ES2232811T3 - Pruebas sobre anticuerpos para la amilina. - Google Patents
Pruebas sobre anticuerpos para la amilina.Info
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Abstract
YN ANTICUERPO MONOCLONAL QUE ENLAZA EN EL EXTREMO TERMINAL C DE AMILINA HUMANA, Y ENSAYOS QUE UTILIZAN MONOCLONALES PARA LA DETECCION DE AMILINA Y ANALOGOS DE AMILINA.
Description
Pruebas sobre anticuerpos para la amilina.
Esta invención está relacionada con las pruebas
sobre anticuerpos para la amilina.
La amilina es una proteína que se expresa en las
células beta de los islotes pancreáticos y secretada en la sangre
como respuesta ante la ingestión de nutrientes. Su estructura y
actividades biológicas se describen en una publicación de Amylin
Pharmaceuticals, Inc. (anteriormente llamada Amylin Corporation),
"Science and Corporate Review" de octubre de 1991, la cual ha
sido incluida aquí por referencia.
Hay la necesidad de monitorizar los niveles de
amilina en los diabéticos tipo I (los cuales poseen niveles de
amilina circulante bajos o insignificantes), en diabéticos tipo II y
individuos obesos (que presentan niveles de amilina circulante
excesivos), y en otras condiciones en las cuales los niveles de
amilina pueden verse alterados y deberían ser determinados o bien de
algún modo evaluados periódicamente. También es necesaria una prueba
que sea específica para la amilina (debido a su homología con los
péptidos relacionados genéticamente con la calcitonina) y que sea
sensible (debido a las cantidades muy pequeñas de amilina
circulante). Además, hay la necesidad de una prueba que pueda ser
usada para monitorizar sustancias análogas a la amilina (tales como
el AC-0137) que están siendo evaluadas para su uso
en el tratamiento de diabéticos tipo I.
EP-A-289287
describe la secuencia de aminoácidos de la amilina. También
proporciona amilina sintética y péptidos similares a la amilina, una
amilina sustancialmente pura, varios hexapéptidos y heptapéptidos
relacionados con la amilina y los procesos para la preparación de
péptidos asociados con la diabetes, incluyendo un vector que
contiene un código de la secuencia genética la amilina. Se proponen
anticuerpos que actúan contra la amilina y péptidos similares a la
amilina.
WO-89/06135 describe compuestos y
métodos para bloquear los efectos de la amilina o de agonistas de la
amilina tales como el péptido relacionado con el gen del calcio
(CGRP) en el tratamiento de la diabetes tipo II. Los inhibidores
incluyen péptidos o subpéptidos substituidos de la amilina o el
CGRP, amilina cross-linked y agonistas de la
amilina, amilina sintética, anticuerpos receptores
anti-amilina y anticuerpos
anti-idiotipo, y anticuerpos contra zonas activas de
la amilina y los agonistas de la amilina.
El solicitante ha descubierto que los anticuerpos
que se unen específicamente a los extremos
C-terminal amidados de la amilina humana son
particularmente ventajosos en las pruebas basadas en anticuerpos
para la detección de la amilina humana o de análogos de la misma,
comprendiendo la secuencia de aminoácidos entre los aminoácidos 30 y
37 de la amilina humana y amidada en el extremo
C-terminal. En concreto, el solicitante ha
descubierto que los anticuerpos monoclonales contra el extremo
C-terminal de la amilina humana pueden ser
seleccionados ya que reconocen la secuencia de aminoácidos entre los
residuos 30 y 37, ambos inclusive, en la amilina y, lo que es muy
importante, pueden diferenciar entre el extremo
C-terminal amidado de la amilina humana y el extremo
C-terminal no amidado. La amilina humana no amidada
(llamada también "amilina ácida") es virtualmente, si no
completamente, inactiva mientras que la amilina humana (cuyo 37º
aminoácido es la tirosina-amida) es totalmente
bioactiva. Dichos anticuerpos son útiles para detectar la presencia
o cantidad de un análogo de la amilina en una muestra de un test y,
en particular, son útiles en las pruebas competitivas o
sandwich para la amilina.
Así pues, en un primer aspecto, la presente
invención ofrece un anticuerpo monoclonal que enlaza o reconoce el
extremo C-terminal amidado de la amilina humana y no
lo hace con el extremo C-terminal de la amilina
humana.
Por "enlaza o reconoce" entendemos que un
resultado de enlace positivo se obtiene utilizando procedimientos de
pruebas estándar tal y como se describe más adelante en el Ejemplo
1.
El término "anticuerpo monoclonal" se
refiere a un anticuerpo purificado producido a partir de un solo
clon de una célula productora de anticuerpos. Dichos anticuerpos
monoclonales son distintos de los anticuerpos policlonales los
cuales incluyen una pluralidad de anticuerpos producidos por una
pluralidad de células productoras de anticuerpos en un organismo
vivo.
En las formas de realización preferente, el
anticuerpo monoclonal reconoce el extremo C-terminal
de la amilina humana que tiene la secuencia de aminoácidos amidados
entre los aminoácidos 30 y 37 de la amilina.
La presente invención presenta un anticuerpo
monoclonal que enlaza con el extremo C-terminal
amidado de la amilina humana y no con el extremo no amidado. Por
ejemplo, la presente invención incluye el anticuerpo monoclonal
denominado como F025-27 depositado en la American
Type Culture Collection el 15 de mayo de 1992 y habiéndosele
asignado el número HB 11045.
En otro aspecto, la presente invención presenta
una prueba para detectar la presencia o cantidad de un análogo de la
amilina, comprendiendo la secuencia de aminoácidos entre los
aminoácidos 30 y 37 de la amilina humana y amidada en el extremo
C-terminal. La prueba incluye el uso de un
anticuerpo monoclonal que enlaza con el extremo
C-terminal de la amilina humana. A título de
ejemplo, una prueba que utiliza un anticuerpo monoclonal para
detectar la presencia o cantidad de un análogo de la amilina puede
comprender los pasos de contactar dicho análogo de la amilina o una
muestra sospechosa de contener dicho análogo con dicho anticuerpo
monoclonal, y determinar la presencia o cantidad de dicho análogo de
la amilina en el cual dicho anticuerpo monoclonal enlaza con el
extremo C-terminal de la amilina humana. La prueba
puede ser competitiva o sandwich. En el formato
sandwich la prueba incluye un segundo anticuerpo
anti-amilina monoclonal o policlonal, y el primer o
segundo anticuerpo se etiqueta como típicamente detectable.
Por "análogo de la amilina" entendemos
análogos que comprenden la secuencia de aminoácidos entre los
aminoácidos 30 y 37 de la amilina humana los cuales se encuentran
amidados en el extremo C-terminal. Dichos análogos
incluyen no solamente las formas de amilina producidas de forma
natural (incluyendo amilina humana y de rata), sino también
proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos sustancialmente
similar a aquella de la amilina pero conteniendo una o más
delecciones o adiciones de aminoácidos dentro de esa secuencia o
bien incluyendo la substitución de uno o más aminoácidos
generalmente con un aminoácido conservado. Por ejemplo, la glicina
puede ser remplazada por una valina, o un aminoácido con carga
positiva puede ser remplazado por otro aminoácido con carga
positiva. Dichos análogos de la amilina presentan una actividad
biológica similar o idéntica a la amilina producida de forma natural
considerada de secuencia muy similar a la de dicho análogo. Dichos
análogos son útiles en el tratamiento de múltiples enfermedades o
bien etapas o condiciones de una enfermedad y la detección de dichos
análogos es útil para determinar que el nivel de análogo de la
amilina apropiado se encuentra presente en el organismo, por
ejemplo, extrayendo en un test una muestra de dicho organismo y
determinando el nivel de análogo de la amilina en esa muestra. Un
análogo de la amilina que puede ser detectado o medido utilizando
las invenciones descritas y reivindicado en la presente memoria es
la
^{25\text{.}28\text{.}29}Pro-h-amilina,
a la cual también hacemos referencia como
AC-0137.
En las formas de realización preferidas, el
método incluye el uso de un segundo anticuerpo monoclonal contra la
amilina o un anticuerpo policlonal contra la amilina. Es preferible
que el anticuerpo monoclonal que enlaza con el extremo
C-terminal de la amilina humana esté marcado para
poder ser detectada (por ejemplo, con un radio isótopo, un agente
fluorescente o quimioluminiscente o con un enzima). El segundo
anticuerpo monoclonal o anticuerpo policlonal enlaza con un lugar
distinto del extremo C-terminal de la amilina. Así
la prueba es o bien una prueba de anticuerpo competitiva o una
prueba sandwich.
Otras características y ventajas de la presente
invención se pondrán de manifiesto en la siguiente descripción de
las formas de realización preferidas y de las presentaciones
La metodología general y los pasos de las pruebas
de anticuerpos están descritas por Greene, Patente U.S. 4.376.110
titulada "Immunometric Assays Using Monoclonal Antibodies";
Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor
Laboratory, Capítulo 14 (1988); Radioimmunoassay and related
methods, A.E. Bolton and W.M. Hunter, Capítulo 26 del Handbook of
Experimental Immunology, Volumen 1, Immunochemistry, editado por
D.M. Weir, Blackwell Scientific Publications, 1986; "Enzyme
immunoassays: heterogenous and homogeneous Systems", R.M.
Nakamura. A. Voller, y D.E. Bidwell, Capítulo 27 del Handbook of
Experimental Immunology, Volumen 1, Imnunochemistry, editado por
D. M. Weir, Blackwell Scientific Publlcations, 1986; y Current
Protocols in Immunology, Capítulo 2, Sección I, editado by John
E. Coligan, Ada M., Druisbeek, et al., 1991 todos ellos
incorporados en la presente memoria por referencia en su
conjunto.
A no ser que se empleen controles históricos, en
todas estas pruebas (como se describe posteriormente) se realiza
habitualmente un control o controles que están diseñados para dar
resultados positivos y/o negativos. Por ejemplo, la prueba puede
incluir una amilina conocida, control positivo, y una
no-amilina conocida, control negativo.
Los anticuerpos monoclonales y policlonales
contra el extremo amino terminal de la amilina pueden ser producidos
mediante técnicas estándar utilizando tanto la amilina entera como
fragmentos de la misma. Anticuerpos contra otras regiones pueden ser
producidos de forma similar. Los formatos de pruebas estándar pueden
ser usados para realizar pruebas para los análogos de la amilina.
Más abajo se encuentran ejemplos no restrictivos de la presente
invención. Procedimientos equivalentes serán reconocidos por
aquellos que sean expertos en la materia.
Los kits que incluyen estos anticuerpos se
encuentran a su vez incluidos en la presente invención, e incluyen
recipientes separados o viales que contienen separados los
anticuerpos marcados o sin marcar y reactivos y controles tal como
se ha descrito anteriormente.
El monoclonal F025-27 reconoce la
porción C-terminal del péptido de la amilina
(residuos 30-37) producida a partir de una cepa de
ratones, la ND4. Los ratones fueron inmunizados con una cantidad de
amilina humana producida sintéticamente que había formado un número
significativo de puentes intermoleculares disulfuro produciendo
polímeros de la secuencia de la amilina (estos enlaces se formaron
espontáneamente con el tiempo). Esta provisión de péptido fue
administrada a los ratones en forma de adyuvante de Complete
Freund seguido por los posteriores suplementos en forma de
adyuvante de Ribi en intervalos de tres semanas. Cada ratón
recibió 30 - 50 ug de péptido por cada dosis. Uno de cada cinco
ratones respondió al protocolo de inmunización con títulos positivos
de suero contra la amilina humana, y el bazo de este ratón se
encontraba unido al acompañante de la fusión de mieloma
P3/X63-Ag8-6.5.3 mediante una
modificación del método de Oi y Herzenberg (17 Selected Methods
in Cellular Immunology, ed. Barbara Mishel and Stanley Shiigi,
1980, W.H. Freeman and Co.). Los clones positivos fueron
seleccionados mediante radioinmunoensayo utilizando técnicas
estándar. El anticuerpo del hibridoma en sobrenadantes de cultivo
fue inmovilizado en pocillos Dynatech Immulon-2
revestidos con antisueros anti-ratón de oveja y
posteriormente bloqueado con leche seca desnatada al 1%. Los clones
positivos fueron detectados mediante el enlace de
amilina-^{125}I humana marcada mediante la
yodinación de la cloramina T. Todos los clones positivos fueron
desarrollados y tres clones fueron congelados. Dos de cada tres
clones tuvieron una reactividad similar con los fragmentos del
péptido de la amilina, pero solamente un clon
(F025-27) permaneció estable y fue subclonado con
éxito. Se descubrió que dicho anticuerpo enlaza con el extremo
C-terminal de la amilina humana amidada pero no con
la amilina no amidada.
Otros métodos para obtener un clon que exprese un
anticuerpo contra la porción C-terminal de la
molécula de amilina consisten en inmunizar con un fragmento
C-terminal. El fragmento de la amilina humana
glicina-cisteína-glicina y los
aminoácidos 28-37 (llamados
CGG28-37-NH_{2}) fueron conjugados
con la tiroglobulina empleando
succinimidil-4-(N-maleimidometil)-ciclohexano-1-carboxilato
(SMCC) y empleados para inmunizar los ratones ND4, Balb/C y A/J.
Solamente los ratones A/J (5/5) respondieron con títulos de suero
positivos cuando se los examinó con la
amilina-^{125}I humana marcada mediante la
yodinación de la cloramina T aunque todos los ratones respondieron
al fragmento inmunizante. Los ratones que presentan títulos de suero
positivos para la amilina intacta pueden ser utilizados para la
fusión y examinados como se señala más arriba para producir clones
que se enlacen con la porción C-terminal de la
molécula (residuos 28-37).
Tanto los anticuerpos monoclonales
F002-2.18 o F024-4.4 (los cuales
reconocen epitopos para la amilina distintos del extremo
C-terminal, y fueron producidos empleando técnicas
estándar tales como las descritas anteriormente utilizando amilina
humana cross-linked a la tiroglobulina con
glutaraldehído) como otros sueros monoclonales o policlonales pueden
ser empleados para generar una prueba tipo sandwich (IRMA)
que cuantifica la amilina. Los pocillos Dynatech
Immulon-2 están revestidos con
F002-2.18 o F024-4.4 mediante
incubación nocturna del anticuerpo a 20 \mug/ml en una solución
tampón de carbonato, a pH 9. Los pocillos son bloqueados
posteriormente con leche seca desnatada al 1% durante una hora a
temperatura ambiente (alrededor de 20ºC). La muestra o el estándar
(50 \mul) conteniendo amilina(0-750 pM) es
añadida al pocillo e incubado durante tres horas a temperatura
ambiente. Los pocillos se limpian con fosfato salino tamponado
(PBS), 0,1% de detergente Tween-20 e
^{125}I-F025-25 (200.000 cpm/50
\mul) se añaden a cada pocillo y se incuban tres horas adicionales
a temperatura ambiente. Los pocillos se lavan con PBS, 0,1% de
detergente Tween-20 y se hace el recuento con un
contador gamma Pharmacia LKB.
Como en el Ejemplo 2, los anticuerpos
monoclonales F002-2.18 o F024-4.4 u
otros anticuerpos monoclonales o antisueros policonales pueden ser
utilizados para generar una prueba sandwich (IEMA) que cuantifique
la amilina. Los pocillos Dynatech Immulon-2 están
revestidos con F002-2.18 o F024-4.4
mediante incubación nocturna del anticuerpo a 20 \mug/ml en una
solución tampón de carbonato, a pH 9. Los pocillos son bloqueados
posteriormente con leche seca desnatada al 1% durante una hora a
temperatura ambiente (alrededor de 20ºC). La muestra o el estándar
(50 \mul) conteniendo amilina(0-750 pM) es
añadida al pocillo e incubado durante tres horas a temperatura
ambiente. Los pocillos se limpian con fosfato salino tamponado
(PBS), 0,1% de detergente Tween-20 y
F025-27 conjugada con la fosfatasa alcalina es
añadida a cada pocillo e incubada durante tres horas adicionales a
temperatura ambiente. Los pocillos se lavan con PBS, 0.1% de
detergente Tween-20 y la actividad enzimática se
detecta utilizando el substrato fluorescente 4-metil
feril fosfato, leyéndose la señal en un lector de placas (INDEXX o
Dynatech).
El Ejemplo 2, IRMA, y el Ejemplo 3, IEMA, para la
amilina fueron validados y comparados el uno con el otro.
El promedio de Concentración Mínima Detectable
(MDC) para la amilina IRMA fue de 2.07 pM. La variabilidad media
intra-prueba fue del 6,7%. La variabilidad
inter-pruebas de ocho muestras clínicas fue del
17,8%. La cuantificación de los controles para la prueba IRMA se
muestra a continuación:
\newpage
| Control | Media |
| Bajo | 5,4 pM |
| Medio | 32,4 pM |
| Alto | 110,4 pM |
El promedio de la MDC para la amilina IEMA fue de
1,4 pM. La variabilidad media intra-prueba fue del
6,3% y la variabilidad inter-prueba para las mismas
8 muestras clínicas a las que hemos hecho referencia anteriormente
fue del 16,2%. La cuantificación de los controles de la amilina en
la prueba IEMA se muestra a continuación:
| Control | Media |
| Bajo | 5,8 pM |
| Medio | 28,6 pM |
| Alto | 107,7 pM |
Las pruebas para la AC-0137
fueron preparadas y realizadas tal como se ha descrito en el Ejemplo
2 (IRMA) y el Ejemplo 3 (IEMA), y comparadas la una con la otra en
un estudio de validación de la prueba.
El promedio de la MDC de la prueba IRMA para la
AC-0137 fue de 9,3 pM. La variabilidad media
intra-prueba fue del 7,5%. Para las muestras
clínicas examinadas, la variabilidad inter-prueba
fue del 16,6%. La cuantificación de los controles para la
AC-0137 en la prueba IRMA se muestra a
continuación:
| Control | Media |
| Bajo | 14,4 pM |
| Medio | 55,0 pM |
| Alto | 147,6 pM |
El promedio de la MDC de la prueba IEMA para la
AC-0137 fue de 1,1 pM. La variabilidad media
intra-prueba fue del 3,5% y la variabilidad
inter-prueba (para las muestras clínicas) fue del
16,7%. La cuantificación de los controles de la
AC-0137 en la prueba IEMA se muestra a
continuación:
| Control | Media |
| Bajo | 13,2 pM |
| Medio | 58,8 pM |
| Alto | 239,3 pM |
Los solicitantes y su cesionario reconocen su
responsabilidad para remplazar este cultivo en el caso de que muera
antes del fin del periodo de una patente concedida sobre esto, 5
años después de la última petición de un cultivo, o 30 años, sea
cual fuere el más largo, y su responsabilidad de notificar al
depositario de la concesión de dicha patente, en cuyo tiempo el
depósito pasará a ser irrevocablemente disponible para el
público.
Otras realizaciones se encuentran dentro de las
siguientes reivindicaciones.
Claims (12)
1. Un anticuerpo monoclonal que enlaza con el
extremo C-terminal amidado de la amilina humana y no
con el extremo C-terminal no amidado de la amilina
humana.
2. Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
reivindicación 1, en el cual dicho extremo
C-terminal comprende la secuencia de aminoácidos
entre los aminoácidos 30 y 37, ambos inclusive, de la amilina
humana.
3. El anticuerpo monoclonal
F025-27 producido mediante el hibridoma depositado
en la American Type Culture Collection en el Depósito nº HB
11045.
4. Un inmunoensayo para detectar la presencia o
cantidad de un análogo de la amilina, llamado análogo de la amilina,
comprendiendo la secuencia de aminoácidos entre los aminoácidos 30 y
37 de la amilina humana y que se encuentra amidado en el extremo
C-terminal, cuyo inmunoensayo consta de los
siguientes pasos:
poner en contacto dicho análogo de la amilina o
muestra sospechosa de contener dicho análogo con un anticuerpo
monoclonal que enlaza con el extremo C-terminal
amidado de la amilina humana y no con el extremo
C-terminal no amidado de la amilina humana; y
determinar la presencia o cantidad de dicho
análogo de la amilina.
5. Una prueba según lo expuesto en la
reivindicación 4, en la que el anticuerpo monoclonal es detectable
por su marcaje.
6. Una prueba según lo expuesto en la
reivindicación 5, en la que el anticuerpo monoclonal está
radiomarcado o marcado con un enzima.
7. Una prueba según lo expuesto en las
reivindicaciones 4 a 6, en la que un segundo anticuerpo monoclonal
marcado contra la amilina o un anticuerpo policlonal opcionalmente
marcado contra la amilina es usado en dicha prueba.
8. Una prueba según lo expuesto en las
reivindicaciones 4 a 7, en la que dicho análogo de la amilina es
amilina humana.
9. Una prueba según lo expuesto en las
reivindicaciones 4 a 7, en la que dicho análogo de la amilina es la
^{25,28,29}Pro-amilina humana.
10. Una prueba según lo expuesto en las
reivindicaciones 4 a 9, en la que dicha prueba es una prueba de
tipo competitivo o de tipo sandwich.
11. Una prueba según lo expuesto en las
reivindicaciones 4 a 10, en la que el anticuerpo monoclonal es el
anticuerpo monoclonal F025-27 tal como es producido
por el hibridoma depositado en la American Type Culture Collection
en el Depósito nº. HB 11045.
12. Un kit que consta de un anticuerpo
monoclonal que enlaza con el extremo C-terminal de
la amilina humana tal como se define en cada una de las
reivindicaciones 1 a 3.
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