ES2232653T3 - Procedimiento para la introduccion de acidos nucleicos y otras moleculas biologicamente activas en el nucleo de celulas eucariotas superiores con ayuda de corriente electrica. - Google Patents

Procedimiento para la introduccion de acidos nucleicos y otras moleculas biologicamente activas en el nucleo de celulas eucariotas superiores con ayuda de corriente electrica.

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ES2232653T3 ES01960408T ES01960408T ES2232653T3 ES 2232653 T3 ES2232653 T3 ES 2232653T3 ES 01960408 T ES01960408 T ES 01960408T ES 01960408 T ES01960408 T ES 01960408T ES 2232653 T3 ES2232653 T3 ES 2232653T3
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Abstract

Procedimiento para introducir moléculas biológicamente activas en el núcleo celular de células eucariotas superiores con ayuda de corriente eléctrica, según el cual se consigue la introducción en el núcleo de células primarias, de manera independiente a la división celular, mediante un impulso con una intensidad de campo de 2-10 kV/cm y una duración de al menos 10 s y una intensidad de corriente de al menos 1 A.

Description

Procedimiento para la introducción de ácidos nucleicos y otras moléculas biológicamente activas en el núcleo de células eucariotas superiores con ayuda de corriente eléctrica.
La invención se refiere a un procedimiento novedoso que posibilita el transporte de ADN y/u otras moléculas biológicamente activas hasta el núcleo de células eucariotas superiores, con ayuda de corriente eléctrica, de manera independiente de la división celular y con una mortalidad celular baja. Mediante el procedimiento según la invención, se acorta el tiempo entre la transfección y el análisis de las células, lo que conduce a una aceleración considerable de los experimentos. Se describen impulsos eléctricos optimizados que pueden utilizarse para la localización nuclear de ADN y/u otras moléculas biológicamente activas.
Antecedentes
Como el lugar de acción del ADN eucariota es el núcleo celular, el ADN añadido desde fuera debe llegar al núcleo para poder ser leído. Los métodos de transfección habituales producen sólo un transporte de ADN a través de la membrana celular hasta el citoplasma. El ADN puede llegar al núcleo de manera pasiva, sólo porque la envoltura nuclear se rompe temporalmente durante la división celular de eucariotas superiores, de modo que pueden expresarse las proteínas codificadas por él. Sólo pueden difundir libremente a través de los poros de la envoltura nuclear moléculas de ADN (oligonucleótidos) muy pequeñas. Por tanto, para la transfección efectiva de células en reposo o poco activas en fase de división deben crearse condiciones que permitan que también moléculas de ADN mayores lleguen al núcleo en cantidad suficiente a través de la membrana nuclear cerrada. El método descrito en el presente documento posibilita esto en células eucariotas superiores.
Estado de la técnica
Desde hace tiempo se sabe que con ayuda de corriente eléctrica puede introducirse ADN en las células a partir de un tampón. Las condiciones de ensayo descritas hasta la fecha se limitan, sin embargo, al transporte de ADN hasta el citoplasma de células eucariotas superiores, de modo que la expresión de ADN transfectado permanece dependiente de la rotura de la envoltura nuclear durante la división celular. Ninguno de los procedimientos conocidos hasta la fecha se ocupa de llevar el ADN hasta el núcleo de células eucariotas superiores de manera encauzada y mediante electricidad. Hasta la fecha no se conoce un sistema que esté optimizado para el transporte nuclear eléctrico, de manera independiente de la división celular.
El desarrollo de la electroporación se remonta a la observación de que las membranas biológicas se vuelven más permeables durante un corto periodo de tiempo mediante la acción de impulsos eléctricos cortos (Neumann & Rosenheck, 1972). En 1976, Auer et al. describieron la captación de ADN en eritrocitos mediante corriente eléctrica.
El primer informe sobre electroporación de células de líneas celulares procede del año 1982 (Neumann et al.). Con impulsos cortos con intensidad de campo de 8 kV/cm y una duración de 5 \mus cada uno, de los cuales normalmente se aplicaron sucesivamente tres en intervalos de tres segundos, se transfectó una línea celular de fibroblastos de ratón. Tras 2 semanas se llevó a cabo un análisis. No se observó transporte nuclear eléctrico.
Mediante puesta en cortocircuito de un transformador, Potter et al. (1984) también generaron una intensidad de campo de 8 kV/cm y la utilizaron para la transfección de células de líneas celulares, sin embargo, la intensidad de corriente estaba limitada a un máximo de 0,9 A. Tampoco se observó en este caso ningún transporte nuclear eléctrico.
A partir de entonces, en el desarrollo se utilizaron descargas cada vez más largas con tensiones más pequeñas, ya que se había demostrado que para una apertura óptima de los poros de la membrana celular (para un diámetro celular medio de 10-20 \mum) era suficiente una intensidad de campo de aproximadamente 1 kV/cm. Por tanto, la mayoría de los aparatos que pueden adquirirse están optimizados para la electroporación de células eucariotas superiores y los protocolos suministrados para transfecciones con esas intensidades de campo.
En un caso (Bertling et al., 1987), se hizo un seguimiento de la cinética de la distribución del ADN en el citoplasma y el núcleo en una línea celular activa en fase de división. Sin embargo, a parte de un aumento de la concentración de ADN, no se realizó ningún ensayo en este caso para mejorar la captación temprana de ADN en el núcleo. No se investigó especialmente si los parámetros eléctricos podrían tener una influencia.
Desde 1986 se han solicitado patentes que se refieren a la electroporación como procedimientos de transfección. En éstas, se describen sobre todo construcciones de aparatos y formas de impulsos. Ninguna aborda el problema del transporte de ADN hasta el núcleo en otro momento que no sea la mitosis.
El documento US 4.750.100 de la empresa Bio-Rad-Laboratories, Richmond, EE.UU. (1986) describe una estructura de aparato determinada que proporciona un máximo de 3000 V para un máximo de 125 A mediante una descarga de condensadores.
El documento US 5.869.326 (Genetronics, Inc., San Diego, EE.UU., 1996) describe una estructura de aparato determinada mediante la cual, con ayuda de dos fuentes de corriente separadas, pueden generarse dos, tres o varios impulsos. Pero el documento US 5.869.326 no muestra que estos impulsos tienen una acción que excede al transporte de ADN hasta el citoplasma.
Los documentos US 6.008.038 y EP 0 866 123 A1 (Eppendorf-Netheler-Hinz GmbH, Hamburgo, 1998) describen un aparato con el que pueden generarse impulsos cortos de 10-500 \mus y un máximo de 1,5 kV, pero de nuevo no dan ninguna indicación sobre condiciones determinadas que podrían conducir a transportar ADN hasta el núcleo.
A partir del documento WO 91/18103 A1 se conoce un procedimiento para la introducción de ADN en células de ratas en el que el ADN se introduce en las células mediante un primer impulso con una intensidad de campo de 750 V/cm y un segundo impulso con una intensidad de campo de 250 V/cm. Además se describen procedimientos correspondientes para células de levaduras y de bacterias, en los que se utilizan intensidades de campo superiores para el primer impulso de 7.500 V/cm o 12.500 V/cm.
Kim et al. (1991) describen un procedimiento para la introducción de proteínas en células CHO en el que la electroporación con una intensidad de campo de 5.000 V/cm se combina con una centrifugación simultánea.
De Chasseval y de Villartay (1991) describen un procedimiento para la transfección de líneas celulares que se lleva a cabo con un primer impulso de 1.000 V para una constante de tiempo de 800 \mus y un segundo impulso de 150 V para una constante de tiempo de 40 ms.
Pero los procedimientos conocidos hasta la fecha no posibilitan el transporte efectivo de ADN y/u otras moléculas biológicamente activas hasta el núcleo celular de células eucariotas superiores con baja mortalidad de las células.
Por tanto, la invención se basa en el objetivo de proporcionar un procedimiento que posibilite el transporte eficiente de ADN y/u otras moléculas biológicamente activas hasta el núcleo celular de células eucariotas superiores con mortalidad celular baja, de manera independiente de la división celular y que acorte de manera considerable el tiempo entre la transfección y el posterior análisis de las células transfectadas.
El objetivo se alcanza mediante un procedimiento del tipo mencionado al principio en el que la introducción en el núcleo de células primarias se consigue de manera independiente a la división celular, mediante un impulso con una intensidad de campo de 2-10 kV/cm y una duración de al menos 10 \mus y una intensidad de corriente de al menos 1 A.
En la presente solicitud, se describen por primera vez condiciones eléctricas específicas que median el transporte nuclear eficiente de ADN en células primarias, de manera independiente de la división celular y tales descargas y corrientes que producen en lo anterior una mortalidad celular especialmente baja. También se describen tampones y modos de proceder experimentales optimizados para una mortalidad celular baja.
Descripción de la invención
En el caso del procedimiento descrito en el presente documento se utilizan intensidades de campo muy elevadas desde 2 hasta 10 kV/cm para una duración de al menos 10 \mus y una intensidad de corriente de al menos 1 A, para que el ADN y/u otras moléculas biológicamente activas lleguen al núcleo de células primarias de manera independiente de la división celular. Estas intensidades de campo se encuentran muy por encima de las intensidades de campo habituales para la electroporación y muy alejadas de las que son suficientes para la apertura eficiente de poros en la membrana celular (promedio de 1 kV/cm según Lurquin, 1997). Probablemente, las altas tensiones utilizadas conducen a una formación de poros en ambas membranas de la envoltura nuclear o los complejos del poro nuclear existentes se vuelven más permeables para moléculas, de modo que se posibilita un transporte muy efectivo de las moléculas biológicamente activas hasta el núcleo celular. En este sentido, el impulso debe presentar una duración de al menos 10 \mus para conseguir un efecto de transporte nuclear.
En lo anterior, el término "moléculas biológicamente activas" comprende ácidos nucleicos, péptidos, proteínas, polisacáridos, lípidos o combinaciones o derivados de estas moléculas, con tal de que desarrollen una actividad biológica en la célula.
En este sentido, la introducción de ácidos nucleicos, péptidos, proteínas y/u otras moléculas biológicamente activas en el núcleo celular puede conseguirse preferiblemente mediante un impulso con una intensidad de campo de 3-8 kV/cm, con lo que en una conformación preferida de la invención el impulso debería ser como máximo de 200 \mus de duración. Para una tensión de 1-2 V sobre una célula, se obtiene la apertura reversible, eficiente de los poros en la membrana celular (Zimmermann et al., 1981). Esto se corresponde, para un diámetro de célula de 10-20 \mum, con 1 kV/cm como promedio. En el caso de duraciones de pulso inferiores a 1 ms, una tensión claramente más alta debería conducir a una rotura irreversible de la membrana (Zimmermann et al., 1981), pero a lo que no se llega con la realización del procedimiento según la invención. En el procedimiento según la invención, se prefiere especialmente mantener la duración del pulso corta, como máximo 200 \mus, de modo que también para 2-10 kV/cm, preferiblemente 3-8 kV/cm, no pueda aparecer ninguna lesión esencialmente irreversible de la membrana, pero elegirla lo suficientemente larga como para que se consiga, sin embargo, el efecto de transporte nuclear.
En una forma de realización preferida del procedimiento, al impulso le sigue sin interrupción un flujo de corriente desde 1 A hasta un máximo de 2,5 A con una duración desde 1 ms hasta un máximo de 50 ms.
La transfección mediante corriente eléctrica se basa en dos efectos: la electropermeación de la membrana celular y la electroforesis de ADN a través de los poros de membrana formados. Normalmente, los impulsos de electroporación descritos cumplen ambas condiciones, con independencia de su formación y su forma exacta, de modo que al principio del impulso existe una tensión que es lo suficientemente alta como para abrir poros en la membrana celular del tipo celular correspondiente y la posterior evolución del impulso es suficiente para la electroforesis del ADN.
En formas de realización preferidas de la presente invención, se utilizan al principio del impulso intensidades de campo de 2-10 kV/cm durante 10-200 \mus para el transporte de ADN y/u otras moléculas biológicamente activas a través de la membrana nuclear hasta el núcleo, con lo que la electroforesis posterior tiene lugar en condiciones habituales.
Mediante la brevedad del impulso fuerte y la pequeña intensidad y/o brevedad del flujo de corriente siguiente, se optimiza la transfección con transporte nuclear eléctrico para tasas elevadas de supervivencia de las células, a pesar de las tensiones muy altas del principio. En este sentido, puede producirse un ajuste preciso en función del tipo de células primarias. Como el impulso corto de tensión muy alta también puede contribuir a la electroforesis del ADN, en el caso de algunos tipos celulares también posibilita que el flujo de corriente posterior pueda reducirse sumamente u omitirse completamente.
En una versión preferida, en primer lugar se expone una cubeta rellena con tampón, células y ácidos nucleicos (y posiblemente otras moléculas biológicamente activas) a un impulso de corta duración (de 10-200 \mus de duración) con una intensidad de campo de 2-10 kV/cm, al que sigue una corriente de como máximo 2,5 A durante de 1 a 50 ms.
En una versión más preferida, en primer lugar se expone una cubeta rellena con tampón, células y ácidos nucleicos (y posiblemente otras moléculas biológicamente activas) a un impulso de corta duración (de 10-100 \mus de duración) con una intensidad de campo de 3-8 kV/cm, al que sigue sin interrupción una corriente de como máximo 2,2 A durante de 1 a 30 ms.
Como este método de transfección es independiente de la división celular, además de células activas en fase de división también pueden transfectarse células primarias en reposo o poco activas en fase de división.
Según la invención, se transfectan células primarias, como por ejemplo, células de sangre humana periférica, tratándose preferiblemente de células T, células B o células precursoras pluripotenciales de la sangre humana.
Otra forma de realización preferida comprende células primarias de médula ósea humana.
Las células eucariotas primarias transfectadas con el procedimiento según la invención pueden utilizarse para procedimientos diagnósticos y para la producción de un medicamento para la terapia génica ex vivo.
En el caso de líneas celulares y células primarias activas en fase de división puede aumentarse la eficiencia de transfección, ya que el ADN no tiene que permanecer en el citoplasma hasta la división celular, donde podría degradarse, y ya que las células, que no se han dividido hasta el análisis, también pueden analizarse.
Además, es posible un análisis incluso muy pronto tras la transfección, lo que conduce a una aceleración considerable de los experimentos. En los experimentos de transfección con vectores de expresión, ya es posible un análisis, según el promotor y la proteína expresada, a partir de aproximadamente 2 horas tras la transfección. Debido al tiempo de permanencia muy corto del ADN transfectado en el citoplasma, el ADN no se expone allí además a la acción de las nucleasas.
Con el transporte nuclear eléctrico pueden transportarse hasta el núcleo, en células activas en fase de división, cantidades de ADN más grandes que lo que se esperaría sólo como resultado de la división celular. En ambos casos, aumenta la probabilidad de una integración de casetes de expresión completos.
Por el término "transporte nuclear eléctrico" se entiende el transporte de moléculas biológicamente activas hasta el núcleo de células eucariotas superiores, que es independiente de la división celular y se produce mediante corriente eléctrica.
En este sentido, la molécula biológicamente activa que debe introducirse en el núcleo celular es preferiblemente un ácido nucleico, especialmente ADN o presenta preferiblemente al menos una parte de ácidos nucleicos.
En este sentido, los ácidos nucleicos también pueden presentarse en el complejo o en unión con péptidos, proteínas, polisacáridos, lípidos o combinaciones o derivados de estas moléculas. Las moléculas complejadas o unidas con el ácido nucleico sirven para la integración del ácido nucleico transferido en el genoma de la célula, para la localización o retención intranuclear, para la asociación con la cromatina o para la regulación de la expresión.
En una forma de realización preferida, las moléculas complejadas con los ácidos nucleicos que sirven para la integración del ácido nucleico transferido en el genoma de la célula, se seleccionan del grupo que comprende integrasas retrovirales, transposasas procariotas, transposasas eucariotas, recombinasas específicas de secuencias, topoisomerasas, RecA de E. coli, RecE de E. coli, RecT de E. coli, Red \alpha del fago \lambda, Red \beta del fago \lambda y terminasa del fago \lambda.
En una forma de realización especialmente preferida, las moléculas complejadas o unidas con el ácido nucleico que sirven para la retención intranuclear o para la asociación con la cromatina, comprenden dominios de la proteína EBNA-1 de VEB. Entre estos dominios figuran los aminoácidos 8-54 y/o 72-84 o 70-89 y/o 328-365 de la proteína EBNA-1 (Marechal et al., 1999).
Un tampón que es adecuado para la utilización en el procedimiento según la invención es el "tampón 1" con la siguiente composición: Ca(NO_{3})_{2} 0,42 mM; KCl 5,36 mM; MgSO_{4} 0,41 mM; NaCl 103 mM; NaHCO_{3} 23,8 mM; Na_{2}HPO_{4} 5,64 mM; D(+)-glucosa 11,1 mM; glutation 3,25 \muM; Hepes 20 mM; pH 7,3.
Para introducir ácidos nucleicos en el núcleo celular de células eucariotas puede procederse según el siguiente protocolo: se incuban en una cubeta con 2 mm de separación de los electrodos, 1 x 10^{5} - 1 x 10^{7} células y hasta 10 \mug de ADN en 100 \mul de tampón 1, durante 10 min. a temperatura ambiente y después se transfectan siguiendo las condiciones según la invención. Inmediatamente después se sacan de la cubeta lavando las células con 400 \mul de medio de cultivo celular sin suero y se incuban durante 10 min. a 37ºC. A continuación, las células se cultivan en medio de cultivo celular caliente a 37ºC (con suero).
El transporte nuclear eléctrico de proteínas puede realizarse, por ejemplo, según el siguiente protocolo: se transfectan en 1 x 10^{5} - 1 x 10^{7} células hasta 10 \mug de proteína en 100 \mul de tampón adecuado siguiendo las condiciones según la invención. Inmediatamente después se sacan de la cubeta lavando las células con 400 \mul de medio de cultivo celular sin suero y se incuban durante 10 min. a 37ºC. A continuación, las células se cultivan en medio de cultivo celular caliente a 37ºC (con suero) y se analizan tras un máximo de 6 horas de incubación.
Cubetas adecuadas son, por ejemplo, aquellas con una separación de electrodos de 2 mm o 1 mm, como por ejemplo, las cubetas habituales en el comercio para la electroporación de procariotas.
Según la invención, las abreviaturas utilizadas poseen el siguiente significado
Además de las abreviaturas habituales del diccionario "Duden", se utilizaron las siguientes abreviaturas:
FACS fluorescence activated cell sorting (clasificación de células activadas mediante fluorescencia)
FCS suero bovino fetal
h hora
kV kilovoltio
ms milisegundo
\mus microsegundo
PBMC células sanguíneas mononucleares periféricas
PE ficoeritrina
Figuras
La invención se explica además mediante las siguientes figuras:
Las figuras 1(a) y 1(b) muestran la eficiencia de transfección de células T cooperadoras frente a la intensidad de campo para un impulso de 40 \mus de duración (a) y frente al tiempo de impulso para 5 kV/cm (b).
Las figuras 2 (a) y (b) muestran la eficiencia de transfección de células T cooperadoras tras un impulso de 5 kV/cm durante 40 \mus, al que se incorpora sin interrupción un flujo de corriente de diferente intensidad y duración.
La figura 3 muestra el análisis mediante FACScan ("fluorescence activated cell scanning" [análisis de células activadas mediante fluorescencia]) de las PMBC transfectadas con el vector de expresión H-2K^{k}. Las células se incubaron sucesivamente con anticuerpo anti-H-2K^{k} acoplado a digoxigenina y anticuerpo anti-digoxigenina acoplado a Cy5, así como para la identificación de las células T cooperadoras se incubaron con anticuerpo un anti-CD4 acoplado a ficoeritrina (PE) y se analizaron mediante citometría de flujo. Se determinó la cantidad de células muertas con tinción de yoduro de propidio (canal de fluorescencia no teñido FL3) (SSC = "side scatter" [dispersión lateral], FSC = "forward scatter" [dispersión frontal]).
La figura 4 representa un análisis de FACScan del transporte nuclear eléctrico en células endoteliales primarias (activas en fase de división) de cordón umbilical humano (HUVEC) que se transfectaron mediante un impulso de 5 kV/cm durante 70 \mus, seguido de un flujo de corriente de 2,2 A durante 10 ms. Tras 4 horas, las células se incubaron sucesivamente con anticuerpo anti-H-2K^{k} acoplado a digoxigenina y anticuerpo anti-digoxigenina acoplado a Cy5, así como yoduro de propidio (canales de fluorescencia no teñidos FL2 y FL3) y se analizaron mediante citometría de flujo (FACScan) (SSC = "side scatter" [dispersión lateral], FSC = "forward scatter" [dispersión frontal]).
La figura 5 muestra un análisis de FACScan del transporte nuclear eléctrico en una línea celular (HeLa), durante 3 horas después de que se transfectara mediante un impulso de 4 kV/cm durante 100 \mus con un vector de expresión H-2K^{k}. Tras 4 horas, las células se incubaron sucesivamente con anticuerpo anti-H-2K^{k} acoplado a digoxigenina y anticuerpo anti-digoxigenina acoplado a Cy5, así como yoduro de propidio (canales de fluorescencia no teñidos Fl2 y FL3) y se analizaron mediante citometría de flujo (FACScan) (SSC = "side scatter" [dispersión lateral], FSC = "forward scatter" [dispersión frontal]).
La figura 6 muestra el transporte nuclear eléctrico de una proteína activadora de la transcripción (HPV 18-E2) mediante el análisis de su acción sobre un constructo indicador ("reporter") (pC18Sp1luc) en células HeLa. La medición tuvo lugar a las 6 horas, tras las cuales se introdujeron en las células la proteína y plásmido mediante un impulso de 4 kV/cm durante 100 \mus.
La figura 7 muestra dos diagramas de mediciones citométricas de flujo del transporte nuclear eléctrico de los complejos represor Lac - ADN en células CHO, a las 5 horas y media tras las cuales se transfectaron con el complejo proteína - ADN mediante un impulso de 5 kV/cm durante 70 \mus, seguido sin interrupción de un flujo de corriente de 2,2 A y 60 ms.
La figura 8 muestra dos diagramas de análisis citométricos de flujo del transporte nuclear eléctrico de complejos ADN - péptido en células CHO y K562. Los complejos se introdujeron en células CHO mediante un impulso de 5 kV/cm durante 70 \mus, seguido de un flujo de corriente de 2,2 A durante 40 ms y en células K562 mediante un impulso de 5 kV/cm durante 100 \mus, seguido de un flujo de corriente de 5 A durante 10 ms. El análisis tuvo lugar cuatro horas tras la transfección.
Ejemplos
Los siguientes ejemplos ilustran la invención, sin embargo no deben entenderse como limitantes.
Ejemplo 1 Transporte nuclear eléctrico frente a la intensidad de campo y el tiempo de impulso
Se transfectaron células mononucleares no estimuladas (inactivas en fase de división), recién producidas a partir de sangre humana periférica (PBMC) con un vector que codifica para la cadena pesada de la proteína del MHC clase I de ratón, H-2K^{k}. En una cubeta con 2 mm de separación de los electrodos, se dispusieron 1 x 10^{6} células con 10 \mug de ADN - vector en tampón 1, a temperatura ambiente y se transfectaron según las condiciones especificadas. Inmediatamente después se sacan de la cubeta lavando las células con 500 \mul de medio RPMI (sin suero bovino fetal, FCS), se incubaron durante 10 minutos a 37ºC y se trasladaron después a una placa de cultivo con medio calentado previamente (con FCS). Tras 5 horas de incubación, las células se incubaron sucesivamente con anticuerpo anti-H-2K^{k} acoplado a digoxigenina y anticuerpo anti-digoxigenina acoplado a Cy5, así como con un anticuerpo anti-CD4 acoplado a ficoeritrina (PE) para la identificación de las células T cooperadoras y se analizaron mediante citometría de flujo (FACScan). Se determinó la cantidad de células muertas mediante tinción con yoduro de
propidio.
La figura 1 muestra la eficiencia de transfección de las células T cooperadoras frente a la intensidad de campo para un impulso de 40 \mus de duración (a) y frente al tiempo de impulso para 5 kV/cm (b).
Ejemplo 2 Aumento de la eficiencia del transporte nuclear eléctrico mediante un flujo de corriente subsiguiente al impulso
Se transfectaron PBMC no estimuladas, recién producidas, tal como se describe en el ejemplo 1, con un vector de expresión H-2K^{k}. A un impulso de 5 kV/cm durante 40 \mus le siguió sin interrupción un flujo de corriente de diferente intensidad y diferente duración. Tras 5 horas de incubación, las células se analizaron tal como en el ejemplo 1 y se determinó la eficiencia de transfección de las células T cooperadoras (figura 2).
Ejemplo 3 Transfección de PBMC
Se transfectaron PBMC no estimuladas, recién producidas, tal como se describe en el ejemplo 1, con un vector de expresión H-2K^{k} mediante un impulso de 5 kV/cm durante 40 \mus, seguido de un flujo de corriente de 2,2 A durante 20 ms y se analizaron tal como en el ejemplo 1.
La figura 3 muestra el análisis de la proporción de células transfectadas en la fracción CD4-positiva y CD4-negativa de las PBMC. El 36% de las células CD4+ y el 19% de las células CD4- expresan el ADN transfectado. De la tasa de mortalidad, que es del 26%, tres cuartas partes se deben al procedimiento de transfección.
Ejemplo 4 Transporte nuclear eléctrico en células endoteliales primarias (activas en fase de división) de cordón umbilical humano (HUVEC)
Las células HUVEC se transfectaron tal como en el ejemplo 1 con un vector de expresión H-2K^{k} mediante un impulso de 5 kV/cm durante 70 \mus, seguido de un flujo de corriente de 2,2 A durante 10 ms y tras 4 horas se incubaron sucesivamente con anticuerpo anti-H-2Kk acoplado a digoxigenina y anticuerpo anti-digoxigenina acoplado a Cy5, así como yoduro de propidio y se analizaron mediante citometría de flujo (FACScan).
Tal como se muestra en la figura 4, el 58% de las células expresan el ADN transfectado con una mortalidad del 32%. Si se llevara ADN hasta el citoplasma mediante transfección en el 100% de las células para una duración de división celular de 24 horas y se descontara una fase de regeneración tras la transfección, tras 4 horas el ADN podría llegar al núcleo mediante la rotura de la envoltura nuclear en el 16% de las células como máximo.
Ejemplo 5 Transporte nuclear eléctrico en una línea celular (HeLa)
Las células HeLa se transfectaron tal como en el ejemplo 4 mediante un impulso de 4 kV/cm durante 100 \mus y tras 3 horas se analizaron. Tal como se muestra en al figura 5, el 28% de las células expresan el ADN transfectado con una mortalidad del 5,5%. Si se llevara ADN hasta el citoplasma mediante transfección en el 100% de las células para una duración de división celular de 24 horas y se descontara una fase de regeneración tras la transfección, tras 3 horas el ADN podría llegar al núcleo mediante la rotura de la envoltura nuclear en el 12,5% de las células como má-
ximo.
Ejemplo 6 Eficiencias de transfección de diferentes líneas celulares y células primarias no estimuladas
Se transfectaron 1 x 10^{6} PBMC, otras células primarias o células de líneas celulares, según el modo de proceder descrito en el ejemplo 1, con vectores de expresión diferentes y con los ajustes especificados análogos a los del ejemplo 1. Con el análisis citométrico de flujo (FACScan) posterior se identificaron las distintas subpoblaciones mediante anticuerpos específicos. En la siguiente tabla 1 se especifican las eficiencias medias de transfección. Para el análisis de la transfección de células precursoras CD34^{+}, se transfectaron 2,5-5 x 10^{6} PBMC. Se llevó a cabo un primer análisis de las eficiencias de transfección tras 3,5 horas, porque en ese intervalo de tiempo ninguna o en el caso de líneas celulares sólo pocas células se habían dividido. Los valores marcados con un asterisco (*) se obtuvieron a los 3 días tras la transfección y se encontraban al mismo nivel que los valores a las 24 horas.
Ejemplo 7 Transporte nuclear eléctrico de proteína HPV18-E2 en células HeLa
El transporte nuclear eléctrico de proteínas puede demostrarse, por ejemplo, mediante la transfección simultánea de proteínas activadoras de la transcripción y constructos indicadores, cuya expresión se activa en el núcleo celular mediante las moléculas activadoras que se unen. Con esta finalidad, las células HeLa se transfectaron con el vector pC18Sp1luc, un plásmido, que también contiene además de la secuencia indicadora de luminiscencia cuatro lugares de unión para el activador de la transcripción del virus del papiloma, HPV18-E2, antes de la secuencia promotora, y proteína HPV18-E2 purificada. En lo anterior, se dispusieron 1 x 10^{6} células en una cubeta con 200 ng de ADN - vector y 8 ng de proteína en tampón, a temperatura ambiente y se transfectaron mediante un impulso de 4 kV/cm durante 100 \mus. Se analizaron las células tras 6 horas de incubación a 37ºC y CO_{2} al 5% mediante medición de la actividad relativa de luminiscencia.
La figura 6 muestra la cotransfección del ADN - vector con la proteína, representándose como valor de control una mezcla básica sin proteína. En la cotransfección con 8 ng de proteína se observa un aumento claro de la actividad de luminiscencia con respecto al control, lo que demuestra que el activador de la transcripción ha llegado al núcleo celular y ha producido una expresión de la secuencia indicadora. Con el procedimiento según la invención, también es posible la introducción de proteínas en el núcleo celular de células eucariotas.
Ejemplo 8 Transporte nuclear eléctrico de anticuerpos
Puede conseguirse un transporte nuclear eléctrico de anticuerpos, por ejemplo, según el siguiente planteamiento. Se transfectaron 1 x 10^{6} células HeLa con un anticuerpo dirigido contra el complejo proteico específico del núcleo, ND10, en 100 \mul de disolución tampón, a temperatura ambiente con un impulso de 4 kV/cm durante 10 \mus, seguido sin interrupción por un flujo de corriente de 5 A y 10 ms. Inmediatamente después de la descarga del pulso, las células se sacan de la cubeta lavándolas con 400 \mul de medio de cultivo sin suero y se incubaron durante 10 min. a 37ºC. Las células se cultivaron en un medio de cultivo celular (con suero) calentado a 37ºC y se incubaron durante 5 horas a 37ºC y CO_{2} al 5%. Posteriormente, se fijaron en formaldehído / glutaraldehído, se permeabilizaron con Triton X100, se incubaron con un anticuerpo marcado con FITC (isotiocianato de fluoresceína), específico para el anticuerpo anti-ND10 y se analizaron mediante microscopía de fluorescencia.
Ejemplo 9 Transporte nuclear eléctrico de complejos proteína - ADN en células CHO
El transporte nuclear eléctrico de complejos proteína - ADN puede demostrarse, por ejemplo, mediante la represión de la expresión de complejos represor - plásmido indicador transfectados. Con esta finalidad, se transfectaron células CHO con un vector (pSpe(LacO)_{1}-H2K^{k}), que presenta una secuencia Lac - operador entre el promotor y la secuencia marcadora de H2K^{k}, y se unieron a las moléculas de represor Lac. Simultáneamente, se cotransfectaron las células con el vector pMACS4.1, que codifica para el CD4 humano y que no contiene ninguna secuencia Lac - operador, de modo que las moléculas de represor Lac no pueden unirse de manera específica a las mismas. En este sentido, se incubaron 1 x 10^{6} células con 1 \mug de ADN - vector de expresión H2K^{k} con secuencia LacO y 1 \mug de ADN - vector de expresión de CD4 sin secuencia LacO en tampón, a temperatura ambiente con 200 ng de proteína represora Lac durante 30 min., se dispusieron en una cubeta y se transfectaron mediante un impulso de 5 kV/cm durante 70 \mus, seguido de un flujo de corriente de 2,2 A durante 60 ms. Tras 5,5 horas de incubación, las células se tripsinizaron a 37ºC y CO_{2} al 5%, se tiñeron y se analizaron para determinar la expresión de los marcadores correspondientes mediante citometría de flujo. Se analizó la expresión de H2K^{k} mediante incubación con anticuerpo anti-H-2K^{k} acoplado a Cy5 y la expresión de CD4 mediante incubación con anticuerpo anti-CD4 acoplado a ficoeritrina
(PE).
Los resultados de los dos experimentos representados en la figura 7 muestran la expresión de las secuencias de marcador tras la transfección del complejo proteína - ADN, de manera correspondiente con y sin represor Lac unido. En el caso de represor Lac específicamente unido (vector de expresión H2K^{k} con secuencia LacO, plásmido 1), se observa una represión clara de la expresión de H2K^{k} con respecto al control sin represor Lac, mientras que sin unión específica del represor Lac (vector de expresión de CD4 sin secuencia LacO, plásmido 2) no se produjo ninguna represión de la expresión de CD4. Esto demuestra que el complejo proteína - ADN ha llegado al núcleo celular y que la proteína represora ha producido una disminución de la expresión de la secuencia de marcador. Con el procedimiento según la invención, también es posible la introducción de complejos proteína - ADN en el núcleo celular de células eucariotas.
Ejemplo 10 Transporte nuclear eléctrico de complejos ADN - péptido
El transporte nuclear de complejos ADN - péptido puede mostrarse, por ejemplo, mediante una represión de la expresión de un plásmido indicador mediante unión de PNA (ácido nucleico peptídico) a una secuencia que une PNA entre el promotor y el casete indicador de un plásmido indicador antes de la transfección. Se incubó 1 \mug de vector de expresión H-2K^{k} en Tris 10 mM, EDTA 1 mM con péptido PNA 25 \muM (baja concentración) o péptido PNA 50 \muM (alta concentración) durante 15 min. a 65ºC. El vector de expresión se utilizó en dos variantes, con y sin secuencia que une PNA específica, además se utilizaron péptidos PNA inespecíficos (péptido 1) y péptidos PNA que unen específicamente (péptido 2). La unión a PNA específica conduce al enmascaramiento de un lugar de corte de restricción y se detectó mediante un análisis de restricción correspondiente. Los péptidos PNA utilizados tenían la siguiente secuencia que une a ADN: NH_{2}-CCTTTCTCCCTTC-péptido (péptido 1) o NH_{2}-CTCTTCCTTTTTC-péptido (péptido 2). La parte peptídica pura tenía la siguiente secuencia: NH_{2}-GKPTADDQHSTPPKKKRKVED-COOH. En la transfección de células K562 se utilizó una parte peptídica con la siguiente secuencia: NH_{2}-GKPSSDDEATADSQHSTPPKKKRKVED-COOH. Tras la incubación, los complejos se transfectaron mediante un impulso de 5 kV/cm durante 70 \mus, seguido de un flujo de corriente de 2,2 A durante 40 ms en células CHO y mediante un impulso de 5 kV/cm durante 100 \mus, seguido de un flujo de corriente de 5 A durante 10 ms en células K562. Tras 4 horas de incubación de las células a 37ºC y CO_{2} al 5%, éstas se tiñeron con anticuerpo anti-H-2K^{k} acoplado a Cy5 y se analizaron para determinar la expresión de H-2K^{k} mediante citometría de flujo.
La figura 8 muestra la acción de la unión específica y la interacción inespecífica de péptido PNA con el ADN - vector sobre la expresión de un constructo indicador y con ello, que el complejo ADN - péptido ha llegado al núcleo celular. Con el procedimiento según la invención también es posible la introducción de complejos ADN - péptido en el núcleo celular de células eucariotas.
TABLA 1
Tipo celular Condiciones % + tras 3,5 h % + tras 24 h
PBMC
CD4^{+} (células T_{H}) 1000 V 40 \mus / 30-60 35-70*
2,2 A 30 ms
CD8^{+} (células T_{C}) 1000 V 70 \mus / 20-70 35-75*
2,2 A 10 ms
CD14^{+} (monocitos) 1000 V 70 \mus / 30-50 10-20
1,0 A 1 ms
CD19^{+} (células B) 800 V 70 \mus / 10-40 10-50*
2,0 A 30 ms
CD34^{+} (células 1000 V 70 \mus / 40-60 40-50
madre) 2,2 A 10 ms
Cordón umbilical
HUVEC 800 V 70 \mus / 60-70 80-90
2,0 A 10 ms
Células embrionarias de gallina
Neuronas 800 V 40 \mus / 30 50
0,1 A 1 ms
Fibroblastos 1000 V 50 \mus / 30 60
0,1 A 1 ms
Líneas celulares
HeLa 1000 V 40 \mus / >30 n.d.
2,2 A 1 ms
CHO 1000 V 50 \mus / 20-30 n.d.
1,6 A 10 ms
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Claims (12)

1. Procedimiento para introducir moléculas biológicamente activas en el núcleo celular de células eucariotas superiores con ayuda de corriente eléctrica, según el cual se consigue la introducción en el núcleo de células primarias, de manera independiente a la división celular, mediante un impulso con una intensidad de campo de 2-10 kV/cm y una duración de al menos 10 \mus y una intensidad de corriente de al menos 1 A.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, según el cual la intensidad de campo del impulso es de 3-8 kV/cm.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, según el cual el impulso tiene una duración máxima de 200 \mus.
4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, según el cual al impulso le sigue sin interrupción una corriente de flujo de desde 1 A hasta un máximo de 2,5 A durante 1 ms hasta un máximo de 50 ms de duración.
5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, según el cual la molécula biológicamente activa es un ácido nucleico o presenta al menos una parte de ácido nucleico.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, según el cual el ácido nucleico se presenta en el complejo o en unión con péptidos, proteínas, polisacáridos, lípidos o combinaciones o derivados de estas moléculas.
7. Procedimiento según la reivindicación 6, según el cual las moléculas complejadas o unidas con el ácido nucleico sirven para la integración del ácido nucleico transferido en el genoma de la célula, para la localización o retención intranuclear, para la asociación con la cromatina o para la regulación de la expresión.
8. Procedimiento según la reivindicación 6, según el cual las moléculas complejadas con el ácido nucleico que sirven para la integración del ácido nucleico transferido en el genoma de la célula, se seleccionan del grupo que comprende integrasas retrovirales, transposasas procariotas, transposasas eucariotas, recombinasas específicas de secuencias, topoisomerasas, RecA de E. coli, RecE de E. coli, RecT de E. coli, Red \alpha del fago \lambda, Red \beta del fago \lambda y terminasa del fago \lambda.
9. Procedimiento según la reivindicación 6, según el cual las moléculas complejadas o unidas con el ácido nucleico que sirven para la retención intranuclear o para la asociación con la cromatina, comprenden dominios de la proteína EBNA-1 de VEB.
10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-9, según el cual las células eucariotas son células de sangre humana periférica.
11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-9, según el cual las células eucariotas son células precursoras pluripotenciales de sangre humana.
12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1-9, según el cual las células eucariotas son células de médula ósea humana.
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