ES2232634T3 - Utilizacion de la aloe-emodina en el tratamiento de los tumores neuroectodermicos. - Google Patents

Abstract

Utilización de un compuesto con la fórmula 1, 8-dihidroxi-3-hidroximetil-9, 10-antracenodiona (aloe-emodina) en la preparación de compuestos farmacéuticos para el tratamiento de tumores neuroectodérmicos.

Description

Utilización de la aloe-emodina en el tratamiento de los tumores neuroectodérmicos.

Campo de la invención

La presente invención está relacionada con un compuesto conocido como aloe-emodina (AE), como agente activo en la preparación de compuestos farmacéuticos para el tratamiento de tumores neuroectodérmicos.

Antecedentes de la invención

Se sabe que las estrategias terapéuticas en el tratamiento de las patologías neoplásicas empleadas hasta la fecha se dirigen esencialmente a eliminar todas las células malignas, tanto en las zonas primarias como en las metastásicas. En este sentido, diferentes modalidades terapéuticas pueden ser utilizadas, desde la cirugía hasta la radioterapia para tumores que se encuentran localizados, la quimioterapia antineoplásica para las dolencias locales o sistémicas, la terapia endocrina para tumores hormono-dependientes, la inmunoterapia y la termoterapia. Todas estas modalidades pueden ser utilizadas singularmente o también pueden emplearse una en combinación con la otra, según el tipo de células neoplásica y la fase en la que se encuentra la patología, con el objetivo de conseguir una terapia efectiva en la erradicación de la neoplasia.

La quimioterapia antineoplásica constituye sin duda uno de los métodos terapéuticos más comunes, tanto sola o en combinación con alguna de las modalidades anteriormente mencionada. Un agente de quimioterapia antineoplásica ideal debería ser selectiva para las células tumorales sin provocar ningún efecto adverso significativo en las células normales ni efectos tóxicos de tipo sistémico; no obstante, a pesar de las largas y complejas investigaciones destinadas a encontrar un agente anticancerígeno de este tipo, hasta el momento ningún compuesto, empleado individualmente o combinado con otros agentes, ha demostrado poseer un índice terapéutico satisfactorio, es decir, la ratio de efectividad en las células tumorales en relación con la ausencia de efectos citotóxicos sobre las células no malignas. Los primeros agentes empleados fueron fármacos alquilantes, tales como el nitrógeno-mostaza, seguidos por fármacos anti-metabólicos, antagonistas del folato tales como el metotrexato, o antagonistas de las purinas tales como la 6-mercaptopurina, o antagonistas de las pirimidinas tales como el 5-fluorouracilo, sustancias de origen vegetal que bloquean la mitosis celular tales como la vincristina o la vinblastina, y podofilotoxinas, antibióticos tales como la mitomicina, adriamicina y bleomicina, nitrosoureas, complejos de coordinación de platino y más recientemente los denominados modificadores de la respuesta biológica tales como el \alpha-interferón y un enzima tal como la asparaginasa. Todos estos fármacos, solos o en combinación, son ampliamente empleados en muchas patologías tumorales que van desde tumores localizados en órganos específicos a tumores diseminados. en el caso de los tumores neuroectodérmicos, tales como por ejemplo el neuroblastoma, el tumor neuroectodérmico periférico primitivo (pPNET), el sarcoma de Ewing, el melanoma, el microcitoma, etc., los agentes de quimioterapia antineoplásica empleados habitualmente, a pesar de no ser específicos, pueden ser por ejemplo la vincristina o la vinblastina, complejos de coordinación de platino y otros agentes adecuados para este propósito.

Aunque se reconoce la efectividad de muchos de estos compuestos, no se ha podido comprobar, sin embargo, que ninguno de ellos presente el perfil ideal mencionado anteriormente, y en bastantes casos puede ser observada una cierta resistencia, también múltiple, de las células tumorales hacia estos agentes a pesar de que los efectos tóxicos en las otras células no desaparecen.

Por lo tanto, con la intención de desarrollar nuevos fármacos anticancerígenos caracterizados por su capacidad de seleccionar su objetivo y baja toxicidad en relación con los tejidos del anfitrión que se dividen con normalidad, la invención ha centrado su atención en compuestos naturales que han sido tradicionalmente empleados durante siglos para tratar una amplia y variada gama de patologías muy heterogéneas y que están caracterizados porque de que no presentan efectos tóxicos significativos, estudiando en particular su citotoxicidad hacia las células tumorales de origen humano, las cuales no son empleadas habitualmente en exámenes para verificar el potencial efecto anti-tumoral de compuestos conocidos y nuevos.

Sumario de la invención

Después de estas investigaciones los inventores han encontrado ahora que una sustancia natural de origen vegetal, la aloe-emodina, presenta sorprendentemente una potente actividad citotóxica, tanto in vivo como in vivo, contra las células de los tumores neuroectodérmicos, sin presentar una similar actividad citotóxica hacia los tejidos del anfitrión que se dividen con normalidad.

Por lo tanto, el objetivo de la presente invención es, la utilización de la aloe-emodina para la preparación de compuestos farmacéuticos que pueden ser utilizados en el tratamiento de los tumores neuroectodérmicos.

La aloe-emodina puede actuar como agente de quimioterapia antineoplásica provocando una citotoxicidad selectiva hacia aquellas células mediante un mecanismo apoptótico.

Breve descripción de las figuras

La figura 1A muestra la citotoxicidad de la AE en la relación dosis-respuesta en las líneas celulares del tumor neuroectodérmico: IRM5 \lozenge, IMR32 \Box, AF8 \blacktriangle, SJ-N-KP \blacklozenge, TC32 x, TC1013 \medcirc, Mel 23 \newmoon y

la figura 1B en células tumorales de distinto origen LoVo 109 \lozenge, LoVo DX \blacksquare, CEM \blacklozenge, CEM VBL x, HeLa \medcirc y en fibroblastos de pulmón humano MRC5 \newmoon.

La figura 1C muestra el porcentaje de crecimiento de la colonia de células del neuroblastoma (SJ-N-KP \blacksquare) y CFU-GM obtenido a partir de médula ósea (BM 7) de donantes sanos y de muestras de sangre de cordón umbilical (CB \Box) incubadas con diferentes concentraciones de AE después de 14 días.

La figura 2 muestra la actividad antitumoral de la AE en ratones SCID (con inmunodeficiencia combinada grave) portadores de células de neuroblastoma humano (IMR5 \medcirc) y células de adenocarcinoma de colon (LoVo 109 \medcirc) en comparación con un grupo de control tratado con excipiente (\blacklozenge): A) Ratones SCID inyectados vía subcutánea con células de neuroblastoma y tratadas inmediatamente después de la inyección de las células tumorales y durante 5 días para un total de 5 dosis; B) Ratones SCID inyectados vía subcutánea con células de neuroblastoma y tratadas con AE a partir del día 15 durante 5 días para un total de 5 dosis; C) Ratones SCID inyectados vía subcutánea con células de adenocarcinoma de colon y tratados inmediatamente después de la inyección de las células tumorales y durante 5 días para un total de 5 dosis.

Descripción detallada de la invención

Las características y ventajas de la presente invención se pueden comprender mejor mediante la siguiente descripción detallada.

El compuesto que aquí se discute, es decir, la aloe-emodina, puede ser encontrado en los jugos vacuolares de la epidermis de las hojas de diversas especies de Aloe, pero también en otras plantas como el sen o el ruibarbo, a partir de las cuales se puede extraer químicamente libre o glucosilado desde principios del siglo pasado. Hasta hoy en día este compuesto ha sido empleado como laxante.

Desde el punto de vista estructural, se trata de una hidroxiantraquinona que tiene, en su forma libre, la siguiente fórmula: 1,8-dihidroxi-3-hidroximetil-9,10-antracenodiona.

La actividad de la aloe-emodina (AE) como fármaco anti-tumoral con una actividad selectiva específica contra los tumores neuroectodérmicos ha sido estudiada in vitro en células humanas tumorales, e in vivo en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID). Posteriormente se han estudiado los efectos tóxicos generales de la AE en ratones suizos.

Bioanálisis in vitro

Los análisis de citotoxicidad in vitro se han llevado a cabo en diferentes líneas celulares tumorales, tanto de tumores neuroectodérmicos como con células de tumores epiteliales y derivados de la sangre, así como con células madre hematopoyéticas y fibroblastos normales, a fin de verificar la actividad citotóxica y la especificidad de dicho efecto del compuesto:

tumores de origen neuroectodérmico: neuroblastoma (IMR-32, IMR-5, AF8,SJ-N-KP), pPNET (TC32), sarcoma de Ewing (TC106) melanoma (Mel 23);

tumores de origen distinto: leucemia de linfocitos T (CEM) y leucemia de linfocitos T resistente a la vinblastina (CEM VBL), adenocarcinoma de colon (LoVo 109) y adenocarcinoma de colon resistente a la doxorrubicina (LoVo DX), carcinoma epitelioide del cuello uterino (HeLa);

células normales: fibroblastos de pulmón humano (MRC5).

Las células, en un medio de cultivo completo en fase de crecimiento exponencial, son expuestas a dosis graduadas de 0 a 100 pM de aleo-emodina (AE), durante 72 horas. Los datos obtenidos indican valores ED50 (dosis efectivas semi-máximas) que varían de 1 a 13 pM (para el neuroblastoma y el sarcoma de Ewing, respectivamente) y valores que varían de 40 a 100 \muM (para fibroblastos y líneas de leucemia linfocítica aguda, respectivamente). La Figura 1A muestra los resultados obtenidos en células de tumor neuroectodérmico como % de supervivencia celular (IMR5 \lozenge, IMR32 \Box, AF8 \blacktriangle, SJ-N-KP \blacklozenge, TC32 x, TC106 \medcirc, Mel 23 \newmoon) y la figura 1B muestra los resultados del % de supervivencia celular en las células tumorales de distinto origen y en células normales (LoVo 109 \lozenge, LoVo DX \blacksquare, CEM \blacklozenge, CEM VBL x, HeLa \medcirc y MRC5 \newmoon).

Los análisis clonogénicos también han sido llevados a cabo con células madre hematopoyéticas, obtenidas de la médula ósea (BM 7) de donantes sanos y de muestras de sangre de cordón umbilical (CB \Box), y en células del neuroblastoma (SJ-N-KP \blacksquare). Las células han sido multiplicadas en metil-celulosa con dosis de AE escaladas en concentraciones entre 1 y 100 \muM durante 14 días. Los datos obtenidos indicaron valores ED50 para la proliferación de las colonias CFU-GM (unidades de granulocitos / macrófagos formadoras de colonias) que variaban desde 80 a 120 \muM para las células hematopoyéticas de la médula ósea y de cordón umbilical respectivamente, mientras que la actividad formadora de colonias de las células de neuroblastoma (NB \blacksquare) se ve inhibida a concentraciones bajas de AE (Figura 1C).

Bioanálisis in vivo

Las pruebas in vivo de toxicidad y efectividad se han llevado a cabo en ratones suizos y en ratones con inmunodeficiencia combinada grave (SCID) a fin de verificar el perfil de toxicidad general y actividad anti-tumoral.

En el primer caso, los análisis de toxicidad aguda y crónica se llevan a cabo en ratones suizos (machos de edad comprendida entre las 8 y 10 semanas) para mostrar posibles efectos de toxicidad general debido a la AE en el peso, en las funciones intestinales y neurológicas y en los parámetros hematológicos. Los animales fueron tratados con altas dosis por vía intraperitoneal, entre 30 mg/kg/die y 50 mg/kg/die, en una administración y con dosis bajas, entre 1 mg/kg/die y 10 mg/kg/die, con administraciones repetidas.

Los animales fueron supervisados para detectar posibles daños neurológicos mediante pruebas de comportamiento repetidas periódicamente, para detectar la toxicidad hemática mediante análisis de hemocromo semanales, y para detectar la toxicidad intestinal mediante análisis fecales. Además, los animales también han sido pesados dos veces cada semana durante toda la prueba. Al final de las pruebas los animales han sido sacrificados y se ha practicado la autopsia.

No se ha registrado toxicidad durante las pruebas y la autopsia no ha revelado ningún daño en los órganos principales.

Después del análisis de la toxicidad, en relación con el segundo objetivo, se realizaron pruebas de efectividad anti-tumoral en ratones SCID.

Los animales (hembras de edades comprendidas entre las 6 y las 8 semanas) han sido inoculados vía subcutánea, entre las escápulas, mediante una suspensión de células IMR5 de neuroblastoma o de adenocarcinoma de colon LoVo 109 (10 x 10^{8}) y han sido entonces tratados con 50 mg/kg/die i. p. de AE (\medcirc) en DMSO y entonces diluidas en una solución salina, mientras que los animales de control (\blacklozenge) han sido tratados con DMSO en solución salina por vía intraperitoneal. El tratamiento con el principio activo ha sido repetido durante 5 días para un total de 5 dosis en ambos casos.

La programación de los análisis permitió el tratamiento inmediato después de la inoculación del tumor o el tratamiento después de la aparición de la masa tumoral (15 días después de la inoculación de las células tumorales). En ambos casos los ratones han sido tratados durante 5 días y luego sacrificados cuando la masa de control alcanzó los 1,5 cm^{3}. Se han llevado a cabo las mismas pruebas realizadas en los ratones suizos y las masas tumorales han sido medidas con un calibrador dos veces por semana. Los datos obtenidos en los ratones SCID muestran que la AE inhibe la aparición del neuroblastoma en los 15 días después de la inoculación (Figura 2A) y bloquea el crecimiento de la masa desarrollada incluso cuando es tratada el día 15 después de la inyección de las células tumorales (Figura 2B) durante el período de tratamiento. Por otro lado, en los ratone inoculados con adenocarcinoma de colon, el crecimiento del tumor no cambia después del tratamiento con AE (Figura 2C).

Los resultados obtenidos y brevemente descritos muestran que la AE libre y no glucosilada actúa como un potente agente de quimioterapia antineoplásica específicamente en tumores neuroectodérmicos.

De hecho, inhibe el crecimiento de los tumores neuroectodérmicos humanos tanto durante la etapa de formación de la masa como cuando la masa ya se ha desarrollado.

Además, el efecto antitumoral no se encuentra de ninguna manera asociada con procesos de citotoxicidad en otras células que se dividan con normalidad así como tampoco con efectos tóxicos significativos en animales. El compuesto tampoco inhibe el crecimiento in vitro de fibroblastos normales o de células madre hematopoyéticas.

Al contrario, la aloína, la forma glucosilada de la AE que tiene la fórmula 10-1',5'-anhidroglucosil-1,8-dihidroxi-3-hidroximetil-9-antrona, no presenta efectos citotóxicos en las células de tumores neuroectodérmicos tomadas en consideración.

El mecanismo de toxicidad identificado resulta especialmente interesante y novedoso en relación con los fármacos anti-tumorales en general y consiste en la inducción de un mecanismo de muerte celular apoptótica, mientras que la selectividad contra las células del tumor neuroectodérmico se basa en una incorporación de la molécula con especifidad celular mediada por receptor.

Para concluir, los resultados de las pruebas muestran claramente que el compuesto tomado en consideración puede ser empleado como agente quimioterapéutico contra los tumores neuroectodérmicos, presentando las ventajas tanto de tener un efecto de especificidad farmacológica relevante in vitro e in vivo contra estas células así como de no tener un efecto tóxico en general. Además, la AE presenta la ventaja añadida de no tener ningún efecto adverso en células proliferativas altamente importantes como las células madre hematopoyéticas.

La aloe-emodina, por lo tanto, demuestra ser un compuesto adecuado elegible para el tratamiento de las patologías tumorales de origen neuroectodérmico (como por ejemplo el neuroblastoma, el tumor periférico neuroectodérmico (pPNET), el sarcoma de Ewing, el melanoma, el microcitoma, etc.), dado que presenta un ventajoso índice terapéutico potencial. Esto resulta aún más importante si consideramos que un tumor neuroectodérmico tal como el neuroblastoma es uno de los tumores sólidos más comunes en niños con un nivel de incidencia del 10% entre todos los tumores infantiles. También debería observarse que, cuando se diagnostica, el 50% de los niños presentan un cuadro clínico de metástasis con un pronóstico altamente negativo.

Puede ser empleada con este objetivo en la preparación de compuestos farmacéuticos que pueden ser administrados a pacientes en la forma de compuestos farmacéuticos que son habitualmente utilizados en la administración oral y parenteral de medicamentos, así como en fórmulas para la administración local en la zona primaria y/o secundaria del tumor. El compuesto aloe-emodina también puede ser empleado con este objetivo en la preparación de compuestos farmacéuticos adecuados para operaciones purgativas de injerto autólogo de médula ósea.

Con este objetivo pueden ser empleados todos los excipientes farmacéuticamente aceptables, incluyendo excipientes o dispositivos para la administración local de liberación controlada.

Los compuestos que contienen la AE como agente activo para el tratamiento de tumores neuroectodérmicos pueden presentarse como fórmulas concretas que tengan la dosis adecuada del principio activo para obtener el efecto terapéutico deseado según los objetivos de esta invención. Dichas fórmulas pueden ser preparadas de acuerdo con métodos conocidos o nuevas tecnologías farmacéuticas, empleando materiales de soporte, excipientes, diluyentes, emulsionantes, excipientes acuosos, oleaginosos o poliméricos, etc., los cuales son aceptables para su uso farmacéutico.

Las fórmulas para la administración parenteral pueden ser todas las formas farmacéuticas tradicionales, tales como viales en excipientes acuosos u oleaginosos en disoluciones amortiguadoras o en disoluciones que contengan los agentes adecuados en suspensión también en la forma de producto liofilizado para ser dispersados antes de la administración.

Las fórmulas para la administración oral pueden ser comprimidos, cápsulas de gelatina dura o blanda oleaginosas o recubiertas, píldoras, polvos dispersables, suspensiones y emulsiones.

Los compuestos según la presente invención también pueden consistir en fórmulas para uso tópico o transdérmico en excipientes o dispositivos adecuados para la administración del agente activo en la zona primaria y/o secundaria del tumor.

Los excipientes, agentes enlazantes, lubricantes, disgregantes, etc., pueden ser de cualquier tipo e igualmente adecuados para su uso farmacéutico y para los objetivos de la presente invención, tales como por ejemplo azúcares (por ejemplo manitol, lactosa, dextrosa, sacarosa, fructosa), polisacáridos naturales tales como la celulosa y sus derivados tales como la metil celulosa, la carboximetil-celulosa, almidones y alginatos además de otros excipientes poliméricos conocidos empleados en el campo farmacéutico, la sílice, el talco, el óxido de magnesio, los estearatos, los glucoles de polietileno, la goma arábiga, la polivinil pirrolidona y el polivinil alcohol.

Claims (6)

1. Utilización de un compuesto con la fórmula 1,8-dihidroxi-3-hidroximetil-9,10-antracenodiona (aloe-emodina) en la preparación de compuestos farmacéuticos para el tratamiento de tumores neuroectodérmicos.

2. Utilización según la reivindicación 1, en la que dichos tumores pueden ser un neuroblastoma, un tumor neuroectodérmico periférico primitivo (pPNET), un sarcoma de Ewing, un melanoma y un microcitoma.

3. Utilización según la reivindicación 1, en la que dichos compuestos son adecuados para su administración parenteral en forma de disoluciones acuosas u oleaginosas o en suspensión en los agentes de dispersión adecuados, también en forma de productos liofilizados para ser dispersados antes de la administración.

4. Utilización según la reivindicación 1, en la que dichos compuestos son adecuados para su administración oral en forma de comprimidos, cápsulas de gelatina dura o blanda oleaginosas o recubiertas, píldoras, polvos dispersables, suspensiones y emulsiones.

5. Utilización según la reivindicación 1, en la que dichos compuestos son fórmulas adecuadas para su utilización en operaciones purgativas de auto-injerto de médula ósea.

6. Utilización según la reivindicación 1, en la que dichos compuestos son adecuados para su administración tópica o transdérmica en formas adecuadas o en excipientes o dispositivos apropiados para la administración del agente activo en la zona primaria y/o secundaria del tumor.