de crecimiento bacteriano LB se obtuvo de Difco. Las columnas de purificación de ADN Qiagen se obtuvieron de Qiagen, Inc. Ad5 d1327 se obtuvo de R.J. Schneider, NYU. El kit de transfección de ADN MBS se adquirió de Stratagene.

Se digirió un (1) \mug de pAd/MLP/p53/E1b- con 20 unidades de cada una de las enzimas de restricción Ecl 136II y NgoMI de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Se digirieron cinco (5) \mug de ADN de Ad2 con 20 unidades de cada una de las endonucleasas de restricción DraI y NgoMI de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Las digestiones de restricción se cargaron en calles separadas de un gel de agarosa al 0,8% y se sometieron a electroforesis a 100 voltios durante 2 horas. El fragmento de restricción de 4268 pb de la muestra de Pad/MLP/p53/E1b- y el fragmento de 6437 pb de la muestra de Ad2 se aislaron del gel utilizando la resina de extracción de ADN Prep-A-Gene de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Los fragmentos de restricción se mezclaron y trataron con ADN ligasa de T4 en un volumen total de 50 \mul a 16ºC durante 16 horas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. Después de la ligación se utilizaron 5 \mul de la reacción para transformar las células de E. coli DH5\alpha para la resistencia a la ampicilina siguiendo el procedimiento del fabricante. Se utilizaron seis colonias bacterianas resultantes de este procedimiento para inocular cultivos de 2 ml separados del medio de crecimiento LB y se incubaron durante la noche a 37ºC con sacudimiento. Se preparó el ADN a partir de cada cultivo bacteriano utilizando procedimientos convencionales (Sambrook et al. (1989)). Un cuarto del ADN plasmídico de cada producto aislado se digirió con 20 unidades de la endonucleasa de restricción XhoI para escrutar en busca del recombinante correcto que contenía los fragmentos de restricción XhoI de 3627, 3167, 2466 y 1445 pares de bases. Cinco de los seis productos aislados escrutados contenían el plásmido correcto. Después se utilizó uno de estos para inocular un cultivo de 1 litro de medio LB para el aislamiento de grandes cantidades de ADN plasmídico. Después de la incubación durante la noche el ADN plasmídico se aisló de un cultivo de 1 litro utilizando columnas de purificación de ADN Qiagen de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El plásmido resultante se denominó Pad/MLP/p53/PIX-. Las muestras de este plásmido se depositaron en la Colección de Cultivos Tipo Americana, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, EEUU, 12301, el 22 de Octubre de 1993. El depósito se realizó bajo las estipulaciones del Tratado de Budapest sobre el Depósito Internacional de Microorganismos con el Propósito del Procedimiento de Patentes. Al depósito se le otorgó el Núm. de Acceso ATCC 75576.

Para construir un adenovirus recombinante, se trataron 10 \mug de Pad/MLP/p53/PIX- con 40 unidades de la endonucleasa de restricción EcoRI para linealizar el plásmido. Se digirió el ADN del adenovirus de tipo 5 d1327 (Thimmappaya (1982)) con la endonucleasa de restricción ClaI y el fragmento grande (aproximadamente 33 kilopares de bases) se purificó mediante centrifugación en gradiente de sacarosa. Se mezclaron diez (10) \mug de Pad/MLP/p53/E1b- tratado con EcoRI y 2,5 \mug de Ad5 d1327 tratado con ClaI y se utilizaron para transfectar aproximadamente 10^{6} células 293 utilizando el kit de transfección de mamífero MBS como recomienda el proveedor. Ocho (8) días después de la transfección las células 293 se dividieron 1 a 3 en medio de nueva aportación y dos días después este adenovirus indujo un efecto citopático evidente en las células transfectadas. A los 13 días de la transfección se preparó ADN a partir de las células infectadas utilizando procedimientos convencionales (Graham y Prevec (1991)) y se analizó mediante digestión de restricción con la endonucleasa de restricción XhoI. La expresión de p53 dirigida por el virus fue verificada después de la infección de células de osteosarcoma SaoS2 con producto lisado viral e inmunotransferencia con anticuerpo monoclonal anti-p53 denominado 1801 (Novocasta Lab. Ltd., U.K.).

\vskip1.000000\baselineskip

Experimento núm. II

Materiales y métodos Líneas Celulares

Se hicieron crecer adenovirus recombinantes y se propagaron en la línea celular de riñón embrionario humano 293 (ATCC CRL 1573) mantenida en medio DME que contenía suero de ternera fetal al 10% (Hyclone) definido, como suplemento. Se mantuvieron las células Saos-2 en medio de Kaighn con un suplemento de suero de ternera fetal al 15%. Se mantuvieron células HeLa y Hep 3B en medio DME con un suplemento de suero de ternera fetal al 10%. Todas las demás líneas celulares se hicieron crecer en medio Kaighn con un suplemento de suero de ternera fetal al 10%. Las células Saos-2 fueron amablemente cedidas por el Dr. Eric Stanbridge. Todas las demás líneas celulares se obtuvieron de la ATCC.

Construcción de Adenovirus Recombinantes

Para construir los virus Ad5/p53, se aisló un fragmento HindIII-SmaI de 1,4 kb que contenía el ADNc completo de p53 (Tabla I) a partir pGEM1-p53-B-T (amablemente proporcionado por el Dr. Wen Hwa Lee) y se insertó en el sitio de clonación múltiple del vector de expresión pSP72 (Promega) utilizando procedimientos de clonación convencionales (Sambrook et al. (1989)). El inserto de p53 se recuperó a partir de este vector después de la digestión con XhoI-BglII y electroforesis en gel. La secuencia codificante de p53 se insertó después en vectores de transferencia génica de adenovirus pNL3C o pNL3CMV (amablemente proporcionados por el Dr. Robert Schneider) que contienen la repetición terminal invertida 5' de Ad5 y las señales de empaquetamiento virales y el intensificador aguas arriba de E1a del promotor tardío principal de Ad2 (MLP) o el promotor del gen temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV), seguido del ADNc líder tripartito y la secuencia de Ad5 de 3325-5525 pb en un fondo de PML2. Estos nuevos constructos sustituyen a la región E1 (pb 360-3325) de Ad5 con p53 dirigido por MLP de Ad2 (A/M/53) o el promotor de CMV humano (A/C/53), ambos seguidos por el ADNc líder tripartito (véase la Figura 4). Los insertos de p53 utilizan el sitio de poliadenilación de E1b aguas abajo restante. Se generaron recombinantes de p53 conducidos por MLP y CMV adicionales (A/M/N/53, A/C/N/53) que tenían una deleción de 705 nucleótidos adicional de la secuencia de Ad5 para eliminar la región codificante de la proteína IX (PIX). Como control, se generó un adenovirus recombinante a partir del plásmido pNL3C parental sin un inserto de p53 (A/M). Un segundo control consistió en un adenovirus recombinante que codificaba el gen de la beta-galactosidasa bajo el control del promotor de CMV (A/C/\beta-gal). Los plásmidos se linealizaron con Nru I o Eco RI y se co-transfectaron con mutantes d1309 o d1327 de Ad5 digerido con Cla I (Jones y Shenk (1979)) utilizando un kit de transfección Ca/PO_{4} (Stratagene). Las placas virales se aislaron y los recombinantes se identificaron mediante análisis con enzimas de restricción y PCR utilizando cebadores específicos recombinantes frente a la secuencia de ADNc líder tripartita con la secuencia de ADNc de p53 aguas abajo. El virus recombinante se purificó adicionalmente mediante dilución limitante, y las partículas del virus se purificaron y se titularon mediante métodos convencionales (Graham y van der Erb (1973); Graham y Prevec (1991)).

Detección de la Proteína p53

Se infectaron células Saos-2 o Hep 3B (5 x 10^{5}) con los adenovirus recombinantes indicados durante un período de 24 horas a multiplicidades de infección crecientes (MOI) de unidades de virus formadoras de placa/célula. Después las células se lavaron una vez con PBS y se recogieron en tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM pH 7,5, NaCl 250 Mm, NP40 al 0,1%, NaF 50 mM, EDTA 5 mM, 10 \mug/ml de aprotinina, 10 \mug/ml de leupeptina, y PMSF 1 mM). Se separaron las proteínas celulares (aproximadamente 30 \mug) mediante SDS-PAGE al 10% y se transfirieron a nitrocelulosa. Las membranas se incubaron con anticuerpo \alpha-p53 PAb 1801 (Novocastro) seguido de IgG anti-ratón de oveja conjugada con peroxidasa de rábano picante. La proteína p53 se visualizó mediante quimioluminiscencia (kit ECL, Amersham) sobre una película Kodak XAR-5.

Medida de la Velocidad de Síntesis del ADN

Las células (5 x 10^{3}/pocillo) se cultivaron en placa en placas de titulación de 96 pocillos (Costar) y se dejó que se fijaran durante la noche (37ºC, CO_{2} al 7%). Después las células se infectaron durante 24 horas con partículas de virus recombinante purificadas a MOI que oscilaban de 0,3 a 100 según se indica. Los medios se cambiaron 24 horas después de la infección, y la incubación continuó durante un total de 72 horas. Se añadió timidina-H^{3} (Amersham, 1 \muCi/pocillo) 18 horas antes de la cosecha. Las células se recogieron sobre filtros de fibra de vidrio y se midieron los niveles de radiactividad en un contador de centelleo beta. La incorporación de timidina-H^{3} se expresó como el % de la media (+/- DT) de control del medio y se trazó frente a la MOI.

Tumorigenicidad en Ratones Carentes de Sistema Inmunitario

Se trataron aproximadamente 2,4 x 10^{8} células Saos-2, cultivadas en placa en matraces T225, con tampón de suspensión (sacarosa al 1% en PBS) que contenía virus purificado A/M/N/53 o A/M a una MOI de 3 o 30. Después de infectar durante la noche, las células se inyectaron subcutáneamente en los flancos izquierdo y derecho de ratones atímicos carentes de sistema inmunitario BALB/c (4 ratones por grupo). En un flanco se inyectaron las células tratadas con A/M/N/53, mientras en el flanco contralateral se inyectaron las células tratadas con A/M de control, sirviendo cada ratón como su propio control. Los animales que recibieron la inyección bilateral de células tratadas con tampón sirvieron como controles adicionales. Después se midieron las dimensiones del tumor (longitud, anchura y altura) y los pesos corporales dos veces por semana a lo largo de un período de 8 semanas. Se estimaron los volúmenes de los tumores para cada animal suponiendo una geometría esférica con un radio igual a la mitad de la media de las dimensiones tumorales medidas.

Análisis del ARN Intra-tumoral

Se inyectaron subcutáneamente 1 x 10^{7} células de carcinoma de pulmón de células pequeñas (SCLC) H69 en ratones atímicos carentes de sistema inmunitario BALB/c (aproximadamente 5 semanas de edad) en sus flancos derechos. Se dejó que los tumores progresaran durante 32 días hasta que tuvieron aproximadamente 25-50 mm^{3}. Los ratones recibieron inyecciones peritumorales de adenovirus recombinante A/C/53 o A/C/\beta-gal (2 x 10^{9} unidades formadoras de placa (pfu)) en el espacio subcutáneo por debajo de la masa tumoral. Los tumores se extirparon de los animales a los 2 y 7 días del tratamiento con adenovirus y se enjuagaron con PBS. Las muestras tumorales se homogeneizaron, y se aisló el ARN total utilizando un kit TriReagent (Molecular Research Center, Inc.). Se aisló el ARN poliA utilizando el PolyATract mRNA Isolation System (Promega), y se utilizaron aproximadamente 10 ng de muestra para la determinación mediante RT-PCR de la expresión del ARNm de p53 recombinante (Wang et al. (1989)). Se diseñaron cebadores para amplificar la secuencia entre el ADNc líder tripartito de adenovirus y el ADNc de p53 aguas abajo, asegurándose de que solamente se podía amplificar el p53 recombinante, y no el endógeno.

Terapia con el Gen p53 de Tumores Establecidos en Ratones Carentes de Sistema Inmunitario

Se inyectaron subcutáneamente aproximadamente 1 x 10^{7} células tumorales H69 (SCLC) en volúmenes de 200 \mul en ratones hembra atímicos carentes de sistema inmunitario BALB/c. Se dejó que los tumores se desarrollaran durante 2 semanas, en cuyo momento los animales se aleatorizaron por el tamaño del tumor (N=5/grupo). Las inyecciones peritumorales de adenovirus A/M/N/53 o A/M de control (2 x 10^{9} pfu/inyección) o tampón solo (sacarosa en PBS al 1%) se administraron dos veces por semana durante un total de 8 dosis/grupo. Se midieron las dimensiones de los tumores y los pesos corporales dos veces por semana durante 7 semanas, y se estimó el volumen del tumor como se ha descrito previamente. Después se hizo un seguimiento de los animales para observar el efecto del tratamiento sobre la supervivencia de los ratones.

Resultados Construcción de Adenovirus con p53 Recombinante

Se construyeron adenovirus con p53 remplazando una porción de la región E1a y E1b del adenovirus de Tipo 5 por ADNc de p53 bajo el control del promotor MLp de Ad2 (A/M/53) o CMV (A/C/53) (esquematizado en la Figura 4). Esta sustitución de E1 deteriora gravemente la capacidad de replicar de los adenovirus recombinantes, restringiendo su propagación a las células 293 que suministran productos génicos de E1 de Ad 5 en trans (Graham et al. (1977)). Después de la identificación de adenovirus recombinante con p53 mediante digestión con enzimas de restricción y análisis PCR, se secuenció el ADNc de p53 completo a partir de uno de los adenovirus recombinantes (A/M/53) para verificar que estaba libre de mutaciones. Después de esto, se utilizaron las preparaciones purificadas de los recombinantes con p53 para infectar células HeLa para analizar la presencia de adenovirus de tipo fenotípicamente salvaje. Las células HeLa, que no permiten la replicación de adenovirus con E1 suprimida, se infectaron con 1-4 x 10^{9} unidades infecciosas de adenovirus recombinante, se cultivaron durante 3 semanas, y se observaron en cuanto a la aparición de efecto citopático (CPE). Utilizando este análisis, no se detectó replicación de adenovirus recombinante o contaminación de tipo salvaje, fácilmente evidente por el CPE observado en las células de control infectadas con adenovirus de tipo salvaje a un nivel de sensibilidad de aproximadamente 1 en 10^{9}.

Expresión de la Proteína p53 a partir de Adenovirus Recombinante

Para determinar si los adenovirus con p53 recombinantes expresaban la proteína p53, se infectaron líneas celulares tumorales que no expresaban la proteína p53 endógena. Las líneas celulares tumorales humanas Saos-2 (osteosarcoma) y Hep 3B (carcinoma hepatocelular) se infectaron durante 24 horas con los adenovirus recombinantes para p53 A/M/53 o A/C/53 a MOI que oscilaban de 0,1 a 200 pfu/célula. El análisis Western de los productos lisados preparados a partir de las células infectadas demostraron una expresión de la proteína p53 dependiente de la dosis en ambos tipos de células (Figura 5). Ambas líneas celulares expresaron niveles de proteína p53 más elevados después de la infección con A/C/53 que con A/M/53 (Figura 3). No se detectó proteína p53 en células no infectadas. Los niveles de p53 de tipo salvaje endógena son normalmente bastante bajos, y casi indetectables mediante análisis Western de los extractos celulares (Bartek et al. (1991)). Sin embargo está claro que los niveles de proteína p53 de tipo salvaje son fácilmente detectables después de la infección con A/M/53 o A/C/53 a MOI inferiores (Figura 5), sugiriendo que incluso dosis bajas de adenovirus recombinantes para p53 pueden producir niveles potencialmente eficaces de p53.

Cambios de Morfología Dependientes de p53

La reintroducción de p53 de tipo salvaje en la línea celular de osteosarcoma negativa para p53, Saos-2, da como resultado un agrandamiento y aplanamiento característicos de estas células normalmente con forma de huso (Chen et al. (1990)). Las células Saos-2 subconfluentes (1x10^{5} células/placa de 10 cm) se infectaron una MOI de 50 con el virus A/C/53 o A/M de control, y se incubaron a 37ºC durante 72 horas hasta que las placas de control no infectadas fueron confluentes. En este punto, el cambio de morfología esperado fue evidente en la placa tratada con A/C/53 (Figura 6, panel C) pero no en las placas no infectadas (Figura 6, panel A) o infectadas con el virus de control (Figura 6, panel B). Este efecto no era una función de la densidad celular puesto que una placa de control sembrada inicialmente a una densidad más baja conservó la morfología normal a las 72 horas cuando su confluencia se aproximó a la de la placa tratada con A/C/53. Los resultados previos han demostrado un elevado nivel de expresión de la proteína p53 a una MOI de 50 en células Saos-2 (Figura 5A), y estos resultados proporcionaron la evidencia de que la proteína p53 expresada por estos adenovirus recombinantes era biológicamente activa.

Inhibición por p53 de la Síntesis de ADN Celular

Para someter a ensayo adicionalmente la actividad de los adenovirus recombinantes para p53, se analizó su capacidad para inhibir la proliferación de las células tumorales humanas medida mediante la absorción de timidina-H^{3}. Se ha demostrado previamente que la introducción de p53 de tipo salvaje en células que no expresan p53 de tipo salvaje endógena puede detener las células en la transición G_{1}/S, conduciendo a la inhibición de la absorción de timidina marcada en el ADN recién sintetizado (Baker et al. (1990); Mercer et al. (1990); Diller et al. (1990)). Se infectaron una variedad de líneas celulares tumorales carentes de p53 con A/M/N/53, A/C/N/53 o un adenovirus recombinante de control que no expresaba p53 (A/M). Se observó una fuerte inhibición dependiente de la dosis de la síntesis de ADN por los recombinantes tanto A/M/N/53 como A/C/N/53 en 7 de las 9 líneas celulares tumorales diferentes sometidas a ensayo (Figura 7). Ambos constructos fueron capaces de inhibir la síntesis de ADN en estas células tumorales humanas, con independiencia de si expresaban p53 mutante o no lograban expresar la proteína p53. También se encontró que en este análisis, el constructo A/C/N/53 era sistemáticamente más potente que A/M/N/53. En las células saos-2 (osteosarcoma) y MDA-MB468 (cáncer de mama), se logró casi el 100% de inhibición de la síntesis de ADN con el constructo A/C/N/53 a una MOI tan baja como 10. A las dosis en las que la inhibición por el adenovirus de control era solamente del 10-30%, se observó una reducción del 50-100% en la síntesis de ADN utilizando cualquier adenovirus recombinante para p53. En contraste, no se observó un efecto específico de p53 significativo con ningún constructo en comparación con el virus de control en células HEP G2 (línea celular de hepatocarcinoma que expresa p53 de tipo salvaje endógena, Bressac et al. (1990)), ni en la línea celular leucémica K562 (p53 nula).

Tumorigenicidad en Ratones Carentes de Sistema Inmunitario

En un ensayo más riguroso de la función para adenovirus recombinantes para p53, se infectaron las células tumorales ex vivo y después se inyectaron las células en ratones carentes de sistema inmunitario para evaluar la capacidad de los recombinantes para suprimir el crecimiento tumoral in vivo. Las células Saos-2 infectadas con virus A/M/N/53 o control A/M a una MOI de 3 o 30, fueron inyectadas en flancos opuestos de los ratones carentes de sistema inmunitario. Después se midieron los tamaños de los tumores dos veces a la semana a lo largo de un período de 8 semanas. A una MOI de 30, no se observó crecimiento del tumor en los flancos tratados con p53 de ninguno de los animales, mientras los tumores tratados con el control continuaron creciendo (Figura 8). El progresivo agrandamiento de los tumores tratados con el virus de control fue similar al observado en los animales de control tratados con tampón. Una clara diferencia en el crecimiento del tumor entre el adenovirus de control y el recombinante para p53 a una MOI de 3, aunque 2 de los 4 tumores de los ratones tratados con p53 comenzaron a mostrar cierto crecimiento después de aproximadamente 6 semanas. De este modo, el adenovirus recombinante A/M/N/53 es capaz de mediar la supresión tumoral específica de p53 en un entorno in vivo.

Expresión In Vivo de Ad/p53

Aunque el tratamiento ex vivo de las células cancerosas y su posterior inyección en los animales proporcionó un ensayo crítico de supresión tumoral, un experimento clínicamente más relevante consiste en determinar si el adenovirus recombinante para p53 inyectado podía infectar y expresar p53 en tumores establecidos in vivo. Para estudiar esto, se inyectaron células H69 (SCLC, p53^{nula}) subcutáneamente en ratones carentes de sistema inmunitario, y se dejó que los tumores se desarrollaran durante 32 días. En este momento, se inyectó una única inyección de 2 x 10^{9} pfu de adenovirus A/C/53 o A/C/\beta-gal en el espacio peritumoral que rodeaba el tumor. Después los tumores fueron extirpados el Día 2 o el Día 7 después de la inyección del adenovirus, y se aisló el ARN poliA de cada tumor. Luego se utilizó la RT-PCR, empleando cebadores específicos de p53 recombinante, para detectar el ARNm de p53 en los tumores tratados con p53 (Figura 9, calles 1,2,4,5). No hubo señal evidente de p53 de los tumores extirpados de los animales tratados con \beta-gal (Figura 9, calles 3 y 6). La amplificación con cebadores de actina sirvió como control para la reacción de RT-PCR (Figura 9, calles 7-9), mientras un plásmido que contenía la secuencia de p53 recombinante sirvió como control positivo para la banda específica de p53 recombinante (Figura 9, calle 10). Este experimento demuestra que un adenovirus recombinante para p53 puede dirigir específicamente la expresión del ARNm de p53 en tumores establecidos después de una única inyección en el espacio peritumoral. También demuestra la persistencia viral in vivo durante al menos una semana después de la inyección con un adenovirus recombinante para p53.

Eficacia In Vivo

Para estudiar la fiabilidad de la terapia génica de los tumores establecidos, se utilizó un modelo de ratón carente de sistema inmunitario portador de tumor. Se inyectaron células H69 en el espacio subcutáneo del flanco derecho de los ratones, y se dejó que los tumores crecieran durante 2 semanas. Después los ratones recibieron inyecciones peritumorales de tampón o virus recombinante dos veces a la semana durante un total de 8 dosis. En los ratones tratados con tampón o virus A/M de control, los tumores continuaron creciendo rápidamente durante todo el tratamiento, mientras aquellos tratados con el virus A/M/N/53 crecieron a una velocidad enormemente reducida (Figura 10A). Una vez que cesaron las inyecciones, los tumores tratados con el control continuaron creciendo mientras los tumores tratados con p53 mostraron un crecimiento pequeño o nulo durante al menos una semana en ausencia de cualquier suministro adicional de p53 exógena (Figura 10A). Aunque los animales de control tratados con tampón solo tuvieron un crecimiento acelerado del tumor en comparación con cualquier grupo tratado con virus, no se encontró ninguna diferencia significativa en el peso corporal entre los tres grupos durante el período de tratamiento. La ulceración del tumor en algunos animales limitó la relevancia de las medidas de los tamaños de los tumores después del día 42. Sin embargo, el control continuo de los animales para determinar el tiempo de supervivencia demostró una ventaja de supervivencia para los animales tratados con p53 (Figura 10B). El último de los animales tratados con adenovirus de control murió el día 83, mientras los controles tratados con tampón solo habían expirado todos el día 56. En contraste, los 5 animales tratados con A/M/N/53 seguían vivos (día 130 después de la inoculación de las células) (Figura 10B). Juntos, estos datos establecen un efecto específico de p53 tanto sobre el crecimiento tumoral como sobre el tiempo de supervivencia en animales con tumores carentes de p53 establecidos.

Vectores de Adenovirus que Expresan p53

Se construyeron vectores de adenovirus humanos recombinante que son capaces de expresar elevados niveles de proteína p53 de tipo salvaje de una manera dependiente de la dosis. Cada vector contiene deleciones en las regiones E1a y E1b que lo convierten en deficiente para la replicación del virus. Cada vector contiene deleciones en las regiones E1a y E1b que convierten al virus en deficiente para la replicación (Challberg y Kelly (1979); Horowitz, (1991)). Tiene una trascendencia adicional que estas deleciones incluyan aquellas secuencias que codifican la proteína de 19 y 55 kd de E1b. Se ha informado de que la proteína de 19 kd está implicada en la inhibición de la apoptosis (White et al. (1992); Rao et al. (1992)), mientras la proteína de 55 kd es capaz de unirse a la proteína p53 de tipo salvaje (Sarnow et al. (1982); Heuvel et al. (1990)). Suprimiendo estas secuencias adenovirales, se separaron inhibidores potenciales de la función de p53 por medio de la unión directa a p53 o la inhibición potencial de la apoptosis mediada por p53. Se elaboraron constructos adicionales que tenían la secuencia de E1b 3' restante, incluyendo toda la secuencia codificante de la proteína IX, también suprimida. Aunque esto ha sido referido para reducir la capacidad del tamaño de empaquetamiento de adenovirus a aproximadamente 3 kb menos que el virus de tipo salvaje (Ghosh-Choudhury et al. (1987)), estos constructos también son suprimidos en la región E3 de manera que los constructos A/M/N/53 y A/C/N/53 están en este intervalo de tamaños. Suprimiendo la región pIX, se reducen las secuencias adenovirales homólogas a las contenidas en las células 293 a aproximadamente 300 pares de bases, disminuyendo las oportunidades de regenerar el adenovirus de tipo salvaje, de replicación competente por medio de la recombinación. Los constructos que carecen de secuencia codificante de pIX parecen tener una eficacia igual a aquellos con pIX.

\vskip1.000000\baselineskip

Eficacia de p53/Adenovirus In Vitro

De acuerdo con una fuerte dependencia de la dosis para la expresión de la proteína p53 en células infectadas, se demostró una inhibición del crecimiento de las células tumorales específica de p53, dependiente de la dosis. Se inhibió la división celular, y se demostró mediante la inhibición de la síntesis de ADN, en una amplia variedad de tipos de células tumorales conocidas por carecer de expresión de la proteína p53 de tipo salvaje. Bacchetti y Graham (1993) informaron recientemente de la inhibición específica por p53 de la síntesis de ADN en la línea celular de carcinoma ovárico SKOV-3 por un adenovirus recombinante para p53 en experimentos similares. Además del carcinoma ovárico, se demostró que en líneas celulares tumorales humanas adicionales, representativas de cánceres humanos clínicamente importantes y que incluían líneas que expresaban al alza la proteína p53 mutante, también se podía inhibir el crecimiento por medio de los recombinantes de p53 de esta invención. A las MOI en las que el recombinante A/C/N/53 es eficaz en un 90-100% al inhibir la síntesis de ADN en estos tipos de tumores, la supresión mediada por el adenovirus de control es menor de 20%.

Aunque Feinstein et al. (1992) informaron de que la re-introducción de p53 de tipo salvaje podía inducir la diferenciación e incrementar la proporción de células en G_{1} versus S+G_{2} para las células K562 leucémicas, no se encontró un efecto específico de p53 en esta línea. Horvath y Weber (1988) han informado de que los linfocitos de sangre periférica humana son muy poco permisivos a la infección por adenovirus. En experimentos separados, el recombinante infectaba significativamente las células K562 que no respondían con adenovirus A/C/\beta-gal recombinante, mientras otras líneas celulares, incluyendo la línea Hep G2 de control y aquellas que mostraban un fuerte efecto de p53, fueron fácilmente infectables. De este modo, al menos parte de la variabilidad de la eficacia parecía deberse a la variabilidad de infección, aunque también podían estar implicados otros factores.

Los resultados observados con el virus A/M/N/53 en la Figura 8 demuestran que la supresión completa es posible en un entorno in vivo. La reanudación del crecimiento tumoral en 2 de los 4, animales tratados con p53 a la MOI más baja resultó muy probablemente de un pequeño porcentaje de células no infectadas inicialmente con el recombinante de p53 a esta dosis. La supresión completa observada con A/M/N/53 a la dosis más alta, sin embargo, demuestra que la capacidad de recuperación del crecimiento tumoral puede ser superada.

\vskip1.000000\baselineskip

Eficacia de p53/Adenovirus In Vivo

El trabajo presentado aquí y por otros grupos (Chen et al. (1990); Takahashi et al. (1992)) ha demostrado que las células tumorales humanas que carecen de expresión de p53 de tipo salvaje pueden ser tratadas ex vivo con p53 y producir la supresión del crecimiento tumoral cuando las células tratadas son transferidas a un modelo animal. Los solicitantes presentan la primera evidencia de terapia génica supresora de tumores de un tumor establecido in vivo, dando como resultado tanto la supresión del crecimiento tumoral como el incremento del tiempo de supervivencia. En el sistema de los solicitantes, la liberación para las células tumorales no dependía de la inyección directa en la masa tumoral. En vez de eso, el adenovirus recombinante para p53 fue inyectado en el espacio peritumoral, y la expresión del ARNm de p53 fue detectada en el tumor. La p53 expresada por los recombinantes era funcional y suprimía fuertemente el crecimiento tumoral en comparación con el de los tumores tratados con adenovirus que no expresaba p53, de control. Sin embargo, los grupos de tumores tratados tanto con virus con p53 como de control mostraron supresión de los tumores en comparación con los controles tratados con tampón. Se ha demostrado que la expresión local del factor de necrosis tumoral (TNF), interferón-\gamma), la interleuquina (IL)-2, IL-4 o IL-7 puede conducir a una supresión transitoria del tumor independiente de las células T en ratones carentes de sistema inmunitario (Hoch et al. (1992)). La exposición de monocitos a viriones de adenovirus también es un débil inductor de IFN-\alpha/\beta (revisado por Gooding y Wold (1990)). Por lo tanto, no es sorprendente que se observara cierta supresión tumoral en ratones carentes de sistema inmunitario incluso con el adenovirus de control. Esta supresión tumoral mediada por virus no se observó en las células tumorales Saos-2 tratadas con el virus de control ex vivo descritas antes. La supresión tumoral in vivo específica de p53 fue espectacularmente demostrada por el control continuado de los animales en la Figura 10. El tiempo de supervivencia de los ratones tratados con p53 aumentó significativamente, con 5 de los 5 animales todavía vivos más de 130 días después de la inoculación celular en comparación con 0 de 5 animales tratados con adenovirus de control. Los animales supervivientes todavía muestran tumores en crecimiento que pueden reflejar células no infectadas inicialmente con el adenovirus recombinante para p53. Se pueden aplicar a esto programas de dosificaciones más altas o más frecuentes. Además, el aislamiento del promotor (Palmer et al. (1991)) o mutaciones adicionales pueden volver resistentes estas células al tratamiento con adenovirus recombinante para p53. Por ejemplo, las mutaciones en el gen WAF1 recientemente descrito, un gen inducido por p53 de tipo salvaje que inhibe con posterioridad el progreso del ciclo celular a la fase S, (El-Deiry et al. (1993); Hunter (1993)) podría dar como resultado un tumor resistente a p53.

\newpage

Experimento núm. III

Este Ejemplo muestra el uso de genes suicidas y la expresión específica de tejidos de tales genes en los métodos de terapia génica descritos en la presente memoria. Se eligió el carcinoma hepatocelular como diana debido a que es una de las malignidades humanas más comunes que afectan a los hombres, causando 1.250.000 muertes estimadas por año en todo el mundo. La incidencia de este cáncer es muy alta en el Sureste Asiático y África donde se asocia con la infección por hepatitis B y C y la exposición a la aflatoxina. Actualmente la cirugía es el único tratamiento que ofrece el potencial de curar el HCC, aunque menos del 20% de los pacientes se consideran candidatos para la resección (Ravoet C. et al., 1993). No obstante, los tumores distintos del carcinoma hepatocelular son igualmente aplicables a los métodos de reducción de su proliferación descritos en la presente memoria.

Líneas celulares

Todas las líneas celulares excepto la línea celular HLF fueron obtenidas de la Colección de Cultivos Tisulares Tipo Americana (ATCC) 12301 Parklawn Drive, Rockville Maryland. Los números de acceso de la ATCC se indican entre paréntesis. La línea de células de riñón embrionarias humanas 293 (CRL 1573) se utilizó para generar y propagar los adenovirus recombinantes descritos en la presente memoria. Se mantuvieron en medio DME con un suplemento de suero de ternera definido al 10% (Hyclone). Las líneas de carcinoma hepatocelular Hep 3B (HB 8064), Hep G2 (HB 8065), y HLF se mantuvieron en medio DME/F12 con un suplemento de suero bovino fetal al 10%, como lo fueron las líneas celulares de carcinoma de mama MDA-MB468 (HTB 132) y BT-549 (HTB 122). Se hicieron crecer células de hígado de Chang (CCL 13) en medio MEM con un suplemento de suero bovino fetal al 10%. La línea celular HLF se obtuvo de los Drs. T. Morsaki y H. Kitsuki del Kyushu University School of Medicine en Japón.

Construcción del virus recombinante

Dos vectores de expresión adenovirales denominados en la presente memoria ACNTK y AANTK y desprovistos de la función de la proteína IX (representados en la Figura 11) son capaces de dirigir la expresión del gen suicida TK en las células tumorales. Se construyó un tercer vector de expresión de adenovirus denominado AANCAT para demostrar adicionalmente la viabilidad de dirigir específicamente la expresión génica a tipos celulares específicos utilizando vectores adenovirales. Estos constructos adenovirales se ensamblaron como se representa en las Figuras 11 y 12 y son derivados de aquellos descritos previamente para la expresión de genes supresores de tumores.

Para la expresión del gen foráneo, se han insertado casetes de expresión que utilizan el promotor/intensificador temprano inmediato de citomegalovirus humano (CMV) (Boshart, M. et al., 1985) o el intensificador/promotor de la alfa-fetoproteína humana (AFP) (Watanable, K. et al., 1987; Nakabayashi, H. et al., 1989) para dirigir la transcripción del gen TK o el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). El intensificador promotor de CMV es capaz de dirigir la expresión robusta del gen en una amplia variedad de tipos celulares mientras el constructo intensificador/promotor de la AFP restringe la expresión a las células de carcinoma hepatocelular (HCC) que expresan la AFP en aproximadamente el 70-80% de la población de pacientes con HCC. En el constructo que utiliza el promotor/intensificador de CMV, también se insertó la secuencia líder tripartita del adenovirus de tipo 2 para intensificar la traducción del transcrito TK (Berkner, K.L. y Sharp, 1985). Además de la deleción de E1, en ambos vectores de adenovirus se han suprimido adicionalmente 1,9 kilobases (kb) de ADN en la región E3 viral. El ADN suprimido en la región E3 no es esencial para la propagación del virus y su deleción aumenta la capacidad de inserción del virus recombinante para ADN foráneo en una cantidad equivalente (1,9 kb) (Graham y Prevec, 1991).

Para demostrar la especificidad del promotor/intensificador de la AFP, también se construyó el virus AANCAT en el que el gen marcador cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) está bajo el control del intensificador/promotor de la AFP. En el constructo viral ACNTK, la secuencia líder tripartita de Ad2 fue colocada entre el promotor/intensificador de CMV y el gen TK. Se ha informado de que el líder tripartito intensifica la traducción de los genes conectados. La sustitución de E1 perjudica la capacidad de los virus recombinantes para replicar, restringiendo su propagación a las células 293 que suministran los productos del gen E1 de Ad5 en trans (Graham et al., 1977).

Vector Adenoviral ACNTK: Se utilizó el plásmido pMLBKTK en E. coli HB101 (de la ATCC Núm. 39369) como fuente del gen de la timidina quinasa (TK) del virus del herpes simplex (HSV-1). TK fue separado por corte de este plásmido en forma de un fragmento génico de 1,7 kb mediante digestión con las enzimas de restricción Bgl II y Pvu II y subclonado en los sitios de restricción Bam HI, EcoR V compatibles del plásmido pSP72 (Promega) utilizando técnicas de clonación convencionales (Sambrook et al., 1989). El inserto de TK se aisló después en forma de un fragmento de 1,7 kb de este vector mediante digestión con Xba I y Bgl II y se clonó en el plásmido pACN digerido con Xba I, BamHI (Wills et al. 1994). Se linealizaron veinte (20) \mug de este plásmido denominado pACNTK con Eco RI y se cotransfectaron a células 293 (ATCC CRL 1573) con 5 \mug de ACBGL digerido con Cla I (Wills et al., 1994 supra) utilizando un kit de transfección con CaPO_{4} (Stratagene, San Diego, California). Las placas virales se aislaron y los recombinantes, denominados ACNTK, fueron identificados mediante análisis digestión con enzimas de restricción del ADN asilado con Xho I y BsiWI. Los recombinantes positivos se purificaron adicionalmente mediante dilución limitante y se expandieron y se titularon mediante métodos convencionales (Graham y Prevec, 1991).

Vector Adenoviral AANTK: Se clonaron el promotor de la \alpha-fetoproteína (AFP-P) y el intensificador (AFP-E) a partir de un ADN genómico humano (Clontech) utilizando la amplificación mediante PCR con cebadores que contenían sitios de restricción en sus extremos. Los cebadores utilizados para aislar el AFP-E de 210 pb contenían un sitio de restricción Nhe I en el cebador 5' y un conector Xba I, Xho I, Kpn I en el cebador 3'. La secuencia del cebador 5' fue 5'-CGC GCT AGC TCT GCC CCA AAG AGC T-3. La secuencia del cebador 5' fue 5'-CGC GGT ACC CTC GAG TCT AGA TAT TGC CAG TGG TGG AAG-3'. Los cebadores utilizados para aislar el fragmento AFE de 1763 pb contenían un sitio de restricción Not I en el cebador 5' y un sitio Xba I en el cebador 3'. La secuencia del cebador 5' fue 5'-CGT GCG GCC GCT GGA GGA CTT TGA GGA TGT CTG TC-3'. La secuencia del cebador 3' fue 5'-CGC TCT AGA GAG ACC AGT TAG GAA GTT TTC GCA-3'. Para la amplificación por PCR, el ADN fue desnaturalizado a 97º durante 7 minutos, seguido de 5 ciclos de amplificación a 97º, 1 minuto, 53º, 1 minuto, 72º, 2 minutos, y una prolongación final a 72º, 10 minutos. La AFE amplificada fue digerida con Not I y Xba I e insertada en los sitios Not I, Xba I de un vector plasmídico (pA/ITR/B) que contenía las secuencias 1-350 y 3330-5790 del adenovirus de tipo 5 separadas por un poliligador que contenía sitios Not I, Xho I, Xba I, Hind III, Kpn I, Bam HI, Nco I, Sma I, y Bgl II. El AFP-E amplificado fue digerido con Nhe I y Kpn I e insertado en el constructo que contenía AFP-E descrito antes que había sido digerido con Xba I y Kpn I. Este nuevo constructo fue digerido adicionalmente después con Xba I y NgoMI para separar las secuencias adenovirales 3330-5780, que fueron sustituidas con posterioridad por un fragmento de restricción Xba I, NgoMI del plásmido pACN que contenía los nucleótidos 4021-10457 del adenovirus de tipo 2 para construir el plásmido pAAN que contenía el intensificador y el promotor de la \alpha-fetoproteína. Este constructo fue digerido después con Eco RI y Xba I para aislar un fragmento de 2,3 kb que contenía la repetición terminal invertida de Ad5, el AFP-E y el AFP-P que fue ligado con posterioridad al fragmento de 8,55 kb de pACNTK digerido con Eco RI Xba I descrito antes donde el gen TK es dirigido por el intensificador y el promotor de la \alpha-fetoproteína en un fondo de adenovirus. Este plásmido fue linealizado después con Eco RI y cotransfectado con el fragmento grande de ALBGL digerido con Cla I como antes y los recombinantes, denominados AANTK, fueron aislados y purificados como se ha descrito antes.

Vector Adenoviral AANCAT: Se aisló el gen de la cloranfenicol acetiltransferasa (CAT) del pCAT-Basic Vector (Promega Corporation) mediante digestión con Xba I, Bam HI. Este fragmento de 1,64 kb se ligó en pAAN digerido con Xba I, Bam HI (descrito antes) para crear pAANCAT. Después éste plásmido se linealizó con Eco RI y se cotransfectó con el fragmento grande de rA/C/\beta-gal digerido con Cla I para crear AANCAT.

Expresión del gen informador: expresión de la \beta-galactosidasa

Las células se cultivaron en placa a 1 x 10^{5} células/pocillo en una placa para el cultivo de tejidos de 24 pocillos (Costar) y se dejó que se adhirieran durante la noche (37ºC, CO_{2} al 7%). Las infecciones durante la noche de ACBGL se realizaron a una multiplicidad de infección (MOI) de 30. Después de 24 horas, las células se fijaron con formaldehído al 3,7%; PBS, y se tiñeron con 1 mg/ml de reactivo Xgal (USB). Los datos se puntuaron (+,++,+++) estimando el porcentaje de células teñidas positivamente a cada MOI. [+=1-33%, ++=33-67% y +++=>67%].

Expresión del gen informador: expresión de CAT

Se sembraron dos (2) x 10^{6} células (Hep G2, Hep 3B, HLF, Chang, y MDA-MB468) sobre placas de 10 cm por triplicado y se incubaron durante la noche (37ºC, CO_{2} al 7%). Después se infectó cada placa con AANCAT a una MOI = 30 o 100 o no se infectó y se dejó incubando durante 3 días. Luego se trataron con tripsina las células y se lavaron con PBS y se resuspendieron en 100 \mul de Tris 0,25 M pH 7,8. Las muestras se congelaron y se descongelaron 3 veces, y el sobrenadante se transfirió a tubos nuevos y se incubaron a 60ºC durante 10 minutos. Después las muestras se centrifugaron a 4ºC durante 5 minutos, y los sobrenadantes se analizaron en cuanto a la concentración de proteína utilizando un análisis Bradford (Kit de Análisis de Proteínas Bio-Rad). Las muestras se ajustaron a concentraciones de proteína iguales a un volumen final de 75 \mul utilizando Tris 0,25 M, 25 \mul de acetil CoA 4 mM y 1 \mul de Cloranfenicol-C^{14} y se incubaron durante la noche a 37ºC. Se añadieron 500 \mul de acetato de etilo a cada muestra y se mezclaron mediante vórtice, seguido de centrifugación durante 5 minutos a la temperatura ambiente. La fase superior se transfirió después a un tubo nuevo y el acetato de etilo se evaporó mediante centrifugación a vacío. Los productos de reacción se redisolvieron después en 25 \mul de acetato de etilo y se aplicaron sobre una placa de cromatografía de capa fina (TLC) y después la placa se colocó en una cámara para TLC pre-equilibrada (cloroformo al 95%, metanol al 5%). Se dejó que el disolvente migrara hasta la parte superior de la placa, después la placa se secó y se expuso a película de rayos X.

Proliferación celular: incorporación de timidina-H^{3}

Se cultivaron en placa las células a 5 x 10^{3} células/pocillo en una placa de microtitulación de 96 pocillos (Costar) y se dejaron incubando durante la noche (37ºC, CO_{2} al 7%). Se utilizó virus ACN, ACNTK o AATK diluido seriadamente en DMEM; FBS al 15%; glutamina al 1% para transfectar las células a una multiplicidad de infección de 30 durante la noche en cuyo momento se administró una dosis de ganciclovir (Cytovene) por triplicado a las células a intervalos log entre 0,001 y 100 mM (micromolar). Se añadió 1 \muCi de timidina-H^{3} (Amersham) a cada pocillo 12-18 horas antes de la cosecha. A las 72 horas de la infección las células se recogieron sobre filtros de fibra de vidrio y se contó la timidina-H^{3} incorporada utilizando el centelleo en líquido (TopCount, Packard). Los resultados se trazan como el porcentaje de proliferación del control no tratado y se tabulan como la dosis eficaz (DE_{50} \pm DT) para una reducción del 50 por ciento en la proliferación sobre los controles de medio. Los valores DE_{50} se estimaron ajustando una ecuación logística a los datos de dosis-respuesta.

Citotoxicidad: liberación de LDH

Las células (HLF, HCC humano) se cultivaron en placa, se infectaron con ACN o ACNTK y se trataron con ganciclovir como se describe para el análisis de proliferación. A las 72 horas de la administración del ganciclovir, las células se centrifugaron, el sobrenadante se eliminó. Los niveles de lactato deshidrogenasa se midieron colorimétricamente (Promega, Cytotox 96®). La liberación de LDH media (+/- D.T.) se traza versus M.O.I.

Terapia in vivo

Se inyectaron subcutáneamente células de carcinoma hepatocelular humano (Hep 3B) en diez (10) ratones hembra nu/nu atímicos (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA). Cada animal recibió aproximadamente 1 x 10^{7} células en el flanco izquierdo. Se dejó que los tumores crecieran durante 27 días antes de aleatorizar los ratones por el tamaño del tumor. Los ratones se trataron con inyecciones intratumorales y peritumorales de ACNTK o del virus de control ACN (1 x 10^{9} ui en 100 \mul) en días alternos durante un total de tres dosis. Comenzando 24 horas después de la dosis inicial de adenovirus, se administró intraperitonealmente a los ratones ganciclovir (Cytovene 100 mg/kg) diariamente durante un total de 10 días. Se controló el tamaño de los tumores de los ratones y el peso corporal dos veces por semana. Las medidas de los tumores se realizaron en tres dimensiones utilizando calibres Vernier y se calcularon los volúmenes utilizando la fórmula 4/3 \pi r^{3}, donde r es la mitad de la dimensión tumoral media.

Resultados

Se utilizaron los adenovirus recombinantes para infectar tres líneas celulares de HCC (HLF, Hep3B y Hep-G2). Se utilizaron una línea celular de hígado humana (Chang) y dos líneas celulares de cáncer de mama como controles (MDAMB468 y BT549). Para demostrar la especificidad del promotor/intensificador de AFP, se construyó el virus AANCAT. Este virus se utilizó para infectar células que expresan (Hep 3B, HepG2) o no expresan (HLE, Chang, MDAMB468) la alfa-fetoproteína (AFP) marcadora del tumor HCC. Como se muestra en la Figura 13, AANCAT dirige la expresión del gen marcador CAT solamente en aquellas células de HCC que son capaces de expresar AFP (Figura 13).

Se evaluó la eficacia de ACNTK y AANTK para el tratamiento del HCC utilizando un análisis de incorporación de timidina-H^{3} para medir el efecto de la combinación de la expresión de HSV-TK y el tratamiento con ganciclovir sobre la proliferación celular. Las líneas celulares se infectaron con ACNTK o AANTK o con el virus de control ACN (Wills et al., 1994 supra), que no dirige la expresión de HSV-TK, y después se trató con concentraciones crecientes de ganciclovir. El efecto de este tratamiento se evalúa como una función de las concentraciones crecientes de ganciclovir, y se determinó la concentración de ganciclovir requerida para inhibir la timidina-H^{3} incorporada en un 50% (DE_{50}). Adicionalmente, se determinó una medida relativa de la transferencia génica mediada por adenovirus y la expresión de cada línea celular utilizando un virus de control que dirige la expresión del gen marcador de la beta-galactosidasa. Los datos presentados en la Figura 14 y en la Tabla 1 más abajo demuestran que el tratamiento combinado de virus ACNTK/ganciclovir era capaz de inhibir la proliferación celular en todas las líneas celulares examinadas en comparación con el adenovirus de control ACN combinado con ganciclovir. En contraste, el vector viral AANTK solamente era eficaz en aquellas líneas celulares de HCC que se ha demostrado que expresan la \alpha-fetoproteína. Además, la combinación AANTK/GCV era más eficaz cuando las células se cultivaron en placa a grandes densidades.

TABLA 1

2

Se trataron intratumoralmente y peritumoralmente ratones carentes de sistema inmunitario que portaban tumores Hep3B (N=5/grupo) con dosis equivalentes de ACNTK o control de ACN. Veinticuatro horas después de la primera administración de adenovirus recombinante, se inició el tratamiento diario con ganciclovir en todos los ratones. Se midieron las dimensiones de los tumores de cada animal dos veces por semana por medio de calibres, y los tamaños medios de los tumores se trazan en la Figura 16. El tamaño medio del tumor el día 58 fue más pequeño en los animales tratados con ACNTK pero la diferencia no alcanzó una trascendencia estadística (p<0,09, test de la t no emparejado). Estos datos apoyan un efecto específico de ACNTK sobre el crecimiento tumoral in vivo. No se detectaron diferencias significativas en el peso corporal medio entre los grupos.

Referencias

AIELLO, L. et al. (1979) Virology 94:460-469.

AMERICAN CANCER SOCIETY. (1993) Cancer Facts and Figures.

AULITZKY et al. (1991) Eur. J. Cancer 27(4):462-467.

AUSTIN, E.A. y HUBER, B.E. (1993) Mol. Pharmaceutical 43:380-387.

BACCHETTI, S. y GRAHAM, F. (1993) International Journal of Oncology 3:781-788.

BAKER S.J., MARKOWITZ, S., FEARON E.R., WILLSON, J.K.V., y VOGELSTEIN, B. (1990) Science 249:912-915.

BARTEK, J., BARTKOVA, J., VOJTESEK, B., STASKOVA, Z., LUKAS, J., REJTHAR, A., KOVARIK, J., MIDGLEY, C.A., GANNON, J.V., y LANE, D.P. (1991) Oncogene 6:1699-1703.

BERKNER, K.L. y SHARP (1985) Nucleic Acids Res 13:841-857.

BOSHART, M. et al. (1985) Cell 41:521-530.

BRESSAC, B., GALVIN, K.M., LIANG, T.J., ISSELBACHER, K.J., WANDS, J.R., y OZTURK, M. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1973-1977.

CARUSO M. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:7024-7028.

CHALLBERG, M.D., KELLY, T.J. (1979) Biochemistry 76:655-659.

CHEN P.L., CHEN Y., BOOKSTEIN R., y LEE W.H. (1990) Science 250:1576-1580.

CHEN, Y., CHEN, P.L., ARNAIZ, N., GOODRICH, D., y LEE, W.H. (1991) Oncogene 6:1799-1805.

CHENG, JL, YEE, J.K., YEARGIN, J., FRIEDMANN, T., y HAAS, M. (1992) Cancer Research 52:222-226.

COLBY, W.W. y SHENK, T. J. (1981) Virology 39:977-980.

CULVER et al. (1991) P.N.A.S. (U.S.A.) 88:3155-3159.

CULVER, K.W. et al. (1992) Science 256:1550-1552.

DEMETRI et al. (1989) J. Clin. Oncol. 7(10):1545-1553.

DILLER, L., et al. (1990) Mol. Cell. Biology 10:5772-5781.

EL-DEIRY, W.S., et al. (1993) Cell 75:817-825.

EZZIDINE, Z.D. et al. (1991) The New Biologist 3:608-614.

FEINSTEIN, E., GALE, R.P., REED, J., y CANAANI, E. (1992) Oncogene 7:1853-1857.

GHOSH-CHOUDHURY, G., HAJ-AHMAD, Y., y GRAHAM, F.L. (1987) EMBO Journal 6:1733-1739.

GOODING, L.R., y WOLD, W.S.M. (1990) Crit. Rev. Immunol. 10:53-71.

GRAHAM F.L., y VAN DER ERB A.J. (1973) Virology 52:456-467.

GRAHAM, F.L. y PREVEC, L. (1992) Vaccines: New Approaches to Immunological Problems. R.W. Ellis (ed), Butterworth-Heinemann, Boston. págs. 363-390.

GRAHAM, F.L., SMILEY, J., RUSSELL, W.C. y NAIRN, R. (1977) J. Gen. Virol. 36:59-74.

GRAHAM F.L. y PREVEC L. (1991) Manipulation of adenovirus vectors. En: Methods in Molecular Biology. Vol 7: Gene Transfer and Expression Protocols. Murray E.J. (ed.) The Humana Press Inc., Clifton N.J., Vol 7:109-128.

HEUVEL, S.J.L., LAAR, T., KAST, W.M., MELIEF, C.J.M., ZANTEMA, A., y VAN DER EB, A.J. (1990) EMBO Journal 9:2621-2629.

HOCK, H., DORSCH, M., KUZENDORF, U., QIN, Z., DIAMANTSTEIN, T., y BLANKENSTEIN, T. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2774-2778.

HOLLSTEIN, M., SIDRANSKY, D., VOGELSTEIN, B., y HARRIS, C. (1991) Science 253:49-53.

HOROWITZ, M.S. (1991) Adenoviridae and their replication. En Fields Virology. B.N. Fields, ed. (Raven Press, New York) págs. 1679-1721.

HORVATH, J., y WEBER, J.M. (1988) J. Virol. 62:341-345.

HUANG et al. (1991) Nature 350:160-162.

HUBER, B.E. et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8039-8043.

HUNTER, T. (1993) Cell 75:839-841.

JONES, N. y SHENK, T. (1979) Cell 17:683-689.

KAMB et al. (1994) Science 264:436-440.

KEURBITZ, S.J., PLUNKETT, B.S., WALSH, W.V., y KASTAN, M.B. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7491-7495.

KREIGLER, M. Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, W.H. Freeman and Company, New York (1990).

LANDMANN et al. (1992) J. Interferon Res. 12(2):103-111.

LANE, D.P. (1992) Nature 358:15-16.

LANTZ et al. (1990) Cytokine 2(6):402-406.

LARRICK, J.W. y BURCK, K.L. Gene Therapy: Application of Molecular Biology, Elsevier Science Publishing Co., Inc. New York, New York (1991).

LEE et al. (1987) Science 235:1394-1399.

LEMAISTRE et al. (1991) Lancet 337:1124-1125.

LEMARCHAND, P., et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6482-6486.

LEVINE, A.J. (1993) The Tumor Suppressor Genes. Annu. Rev. Biochem. 1993. 62:623-651.

LOWE S.W., SCHMITT, E.M., SMITH, S.W., OSBORNE, B.A., y JACKS, J. (1993) Nature 362:847-852.

LOWE, S.W., RULEY, H.E., JACKS, T., y HOUSMAN, D.E. (1993) Cell 74:957-967.

MARTIN (1975) IE: Remington's Pharm. Sci., 15ª Ed. (Mack Publ. Co., Easton).

MERCER, W.E., et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6166-6170.

NAKABAYASHI, H. et al. (1989) The Journal of Biological Chemistry 264:266-271.

PALMER, T.D., ROSMAN, G.J., OSBORNE, W.R., y MILLER, A.D. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci USA 88:
1330-1334.

RAO, L., DEBBAS, M., SABBATINI, P., HOCKENBERY, D., KORSMEYER, S., y WHITE, E. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7742-7746.

RAVOET C. et al. (1993) Journal of Surgical Oncology Supplement 3:104-111.

RICH, D.P., et al. (1993) Human Gene Therapy 4:460-476.

ROSENFELD, M.A., et al. (1992) Cell 68:143-155.

SAMBROOK J., FRITSCH E.F., y MANIATIS T. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor).

SARNOW, P., HO, Y.S., WILLIAMS, J., y LEVINE, A.J. (1982) Cell 28:387-394.

SHAW, P., BOVEY, R., TARDY, S., SAHLI, R., SORDAT, B., y COSTA, J. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4495-4499.

SIEGFRIED, W. (1993) Exp. Clin. Endocrinol. 101:7-11.

SORSCHER, E.J. et al. (1994) Gene Therapy 1:233-238.

SPECTOR, D.J. (1983) Virology 130:533-538.

STEWART, P.L. et al. (1993) EMBO Journal 12:2589-2599.

STRAUS. S.E. (1984) Adenovirus infections in humans. En: The Adenoviruses, Ginsberg HS, ed. New York: Plenum Press, 451-496.

SUPERSAXO et al. (1988) Pharm. Res. 5 (8) :472-476.

TAKAHASHI, T., et al. (1989) Science 246: 491-494.

TAKAHASHI, T., et al. (1992) Cancer Research 52:2340-2343.

THIMMAPPAYA, B. et al. (1982) Cell 31:543-551.

WANG, A.M., DOYLE, M.V., y MARK, D.F. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:9717-9721.

WATANABLE, K. et al. (1987) The Journal of Biological Chemistry 262:4812-4818.

WHITE, E., et al. (1992) Mol. Cell. Biol. 12:2570-2580.

WILLS, K.N. et al. (1994) Hum. Gen. Ther. 5:1079-1088.

YONISH-ROUACH, E., et al. (1991) Nature 352:345-347.

Claims (16)

1. Una composición farmacéutica que comprende un vector de expresión de adenovirus recombinante, comprendiendo el vector un gen que codifica una proteína foránea y una deleción total de la secuencia codificante de la proteína IX, donde la proteína foránea es una proteína supresora de tumores seleccionada del grupo que consiste en p53, p21, p16, Rb, proteína WT1 del tumor de Wilms, h-NUC y mitosina.

2. La composición farmacéutica de la reivindicación 1, donde la proteína supresora de tumores es p53 o p21.

3. La composición farmacéutica de la reivindicación 1 o 2, que comprende adicionalmente la deleción de una secuencia de ADN denominada E1a y E1b de adenovirus.

4. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende adicionalmente la deleción de una secuencia de ADN en la región temprana 3 y/o la región temprana 4.

5. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende adicionalmente una deleción de hasta cuarenta nucleótidos situados 3' con respecto a la deleción de la proteína IX y una molécula de ADN foráneo que codifica una señal de poliadenilación.

6. La composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde el adenovirus es un adenovirus del Grupo C seleccionado entre el serotipo 1, 2, 5 o 6.

7. Un kit para reducir la proliferación de células tumorales de vejiga, comprendiendo dicho kit una composición farmacéutica de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en ganciclovir, arabinonucleósido de 6-metoxipurina, 5-fluorouracilo, 6-metil-purino-2'-desoxirribonucleosido, y sus combinaciones, y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.

8. Un vector de expresión de adenovirus recombinante que comprende un gen que codifica una proteína foránea y una deleción total de la secuencia codificante de la proteína IX, donde la proteína foránea es una proteína supresora de tumores seleccionada del grupo que consiste en p53, p21, p16, Rb, proteína WT1 del tumor de Wilms, h-NUC y mitosina.

9. El vector de expresión de adenovirus recombinante de la reivindicación 8, donde la proteína supresora de tumores es p53 o p21.

10. El vector de expresión de adenovirus recombinante de la reivindicación 8 o 9, que comprende adicionalmente la deleción de una secuencia de ADN denominada E1a y E1b de adenovirus.

11. El vector de expresión de adenovirus recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10, que comprende adicionalmente la deleción de una secuencia de ADN en la región temprana 3 y/o la región temprana 4.

12. El vector de expresión de adenovirus recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, que comprende adicionalmente una deleción de hasta cuarenta nucleótidos situados en 3' con respecto a la deleción de la proteína IX y una molécula de ADN foránea que codifica una señal de poliadenilación.

13. El vector de expresión de adenovirus recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, donde el adenovirus es un adenovirus del Grupo C seleccionado entre el serotipo 1, 2, 5 o 6.

14. El uso del adenovirus recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 para la preparación de una composición farmacéutica para tratar el cáncer de vejiga, cuya composición farmacéutica comprende adicionalmente uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.

15. El uso del adenovirus recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 para la preparación de una composición farmacéutica para inhibir la proliferación de un tumor de vejiga en un animal, cuya composición farmacéutica comprende adicionalmente uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.

16. El uso del adenovirus recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 8 a 13 para la preparación de una composición farmacéutica para reducir la proliferación de células de tumor de vejiga en un sujeto, donde la composición farmacéutica comprende adicionalmente una cantidad eficaz de un agente terapéutico seleccionado del grupo que consiste en ganciclovir, arabinonucleósido de 6-metoxipurina, 5-fluorouracilo, 6-metilpurino-2'-desoxirribonucleosido, y sus combinaciones, y uno o más portadores farmacéuticamente aceptables.